Αφηρημένο

τροποποίηση της ιστόνης παίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου, καθώς θεωρείται ως παγκόσμια επιγενετικών δεικτών, ειδικά σε γονίδια που σχετίζονται με όγκο. Ως εκ τούτου, χημικές προσεγγίσεις που στοχεύουν ένζυμα ιστονών τροποποιητικά έχουν προκύψει πάνω στην κεντρική σκηνή του την ανακάλυψη αντικαρκινικών φαρμάκων. Εδώ, ερευνήσαμε τις θεραπευτικές δυνατότητες και μηχανιστικές ρόλοι της που αναπτύχθηκαν πρόσφατα αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης, CG200745, σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα κύτταρο. Η θεραπεία με CG200745 αύξησε το παγκόσμιο επίπεδο ακετυλίωσης ιστόνης, με αποτέλεσμα την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. ChIP-on-chip ανάλυση με ένα αντίσωμα H4K16ac παρουσίασαν αλλοιωμένη H4K16 ακετυλίωση σε γονίδια κρίσιμης σημασίας για την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, αν και μειώθηκε κατά τη θέση έναρξης μεταγραφής ενός υποσυνόλου γονιδίων. Altered H4K16ac σχετίστηκε με τις αλλαγές στην έκφραση του mRNA των αντίστοιχων γονιδίων, τα οποία περαιτέρω επικυρωθεί σε ποσοτικές δοκιμασίες RT-PCR και κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι CG200745 προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης NSCLC κυττάρων μέσω της επιγενετικής τροποποίησης των κρίσιμων γονιδίων στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, παρέχοντας κεντρικό ενδείξεις ως μια πολλά υποσχόμενη χημειοθεραπευτικών κατά του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Chun SM, Lee JY, Choi J, Lee JH, Hwang JJ, Kim CS, et al. (2015) Επιγενετική Διαμόρφωση με HDAC αναστολέα CG200745 Προκαλεί Anti-διάδοση των πυρηνικών όπλων σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 10 (3): e0119379. doi: 10.1371 /journal.pone.0119379

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 22, Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 30 Ιανουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Chun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Υποστηριζόμενα επιχορηγήσεις για τη μελέτη ήταν η κορεατική Υγεία Τεχνολογία R & amp? D Έργου, Υπουργείο Υγείας & amp? Πρόνοιας, Δημοκρατία της Κορέας (HI06C0868, HI10C2014), οδηγώντας Εξωτερικών Research Institute Πρόσληψη Πρόγραμμα, Βασικές Ταμείου Προώθησης Έρευνας, και Βασική Επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

Επιγενετική τροποποιήσεις όπως CpG μεθυλίωση του DNA ή ακετυλίωση των ιστονών θεωρείται ως ένα σημαντικό βήμα για την ανάπτυξη του καρκίνου και επομένως έχουν μελετηθεί για να ανακαλύψετε βιοδείκτες του καρκίνου και τη θεραπευτική stratege [1-3]. Μόλις μεθυλίωση κυτοσίνης συμβαίνει σε CpG δινουκλεοτίδια μέσω της δράσης της τρανσφεράσης DNA μεθύλιο (DNMT), ο μεθυλ κυτοσίνη διατηρείται στην επόμενη γενεά λόγω της έλλειψης ενός DNA de-μεθυλ τρανσφεράσης σε θηλαστικά. Η μη αναστρέψιμη τροποποίηση των ιστονών έχει επίσης χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την έγκαιρη διάγνωση ή την πρόγνωση του καρκίνου, καθώς επίσης και μια αποτελεσματική στόχος σε θεραπευτικές του καρκίνου [4,5]. Η ακετυλίωση ή μεθυλίωση επί υπολειμμάτων λυσίνης των Η3 και Η4 αμινο τερματικό ουρές είναι κυρίαρχη τροποποιήσεις των ιστονών, και το καθένα είναι υπεύθυνο για την έκφραση των δεσμευμένων γονιδίων. Για παράδειγμα, οι μεθυλιώσεις σε λυσίνη 4 του Η3 και λυσίνης 27 του Η3 είναι γνωστή ως ενεργοποίησης μεταγραφής και την καταστολή εκδηλώσεις για δεσμευμένο ιστόνη γονίδια, αντίστοιχα. Η ακετυλίωση των ιστονών σε λυσίνη 16 του H4 σχετίζεται με μεταγραφική ενεργοποίηση ή /και την έναρξη αντιγραφής των αντίστοιχων γονιδίων. Σε φυσιολογικά κύτταρα, ακετυλίωση ιστονών ελέγχεται με ακρίβεια από ιστόνης ακετυλο τρανσφεράσης (ΗΑΤ) και αποακετυλασών των ιστονών (HDAC). Hyper-ακετυλίωση των ογκογονιδίων ή υπο-ακετυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, ωστόσο, παρατηρείται συχνά σε διάφορους καρκίνους. HDAC αναστολείς (HDACi) είναι οι πιο ανεπτυγμένες αντικαρκινικά φάρμακα στοχεύουν επιγενετική διαφοροποίηση και εφαρμόζονται για την θεραπεία διαφόρων καρκίνων, ιδιαίτερα σε στερεούς όγκους, όπως του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, και των ωοθηκών, καθώς επίσης και σε αιματολογικές όγκους , όπως λέμφωμα, λευχαιμία, και μυέλωμα [6-9]. Επιπλέον, επιγενετική διαταραχή στον καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται συχνά με την υπερέκφραση του HDAC1 και παρεκκλίνουσα μεθυλίωση ορισμένων γονιδίων, με αποτέλεσμα την θεραπευτική αποτελεσματικότητα του συνδυασμού θεραπείας επιγενετικών στόχευσης μεθυλίωσης του DNA και απακετυλίωση ιστόνης. HDACs περιλαμβάνουν τρεις κατηγορίες: Κατηγορία Ι, HDAC 1, 2, 3, και 8? Κατηγορία II, HDAC 4, 5, 6, 7, 9, και 10? και κατηγορίας III, HDAC 11 (sirtuins 1-7) [10,11]. HDACi, τριχοστατίνη Α (TSA) [12,13] ή vorinostat (SAHA) [14-16] αναστέλλουν τάξης Ι και II ένζυμα HDAC, με αποτέλεσμα την διακοπή της ανάπτυξης, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση, και αντι-αγγειογένεσης των καρκινικών κυττάρων, όταν χρησιμοποιείται ανεξάρτητα ή σε συνδυασμό με άλλους αντικαρκινικούς παράγοντες. Μηχανιστικά, η αποκατάσταση της σιγήσει ογκοκατασταλτικών γονιδίων ή καταστολή των ενεργοποιημένων ογκογονιδίων σε καρκινικά κύτταρα διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στις αντικαρκινικές επιδράσεις των φαρμάκων. Αυτό ακολουθείται από την επαγωγή της διακοπής κύκλου κυττάρου στο στάδιο G1 μέσω της έκφρασης των πρωτεϊνών ρ21 και ρ27, ή ένα G2 /M καθυστέρηση μετάβασης μέσω της μεταγραφικής μειορύθμιση της κυκλίνης Β1, PLK1, και survivin.

HDAC αναστολέα CG200745, (Ε) -Ν (1) – (3- (διμεθυλαμινο) προπυλο) -Ν (8) -υδροξυ-2 – ((ναφθαλεν-1-ακραίες προστατευτικές) μεθυλ) οκτ-2-ενοδιαμιδίου, έχει αναπτυχθεί πρόσφατα και προς το παρόν βρίσκονται σε στάδιο κλινικών δοκιμών. ανασταλτική δράση της επί της κυτταρικής ανάπτυξης έχει καταδειχθεί σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, και RKO κύτταρα (κύτταρα καρκινώματος κόλον) σε μονο- και συνδυαστικές-θεραπεία με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα [17-19]. Ο μηχανισμός βασίζεται η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του CG200745 σε RKO κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι απαντιέται σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο [19]. Είναι σημαντικό, CG200745 αυξημένη ακετυλίωση του p53 στα κατάλοιπα λυσίνης K320, K373, K382 και. CG200745 επάγεται επίσης τη συσσώρευση ρ53, που προωθείται ρ53-εξαρτώμενη διενεργοποίηση, και ενίσχυσε την έκφραση των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από τα γονίδια-στόχους της ρ53,

MDM2

και

p21

(WAF1 /Cip1) σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κύτταρα. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τις αντικαρκινικές επιδράσεις και να διερευνηθούν οι άμεσοι στόχοι της CG200745 σε μη μικρά κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) για να επαληθεύσετε πρόσθετη ένδειξη καρκίνου. Αναλύσαμε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και αλλαγμένο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης κατά την απακετυλίωση ιστόνης μέσω ChIP-on-chip δοκιμασία, σε πραγματικό χρόνο PCR ποσοτικοποίηση και κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο αναστολέας HDAC CG200745 προκαλεί επιγενετικές επανενεργοποίηση των κρίσιμων γονιδίων που καταστέλλονται μεταγραφικώς σε καρκίνους, και ως εκ τούτου μπορεί να είναι θεραπευτικός μια πολλά υποσχόμενη καρκίνος NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και κυτταρικές γραμμές

Οι αναστολείς HDAC (HDACi), σουμπεροϋλανιλίδιο hydroamic (vorinostat, SAHA) και CG200745, δόθηκαν από την Crystal Genomics Co. (Σεούλ, Δημ. Κορέα). Αυτές οι ενώσεις διαλύθηκαν σε DMSO και φυλάχθηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Ανθρώπινη μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυτταρικές σειρές και ένα αθανατοποιημένο κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων (Beas-2Β) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη με 5% CO

2 στους 37 ° C.

κηλίδωση Western

50μg εκχυλισμάτων ολικού κυττάρου έτρεξαν σε γέλες SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν και επωάστηκαν με ειδικά πρωτογενή αντισώματα εναντίον H4K16ac, CCND1, ρ21, και κασπάσης 3 (Cell Signaling, Beverly, ΜΑ), αντι-H4S1 /Κ5 /Κ8 /K12Ac από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA) και β- ακτίνη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Μετά την επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση κατάλληλη χρένο, ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ECL (Amersham-GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).

Real-time ποσοτική PCR

Σύνολο προετοιμασία RNA και cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), και SuperScript III Πρώτη Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη με τη χρήση ισχύος SYBR Green ΡΟΚ Master Mix (Applied Biosystems, Grand Island, Νέα Υόρκη) για το σύστημα IQ5 Πολύχρωμο Real-Time ανίχνευση (Bio-Rad) με κάθε ένα από τα εμπρός και να αντιστρέψει αλφαβητάρι για

CCNA2

,

CCNB1

,

CCND1

,

CCNE2

,

CDK2

,

Bax-a

,

bcl- 2

,

p16

,

p21

,

p27

, και

Mxi1

(Bionics, Σεούλ, Κορέα) (S1 πίνακα).

Η κυτταροτοξικότητα δοκιμασία

Το IC

50 κάθε HDACi σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα προσδιορίστηκε μέσω δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας CellTiter 96 AQ

ueous αντιδραστηρίου Λύση Ένα (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά διαφορετική χρονική περίοδο επώασης με HDACis, η απορρόφηση μετρήθηκε κατόπιν σε 490 nm για την Wallac 1420 Victor3 με λογισμικό προπόνηση 2.

FACS δοκιμασία

Η επίδραση της CG200745 επί NSCLC κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε για κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Μετά την επώαση με CG200745 ή DMSO, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Γονιδιωματικό DNA χρωματίστηκε με 30 μg /mL PI και ο φθορισμός μετρήθηκε με ένα μηχάνημα FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). Το κόκκινο φθορισμού λόγω της ΡΙ-χρώση DNA συλλέχθηκε στα 560 nm διχρωματικού κατόπτρου και ένα φίλτρο διέλευσης 600 nm (εύρος ζώνης, 35 μm). Ένα σύνολο 10,000 κυττάρων συλλέχθηκαν με FACS και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Cell Quest 3.1 λογισμικό (Becton Dickinson).

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας)

Οι προσδιορισμοί ChIP διεξήχθησαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα κατεργασμένα με 3 μΜ CG200745 ή DMSO για 24 ώρες κατακρημνίστηκαν με αντι-ακετυλο-H4K16 αντίσωμα (Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ). Μετά από διασύνδεση με 1% φορμαλδεΰδη, χρωματίνη ήταν κατακερματισμένο σε 300 ~ 800 bp μέγεθος με υπερήχους σε Bioruptor, UCD-200 (Diagenode, Denville. NJ). σύμπλοκα χρωματίνης /πρωτεΐνης καταβυθίστηκαν με μία τροποποιημένη ιστόνη ειδικό αντίσωμα και πρωτεΐνη Α /G συν ακινητοποιημένου σφαιρίδια αγαρόζης. Μετά την έκλουση από τα σφαιρίδια, καταβυθίστηκε με DNA πρωτεΐνες ήταν αντίστροφης σταυροειδείς δεσμούς, και το DNA καθαρίστηκε με κιτ καθαρισμού PCR (Qiagen, Valencia, CA)

πειράματα μικροσυστοιχιών για τα προϊόντα Τσιπ:. ChIP-on-chip πειράματα

δοκιμασία chIP-on-chip πραγματοποιήθηκε σε ένα Agilent 244k × 2 ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχιών όπως τις οδηγίες του κατασκευαστή (Agilent θηλαστικών chIP-on-chip πρωτόκολλο V.10). Εν συντομία, ο έλεγχος εισόδου για ολόκληρη την κυτταρικά εκχυλίσματα και τα καθαρισμένα προϊόντα τσιπς ενισχύθηκαν με απολίνωση μεσολάβηση PCR χρησιμοποιώντας ένα τεχνητό ολιγονουκλεοτιδικό συνδετήρα, μετά αμβλύνοντας το DNA άκρα χρησιμοποιώντας Τ4 DNA πολυμεράση. Στη συνέχεια, ενισχύεται εισόδου και το chip προϊόντα σημάνθηκαν με φθορίζουσα BioPrime ολικό γονιδιωματικό Labeling System (Invitrogen). Η ίδια ποσότητα DNA εισόδου και προϊόν τσιπ με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές αναμίχθηκαν με ανθρώπινο Cot-1 DNA (1 mg /mL), και υβριδοποιήθηκαν επί ενός Agilent 488K συστοιχία υποκινητή (δύο 244k συστοιχίες), που περιέχει ~ 17.000 των καθορισμένων ανθρώπινης μεταγραφές που καλύπτουν από -5.5 kb έως 2,5 kb της θέσης έναρξης της μεταγραφής (TSS). Υβριδοποιημένα εικόνες έγιναν ορατά με το σαρωτή μικροσυστοιχιών (Επανάσταση 4200?. Vidar Systems Cor, Herndon, VA)

Ανάλυση Δεδομένων και Οντολογιών ανάλυση

Χίστον ακετυλίωση των προϊόντων chip και εισόδου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το. ενότητα μάρκα της DNA Analytics (Agilent, έκδοση 4.0.81) με Tukey biweight κανονικοποίηση, Whitehead μοντέλο σφάλματος και Whitehead Per-Array μοντέλο Γειτονιά. Εν συντομία, η αναλογία log2 για κάθε γονίδιο προϊόντων CHIP και εισόδου υπολογίστηκε ο μέσος όρος των ανιχνευτών σε 1,000bp, θεωρώντας γονίδια με τιμή Ρ μικρότερη από 0,1 ως πολύτιμη. Προκειμένου να απεικονίζουν την κατάσταση H4K16ac από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS), η απόσταση για κάθε αισθητήρα απλοποιήθηκε ως εξής: περιοχή μεταξύ-1000 ~ -500 από το TSS ήταν αριθμημένα ως-2, -500 ~ TSS όπως-1, και TSS ~ + 500 ως +1, όπως η θέση TSS ορίζεται από-11-10.

Λειτουργική σχολιασμούς μέσω ποσοτικής RT-PCR και κηλίδωση Western ακολουθήθηκαν από την ανάλυση χρησιμοποιώντας το DAVID (βάση δεδομένων για το σχολιασμό, Οπτικοποίηση και Ολοκληρωμένη Discovery) πόρων βιοπληροφορικής και Gene οντολογίες (Μοριακή Λειτουργία, βιολογική διαδικασία, Cell Components) για μονοπάτια σηματοδότησης. Όλες οι κατηγορίες που αντιπροσωπεύουν λιγότερο από το 4% του συνολικού αριθμού των εφαρμοσμένων γονιδίων αποκλείστηκαν.

Αποτελέσματα

CG200745 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC

Για να προσδιορίσετε τα ανασταλτικά αποτελέσματα της CG200745 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μετρήθηκε η IC

50 CG200745 από τις ακόλουθες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα: Calu6, Η358, Η596, Α549, HOP62, HOP92, H226, Η460, Η522 και, καθώς επίσης κύτταρα Beas2B. IC

50 τιμές των CG200745 στα δοκιμάστηκαν καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα ήταν σε micromolar επίπεδα, και ήταν συγκρίσιμα με εκείνα που λαμβάνονται από το φάρμακο αναφοράς, SAHA (Πίνακας 1), υποδεικνύοντας μια σημαντική καταστολή της ανάπτυξης επίδραση της CG200745 σε διάφορες NSCLC κυτταρικές γραμμές. Μεταξύ αυτών, Α549, Calu6, HOP92 και Η522 κύτταρα ήταν η πιο ευαίσθητη με IC

50 & lt? 3 μΜ. Η επίδραση της CG200745 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Calu6 επιβεβαιώθηκε ως ο αριθμός των κυττάρων και η μορφολογία σε οπτικό μικροσκόπιο μετά από έκθεση σε 3 μΜ CG200745 σε διαφορετικές χρονικές περιόδους (Εικ. 1). κύτταρα Calu6 έδειξε κανονικό κύτταρο αυξάνεται μοτίβα σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο μέχρι 8 ώρες μετά την αγωγή του φαρμάκου. Ωστόσο, μετά από 8 ώρες επεξεργασίας CG200745, ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων Calu6 μειώθηκε, και θάνατο των κυττάρων με μορφολογικές αλλαγές σημειώθηκε. Η δυσμενής επίδραση των CG200745 στην κυτταρική ανάπτυξη Calu6 αναλύθηκε με διεξαγωγή δοκιμασίας ΜΤΤ με διάφορες συνθήκες, επιβεβαιώνοντας ότι το φάρμακο μείωσε το κυτταρικό πολλαπλασιασμό στο 40% των μη κατεργασμένων κυττάρων (Εικ. 1Α).

Η κύτταρα

Calu6 αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ CG200745 για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα για να αναλυθεί η επίδραση αντι-πολλαπλασιασμό των CG200745, και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο. (Β) Η ανάπτυξη των κυττάρων Calu6 σε πλάκες 96-φρεατίων αναλύθηκε μέσω ανάλυσης MTS κατά την επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις CG200745 (0 έως 10 μΜ) σε χρονική πορεία (0 έως 48 ώρες). Η στατιστική σημαντικότητα των αλλαγών στην βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας t-test (*** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001)

Η

θεραπεία CG200745 επάγει G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση σε κύτταρα Calu6

HDACi ενώσεις είναι γνωστό ότι επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, ένα σημαντικό μηχανισμό στόχο τον καρκίνο, σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. Για να εξεταστεί αν επάγεται CG200745 διακοπή κύκλου στην κυτταρική σειρά Calu6, αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυτό το μόριο HDACi για διάφορα χρονικά σημεία από 0 έως 24 ώρες, που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FACS). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η αύξηση του πληθυσμού G2 /M παρατηρήθηκε σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. CG200745-επεξεργασμένα κύτταρα Calu6 παρουσίασαν σημαντικά αυξημένη αναλογία κυττάρων σε G2 /M φάση (69%) σε σύγκριση με μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (26%) (Σχ. 2Β και 2C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CG200745 προκαλεί αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης μέσω της G2 /M φάση του κύκλου κυττάρου σύλληψης.

Κύτταρα

Calu6 αγωγή με 3 μΜ CG200745 αναλύθηκαν κυτταρικούς κύκλους επί κυτταρομετρητή ροής. Κάθε ιστόγραμμα αποτελείται από δύο μαύρες κορυφές και ένα γδαρμένο περιοχής υποδεικνύοντας G0 /G1 φάση, φάση G2 /M και S φάση, αντίστοιχα. Η επίδραση της CG200745 στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε σε για διάφορα χρονικά σημεία (Α), ή σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Β) απεικονίζει ως γραφική όψη (C).

Η

CG200745 προκαλεί αυξημένη ιστόνης ακετυλίωση

για να εξεταστούν τα ανασταλτικά αποτελέσματα HDAC του CG200745 σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, μπορούμε κατεργασμένα κύτταρα Calu6 με διαφορετικές συγκεντρώσεις και αναλύθηκαν CG200745 ακετυλίωση ιστονών με κηλίδωση Western, καθώς και ΗΑΤ και HDAC δραστικότητα σε διάφορα χρονικά σημεία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, χαμηλή συγκέντρωση της θεραπείας CG200745 αύξησε σημαντικά την ακετυλίωση της ιστόνης Η3 και Η4 σε διάφορες θέσεις, συμπεριλαμβανομένων Κ9 επί Η3, και Κ16 καθώς και S1 /Κ5 /Κ8 /Κ12 σε H4, σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο έως και 24 ώρες μετά την θεραπεία σε κηλίδωση Western ανάλυση. Για να επιβεβαιωθεί τα ανασταλτικά αποτελέσματα της CG200745 επί απακετυλίωση ιστόνης, μετρήσαμε ΗΑΤ και HDAC δραστικότητα σε πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων Calu6 πριν και μετά τη θεραπεία CG200745. Σε αντίθεση με την αμετάβλητη δραστικότητα ΗΑΤ μετά από θεραπεία CG200745 (Σχ. 3Β), δραστικότητα HDAC σε CG200745-επεξεργασμένα κύτταρα Calu6 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 3C), υποδεικνύοντας ότι CG200745 αυξημένο επίπεδο ακετυλίωσης ιστόνης οφείλεται στην αναστολή της δραστικότητας HDAC.

(Α) κατάσταση ακετυλίωσης των ιστονών αναλύθηκαν σε κηλίδωση Western των κυττάρων Calu6 σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις CG200745 (0 έως 10 μΜ) με αντι-H3K9ac, αντι-H4K16Ac, αντι-H4S1 /Κ5 /Κ8 /K12Ac ή /και αντι-ακετυλο H4 αντισώματα. (B, C) και ΗΑΤ HDAC δραστηριότητες στον έλεγχο και CG200745-επεξεργασμένα κύτταρα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας 50 μγρ του πυρηνικού εκχυλίσματος στο υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο.

Η

CG200745 προκαλεί αλλαγές τροποποίηση ιστόνης σε κύτταρα Calu6

H4K16ac είναι ένα πολύ γνωστό ενεργοποιητή της παγκόσμιας μεταγραφής γονιδίου. Για να διερευνήσουν κατά πόσο τα γονίδια που ρυθμίζουν την κυτταρική επιβίωση επηρεάστηκαν από την ακετυλίωση της ιστόνης που προκύπτουν από την επεξεργασία CG200745, πραγματοποιήσαμε ChIP-on-chip δοκιμασία χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα H4K16ac. Γονίδια συνδέεται προς H4K16ac ανοσοκαταβυθίστηκαν και αναλύθηκαν σε ολιγονουκλεοτίδιο μικροδιάταξη επικεντρώθηκε στην περιοχή υποκινητή. Ο κύριος σκοπός αυτού του πειράματος ήταν να προσδιορίσει πόσα και ποια γονίδια που σχετίζονται με την κατάσταση H4K16ac επηρεαστεί από τη θεραπεία CG200745. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, περισσότερα από 10.000 γονίδια συνδεδεμένο με H4K16ac ανιχνεύθηκαν τόσο ελέγχου-και CG200745-επεξεργασμένα κύτταρα, με τα επίπεδα έκφρασης χιλιάδων γονιδίων που δείχνει τις αλλαγές στην δοκιμασία H4K16ac ChIP-on-chip μετά τη θεραπεία CG200745.

στη συνέχεια εξετάστηκε ο τρόπος διεξαγωγής των H4K16ac αλλάζει ανάλογα με την απόσταση από το TSS με τεταγμένη μία μέση τιμή log τσιπ /εισόδου για όλες τις ανιχνευτές (Σχ. 4), στο οποίο ο άξονας Χ συμβολίζεται η απόσταση από η περιοχή TSS, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα. Η H4K16ac ήταν, παραδόξως, μειωμένη κατά την παρακείμενη περιοχή στην TSS, ειδικά στα 500 nt από το TSS, μετά τη θεραπεία CG200745, ενώ H4K16ac σε απομακρυσμένη περιοχή από TSS ήταν καμία διαφορά με αυτό, χωρίς θεραπεία κύτταρα ελέγχου, η οποία είναι κοινή λόγω της η λειτουργία μεταγραφικής ενεργοποίησης του H4K16 (Σχ. 4Α). Η μέση αναλογία log των δεδομένων /εισόδου ChIP κατέδειξε σαφώς ότι λιγότερα γονίδια με H4K16ac στα 500 nt από το TSS παρατηρήθηκαν σε κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, αν και ένα μεγάλο χώρο τροποποίηση για H4K16ac ήταν ακόμη εμφανής σε όλο τον TSS (Εικ. 4Β) . Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε επανειλημμένα πειράματα, υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία CG200745 καταστέλλει H4K16 ακετυλίωση σε 500 nt από το TSS πολλών γονιδίων.

H4K16 ακετυλίωση δίπλα στο TSS αξιολογήθηκε με τον υπολογισμό του μέσου όρου αναλογία δρομόμετρο /εισόδου κατά τη ίδια απόσταση από το TSS. Οι αριθμοί στον άξονα Χ δείχνουν την απόσταση από το TSS. άξονας Υ αντιπροσωπεύει τη μέση αναλογία δρομόμετρο /εισόδου. (Α) H4K16 κατάσταση ακετυλίωση των γονιδίων σε όλο TSS ήταν μεμονωμένα απεικονίζεται στο CG200745-επεξεργασμένο ή Calu6 κύτταρα. (Β) το επίπεδο της ακετυλίωσης H4K16 συγκρίθηκε μεταξύ CG200745 επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα σύμφωνα με την απόσταση από το TSS. Δύο ξεχωριστά πειράματα πραγματοποιήθηκαν για να υπολογιστεί η μπάρα σφάλματος για κάθε θέση.

Η

Συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών στην H4K16ac και γονιδιακή έκφραση εξής CG200745 θεραπεία

γονιδιακή έκφραση

H4K16ac επαγόμενη οδηγείται από την χαλάρωση χρωμοσωμικού DNA συνδέεται με τις πρωτεΐνες ιστόνης, έχοντας σαν αποτέλεσμα το άνοιγμα των τόπων DNA για διάφορους παράγοντες μεταγραφής. Σύμφωνα με ένα καθεστώς υπο-ακετυλιωμένη, ωστόσο, το θετικό φορτίο των υπολειμμάτων λυσίνης στο αμινοτελικό άκρο της ουράς ιστόνης δρα ως πηγή για σύνδεση με το αρνητικό φορτίο της ραχοκοκαλιάς φωσφορικού στο χρωμοσωμικό DNA υψηλή συγγένεια. Αυτή η ισχυρή σύνδεση επιτρέπει χρωματίνη για να σχηματίσει πιο συμπαγή δομές, με αποτέλεσμα την αναστολή της μεταγραφής του που σχετίζονται με τα γονίδια. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, τα επίπεδα H4K16ac χιλιάδων γονιδίων άλλαξαν μετά τη θεραπεία CG200745. Προκειμένου να επαληθεύσει την αντιστοιχία μεταξύ της κατάστασης H4K16ac και αντίστοιχη έκφραση των γονιδίων, τα επίπεδα mRNA εξετάστηκαν για γονίδια που υπέστη σημαντικές αλλαγές H4K16ac γύρω από την περιοχή TSS. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

σ

21,

GSN-b

, και

Mxi1

, η οποία έδειξε αυξημένη H4K16ac, ήταν όλα αυξημένα μετά από αγωγή CG200745 , ενώ άλλα γονίδια με μειωμένη H4K16ac, όπως

HOXD11

,

HOXD9

, και

mRNA έκφραση Pim1

, έδειξαν μειωμένη. Επιπλέον, η έκφραση του mRNA της

HAT1

, η οποία έδειξε παρόμοια επίπεδα H4K16ac με και χωρίς θεραπεία CG200745, δεν άλλαξε.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η συσχέτιση της έκφρασης του mRNA και οι αλλαγές στη H4K16ac μετά τη θεραπεία CG200745, η έκφραση του mRNA της

CCND1

και

αξιολογήθηκαν p21

γονίδια. Τα επίπεδα H4K16ac του

CCND1

και

p21

προαγωγέα περιοχή αναλύθηκαν σε αγωγή (έλεγχος) και CG200745-κατεργασμένα κύτταρα (ΒΚ5) Calu6 χρησιμοποιώντας έναν ολόκληρο μικροσυστοιχιών ανιχνευτή γονιδίου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, το επίπεδο H4K16ac σε

CCND1

και

p21

γονιδίων μετά από θεραπεία CG200745, ειδικά κοντά στη θέση του TSS, βρέθηκε να τροποποιηθεί σημαντικά (Σχ. 5Α) και να συσχετίζεται με την έκφραση του mRNA όταν ποσοτικά μετράται (Σχ. 5Β). Η έκφραση του

Mxi1

αυξήθηκε μετά από 24 ώρες επεξεργασία του CG200745 σε ημι ποσοτική ανάλυση με δύο διαφορετικά σετ εκκινητών (Εικ. 5C). Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του

κυκλίνη D1

και

p21

γονίδια δραματικά μειωμένες και αυξημένες, αντίστοιχα, όχι μόνο σε κύτταρα Calu6 αλλά επίσης και σε διάφορα άλλα κύτταρα NSCLC συμπεριλαμβανομένων Α549, Η358, Η596 και κυττάρων (Εικ. 6). Επιπλέον, η θεραπεία CG200745 είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της εγγενούς αποπτωτικών κασπάσης 3, σε κύτταρα Calu6 καθώς επίσης και σε διάφορα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων NSCLC Α549, Η358, Η596 και κυττάρων (Εικ. 6Α και 6Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης ορισμένων γονιδίων επηρεάστηκαν από αγωγή CG200745 μέσω του επιπέδου H4K16ac στην περιοχή TSS.

(Α) Τα επίπεδα του H4K16 ακετυλίωσης επί CCND1 και

ρ

21 γονίδια συμβολίζεται ανάλογα με την απόσταση από το TSS σε αγωγή (έλεγχος) και CG200745-κατεργασμένα κύτταρα (ΒΚ5). (Β) Τα επίπεδα mRNA του CCND1 και

σ

21 γονίδια ποσοτικά με πραγματικού χρόνου RT-PCR. (Γ) Η έκφραση του γονιδίου Mxi1 προσδιορίστηκε με RT-PCR σε Α549 και κύτταρα Calu6.

Η

Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε κηλίδωση Western με κυκλίνη D1, ρ21, κασπάση-3, c-myc, ακετυλο-Η4, Η3, και β-ακτίνη αντισώματα. Τα κυτταρολύματα Α549 αγωγή με φάρμακο, Calu6 (Α), και κύτταρα Η358 Η596 (Β) συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Συζήτηση

μόρια HDACi έχουν αναφερθεί επάγουν μία σειρά αντικαρκινικών επιδράσεων, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης των κυττάρων του όγκου, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση, γηρασμό, διαμόρφωση ανοσοαποκρίσεων, και αλλαγμένη αγγειογένεση [20]. Επιπλέον, η χρήση των HDACi έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την ευαισθησία των κυτταρικών σειρών NSCLC στο gefitinib ή erlotinib [21,22]. CG200745, (Ε) -Ν (1) – (3- (διμεθυλαμινο) προπυλο) -Ν (8) -υδροξυ-2 – ((ναφθαλεν-1-ακραίες προστατευτικές) μεθυλ) οκτ-2-ενοδιαμιδίου, είναι ένα πρόσφατα αναπτύχθηκε HDACi , προς το παρόν βρίσκονται σε στάδιο κλινικών δοκιμών. ανασταλτική δράση της επί της κυτταρικής ανάπτυξης έχει καταδειχθεί σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, και RKO κύτταρα (κύτταρα καρκινώματος κόλον) σε μονο- και συνδυαστικές-θεραπεία με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα [17-19]. Αυτό το φάρμακο σε συνδυασμό με δοκεταξέλη επαγόμενη υποχώρηση του όγκου σε DU145 καρκίνου του προστάτη ξενομοσχεύματος κυττάρου μέσω ενεργοποίησης απόπτωσης. Επίσης, προκάλεσε κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα καρκινώματος κόλου που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 με ακετυλίωση της ρ53. Στην παρούσα μελέτη μας, ερευνήσαμε τις αντικαρκινικές επιδράσεις του HDACi στα κύτταρα NSCLC σε δυνητικά επεκτείνει κλινική εφαρμογή της με γενικές ενδείξεις όγκου. Εμείς προορίζονται περαιτέρω για τη διαλεύκανση του υποκείμενου μηχανισμού του νέου αναστολέα HDAC που είναι τώρα σε κλινικές δοκιμές για τη λευχαιμία και συμπαγής όγκος, με την οποία θα μπορούσε να επιτευχθεί ορθή κλινική εφαρμογή, όπως συν-θεραπεία ή /και επικουρική θεραπεία με στοχευμένες χημειοθεραπευτικά. θεραπεία HDACi προκάλεσε την αναστολή της ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα, διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων σε G2 /M φάση, και την απόπτωση αποδεικνύεται από κασπάσης 3 διάσπασης σε συγκρίσιμη IC

50 συγκεντρώσεις με εκείνη του SAHA (επίσης γνωστή ως Vorinostat), το μόνο HDACi σήμερα έχει εγκριθεί για την κλινική θεραπεία του δερματικού λεμφώματος Τ-κυττάρων [23-25]. Παρά το γεγονός ότι H4K16 ακετυλίωση εξακολουθούν να συμβεί σε μεγάλο βαθμό σε περιοχές υποκινητή, κατά τρόπο ενδιαφέροντα, CG200745 μειώθηκε συγκεκριμένα ακετυλίωση των ιστονών H4K16 στα 500 νουκλεοτίδια από το TSS, όπως φαίνεται από την επανάληψη CHIP-on ανάλυση chip. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι HDAC αναστολέας μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης περιλαμβάνει τη μεταγραφική ρύθμιση πολλαπλών γονιδίων. Σε βάθος ανάλυση των γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, όπως

CCND1

,

p21

, και

Mxi1

, έδειξε ότι CG200745 αποτελέσματα της θεραπείας στο μεταγραφικό αλλαγές στα γονίδια αυτά .

Mxi1

, ένας ανταγωνιστής του ο

c-Myc

ογκογονίδιο, κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που ορίζεται ΜΑϋ2, το οποίο είναι ένας παράγοντας μεταγραφής στο Myc-Max-Mad δίκτυο. Το Mad /MXI ετεροδιμερές προβλέπεται να ανταγωνίζεται Myc λειτουργία με την κατάργηση Μέγιστη διαθέσιμη για myc μεταγραφική δραστηριότητα. Ο παράγοντας μεταγραφής c-Myc υπερεκφράζεται σε πολλούς ανθρώπινους όγκους, και η ενεργοποίηση του απαιτεί ετεροδιμερισμό με το συνεργάτη Max. C-myc ρυθμίζεται μέσω ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος [26,27]. Στην πραγματικότητα, η αναστολή της Myc /Max δέσιμο με μικρά μόρια έχει ταυτοποιηθεί ως ένα ιδιαίτερα υποσχόμενο στόχο για την θεραπεία του καρκίνου [28]. Mxi1 σχετίζονται πολλαπλασιασμός προκαλείται μέσω IGFBP-3 σηματοδότηση [18], και η αυξημένη έκφραση FOXO3a ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση των μελών της Mad /MXI μονοπάτι [29]. Προς τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση του Mxi1 με κατεργασία CG200745 μπορεί συνεπώς να παίζει ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω της Myc-Max-Mad δίκτυο.

Το SAHA HDACi, έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν τα επίπεδα έκφρασης του Erk1 /2 και ΜΜΡ-9, την αύξηση των επιπέδων έκφρασης του p53, το οποίο με τη σειρά του μεταβάλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, και να προωθήσει την ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 σε κύτταρα καρκινώματος ωοθήκης [30]. Επιπλέον, μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι SAHA ενεργοποιεί ρ53, αλλά δεν απαιτεί p53 για αντικαρκινικές επιδράσεις του. Η ίδια μελέτη έδειξε ότι entinostat επαγόμενη κυτταροτοξικά αποτελέσματα εξαρτώνται εν μέρει από ρ53, που δείχνει ότι διαφορετικές ενώσεις HDACi έχουν διαφορετικές απαιτήσεις για το ρ53 [31]. Ο μηχανισμός βασίζεται η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του CG200745 σε RKO κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι απαντιέται σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο [19]. Στην εν λόγω μελέτη, CG200745 αυξημένη ακετυλίωση του p53 στα κατάλοιπα λυσίνης K320, K373, K382 και. CG200745 επάγεται επίσης τη συσσώρευση ρ53, που προωθείται ρ53-εξαρτώμενη διενεργοποίηση, και ενίσχυσε την έκφραση των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από τα γονίδια-στόχους της ρ53,

MDM2

και

p21

(WAF1 /Cip1) σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κύτταρα. Οι επιδράσεις κατά του όγκου του CG200745 σε κύτταρα NSCLC, ωστόσο, βρέθηκαν στη σημερινή μας αναλύσεις να είναι ανεξάρτητη από την κατάσταση μετάλλαξης των γονιδίων που κωδικοποιούν ρ53. Τα κύτταρα NSCLC που χρησιμοποιήσαμε, συμπεριλαμβανομένων ρ53 άγριου τύπου και null /μεταλλαγμένα κύτταρα, παρουσίασαν αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης κατά την κατεργασία με ένα HDACi, υποδεικνύοντας ότι CG200745 ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη με διαφορετικούς μηχανισμούς ανάλογα με το πλαίσιο του κυττάρου.

Συμπερασματικά, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης μας επεκτείνει την γενική εφαρμοσιμότητα της CG200745 στη θεραπεία του NSCLC, για το οποίο είναι μια πολλά υποσχόμενη νέα HDACi. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι οι επιπτώσεις αυτής της HDACi μπορεί να συμβεί μέσω μιας ρ53-ανεξάρτητο μηχανισμό. Επιπλέον, τα στοιχεία δείχνουν ότι HDACi μπορεί να καταστείλει την c-myc σηματοδοτικό μονοπάτι μέσω της επαγωγής του

Mxi1

, αλλά αυτό το εύρημα απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Τέλος, η δυνατότητα των CG200745 να ενισχύσει την ικανότητα των αντικαρκινικών φαρμάκων ως μέρος μιας θεραπείας συνδυασμού, πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 πίνακα. Αλληλουχίες εκκινητή για την ποσοτική αντίδραση RT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0119379.s001

(DOCX)

Ευχαριστίες

Υποστηριζόμενα επιχορηγήσεις για τη μελέτη ήταν η κορεατική υγεία Τεχνολογία R & amp? D Έργου, Υπουργείο υγείας & amp? Πρόνοιας, Δημοκρατία της Κορέας (HI06C0868, HI10C2014), οδηγώντας Εξωτερικών Research Institute Πρόσληψη Πρόγραμμα, Βασικές Ταμείου Προώθησης Έρευνας, και Βασική Επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192).