Αφηρημένο

Ιστορικό

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης -συνδεδεμένης φουκοσυλίωσης με την ανάπτυξη του καρκίνου του ήπατος και προσδιόρισε πολλές από τις πρωτεΐνες που περιέχουν τις αλλαγμένες γλυκάνης δομές. Μία τέτοια πρωτεΐνη είναι άλφα-1-αντιθρυψίνης (Α1ΑΤ). Για την προώθηση αυτών των μελετών, πραγματοποιήσαμε Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη ανάλυση σχετικά με τις πέντε κύριες ισομορφές της Α1ΑΤ και ολοκλήρωσε μια ολοκληρωμένη μελέτη της γλυκοζυλίωσης των A1AT βρέθηκαν σε υγιείς μάρτυρες, οι ασθενείς με ηπατίτιδα C-(HCV) που προκαλείται από κίρρωση του ήπατος, και σε ασθενείς που έχουν μολυνθεί με HCV με τη διάγνωση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Οι ασθενείς με κίρρωση του ήπατος και καρκίνο του ήπατος είχε αυξημένα επίπεδα των διακλαδώσεων που περιέχουν γλυκάνης-εξωτερικό μέρος του βραχίονα (α-1, 3) φουκοσυλίωσης. Αυξήσεις σε πυρήνα (α-1,6) φουκοσυλίωσης παρατηρήθηκαν μόνο σε Α1ΑΤ από ασθενείς με καρκίνο. Πραγματοποιήσαμε μια λεκτίνη φθοροφόρου-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία χρησιμοποιώντας το

Aleuria aurantia

λεκτίνη (AAL), ειδικά για πυρήνα και εξωτερικό φουκοσυλίωσης χέρι σε πάνω από 400 ασθενείς με ηπατική νόσο. AAL-αντιδρώσα Α1ΑΤ ήταν σε θέση να ανιχνεύσει HCC με ευαισθησία 70% και ειδικότητα 86%, η οποία ήταν μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε με την τρέχουσα δείκτη του HCC, α-εμβρυϊκή πρωτεΐνη. ανάλυση γλυκοζυλίωσης των ψευδώς θετικών έγινε? αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς αυτοί είχαν αυξήσεις στα εξωτερικά φουκοσυλίωσης χέρι, αλλά όχι σε πυρήνα φουκοσυλίωσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο πυρήνας φουκοσυλίωσης είναι ο καρκίνος συγκεκριμένο.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η έκθεση περιγράφει λεπτομερώς τη σταδιακή μεταβολή της γλυκοζυλίωσης των A1AT με την εξέλιξη από κίρρωση του ήπατος με τον καρκίνο και προσδιορίζει πυρήνα φουκοσυλίωσης σε A1AT ως ειδική τροποποίηση HCC

Παράθεση:. Comunale MA, Rodemich-Betesh L, Hafner J, Wang Μ, το Norton P, Di Bisceglie AM, et al. (2010) Σύνδεση Ειδικές φουκοσυλίωσης της Alpha-1-αντιθρυψίνης σε κίρρωση του ήπατος και Καρκινοπαθών: Συνέπειες για μια βιοδεικτών ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. PLoS ONE 5 (8): e12419. doi: 10.1371 /journal.pone.0012419

Επιμέλεια: Wang-Shick Ryu, Πανεπιστήμιο Yonsei, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 15 του Ιούνη του 2010? Αποδεκτές: 22 Ιουλίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 25 Αυγούστου του 2010

Copyright: © 2010 Comunale et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση R01 CA120206-01 από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI), να χορηγούν UO1 CA084951-06 από την Πρώιμη Δίκτυο NCI Έρευνα ανίχνευσης (EDRN), το Ίδρυμα της ηπατίτιδας Β, και μια πίστωση από την Κοινοπολιτεία της Πενσυλβάνια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μόλυνση με τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV) ή ιό της ηπατίτιδας C (HCV) είναι η κύρια αιτιολογία του καρκίνου στο ήπαρ (HCC) [1] – [4]. Τόσο HBV και HCV αίτιο λοιμώξεων οξείας και χρόνιας ηπατικής, και τα περισσότερα χρονίως μολυσμένα άτομα παραμένουν ασυμπτωματικά για πολλά χρόνια [5]. Περίπου το 10% έως 40% όλων των χρόνιων φορέων HBV τελικά αναπτύσσουν καρκίνο του ήπατος, και εκτιμάται ότι πάνω από ένα εκατομμύριο άνθρωποι σε όλο τον κόσμο πεθαίνουν εξαιτίας του ΗΒν και HCV που σχετίζεται καρκίνο του ήπατος [2], [6], [7]. Πράγματι, HBV και HCV λοιμώξεων που συνδέονται με πάνω από το 80% όλων των περιπτώσεων HCC σε όλο τον κόσμο και μπορεί να είναι τόσο υψηλή όσο 96% σε περιοχές όπου είναι ενδημική HBV [3].

Η εξέλιξη της ηπατικής νόσου σε καρκίνο του ήπατος κυρίως παρακολουθείται από τα επίπεδα της ογκοεμβρυϊκά γλυκοπρωτεΐνη, α-εμβρυϊκής πρωτεΐνης (AFP), ή τον πυρήνα φουκοζυλιωμένη γλυκομορφή του AFP, AFP-L3 ορό. AFP μπορούν, όμως, να παράγεται σε πολλές περιπτώσεις, και σε σχέση με άλλες ηπατικές νόσους [8] – [10] και δεν είναι παρούσα σε όλους εκείνους με HCC [11]. Ως εκ τούτου, η χρήση των AFP ως κύρια οθόνη για την HCC έχει αμφισβητηθεί [12], και οι πιο ευαίσθητοι βιοδείκτες ορό για HCC χρειάζεται.

Η γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών είναι συγκεκριμένο κελί. Η Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση μιας πρωτεΐνης αντανακλά τροποποιήσεις που συνέβησαν στο κύτταρο από το οποίο προήλθε [13]. Η γλυκοζυλίωση της ίδιας πρωτεΐνης που εκκρίνεται από νοσούντα ιστό, κακοήθη κύτταρα ή φυσιολογικά κύτταρα μπορεί, και συχνά διαφέρουν [14]. Εμείς, και άλλοι, έχουν παρατηρηθεί μεταβολές σε Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση με την ανάπτυξη της κίρρωσης και HCC [15] – [19]. Συγκεκριμένα, το ποσό του πυρήνα φουκοζυλιωμένη Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη που προέρχεται από το σύνολο των παρασκευασμάτων πρωτεΐνη που απομονώνεται από τον ορό ατόμων με χρόνια μόλυνση από HCV και από εκείνους με διάγνωση HCC ήταν σταθερά μεγαλύτερη από ότι σε υγιείς ασθενείς ή σε αυτούς με HCV και «ανενεργή «ασθένεια [19].

Χρησιμοποιώντας φουκόζη ειδικών λεκτινών για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών που γίνονται φουκοζυλιωμένη σε ασθενείς με ηπατική νόσο, προσδιορίσαμε περισσότερα από 100 γλυκοπρωτεΐνες από ασθενείς με HCC και /ή κίρρωση που περιείχε αυξημένη φουκοσυλίωσης [19 ]. Μία από αυτές τις πρωτεΐνες ήταν άλφα-1-αντιθρυψίνης (Α1ΑΤ). Αναλύσαμε το Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση των πέντε κύριες ισομορφές του Α1ΑΤ και ανακάλυψε, εκτός από την αύξηση των επιπέδων του πυρήνα φουκοσυλίωσης, σημαντικές αυξήσεις στην εξωτερική φουκοσυλίωσης βραχίονα με την ανάπτυξη του καρκίνου του ήπατος. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία λεκτίνη-που βασίζεται, μετρήσαμε την αλλαγή αυτή σε πάνω από 400 ασθενείς με ηπατική νόσο και βρέθηκε AAL αντιδραστικά A1AT θα μπορούσε να ανιχνεύσει HCC με ευαισθησία 70% και ειδικότητα 86% με τη χρήση ενός cut-off 5 σχετικές μονάδες. Γλυκάνης ανάλυση των ψευδώς θετικών προσδιορίζονται φουκοσυλίωσης εξωτερικό βραχίονα ως η αιτία της ψευδούς θετικότητας. Σε αντίθεση, οι αυξήσεις των πυρήνας φουκοσυλίωσης βρέθηκαν μόνο σε ασθενείς με καρκίνο. Οι λόγοι γι ‘αυτή την αλλαγή και την κλινική χρησιμότητα αυτής της αλλαγής που συζητήθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Τόσο το Drexel University College of Medicine και το πανεπιστήμιο του Saint Louis Institutional Review Boards ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης, η οποία ήταν σύμφωνη με τις προδιαγραφές που καθορίζονται από τη Διακήρυξη του 1975. Ελσίνκι γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε συμμετέχοντα.

ασθενείς

τα δείγματα ορού ελήφθησαν από το saint Louis University School of Medicine (saint Louis, ΜΟ). Δημογραφικές και κλινικές πληροφορίες, μαζί με ένα δείγμα αίματος συλλέχθηκε από κάθε συμμετέχοντα σε ένα σωλήνα διαχωρισμού ορού. Το δείγμα περιστράφηκε μέσα σε 2 ώρες, και ο ορός αποθηκεύθηκε στους -80 ° C μέχρι τη δοκιμή. Οι ασθενείς εντάχθηκαν στο πανεπιστήμιο του Saint Louis ήπατος Καρκίνος Κλινική και HCC διαγνώστηκαν με τα ίδια κριτήρια που καθορίζονται για τη δίκη ΣΤΑΜΑΤΗΣΕΙ-C [20]. Οι συμμετέχοντες είχαν HCC προσδιορίζονται από βιοψία, από ένα νέο ηπατικής βλάβης που δείχνει αγγειακή βελτίωση σε μία μέθοδο απεικόνισης (υπέρηχος [των ΗΠΑ], η μαγνητική τομογραφία [MRI] ή αξονική τομογραφία [CT]) με τα επίπεδα AFP & gt? 1000 ng /ml, ή από τεκμαίρεται HCC. Οι συμμετέχοντες θεωρείται ότι έχει HCC αν είχαν ένα διακριτό ηπατική βλάβη επί των ΗΠΑ με τα επίπεδα AFP & lt? 1,000 ng /ml και είτε δύο άλλες σαρώσεις (MRI, CT, αγγειογραφία) υποδεικνύοντας κακοήθεια με τουλάχιστον ένα από τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: αγγείωση, η αρτηριακή με πυλαία φλέβα διακλαδώσεις, θρόμβωση της πυλαίας φλέβας κοντά στο ελάττωμα, όγκου στην πυλαία φλέβα, ή ένα άλλο σάρωσης (MRI ή CT) εμφανίζει τις λειτουργίες χαρακτηριστικό του HCC και είτε μια αύξηση στο μέγεθος πάροδο του χρόνου μετά την αρχική ανακάλυψη (τουλάχιστον διπλάσιο αν είναι λιγότερο από ό, τι 1 cm) ή η αύξηση του επιπέδου του AFP στο & gt? 200 ng /ml. Όγκου στάσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τις Ηνωμένες Δίκτυο των οργάνων Sharing-τροποποιημένα (UNOS) σύστημα TNM στάσης για HCC. Για την ομάδα κίρρωση του ήπατος, ασθενείς με ηπατίτιδα C και βιοψία κίρρωση είχαν εγγραφεί. Όλα τα κίρρωση έλεγχοι ελέγχθηκαν για HCC χρησιμοποιώντας US, CT, ή MRI πριν από την εγγραφή. Οι ασθενείς οι οποίοι ήταν HBsAg + (με ή χωρίς HBV DNA είχαν ταξινομηθεί στην ομάδα του HBV. Ομοίως, οι ασθενείς οι οποίοι ήταν HCV RNA θετικοί, χωρίς ενδείξεις κίρρωσης, ταξινομήθηκαν στην ομάδα HCV. Ασθενείς με άλλα μη ιογενή νόσο του ήπατος, αλλά χωρίς κίρρωση ήταν ταξινομηθεί σε άλλη ομάδα ηπατική νόσο (OLD). Έλεγχος ασθενείς ήταν υγιείς ασθενείς οι οποίοι προσλαμβάνονται από τη μελέτη για να ενεργεί ως μάρτυρες.

Δύο διαστάσεων (2-D) Gel Ηλεκτροφόρηση

Ένα σύνολο 7 μΙ ορού αραιώθηκαν σε 330 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος διαλυτοποίησης που περιέχει 7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% CHAPS, 65 mM DTT, 5 mM τριβουτυλοφωσφίνη, και ένα μίγμα 0,4% του αμφολυτών φορέα (Servalyt ρΗ 2-4, ρΗ 3 -10, ρΗ 9-1, 1:02:01). τα δείγματα στροβιλίζονται περιοδικά για 1 ώρα και εφαρμόζεται σε μια 18-cm ρΗ 3-7 NL ακινητοποιημένη διαβάθμιση ρΗ (IPG) λωρίδα (Amersham, Piscataway, NJ, USA) . επανυδάτωση gel διεξήχθη για 14 ώρες σε 50 V και εστιασμένη χρησιμοποιώντας τη συσκευή IPGPhor (Amersham) ισοηλεκτρική εστίαση. Μετά την εστίαση, οι λωρίδες γέλης μειώθηκαν για πρώτη φορά μετά αλκυλιώνεται σε 6Μ ουρία, 2% SDS, 30% γλυκερόλη, 50 mM Tris, ρΗ 6.8, και είτε 30 mM DTT ή 75 mM ιωδοακεταμίδιο για 10 λεπτά η κάθε μία. Η δεύτερη διάσταση επιλύθηκε με ένα τζελ 8% έως 18% ακρυλαμίδιο-0,8% κλίση PDA σε Protean II xi κυττάρων (Biorad Laboratories Αρχηγείου, Hercules, CA, USA) με τις συνθήκες λειτουργίας ορίζεται σε 20 mA /τζελ για 20 λεπτά και 40 mA /πηκτή για 4 ώρες. Τα πηκτώματα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με κολλοειδές Coomassie. Τζελ απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το Infrared System Οδύσσεια απεικόνισης (Li-Cor Biosystems, Λίνκολν, Νεμπράσκα) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης γέλης μη γραμμική δυναμική Progenesis Workstation (μη γραμμικές Durham, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Matrix-Assisted Laser Απορρόφησης /Ιονισμού-Time of Flight (MALDI-TOF) Φασματομετρία μάζας

κηλίδες πρωτεΐνης αποκόπηκαν από πηκτώματα χρωματίστηκαν κολλοειδές Coomassie blue, αποχρωματίστηκε, και υποβλήθηκε σε πέψη με θρυψίνη. Τα ανακτημένα πεπτίδια συμπυκνώθηκαν και αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας ZipTip C18 (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και προετοιμάζονται για φασματομετρία μάζας MALDI-TOF με ανάμιξη 0,5 ml του μίγματος πεπτιδίων με 0,5 mL 10 mg /mL α-κυανο- 4-υδροξυκινναμωμικού οξέως και 1% μυρμηκικό οξύ σε 50% ακετονιτρίλιο και αφήνοντας το να στεγνώσει σταγονιδίων στο MALDI πλάκα. Peptide χάρτες μάζας λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Voyager-DE Pro Φασματόμετρο Μάζας (Applied Biosystems, Life Biotechnologies, Carlsbad, CA) λειτουργήθηκε σε κατάσταση θετικού ιόντος ανακλαστήρα. Πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από τους χάρτες μάζα πεπτίδιο χρησιμοποιώντας την ηλεκτρονική βάση δεδομένων ΜΑΣΚΩΤ (www.matrixscience.com) για να αναζητήσετε το μη περιττό βάση δεδομένων πρωτεϊνών.

γλυκάνης Ανάλυση

Οι κηλίδες τζελ 2DE αποκόπηκαν και αποχρωματίζονται με χρήση 40% μεθανόλη 7% οξικό οξύ. Τα βύσματα γέλη αφυδατώθηκαν με ακετονιτρίλιο, το ακετονιτρίλιο απομακρύνθηκε και 25mM DTT αφέθηκε να απορροφηθεί μέσα στο βύσμα. Το βύσμα θερμάνθηκε στους 100 ° C για 5 λεπτά, αφήνεται να ψυχθεί, και αλκυλιώνεται στο σκοτάδι για 30 λεπτά με 75 mM ιωδοακεταμίδιο. Τα βύσματα γέλη πλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο επαναλήψεις ακετονιτριλίου αφυδάτωση και 20 mM διττανθρακικού αμμωνίου επανυδάτωση. Μετά από μία τελική αφυδάτωση, τα βύσματα γέλη ξηράθηκαν σε Speed ​​Vac. Peptide:N-γλυκοσιδάση F (PNGase F) αραιώθηκε με 20 mM διττανθρακικού αμμωνίου ρΗ 7 και αφέθηκε να προσροφηθεί στο βύσμα γέλης. Το βύσμα πηκτή στη συνέχεια καλύπτονται με το ίδιο διάλυμα και αφέθηκαν να επωαστούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Οι γλυκάνες εκλούστηκαν από το βύσμα γέλης με υπερήχους σε Milli-Q νερό τρεις φορές? ο έκλουσης συνενώθηκε, ξηράνθηκε κάτω, και επισημασμένο με χρωστική 2ab (Ludger, Oxford, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι γλυκάνες συνέχεια καθαρίζονται χρησιμοποιώντας χρωματογραφία χάρτου και διηθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο σύριγγας 0,22-μm. Σημασμένα με φθορισμό γλυκάνες στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη χρήση της υψηλής απόδοσης σύστημα υγρής χρωματογραφίας Waters Alliance με ένα κανονικό στήλη φάσης (TSK αμίδιο 80 στήλες) συμπληρώνεται με έναν ανιχνευτή φθορισμού Waters και ποσοτικοποιείται με τη χρήση του Millennium Chromatography Manager (Waters Corporation, Milford, ΜΑ). Η κινητή φάση αποτελείται από διαλύτη Α (50 mM μυρμηκικό αμμώνιο, ρΗ 4.4) και διαλύτη Β (ακετονιτρίλιο). Η βαθμίδα που χρησιμοποιήθηκε ήταν ως ακολούθως: γραμμική κλίση από 20% έως 58% διαλύτης Α σε 0,4 κ.εκ. /λεπτό για 152 λεπτά που ακολουθείται από μια γραμμική κλίση από 58% έως 100% διαλύτης Α για τα επόμενα 3 λεπτά. Ο ρυθμός ροής αυξήθηκε σε 1,0 mL /λεπτό? Η στήλη πλύθηκε σε 100% Α διαλύτη για 5 λεπτά. Μετά το στάδιο πλύσης, η στήλη εξισορροπήθηκε σε 20% Α διαλύτη για 22 min σε προετοιμασία για το επόμενο δείγμα. Glycan δομές ταυτοποιήθηκαν με τον υπολογισμό της αξίας πρόσληψη γλυκόζης και εξωγλυκοσιδάσης πέψη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

λεκτίνη φθοροφόρο συνδέεται Δοκιμασία ανοσοαπορρόφησης (Flisa)

Το αντίσωμα σύλληψης (αντιανθρώπινη Α1ΑΤ ποντίκι , Abd Serotec, Raleigh NC, USA), επωάστηκε με 10 mM υπεριωδικό νάτριο για 1 ώρα στους 4 ° C. Ο χειρισμός αυτός εγγυάται η λεκτίνη δεν είναι σε θέση να αντιδράσει με τη γλυκοζυλίωση του αντισώματος και δεν επηρεάζει σύνδεσης υποστρώματος του αντισώματος. Προστέθηκε ίσος όγκος αιθυλενογλυκόλη, και το οξειδωμένο αντίσωμα φέρεται σε συγκέντρωση 10 μg /mL με ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού νατρίου, ρΗ 9.5. Αντίσωμα (5 μg /φρεάτιο) προστέθηκε στην πλάκα και, μετά από επώαση, πλύθηκε με 0,1% φωσφορικό Tween 20 mM ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα ρΗ 7.4. Η πλάκα μπλοκαρίστηκε όλη τη νύκτα με 3% αλβουμίνη βόειου ορού /φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα. Για την ανάλυση, 5 μΙ ορού αραιώθηκαν σε 95 μΙ αντιδραστήριο δέσμευσης σε Ετεροφυλικά Blocking Σωλήνες

ΤΜ (Scantibodies Laboratory, Santee Inc., CA, USA) και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα δείγματα προστέθηκαν στις πλάκες για 2 ώρες και πλένονται 5 φορές σε ρυθμιστικό επώασης λεκτίνη (10 mM Tris ρΗ 8,0, 0,15Μ NaCl, 0,1% Tween 20). Φουκοσυλιωμένες A1AT ανιχνεύθηκε με βιοτίνη συζευγμένο

Aleuria aurantia

λεκτίνη (AAL) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Η δεσμευμένη λεκτίνη ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας IRDye 800 συζευγμένη στρεπταβιδίνη? η ένταση του σήματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης Οδύσσεια (LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska). Σε όλες τις περιπτώσεις, οι εντάσεις σήματος συγκρίθηκαν με εκείνες των σημάτων που ανιχνεύονται με εμπορικώς αγοράστηκε ανθρώπινο ορό (Sigma Chemicals). Η λεκτίνη Flisa ανιχνεύει την ποσότητα φουκοσυλίωσης παρούσης σε ίση ποσότητα μορίων συλλαμβάνονται από κάθε δείγμα ασθενούς και γίνεται κατά τρόπο ανεξάρτητο από την συνολική ποσότητα της πρωτεΐνης σε κάθε συγκεκριμένο ασθενή.

Στατιστική Ανάλυση

οι περιγραφικές στατιστικές για σταδιακή ασθενών συγκρίθηκαν με διασπορά οικόπεδα που περιλάμβανε τις ακραίες τιμές. Όλες οι τιμές αναφέρονται ως μέσες τιμές συν ή μείον το τυπικό σφάλμα, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Επειδή τα δεδομένα δεν ακολούθησαν τυπική κατανομή Gauss, ένα nonparametrical δοκιμή (two-tailed, 95% εμπιστοσύνη, Mann-Whitney test) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί στατιστική διαφορά μεταξύ των ομάδων. Για να προσδιοριστεί η βέλτιστη τιμή αποκοπής για κάθε δείκτη, ο δέκτης λειτουργεί χαρακτηριστικές καμπύλες κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας όλες τις πιθανές αποκοπές για κάθε δοκιμασία. Η περιοχή κάτω από της χαρακτηριστικής καμπύλης κατασκευάστηκε και συγκρίθηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως. Μια δίπλευρη τιμή Ρ 0,05 χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).

Αποτελέσματα

Επίπεδα A1AT και Βαθμός Sialyation σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος και HCC

Συγκεντρωτικά οροί από υγιείς ασθενείς (n = 20), οι ασθενείς με κίρρωση του ήπατος (n = 20) και σε ασθενείς με HCC με ένα φόντο από κίρρωση (n = 20) αναλύθηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης 2-D gel (2DE) (Πίνακας 1). Το Σχήμα 1Α δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό 2-DE του φυσιολογικού ανθρώπινου ορού και τα Σχήματα 1Β, 1C και 1D δείχνουν μια εστίαση στις 5 ισομορφές (Μ1, Μ2, Μ4, Μ6, και Μ7) του Α1ΑΤ από τις τρεις ομάδες ασθενών. Οι τρεις μεγάλες και δύο μικρές ισότυποι A1AT κοινώς δει όταν ανθρώπινου ορού είναι ισοελεκτρικά εστιασμένη και να τρέξει σε ένα 2-D gel [22], [23] και αυτά δεν αλλοιώνονται με τις τρεις ομάδες ασθενών. Οι συγκεντρώσεις Α1ΑΤ σε κάθε ομάδα ασθενών ήταν συγκρίσιμες (Σχήματα 1Ε-1G) και έπεσε μέσα σε κανονικές συγκεντρώσεις στον ορό. Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Α1ΑΤ ένα ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA), όπου τα επίπεδα Α1ΑΤ ήταν 3,2 mg /mL στο σύνθετο από τους υγιείς ασθενείς, 3,3 mg /mL στο σύνθετο από τους κιρρωτικούς ασθενείς, και 3.3 mg /mL στο σύνθετο από τους ασθενείς HCC.

οροί από ομάδες υγιών ελέγχων (Α, Β, Ε) και κίρρωση (C, F) και ο καρκίνος (D, G) ασθενείς επικεντρώθηκαν χρησιμοποιώντας IPGPhor 3-7 NL πρώτες λωρίδες διάσταση που ακολουθείται από διαχωρισμό SDS-PAGE σε πηκτώματα ακρυλαμιδίου 8% έως 18%. Το ρΐ επιλεγμένα σημεία gel είναι Μ1 = 4,91, M2 = 4.95, Μ4 = 5.00, M6 = 5.05, και Μ7 = 5.10. Πάνελ Ε, F, και G δείχνουν την σχετική αφθονία του κάθε τόπου gel.

Η

Πραγματοποιήσαμε γλυκάνης ανάλυση σχετικά με την Μ1, Μ2, Μ4, Μ6, και Μ7 ισότυποι από τις πισίνες των ορών από την κανονική τους συμμετέχοντες και τους ασθενείς με κίρρωση και ΗΚΚ (Σχήματα 1Β-1D) και εξέτασε τα πρότυπα σιαλυλίωσης του κάθε ισοτόπου. Το Σχήμα S1 δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό γλυκάνη προφίλ για το ισότυπο M4 από τους ελέγχους. Συνεπής με τα αποτελέσματα των προηγούμενων μελετών [24], η διπλής κεραίας γλυκάνη είναι το πιο άφθονα είδη. Σχήμα S1-Β δείχνει το επίπεδο της σιαλιωμένης διπλής κεραίας και τριών διακλαδώσεων γλυκάνης που σχετίζονται με κάθε ισομορφές από κάθε ομάδα ασθενών. Όπως δείχνει S1-Β, το επίπεδο των sialyation στις γλυκάνης bi-anntennery (A2G2S1 ή A2G2S2) ήταν παρόμοια στις διάφορες ομάδες ασθενών. Ομοίως, το επίπεδο της sialyation δεν μεταβλήθηκε επί των τριών διακλαδώσεων γλυκάνης. Ωστόσο, υπήρχε μια αύξηση στο επίπεδο του τρι-σιαλυλιωμένης α-1,3 συνδεδεμένο φουκοζυλιωμένη εξωτερικό μέρος του βραχίονα φουκοζυλιωμένη γλυκάνη (A3F (3) 1G3S3) σχετικά Α1ΑΤ από τις ασθενείς με καρκίνο, σε σύγκριση με τα υγιή και ασθενείς με κίρρωση. Αυτά κορυφής δεικνύονται στο σχήμα S1A & amp? Β με αστερίσκο.

Αυξημένα επίπεδα Core και εξωτερικό μέρος του βραχίονα φουκοσυλίωσης παρατηρούνται στις A1AT από ασθενείς με HCC

Για να ελέγξετε αν το αυξημένο επίπεδο των τρι-σιαλιωμένης α-1,3 συνδεδεμένης με φουκοσυλιωμένες εξωτερικό μέρος του βραχίονα φουκοζυλιωμένη γλυκάνη (A3F (3) 1G3S3) ήταν το αποτέλεσμα της αύξησης των sialyation ή σε αύξηση του συνολικού ποσού της μητρικής γλυκάνης, σιαλικό οξύ απομακρύνθηκε ενζυματικώς και το δείγμα αναλύεται ξανά. Το Σχήμα 2 δείχνει την απλοποιημένη αποσαλικυλιωμένοι glycoprofile από τις πέντε κύριες ισομορφές για κάθε ένα από την ομάδα των ασθενών μετά από θεραπεία με νευραμινιδάση (

Arthrobacter ureafaciens

). Τρεις κορυφές του ενδιαφέροντος, που υποδεικνύεται με ένα αστέρι στο Σχήμα 2, τα αναπαραγώγιμα αλλοιώνονται με τις ισομορφές Μ1, Μ2, Μ4 και καθώς η νοσούντων ήπατος προχωρεί από κίρρωση σε καρκίνο. πέψη Διαδοχική εξωγλυκοσιδάσης (τα δεδομένα δεν δείχνονται) έδειξαν κορυφές αυτές να είναι ένα βασικό φουκοζυλιωμένη γλυκάνη διπλής κεραίας (F (6) A2G2), ένα τριών διακλαδώσεων γλυκάνη (A3G3), και ένα τρικεραιϊκό γλυκάνη με ένα μόνο α 1,3 συνδέονται υπόλειμμα φουκόζης εξωτερικό μέρος του βραχίονα ( A3F (3) 1G3). Το Σχήμα 3Α δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό σιαλυλιωμένη προφίλ με την αντίστοιχη δομή γλυκάνης που προσδιορίζονται για κάθε κορυφή. Ο πίνακας 2 είναι μια ποσοτικοποίηση της κάθε γλυκάνης δομής παρούσα στις πέντε κύριες ισομορφές για κάθε ομάδα ασθενών. Ειδικές αλλαγές στην γλυκοσυλίωση παρατηρήθηκε στις ισομορφές Α1ΑΤ με την εξέλιξη σε κίρρωση και HCC. Στις Μ6, η ισομορφή με πολύ λίγη τρι και τετρα-κεραιοειδείς δομές, το διπλής κεραίας πυρήνας φουκοζυλιωμένη γλυκάνη (F (6) A2G2), αντιπροσωπεύει 4,48% σε φυσιολογικούς ασθενείς, 4,37% σε ασθενείς με κίρρωση, και 7,04% σε ασθενείς με καρκίνο, μια τάση που παρατηρείται σε ολόκληρη την κάθε ισομορφές (Πίνακας 2, γλυκάνη 3). Η ποσοστιαία μεταβολή μεταξύ υγιών και κίρρωση και μεταξύ κίρρωση και καρκίνο του δίδεται στο Σχήμα 3C και δείχνει ότι αυτή η δομή αλλάζει μόνο με τον καρκίνο. Σε Μ4, οι τρικεραιϊκό γλυκάνης με ένα εξωτερικό υπόλειμμα φουκόζης βραχίονα (A3F (3), 1G3) αυξάνεται από 4,34% σε φυσιολογικό συμμετέχοντες να 6.78% σε ασθενείς με κίρρωση, και 13,18% σε ασθενείς με κίρρωση συν καρκίνο. Και πάλι, αυτή η τάση παρατηρείται σε καθεμία από τις ισομορφές, με εξαίρεση την M6, λόγω της απόλυτης έλλειψης δομές τριών κεραιών (Πίνακας 2, γλυκάνη 8). Η σχετική αύξηση σε καθένα από αυτά τα φουκοζυλιωμένη γλυκάνη δομές ως συνάρτηση της νόσου φαίνεται στο Σχήμα 3Β και δείχνει ότι αυτή δομών αλλαγές τόσο κίρρωση του ήπατος και HCC. Η αύξηση στην εξωτερική φουκοσυλίωσης βραχίονα συσχετίστηκε επίσης με μείωση του γονέα Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη. Δηλαδή, η αύξηση στο εξωτερικό βραχίονα φουκοζυλιωμένη γλυκάνη triantennary, A3F (3) 1G3, συνδέθηκε με μια μείωση στην triantennary γλυκάνη A3G3. (Πίνακας 2, γλυκάνη 6).

Οι κυριότερες κορυφές που έχουν αλλοιωθεί σημειώνονται με αστερίσκο και είναι (από αριστερά προς τα δεξιά) ένα πυρήνα φουκοζυλιωμένη bianntennary γλυκάνης (F96) A2G2), ένα trianntennary Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη , και ένα trianntennary Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη με ένα μόνο εξωτερικό υπόλειμμα φουκόζης βραχίονα (A3F [3] 3). Το ποσοστό του καθενός από αυτές τις κορυφές στις διάφορες ισομορφές και στις διάφορες ομάδες ασθενών παρουσιάζεται στον Πίνακα 2.

Η

(Α) Ένα αντιπροσωπευτικό Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη προφίλ από ένα κανονικό ασθενή μάρτυρα. Οι 11 μεγάλες γλυκάνης δομές προσδιορίζονται έδειξε και με δεδομένο έναν αριθμό. Ο αριθμός αυτός χρησιμοποιείται στον Πίνακα 2 με ονόματα δομή που παρέχονται. Η σχετική αλλαγή στο επίπεδο του trianntennary Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη με ένα μόνο εξωτερικό υπόλειμμα φουκόζης βραχίονα (A3F [3] G3) (Β) και του πυρήνα φουκοζυλιωμένη bianntennary γλυκάνης (F [6] A2G2) (C) σε φυσιολογικό να κιρρωτικούς και κίρρωση να HCC εμφανίζεται ως ποσοστιαία μεταβολή. Καθώς Αυτό το σχήμα δείχνει, οι αυξήσεις στα εξωτερικά φουκοσυλίωσης βραχίονα που σχετίζονται τόσο με κίρρωση και ΗΚΚ, ενώ αυξημένη πυρήνα φουκοσυλίωσης παρατηρείται μόνο με HCC.

Η

Ανάλυση φουκοζυλιωμένων Α1ΑΤ από λεκτίνη Flisa σε ένα ομάδα των 458 ασθενών

για την περαιτέρω εξετάσει αν οι αλλαγές τόσο στο πυρήνα και το εξωτερικό φουκοσυλίωσης βραχίονας θα μπορούσε να δει σε μεμονωμένους ασθενείς και ενδεχομένως χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικός δείκτης καρκίνου, αναλύσαμε έναν ασθενή ομάδα που αποτελείται από 458 ασθενείς για την επίπεδο φουκοσυλιωμένες A1AT χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία λεκτίνη-Flisa βάση. Σε αυτή τη δοκιμασία, Α1ΑΤ συνελήφθη χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα και το επίπεδο της φουκοσυλίωσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το φουκόζη δέσμευσης AAL. AAL αναγνωρίζει τόσο εξωτερικό μέρος του βραχίονα και του πυρήνα φουκοσυλιωμένες γλυκάνης. Είκοσι ασθενείς χωρίς ενδείξεις ηπατικής νόσου χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι? 33 ασθενείς έχουν μολυνθεί με HBV είχαν άγνωστη επίπεδο της ίνωσης του ήπατος? 215 ασθενείς που έχουν μολυνθεί με HCV είχε ένα άγνωστο επίπεδο της ίνωσης του ήπατος? 65 ασθενείς είχαν κίρρωση του ήπατος? 62 ασθενείς είχαν άλλες ασθένειες του ήπατος? και 63 ασθενείς είχαν καρκίνο του ήπατος (Πίνακας 1). Το Σχήμα 3Α δείχνει το σχετικό επίπεδο φουκόζη λεκτίνη-δραστικής Α1ΑΤ στις έξι ομάδες ασθενών. Οι τιμές δίνονται σαν φορές σε αύξηση σε σχέση με το επίπεδο σε εμπορικά αγοράζονται «κανονική» ορούς. Ο μέσος όρος και το 95% διάστημα εμπιστοσύνης του μέσου παρουσιάζονται για κάθε ομάδα. Βρήκαμε μια σαφή στατιστική διαφορά μεταξύ της ομάδας HCC και όλες τις άλλες ομάδες (Ρ & lt? 0.0001) και μεταξύ του κιρρωτικό ομάδας και της ομάδας ελέγχου (Ρ = 0.0173), αλλά όχι μεταξύ άλλων ομάδων (Σχήμα 3Α). Η μέση στάθμη του λεκτίνη αντιδραστικών Α1ΑΤ ήταν 1.4-φορές (± 0.80) παραπάνω σίγμα στην ομάδα ελέγχου, 1,7 φορές (± 0.1.8) στην ομάδα που έχουν μολυνθεί με HBV, 1,9 φορές (± 1,8) στην ομάδα έχουν προσβληθεί με HCV, 2.6-φορές (± 2,3) στην ομάδα με κίρρωση, 2.6-φορές (± 2,0) στην ομάδα με άλλες ηπατικές νόσους, και 7,70 φορές (± 4.45) στην ομάδα με HCC. Απροσδόκητα, δεν υπήρχε διαφορά στο μέσο επίπεδο του AAL-δραστικής Α1ΑΤ σε ασθενείς HCC σε σχέση με το στάδιο της HCC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό είναι ασθενείς με σταδίου 1 HCC, όπως ορίζεται ως ένα ενιαίο βλάβη μικρότερη από 2 εκατοστά [11], είχε μια αύξηση 9.1 φορές (± 4.70) στο επίπεδο των AAL αντιδραστικών Α1ΑΤ ενώ οι ασθενείς με σταδίου 4 HCC (εκείνα με πολλαπλές βλάβες & gt ? 6 εκατοστά σε διάμετρο) είχαν κατά μέσο όρο 6,7 φορές (± 5.54), η οποία δεν ήταν διαφορετική από εκείνη που παρατηρήθηκε στο στάδιο 1 ασθενείς (

σ

= 0,114)

σε αυτή την ομάδα, φουκοσυλιωμένες. A1AT θα μπορούσε να γίνει διάκριση μεταξύ HCC και μη-HCC περιπτώσεις με μια περιοχή κάτω από την καμπύλη χειριστή του δέκτη (AUROC) των 0.871. Κατά τη σύγκριση μόνο HCC σε σχέση με κίρρωση, η διακριτική ικανότητα ήταν 0.867. Χρησιμοποιώντας μια αποκοπής 5 σχετικές μονάδες AAL αντιδραστική A1AT θα μπορούσε να διαφοροποιήσει HCC από κίρρωση με ευαισθησία 70% και ειδικότητα 86%. Αντίθετα, AFP, όταν αναλύονται σε αυτή την ομάδα, είχε μια AUROC των 0.764 και θα μπορούσε να διαφοροποιήσει HCC από κίρρωση με ευαισθησία 59% και ειδικότητα 93% με τη χρήση ενός αποκοπής των 20 ng /mL.

Λάθος Θετικά έχουν αυξημένα επίπεδα εξωτερικό μέρος του βραχίονα φουκοσυλίωσης Εκτιμώντας Πυρήνας φουκοσυλίωσης είναι ειδικό για HCC

Μερικοί ασθενείς δεν έχουν καρκίνο, αλλά έχουν αυξημένα επίπεδα λεκτίνη-αντιδρώσα A1AT (Εικόνα 4Α). Επειδή παρατηρήθηκαν αλλαγές στις εξωτερικές φουκοσυλίωσης βραχίονα πάνω Α1ΑΤ από ασθενείς με κίρρωση, ήταν ενδιαφέρον να προσδιορισθεί αν τα άτομα με ψευδή θετικά αποτελέσματα είχαν πυρήνα ή εξωτερικό φουκοσυλίωσης βραχίονα. Το Σχήμα 4Α δείχνει τα αποτελέσματα της ανάλυσης γλυκάνης από καθαρισμένα Α1ΑΤ από τρία κιρρωτικούς ασθενείς (από εννέα) και τρεις ασθενείς με σταδίου 1 ή 2 HCC (από εννέα) και αναλύθηκαν όπως προηγουμένως. Τα αποτελέσματα από αυτούς τους ασθενείς φαίνεται στο Σχήμα 4Α, και ένας εκπρόσωπος γλυκάνης προφίλ ενός από αυτούς τους ασθενείς φαίνεται στο Σχήμα 4Β, μαζί με το επίπεδο του 4 μεγάλες γλυκάνης δομές υποδεικνύεται. Όπως δείχνει το σχήμα 4Β, σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 2 και στα Σχήματα 3A-3C, οι τρεις ασθενείς με κίρρωση έχουν επίπεδα πυρήνα φουκοσυλίωσης (F (6) A2G2) παρόμοια με αυτές που παρατηρήθηκαν σε υγιείς μάρτυρες. Ωστόσο, οι ασθενείς αυτοί έχουν σημαντικές αυξήσεις στο εξωτερικό φουκοσυλίωσης βραχίονα (A3F (3) 1G3), παρόμοια με τα υψηλότερα επίπεδα που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με HCC. Δηλαδή, το επίπεδο του εξωτερικού φουκοσυλίωσης βραχίονα σε αυτούς τους ασθενείς κυμάνθηκε από 10% έως 17%, το οποίο είναι παρόμοιο με το επίπεδο που παρατηρήθηκε σε ασθενείς με HCC (13%). Αντίθετα, τρεις ασθενείς με HCC που είχε πολύ ισχυρά θετικά αποτελέσματα από τη δοκιμή λεκτίνη Flisa είχε αυξηθεί πυρήνα και εξωτερικό φουκοσυλίωσης βραχίονα. Για παράδειγμα, ο πυρήνας φουκοζυλιωμένη γλυκάνη bianntennary αντιπροσωπεύεται 9,55% επί Α1ΑΤ καθαρισμένο από Η27 ασθενή. Ομοίως, αυτή η γλυκάνη αντιπροσώπευαν πάνω από το 9% στο A1AT καθαρίζεται από ασθενείς Η18 και Η23. Αυξήσεις στην εξωτερική φουκοσυλίωσης βραχίονα κυμαίνονται από 14,03% έως 15,97% του συνόλου των γλυκάνης επί Α1ΑΤ παρατηρήθηκαν επίσης σε αυτούς τους ασθενείς. Σχήμα 4D δείχνει τα αποτελέσματα όλων των 18 ασθενών, με έμφαση στο επίπεδο του εξωτερικού βραχίονα (α-1,3) και του πυρήνα (α-1,6) φουκοσυλίωσης. Κατά την εξέταση όλων των 9 κίρρωση ψευδώς θετικά το μέσο επίπεδο του πυρήνα φουκοσυλίωσης ήταν 3,77% ± 0,25 και το μέσο επίπεδο της εξωτερικής fucosyalation βραχίονα ήταν 11,88% ± 2,79. Στην περίπτωση των καρκίνων το μέσο επίπεδο του πυρήνα του φουκοσυλίωσης ήταν 8,62% ± 1.2 και το μέσο επίπεδο της εξωτερικής φουκοσυλίωσης βραχίονα ήταν 14.26% ± 1.9. Υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ του επιπέδου των βασικών α-1,6 φουκοσυλίωσης μεταξύ αυτών των εννέα κίρρωση και εννέα ασθενείς HCC (p & lt? 0,0001), αλλά όχι με α-1,3 συνδεδεμένο φουκοσυλίωσης (p = 0.07). Είναι σημαντικό, το ανώτατο επίπεδο των βασικών φουκοσυλίωσης παρατηρήθηκε στις ψευδώς θετικών ασθενείς με κίρρωση ήταν 4,01%, παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε υγιείς μάρτυρες (3,62%).

(A) Το επίπεδο των λεκτίνη-αντιδραστική A1AT σε ασθενείς με HCC, HBV λοίμωξη, λοίμωξη HCV, ή άλλες ασθένειες του ήπατος (παλαιό) και στους μάρτυρες. Η συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή. Ο άξονας x αντιπροσωπεύει την ομάδα των ασθενών. Ο γ-άξονας δείχνει την φορές σε αύξηση λεκτίνη-αντιδραστικά Α1ΑΤ σε σύγκριση με εκείνη σε εμπορικά αγοράζονται ορό. (Β) γλυκάνης ανάλυση των A1AT ισομορφής M4 από ασθενή 21. (Γ) Ποσοτικοποίηση της γλυκάνης ανάλυση από τρεις ασθενείς με κίρρωση (01,21 και 27) και τρεις ασθενείς με στάδιο 1 ή 2 HCC (HCC-23, HCC 27 και HCC 18 ). Τα επίπεδα του 4 μεγάλες γλυκάνης δομές που παρουσιάζονται. Όπως Αυτό το σχήμα δείχνει, σε κιρρωτικούς false positives, υπάρχει μια αύξηση στο εξωτερικό μέρος του βραχίονα, αλλά όχι του πυρήνα φουκοσυλίωσης. Σε συμφωνία με τα δεδομένα φαίνονται στα Σχήματα 2 και 3, οι αυξήσεις των βασικών φουκοσυλίωσης επί ΑΑΤ παρατηρήθηκαν μόνο από ασθενείς με HCC. (D) οικόπεδο διασπορά του επιπέδου της α-1,3 ή α 1,6 συνδεδεμένη φουκόζη από 9 κίρρωση false positives και 9 ασθενείς είτε με το στάδιο 1 ή 2 HCC.

Η

Συζήτηση

Πρόσφατες εκθέσεις έχουν δείξει ότι η αυξημένη πυρήνα και φουκοσυλίωσης εξωτερικού-βραχίονα μπορεί να παρατηρηθεί μετά από glycomic ανάλυση είτε των συνολικών ανθρώπινο ορό ή ορό εξαντλημένο της ανοσοσφαιρίνης [18], [19], [25]. Εξετάσαμε την γλυκοζυλίωση μιας ενιαίας πρωτεΐνης, Α1ΑΤ, ως συνάρτηση της κίρρωσης του ήπατος και καρκίνο του ήπατος. Για το σκοπό αυτό, βρήκαμε κάποιες αλλαγές που ήταν συνεπή με τα προηγούμενα ευρήματά μας, όπως η αύξηση του πυρήνα φουκοσυλίωσης καθώς και αλλαγές στην εξωτερική φουκοσυλίωσης βραχίονα.

Η παρατήρηση που αλλάζει τόσο πυρήνα και εξωτερικό φουκοσυλίωσης βραχίονα συμβεί μπορεί παρέχουν ενδείξεις για τη μοριακή βάση αυτής της αλλαγής. Δηλαδή, αν και οι ακριβείς μηχανισμοί για αυξημένη πυρήνας φουκοσυλίωσης σε HCC είναι άγνωστες, εντούτοις θεωρείται ότι περιλαμβάνει αυξήσεις τόσο τα επίπεδα του ενζύμου και τα υποστρώματα που εμπλέκονται στην πυρήνας φουκοσυλίωσης [17].

Είναι επίσης δυνατό ότι αυτοί οι δείκτες αντανακλούν κάποια μεταβολή στο σύστημα Golgi. Πρόσφατες αναφορές έχουν προτείνει ότι, σε σχέση με το ήπαρ, ο φουκοσυλίωση πρωτεϊνών εμπλέκεται σε πρωτεΐνη διαλογή στην χολή [26]. Έτσι, είναι κατανοητό ότι η εμφάνιση του φουκοζυλιωμένη πρωτεϊνών στον ορό μπορεί να αντανακλά ένα κοινό ελάττωμα στην πρωτεΐνη διαλογή. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η γλυκοζυλίωση της Α1ΑΤ στον ορό των ασθενών με καρκίνο του ήπατος (Σχήματα 2, 3 και 4) είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρείται στη χολή των υγιών ατόμων [26].

Είναι επίσης ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η αντιδραστικότητα λεκτίνη ήταν μεγαλύτερη από τη συνολική αλλαγή που παρατηρείται στην φουκοσυλίωσης. Για παράδειγμα, ασθενής 27 είχε είτε πυρήνα ή εξωτερική φουκόζη βραχίονας στο 22,82% των Ν-συνδεδεμένων γλυκανών του ή της. Σε αντίθεση, Α1ΑΤ από ένα υγιές άτομο είχε φουκόζη (πυρήνας ή εξωτερικό μέρος του βραχίονα), στις 9% των Ν-συνδεδεμένων γλυκανών. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιώντας την Flisa λεκτίνη, θα έπρεπε να έχουμε παρατηρούνται πιο κοντά σε μια 2.5-πλάσια αύξηση και όχι η 11-πλάσια αύξηση που ελήφθη. Αυτή η διαφορά μπορεί να είναι ένα τεχνούργημα της λεκτίνης-Flisa, το αποτέλεσμα άλλων πρωτεϊνών που συνδέονται με Α1ΑΤ, αυξημένη ή τροποποιημένη Ο-γλυκοζυλίωση, ή αυξημένη προσβασιμότητα του λεκτίνη στα υπολείμματα φουκόζης. Όλα αυτά τα πιθανά σενάρια είναι υπό διερεύνηση.

Είναι επίσης σημαντικό να σημειωθεί ότι η αύξηση της εξωτερικής φουκοσυλίωσης βραχίονα παρατηρήθηκε τόσο σε ασθενείς με κίρρωση και σε εκείνους με HCC. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι το εξωτερικό φουκοσυλίωσης βραχίονας δεν ήταν ειδική για τον καρκίνο, αλλά μάλλον ήταν πιθανώς σχετίζεται με την φλεγμονή, την πρώτη από την κίρρωση του ήπατος και στη συνέχεια από την παρουσία της βλάβης HCC. Πράγματι, το επίπεδο του εξωτερικού φουκοσυλίωσης βραχίονας μπορεί να είναι μια πιο συγκεκριμένη δείκτης φλεγμονής και μπορεί να είναι προγνωστική του καρκίνου ανάπτυξης [27], [28]. Αντίθετα, οι αυξήσεις στις βασικές φουκοσυλίωσης παρατηρηθεί μόνο σε ασθενείς με HCC, υποδηλώνοντας ότι αυτή η αλλαγή είναι ο καρκίνος ειδικό.

Όπως Σχήμα 4Α δείχνει, πολλοί ασθενείς στις ομάδες μη-HCC έχουν αυξημένα επίπεδα λεκτίνης-αντιδρώσας AAL . Ανάλυση τρεις ασθενείς με αυξημένα επίπεδα AAL από την ομάδα κίρρωση έδειξε ότι είχαν αλλαγές κυρίως σε εξωτερικό φουκοσυλίωσης βραχίονα, όχι σε πυρήνα φουκοσυλίωσης. Για το σκοπό αυτό, ο πυρήνας του φουκοσυλίωσης μπορεί να είναι ένας περισσότερο ειδικός στόχος για την ανίχνευση του καρκίνου [29].