Αφηρημένο

Πολλαπλές οι παράγοντες οδηγούν την εξέλιξη από υγιή βλεννογόνο προς σποραδικά καρκινώματα του εντέρου και τη συσσώρευση αποδείξεις συνδέει εντερικά βακτήρια με την έναρξη και την εξέλιξη της νόσου. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να παρέχει μια πρώτη υψηλής ανάλυσης χάρτη της κολονικής dysbiosis που σχετίζεται με την ανθρώπινη ορθοκολικό καρκίνο (CRC). Για το σκοπό αυτό, οι microbiomes αποικισμό ιστό όγκου κόλου και παρακείμενες μη κακοήθεις βλεννογόνο συγκρίθηκαν με βαθιά αλληλούχιση rRNA. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές σε μικροβιακούς μοτίβα αποικισμό μεταξύ αυτών των δύο θέσεων. Παρά το γεγονός ότι μεταξύ των ατόμων αποικισμό σε ασθενείς CRC ήταν μεταβλητή, οι όγκοι σχηματίζονται σταθερά μια θέση για

Coriobacteria

και άλλες προτεινόμενες προβιοτικά είδη βακτηρίων, ενώ δυνητικά παθογόνων

εντεροβακτήρια

υποεκπροσωπούνται στον ιστό του όγκου. Δεδομένου ότι η εντερική μικροχλωρίδα είναι γενικά σταθερή κατά τη διάρκεια της ενήλικης ζωής, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι CRC σχετίζονται με φυσιολογικές και μεταβολικές αλλαγές που προσλαμβάνουν όγκο τροφής συμβιωτικό-όπως τα βακτήρια. Αυτά τα μικρόβια έχουν έτσι ένα φαινόμενο ανταγωνιστικό πλεονέκτημα στο μικροπεριβάλλον του όγκου και ως εκ τούτου φαίνεται να αντικαθιστά τα παθογόνα βακτήρια που μπορεί να εμπλέκεται σε CRC αιτιολογία. Αυτή η πρώτη γεύση από το microbiome CRC παρέχει ένα σημαντικό βήμα προς την πλήρη κατανόηση της δυναμικής αλληλεπίδρασης μεταξύ εντερική μικροβιακή οικολογία και σποραδικές CRC, τα οποία μπορούν να παρέχουν σημαντικές οδηγεί προς την κατεύθυνση νέων διαγνωστικών εργαλείων microbiome σχετίζονται και θεραπευτικές παρεμβάσεις

Αιτιολογική αναφορά.: Marchesi JR, Dutilh BE, Αίθουσα Ν, Peters WHM, Roelofs R, Boleij A, et al. (2011) Προς το Ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου microbiome. PLoS ONE 6 (5): e20447. doi: 10.1371 /journal.pone.0020447

Επιμέλεια: Niyaz Ahmed, του Πανεπιστημίου της Hyderabad, Ινδία

Ελήφθη: 18 Φεβρουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 22, Απρ 2011? Δημοσιεύθηκε: May 24, 2011

Copyright: © 2011 Marchesi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. AB ήταν που υποστηρίζεται από την ολλανδική Εταιρεία Καρκίνου (KWF? KUN Έργου 2006 έως 3591). Ολλανδικά Digestive Diseases Ίδρυμα (ΜΟΙ? Έργου WO 10-53). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ανθρώπινο εντερικό σωλήνα περιέχει περίπου 10

14 βακτήρια, η οποία περιλαμβάνει περίπου 10

3 είδη, τα οποία είναι απαραίτητα για την πέψη των τροφίμων, τον έλεγχο των εντερικών επιθηλιακών ομοιόστασης, εντερική ανάπτυξη και την υγεία του ανθρώπου [1 ]. Αντιστρόφως, ένας μεγάλος όγκος στοιχείων υποστηρίζει μια σχέση μεταξύ μολυσματικών παραγόντων και ανθρώπινους καρκίνους [2] και προτείνει ότι ορισμένα βλεννογόνο που σχετίζεται βακτηριακά είδη παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC? [3], [4], [ ,,,0],5]. Επιπλέον, κλινικές συσχετίσεις μεταξύ βακτηριακή λοίμωξη και CRC έχουν περιγραφεί εδώ και πολλές δεκαετίες, τα πιο γνωστά εκ των οποίων αφορούν λοιμώξεις με

Streptococcus bovis

[6], [7] και

Clostridium septicum

[8] Ωστόσο, ο συν-συχνότητα εμφάνισης αυτών των λοιμώξεων με CRC είναι πολύ χαμηλή (& lt? 1%).. δεδομένου ότι οι χαμηλού βαθμού ευκαιριακά παθογόνα μπορεί να γίνει μόνο κλινικά έκδηλη σε μειωμένη ασθενείς Αντίστοιχα, ορολογικά δεδομένα έχουν δείξει αυξημένη έκθεση να

S. bovis

αντιγόνα σε ασθενείς πρώιμο στάδιο CRC χωρίς κλινικά συμπτώματα της βακτηριακής λοίμωξης [9]. Με βάση αυτό, έχει προταθεί ότι συγκεκριμένα βακτήρια του εντέρου έχουν ένα ανταγωνιστικό πλεονέκτημα στο μικροπεριβάλλον CRC, ενώ ευκαιριακές λοιμώξεις παραμένουν καταστέλλεται από την ενεργό ανοσοποιητικό σύστημα στην πλειοψηφία των ασθενών.

Πρόσφατες δημοσιεύσεις παρείχαν μηχανιστική αποδείξεις για η συμμετοχή των βακτηρίων του εντέρου στην ανάπτυξη της CRC, η οποία περιλαμβάνει ί), η παραγωγή του DNA βλάπτει ριζών υπεροξειδίου, ii) η παραγωγή του γενοτοξίνες, iii) κύτταρο-εξαρτώμενη επαγωγή Τ βοηθητικών του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, iv) υποδοχέα ΤοΙΙ μεσολαβούμενη επαγωγή του pro-καρκινογόνες οδών [10] – [14]. Παρά αυτό το τεράστιο σώμα του έμμεσες αποδείξεις, ωστόσο, δεν υπάρχουν κλινικά δεδομένα έχουν μέχρι στιγμής ήταν διαθέσιμες για να δείξει άμεσα διακριτές βακτηριακές μορφές αποικισμού CRC ασθενείς. Στην πραγματικότητα, η μοριακή φύση του συμπλόκου εντερικού κοινότητα ήταν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη πριν από τη στιγμή που Eckburg και συνεργάτες [15] απεκάλυψε την παρουσία ~ 400 βακτηριακά είδη με αλληλούχιση προκαρυωτικές αλληλουχίες ριβοσωμικού γονιδίου RNA από πολλαπλούς του κόλου θέσεις βλεννογόνων και τα περιττώματα των υγιών ατόμων . Περαιτέρω έρευνες αποκάλυψαν υψηλή ενδο-ατομική διακύμανση της εντερικής microbiomes στον ανθρώπινο πληθυσμό, ενώ η μικροβιακή αποίκιση του βλεννογόνου εντός ενήλικων ατόμων είναι σχετικά σταθερή σε όλη του παχέος εντέρου [16] – [18]. Με βάση τις τελευταίες παρατηρήσεις υποθέσαμε ότι η σε βάθος ανάλυση ενός σχετικά μικρού αριθμού ζεύγη on /off-καρκινικά δείγματα ιστών από ασθενείς CRC θα μπορούσε να αποκαλύψει βακτηριακών ειδών που θα μπορούσαν να εμπλέκονται στην αιτιολογία CRC. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, χρησιμοποιήσαμε βαθιά Pyrosequencing βακτηριακού rRNA να συγκρίνετε microbiomes όγκου CRC με εκείνη των γειτονικών μη κακοήθεις βλεννογόνο σε έξι ασθενείς. Τα στοιχεία που παρείχε την πρώτη εικόνα υψηλής ανάλυσης του ανθρώπινου microbiome CRC και έδειξε ότι CRC συνδέεται με αρκετά δραματικές αλλαγές στην προσκολλημένη εντερική μικροχλωρίδα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικό Ασθενής

Έξι ασθενείς (με την ένδειξη A-F, Πίνακας 1) υποβλήθηκαν σε εκτομές για την πρωτοβάθμια αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου στο Πανεπιστήμιο Radboud Nijmegen Medical Centre. Μετά την εκτομή, τα δείγματα κολονικής ξεπλύθηκαν εκτεταμένα με αποστειρωμένο νερό μετά την οποία τα δείγματα εξετάστηκαν από ογκολογική παθολογοανατόμο. Νόσος ανέβηκε σύμφωνα με την Tumor-Node-Μετάσταση (TNM) ταξινόμησης [19]. Από κάθε κολονική δείγμα, βιοψίες ελήφθησαν από την θέση του όγκου ( «on-όγκου», Α

σε F

on) και από παρακείμενες μη κακοήθη ιστό ( «off-όγκου», Α

off -F

εκτός) στην αυλική πλευρά του κολικού τοιχώματος (απόσταση περίπου 5-10 cm). Δείγματα ιστού διασπάστηκαν με μηχανική διάτμηση μετά από την οποία το συνολικό DNA εκχυλίζεται με τη χρήση του κιτ /RNA AllPrep DNA (Qiagen). Όλα τα δείγματα αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Η

Ηθική Δήλωση

Η έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη εγκρίθηκε από την από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ιατρική της περιοχής Arnhem-Nijmegen (Ολλανδία)? ασθενών που προβλέπεται γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των δειγμάτων και η επακόλουθη ανάλυση, όταν απαιτείται.

Η μετουσίωση Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) και Ριβοσωματιακής διαγονιδιακές Ανάλυση Αποστάτης (RISA)

Χρησιμοποιώντας συνολικού DNA από το 12 παχέος εντέρου βιοψίες ως πρότυπο, βακτηριακά 16S rRNA γονίδια ενισχύθηκαν με μια ένθετη προσέγγιση [20] χρησιμοποιώντας το εναύσματα ζεύγη 27f /1492r [21] και L1401r /968f-GC [22], [23] σε δύο διαδοχικές αντιδράσεις PCR (Πίνακας S1) . DGGE διεξήχθη επί του προκύπτοντος μίγματος PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ορατές ζώνες (βλέπε Εικόνα 1) αντιπροσωπεύουν βακτηριακών ειδών που έχουν μια πληθώρα τουλάχιστον 1-10% του συνόλου της κοινότητας, ενώ χαμηλά άφθονα είδη δεν θα οδηγήσει σε ανιχνεύσιμη ζώνες με αυτήν την προσέγγιση. Για να επιβεβαιωθεί DGGE δεδομένα, ριβοσωμικό διαγονιδιακές περιοχές βακτηριακών διαχωριστή ενισχύθηκαν με εκκινητές 1406f και 23Sr χρησιμοποιώντας το ίδιο DNA ως μήτρα (Πίνακας S1? [24]). RISA διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [23].

Ένα εσωτερικό θραύσμα (~ 450 bps) του γονιδίου βακτηριακού 16S rRNA ενισχύθηκε από κόλον ιστού εκχυλισμένο DNA από μια ευρείας-κλίμακας προσέγγιση PCR μετά από το οποίο αυτά τα μείγματα αμπλικόνιο εφαρμόστηκαν σε DGGE. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα 1?

off

, μη κακοήθη ιστό?

για την πώληση, καρκινικό ιστό.

Η

FLX 454 τιτανίου Pyrosequencing

Στο δεύτερο βήμα της ένθετης PCR προσέγγισης, μπορούμε ενισχύεται η περιοχή V1-V3 του βακτηριακού 16S rRNA γονίδιο χρησιμοποιώντας ζεύγη εκκινητών με ετικέτα 12 διακριτές μεταγονιδίωμα αναγνώριση (MID) ετικέτες (Πίνακας S1). 454 αλληλούχιση διεξήχθη στο Πανεπιστήμιο της προηγμένης γονιδιωματικής Διευκόλυνσης Λίβερπουλ. Αλληλουχίες είναι διαθέσιμες κατόπιν αιτήματος & lt?.

Διαβάστε ποικιλομορφία της μεταποίησης και της κοινότητας

Όλες οι μερικές αλληλουχίες γονιδίων 16S rRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας αρχικά το Pyro-αγωγού στο έργο Ριβοσωματιακής βάση δεδομένων (RDP, [25] ? Αφήστε 10) για να τακτοποιήσει και να αφαιρέσετε εκκινητές από τις μερική ribotags και να περιορίσει ακολουθίες σε & gt? 400 bp και & lt? = 500 bp, αλληλουχίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας την εντολή pre.cluster η οποία ελαχιστοποιεί τα σφάλματα που εισήγαγε η πλατφόρμα Pyrosequencing [26]. Αυτό το βήμα παρέχονται τα σύνολα δεδομένων για ανάλυση (Πίνακας S2) με τα ιστογράμματα μήκους ανάγνωσης παρουσιάζεται στο σχήμα S2

A

. Τα δεδομένα από όλα τα δείγματα υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας MOTHUR [27] για τη δημιουργία δεικτών της διαφορετικότητας, καμπύλες αραίωσης (σχήμα S2

Β

) και να αναλάβει την ανάλυση Libshuff ομοιότητας δείγματος. MOTHUR διεξήχθη με τη χρήση των υπολογιστικών εγκαταστάσεων του τμήματος Advanced Research Computing @ Κάρντιφ (ARCCA), το Πανεπιστήμιο του Κάρντιφ. Συγκρίσεις των βιβλιοθηκών από ένα άτομο πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της Βιβλιοθήκης του ΠΑΑ συγκρίνουμε εργαλείο. Ανάλυση των ribotags πραγματοποιήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας MEGAN [28], για τα οποία η είσοδος ήταν την έξοδο csv από αγωγό ταξινομητή ΠΑΑ (χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις και επίπεδο εμπιστοσύνης 50%). επιλέχθηκε το εργαλείο σύγκρισης και διαβάζει ομαλοποιημένη μεταξύ των δειγμάτων και τη διόρθωση Bonferroni χρησιμοποιηθεί για να τονίσει τις διαφορές μεταξύ των δειγμάτων. Η ευθυγράμμιση ανεξάρτητη ανάλυση από την ημερομηνία αυτή και πραγματοποιείται με τη χρήση 5-καταναλωτές και τη διανομή του τοπίου συχνότητας (fLAND) ανάλυση [29] – [31]. Η γενιά του 5-μερών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κατά παραγγελία σενάριο PERL (γραμμένο από το κρεβάτι? Διαθέσιμο κατόπιν αιτήματος) και την ανάλυση PCA πραγματοποιήθηκε σε MATLAB για ARCCA, η ανάλυση fLAND πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού fLAND

Συνοχή. ανάλυση

μεροληψία στην μικροχλωρίδα μεταξύ των on-όγκου και off-καρκινικά δείγματα σε όλη ασθενείς συνοψίζονται προκειμένου να εντοπιστούν taxa που εμπλουτίζονται είτε συστηματικά είτε εξαντλούνται στις δύο κόγχες με συνέπεια. Όλα Pyrosequencing διαβάζει για πρώτη φορά χαρτογραφείται στην ολοκληρωμένη βάση δεδομένων SILVA ευθυγραμμισμένων, η ποιότητα ελέγχεται 16S /18S rRNA ακολουθίες & gt? 300 nt (έκδοση SSUParc_100? [32]) χρησιμοποιώντας BLAT v34 με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους και αποκοπές [33]. Υποθέσαμε ότι κάθε ανάγνωση προήλθε από ένα διαφορετικό μικροοργανισμό και ότι η δειγματοληψία των διαβάζει εκπροσώπησε την ταξινομική κατανομή εντός του εντερικού μικροχλωρίδα. Για κάθε δείγμα, κάθε ανάγνωση ανατέθηκε στο πιο παρόμοια ακολουθία της στη βάση δεδομένων SILVA καθώς και περίληψη των ταξινομικών σχολιασμούς των ανιχνεύθηκαν ακολουθίες της βάσης δεδομένων δημιουργήθηκε. Κάθε ταξινομική clade αξιολογήθηκε για να διαπιστώσει αν έδειξε ένα υψηλότερο κλάσμα διαβάζει σε off-όγκου ή σε καρκινικά δείγματα για κάθε ασθενή, και μια βαθμολογία συνοχή υπολογίστηκε μετρώντας «1», αν η clade ήταν υψηλότερη off-όγκου, » -1 «αν ο κλάδος ήταν υψηλότερη σε όγκο, και» 0 «αν το κλάσμα του διαβάζει εντός και εκτός του όγκου ήταν πανομοιότυπη (π.χ. αν ο κλάδος δεν μετρήθηκε σε αυτόν τον ασθενή). Τέλος, αυτές οι βαθμολογίες αθροίζονται, δίδοντας μια συνολική βαθμολογία συνοχή μεταξύ -6 και +6 που αντανακλά τον τρόπο με συνέπεια ο κλάδος ήταν εμπλουτισμένου ή εξαντλημένου σε όλους τους ασθενείς. Σημειώστε ότι κάθε ακολουθία στη βάση δεδομένων SILVA έχει δύο ταξινομικές σχολιασμούς, δηλαδή EMBL και ΠΑΑ.

Αποτελέσματα

DGGE αποτυπωμάτων

Ως πρώτη εξερεύνηση, τα προφίλ των βακτηριακών 16S rRNA γονίδια παρήχθησαν χρησιμοποιώντας DGGE για όγκο και ταιριάζουν παρακείμενες μη κακοήθη (off-όγκου) βλεννογόνου από 6 ασθενείς CRC (Πίνακας 1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, οι μικροβιακές κοινότητες του ιστού του όγκου και των παρακείμενων «off-όγκου» βλεννογόνο ήταν εντυπωσιακά διαφορετικά και παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν RISA λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων εφαρμόστηκε στα ίδια δείγματα (Σχήμα S1). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτό το αποτέλεσμα έρχεται σε έντονη αντίθεση με τις προηγούμενες παρατηρήσεις ότι η κολονική μικροχλωρίδα του βλεννογόνου είναι σχεδόν ταυτόσημα σε γειτονικές θέσεις σε υγιή άτομα [15], [16], [34] – [36]. Εμπνευσμένος από αυτήν την εντυπωσιακή παρατήρηση, μπορούμε επόμενο στόχο για μια προσέγγιση αλληλουχίας microbiome να χαρτογραφήσει τις αλλαγές microbiome σε υψηλή ανάλυση και όχι αλληλουχίας των επιμέρους διακριτικό συγκροτήματα που εκπροσωπούν μόνο τα άφθονα είδη σε ένα συγκεκριμένο δείγμα.

FLX 454 τιτανίου Pyrosequencing

Για να ορίσετε το microbiome όγκου του παχέος εντέρου σε ένα βαθύ επίπεδο, ενισχύεται και η αλληλουχία της περιοχής V1-V3 των βακτηριακών 16S rRNA γονίδια (Πίνακας S1), η οποία κατέληξε σε ένα σύνολο 193.880 ribotags μήκους 401 500 bp. Τα δεδομένα έδειξαν υψηλές τιμές κάλυψης (& gt? 88%) και οι καμπύλες αραίωσης αναγράφεται ικανοποιητική δειγματοληψία των κοινοτήτων στο 90% ταυτότητα (Σχήμα S2

Β

? Πίνακας S2). ανάλυση Libshuff έδειξε ότι όλα τα εντός και εκτός του όγκου των κοινοτήτων ήταν σημαντικά διαφορετικές (p & lt? 0,0001) από τον άλλο (Πίνακας S3). Είναι σημαντικό, οι δύο ευθυγράμμιση-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη μεθόδους υποστήριξε την παρατήρηση αυτών των τροποποιημένων microbiomes όγκου (Σχήμα 2, Εικόνα S2

C

και

D

? Πίνακα S3). Επιπλέον, ενώ DGGE και RISA έδειξε μόνο μικρές διαφορές για τον ασθενή D, λεπτές, αλλά σημαντικές, οι διαφορές θα μπορούσαν να αναγνωριστούν από την προσέγγιση βαθιά αλληλουχίας. Αυτό εξηγεί σαφώς την ανώτερη ανάλυση που μπορεί να επιτευχθεί με την τελευταία τεχνολογία. Τα δεδομένα έδειξαν μια γενική τάση των περισσότερων Bacteroidetes και λιγότερο Firmicutes από σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με αντιστοιχία off-όγκου βλεννογόνου (Σχήμα S3). Ωστόσο, όπως θα αναμενόταν οι παρατηρούμενες μετατοπίσεις microbiome έδειξαν ένα υψηλό επίπεδο μεταβλητότητας μεταξύ των ασθενών (Σχήμα S3A-F) και σε ορισμένες περιπτώσεις ήταν ακόμη και σε αντίθεση με τη γενική τάση (Σχήμα S3

G

). Παρά το γεγονός ότι

S. bovis

ή

C. septicum

λοιμώξεις έχουν γνωστή κλινική συσχέτιση με CRC, μόνο πολύ λίγοι αλληλουχίες αντιστοιχίζονται σε rRNA των δύο αυτών ειδών και δεν παρατηρήθηκε καμία αξιόπιστη αποικισμό του CRC ιστού. Αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από το γεγονός ότι οι εν λόγω ευκαιριακά παθογόνα είναι κυρίως παρόντα στο παροδικό στάδιο αδένωμα του CRC [37].

Τα δεδομένα αλληλούχισης 454 ομαλοποιήθηκαν σε MEGAN (Huson et al. 2009) και αναλύεται μέσω της ΠΑΑ εργαλείο pyropipeline ταξινομητή (Cole et al. 2009) για να δημιουργήσετε ένα αρχείο csv της ταξινομικής αφθονία. Αυτό το αρχείο χρησιμοποιείται ως πρώτη ύλη για MEGAN να απεικονίσει τον οποίο οι οικογένειες διαφορές μεταξύ των μη-κακοήθεις ιστούς (

off

-tumor) και CRC ιστού (

στο

-tumor) κοινοτήτων. Μια εικόνα υψηλής ανάλυσης αυτού του Σχήματος για «zoom-in» σκοπούς μπορείτε να το κατεβάσετε από το σχήμα S2

E

.

Η

Συνέπεια ανάλυση

Για να εντοπίσετε την πιο επιτακτική ανάγκη αλλαγών microbiome κατά τη διάρκεια του σχηματισμού του CRC, η συνέπεια μεταξύ των ασθενών που υπολογίστηκε για κάθε taxon ατομικά του δίνει μια βαθμολογία «-1» εάν η ομαλοποιημένη αριθμός ακολουθίας διαβάζει αυτής της ταξινομικής ομάδας στον ιστό του όγκου ήταν υψηλότερη από ό, τι σε αντιστοιχία off-όγκου βλεννογόνο, «1», αν η ταξινομικής ομάδας ήταν πιο άφθονο σε υγιή βλεννογόνο και «0» αν δεν ανιχνεύθηκε καθόλου σε αυτόν τον ασθενή. Συνοψίζοντας αυτά τα αποτελέσματα σε όλη ασθενείς κατέληξαν σε ένα αποτέλεσμα συνέπειας -6-6 για κάθε ταξινομική βαθμίδα (Πίνακες 2 και S4, το σχήμα S4

Μια

και

Β

). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ορισμένες αλληλουχίες σχολιασμένη καλύτερα από EMBL παρά με ΠΑΑ, και

αντίστροφα

(βλέπε Εικόνα S4C), έτσι ώστε να αναφέρουν και οι δύο και όχι επιλεκτικά εμπιστευθεί οποιαδήποτε από αυτές τις ταξινομικές σχολιασμούς. Αυτή η προσέγγιση έδειξε ότι CRC ιστός συνδέεται σταθερά με υπερεκπροσώπηση της υποκατηγορίας των

Coriobacteridae

, ειδικά τα γένη

Slackia

και

Collinsella

, η οποία μπορεί να θεωρηθεί ως συσσιτώνες έντερο. Από την άλλη πλευρά, τα μέλη του

Enterobacteriaceae

, όπως

Citrobacter

,

Shigella

,

Cronobacter

,

Kluyvera

,

Serratia

και

Salmonella spp

. (Βαθμολογίες μεταξύ 4 και 6? Πίνακας 2? Σχήμα S4

Μια

και

Β

) ήταν υποεκπροσωπούνται σε CRC ιστό. Παρόλο που αυτά τα ευρήματα ήταν συνεπής, η σχετική αφθονία αυτών των taxa διέφεραν σημαντικά μεταξύ των εντός και εκτός του βλεννογόνου του όγκου από ασθενείς που ερευνήθηκαν όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3.

Σχετική κατανομή των επιλεγμένων CRC over /under εκπροσωπείται taxa υπολογίστηκε ως η κλάσμα σχολιασμένη αλληλουχίες του συνολικού αριθμού των διαβάζει στο συγκεκριμένο δείγμα. βαθμολογία Συνοχή για την αναφερόμενη ταξινομική βαθμίδα (βλέπε πίνακα 2) δίνεται εντός παρενθέσεων και αντικατοπτρίζει τον τρόπο με συνέπεια κλάδων εμπλουτίστηκαν σε όλη ασθενείς Α-F? πράσινες γραμμές δείχνουν το κλάσμα στο

off

-tumor και κόκκινες γραμμές δείχνουν κλάσμα αυτού του taxon

για την πώληση -tumor.

Η

Συζήτηση

Η πιο εντυπωσιακή παρατήρηση από την τρέχουσα μελέτη μας ήταν τα δραματικά διαφορετική microbiomes στο CRC ιστό και τις παρακείμενες μη κακοήθεις βλεννογόνου σε 5 ασθενείς διερευνήθηκαν τα 6. Προς έκπληξή μας, ωστόσο, βρήκαμε καμία συνεπής υπερεκπροσώπηση των πιθανών παθογόνων βακτηρίων στο CRC ιστό. Σε αντίθεση, υπερεκπροσωπούνται είδη ανησυχεί μέλη των γενών

Coriobacteridae

,

Roseburia

,

Fusobacterium

και

Faecalibacterium

, οι οποίες γενικά θεωρούνται ως συσσιτώνες εντέρου με προ-βιοτικά χαρακτηριστικά. Αυτό υποδηλώνει ότι οι παρατηρούμενες μετατοπίσεις μικροβιακή που προκαλείται από τις αρκετά δραματική φυσιολογικές και μεταβολικές αλλοιώσεις που προκύπτουν από την ίδια κόλον καρκινογένεση [38] – [40], και ότι τα είδη αυτά μπορούν να θεωρηθούν ως επιβάτες CRC. Στην πραγματικότητα, πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν μεταβολισμική εξαιρετικά αλλαγμένες θρεπτικές συνθήκες στο μικροπεριβάλλον του όγκου CRC σε σύγκριση με μη κακοήθη βλεννογόνο [41]. Τα πιο εμφανή και συνεπή ευρήματα αφορούσε μια δραστική μείωση της γλυκόζης και πυροσταφυλικό και αύξηση των γαλακτικών (χαμηλό ρΗ), αμινοξέα, λιπίδια και λιπαρά οξέα. Η ενδο-ασθενούς μεταβλητότητα microbiome αλλαγές θα μπορούσε ενδεχομένως να αντικατοπτρίζει την ενδο-ατομική μεταβλητότητα στο μικροπεριβάλλον του όγκου CRC [42], με αποτέλεσμα την κατά προτεραιότητα πρόσληψη των διαφόρων κατηγοριών των εντερικών ειδών. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μείωσε τον αριθμό των

Collinsella

spp. και

Roseburia

spp. έχουν προηγουμένως βρεθεί σε ηλικιωμένα άτομα που χρησιμοποιούν μη-στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα σε σύγκριση με τους μη χρήστες (NSAID [43]?. υποδηλώνοντας ότι αυτά τα βακτηρίδια χρειάζονται φλεγμονώδεις κόγχες να αποικίσουν βέλτιστα το τοίχωμα του εντέρου Είναι ενδιαφέρον ότι η γένη

Roseburia

,

Fusobacterium

και

Faecalibacterium

, οι οποίες εμπλουτίζονται μετρίως σε όγκους ανήκουν στο μείζον βουτυρικό παραγωγή εντερικών βακτηρίων. το βουτυρικό φαίνεται να είναι προστατευτική έναντι CRC επάγοντας ένα ρ21-εξαρτώμενη αναστολή του κυτταρικού κύκλου με αποτέλεσμα ένα αυξημένο ρυθμό απόπτωσης των καρκινογόνων κυττάρων [44]. τα αποτελέσματα της βουτυρικού είναι ωστόσο ακόμα υπό συζήτηση ως αναστολή όγκου μπορεί για παράδειγμα να περιορίζεται στα πρώτα στάδια της καρκινογένεσης. Σημαντικά, έχει δειχθεί ότι

Faecalibacterium prausnitzii

εκκρίνει αντι-φλεγμονώδεις παράγοντες που μπλοκάρουν την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ και παραγωγής IL-8 σε ένα πειραματικό ζωικό μοντέλο για τη νόσο του Crohn [45]. Επιπλέον, οι ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου, οι οποίοι βρίσκονται σε αυξημένο κίνδυνο για CRC, έχουν συσχετισθεί με χαμηλότερους αριθμούς του

F. prausnitzii

στον εντερικό πληθυσμού [46]. Τέλος,

Slackia

spp. Είναι γνωστό για τη μετατροπή διαιτητικές ισοφλαβόνες σε πιο ισχυρό αντι-οξειδωτικά [47] ικανά να επάγουν αποπτωτικών οδών σε κύτταρα όγκου [48]. Έτσι, εν όψει των σημερινών δεδομένων μας, θα μπορούσαμε να βγάλουμε το συμπέρασμα ότι το μικροπεριβάλλον CRC κατά προτίμηση αποικίστηκε από τα εντερικά βακτήρια με αντι-ογκογόνο και αντι-καρκινογόνες ιδιότητες, οι οποίες με αυτόν τον τρόπο μπορεί να εμποδίσει την ταχεία εξέλιξη της ασθένειας αυτής. Ωστόσο, θα μπορούσε κανείς να υποστηρίξει ότι, για παράδειγμα, βουτυρικό παρέχει μια πρόσθετη πηγή ενέργειας για τα κύτταρα του όγκου, ενώ η μειωτική τη φλεγμονώδη αντίδραση σταματά το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα επιτίθεται η εκκολαπτόμενη όγκου. Έτσι, τόσο καταστολής όγκων ή τα σενάρια προώθηση του όγκου μπορεί να είναι τα πιθανά αποτελέσματα της διαφοράς εποικισμό της CRC ιστού και περαιτέρω, λεπτομερείς έρευνες, θα πρέπει να διαλευκανθεί αυτό το θέμα.

Μια άλλη αξιοσημείωτη παρατήρηση αφορούσε την μειωμένη παρουσία των μελών της η

Enterobacteriaceae

, όπως

Citrobacter

,

Shigella

,

Cronobacter

,

Kluyvera

,

Serratia

και

Salmonella spp

. στον ιστό του όγκου των ασθενών ερευνήθηκαν CRC. Αυτά τα δεδομένα μπορεί να υποδηλώνουν ότι τα βακτήρια αυτά είναι μέρος της εγγενούς microbiome των ασθενών CRC, αλλά outcompeted από τις προαναφερθείσες συμβιωτικό-όπως βακτήρια κατά την εξέλιξη της νόσου. Παρά το γεγονός ότι έχουμε συνειδητοποιήσει ότι, ελλείψει μιας μεγάλης βάσης δεδομένων αναφοράς του βλεννογόνου microbiomes από υγιή άτομα, είναι δύσκολο να εξαχθούν συμπεράσματα σχετικά με αυτή την παρατήρηση, θα ήθελα να εκμεταλλευτώ την ευκαιρία να επανεξετάσει σύντομα γιατί Εντεροβακτηριακών εντερικού αποικισμού θα μπορούσε να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για CRC. Κατ ‘αρχάς, μεταγονιδιωματική αποθέματα του ανθρώπινου εντέρου microbiome έδειξε ότι

Salmonella

,

Citrobacter

, και

Cronobacter

ήταν μεταξύ των χαμηλών άφθονα εντερική είδη ή ήταν ακόμα εντελώς απούσα σε υγιή άτομα [15], [49], η οποία είναι σε πλήρη συμφωνία με το παθογόνο χαρακτήρα τους [50]. Αντίθετα, αυτή η βακτηριακή οικογένεια ήταν ανιχνεύσιμα παρούσα σε μη κακοήθεις δείγματα βλεννογόνου του κόλου από ασθενείς CRC [36], ενώ Shen και οι συνεργάτες του πρόσφατα έδειξε ότι

Shigella spp

εμφανίζεται αυξημένη αφθονία στην εγγενή (μη κακοήθη) microbiome του αδενώματος των ασθενών [51]. Είναι σημαντικό ότι, το δυναμικό των εντεροβακτήρια να κινήσει CRC έχει ήδη δειχθεί για

Citrobacter

ειδών σε ένα ζωικό μοντέλο [52], και πιστεύεται ότι αυτή η αυξημένη ευαισθησία για CRC προκαλείται από μία ασυμπτωματική, αλλά η χρόνια, φλεγμονώδης απόκριση στο βλεννογόνο του κόλου [53]. Επιπλέον, αρκετές Εντεροβακτηριακών στελέχη παράγουν DNA βλάπτει γενοτοξίνες [54] και μπορεί έτσι να συμβάλει ενεργά στη συσσώρευση μεταλλάξεων που χαρακτηρίζουν την ακολουθία αδένωμα-καρκινώματος [55]. Σε αυτό το πλαίσιο, τα δεδομένα μας μπορεί περαιτέρω να υποδεικνύουν ότι κατά την εξέλιξη της CRC, οι αλλαγές μικροπεριβάλλον του όγκου κατά τέτοιο τρόπο ώστε εντεροβακτήρια αντικαθίστανται από συμβιούντα συναφών ειδών ή βακτήρια με την προτεινόμενη προβιοτικές ιδιότητες που έχουν αυξημένη πρόσβαση και /ή μπορούν πιο αποτελεσματικά χορτονομής στη το τροποποιημένο μικροπεριβάλλον του όγκου. Η εξαφάνιση του CRC-οδήγηση παθογόνα βακτήρια από την προηγμένη ιστό του όγκου CRC μπορεί να είναι ανάλογο με αυτό που έχει αναφερθεί για

Helicobacter pylori

κατά τη διάρκεια του γαστρικού εξέλιξης του καρκίνου [56].

Συνολικά, η μελέτη μας παρέχει μια σημαντικά πρώτη γεύση από την CRC που σχετίζονται με microbiome και δείχνει μια πολύ δυναμική σχέση μεταξύ των εντερικών βακτηρίων και την ανάπτυξη όγκων. Παρ ‘όλα αυτά, πολλά ανοιχτά ερωτήματα πρέπει να εξεταστούν σε μελλοντικές μελέτες, συμπεριλαμβανομένης βαθιά ανάλυση microbiome της επεκτάθηκε ομάδων δείγματα όγκων από διαφορετικά στάδια της νόσου, συμπεριλαμβανομένων των αδενωμάτων και βιοψίες από ένα μεγάλο σύνολο των ασθενών με μη καρκίνο για να χρησιμεύσει ως βάση δεδομένων αναφοράς. Επιπλέον, για διαγνωστικούς σκοπούς, θα είναι σημαντικό να διερευνηθεί πώς οι τοπικές σχετίζονται με όγκους μετατοπίσεις microbiome αφορούν τη σύνθεση των κοπράνων microbiota [57]. Μια πιο λεπτομερής ανάλυση των CRC (μετα-) γονιδιώματα και βακτηριακή transcriptomes είναι απαραίτητη για να εντοπίσουμε τα γονίδια που προκαλούν απόκλιση αποικισμό στο μικροπεριβάλλον του όγκου και να καθοριστεί καλύτερα μικροβιακούς πληθυσμούς υψηλού κινδύνου. Στη συνέχεια, υψηλού κινδύνου και χαμηλού κινδύνου βακτηριακών πληθυσμών πρέπει να επικυρώνονται (ζωικά) μοντέλα για σποραδικές CRC, και οι μηχανισμοί της βακτηριακής παρεμβολής στο CRC πρέπει να κατέρρευσε με περισσότερες λεπτομέρειες. Όλα-σε-όλα, αυτό θέτει την ατζέντα για μια νέα συναρπαστική εποχή στην παχέος έρευνα για τον καρκίνο, την ενσωμάτωση της μικροβιολογίας και μικροβιακή οικολογία με τη βιολογία του όγκου. Αυτό θα μας οδηγήσει προς μια αυξημένη κατανόηση των κινητήριων δυνάμεων της CRC, καθώς και τα νέα διαγνωστικά εργαλεία microbiome σχετίζονται και θεραπευτικές παρεμβάσεις.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

RISA λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων από CRC ιστού και μη-κακοήθεις παρακείμενο βλεννογόνο. Η διαγονιδιακή περιοχή διαχωρισμού μεταξύ των γονιδίων 16S και 23S rRNA ενισχύθηκε με διατηρημένη ζεύγη εκκινητών (Πίνακας S1) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια Agilent Bioanalyser. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα 1? off, μη κακοήθη ιστό? σε, καρκινικό ιστό

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020447.s001

(PDF)

Εικόνα S2.

Μια

, Διαβάστε μήκη ανά δείγμα, με το Χ

off και Χ

σχετικά με προέρχονται από τα δείγματα εκτός του όγκου και του όγκου στο θέμα X, τα δεδομένα που προκύπτουν από τα μήκη ανάγνωσης μετα-επεξεργασία μέσω του pyropipeline ΠΑΑ.

B

, Rarefraction καμπύλες για κάθε δείγμα, το κλειδί δείγμα είναι το ίδιο όπως για το Σχήμα χρήση S1. Αυτές οι καμπύλες παρήχθησαν χρησιμοποιώντας MOTHUR, διακόπτει τιμές εμφανίζονται.