Abstract

Insulin-σαν υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα 1 (IGF1R) είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας που ενεργοποιείται από την ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 1 (IGF-1) και με μία σχετική ορμόνη που ονομάζεται IGF-2. Ανήκει στην μεγάλη κατηγορία υποδοχέων κινάσης τυροσίνης και παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αιτιολογία του παχέος και την εξέλιξη του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε βιοπληροφορικής αναλύσεις για να ψάξετε miRNAs που ενδεχομένως στοχεύουν IGF1R. Έχουμε προσδιορίσει συγκεκριμένες θέσεις στόχους για το miR-143 και miR-145 (miR-143/145) στην 3′-μη μεταφραζόμενη περιοχή (3′-UTR) του γονιδίου IGF1R. Αυτά τα miRNAs είναι μέλη ενός συμπλέγματος των miRNAs που έχουν αναφερθεί ότι παρουσιάζουν δραστικότητα καταστολέα όγκων. Συνεπής με τις βιοπληροφορικής αναλύσεις, εντοπίσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-143/145 επίπεδα και τα επίπεδα της πρωτεΐνης IGF1R στην παχέος καρκινικούς ιστούς. Με υπερεκφράζουν miR-143/145 Caco2, SW480 ΗΤ29 και κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, μπορούμε πειραματικά επικυρωμένη ότι miR-143/145 αναγνωρίζει άμεσα την 3′-UTR της μεταγραφής IGF1R και ρυθμίζει την έκφραση IGF1R. Επιπλέον, οι βιολογικές συνέπειες της στόχευσης των IGF1R με miR-143/145 εξετάστηκαν με προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

σε

vitro

. Αποδείξαμε ότι η καταστολή των IGF1R από miR-143/145 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Caco2. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας παρέχουν αποδείξεις για έναν ρόλο του συμπλέγματος miR-143/145 ως καταστολέας των όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της αναστολής της μετάφρασης IGF1R

Παράθεση:. Su J, Liang Η, Yao W, Γουάνγκ Ν, Zhang S, Γιαν X, et al. (2014) MiR-143 και MiR-145 Ρυθμίζουν IGF1R να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (12): e114420. doi: 10.1371 /journal.pone.0114420

Επιμέλεια: Cecilia Williams, Πανεπιστήμιο του Χιούστον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 19, 2014? Αποδεκτές: 10 Νοεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Su et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Program) (Αρ 2014CB542300), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81101330, 31271378 και 81250044.) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (αριθ BK2011013 και BK2012014.)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στον κόσμο, και είναι πιο διαδεδομένη στις ανεπτυγμένες χώρες [1]. Εκτιμάται ότι το ακαθάριστο μέση συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παχέος εντέρου στη Νοτιοανατολική Ασία και για τα δύο φύλα ήταν 6,95 /100000 πληθυσμού το 2008 και η συχνότητα αυξάνεται με την ηλικία [2]. Στο μοριακό επίπεδο, ορθοκολικό καρκίνο προκύπτει από μια σειρά γενετικών και επιγενετικών αλλαγών που αδρανοποιούν ογκοκατασταλτικών γονιδίων και ενεργοποίηση ογκογονιδίων [3]. Ωστόσο, οι βασικοί μηχανισμοί που διέπουν έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου του παχέος παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 1 υποδοχέα (IGF1R), έναν υποδοχέα κινάσης τυροσίνης για IGF-1 και IGF-2, συχνά υπερεκφράζεται σε όγκους και έχει τεκμηριωθεί καλά σε κυτταρική καλλιέργεια, μελέτες σε ζώα και ανθρώπους για να παίξει ένα ρόλο στην κακοήθη μετασχηματισμό, την εξέλιξη, την προστασία από την απόπτωση, και μετάσταση [4], [5]. Η οικογένεια υποδοχέων IGF αποτελείται από τρεις πρωτεΐνες διαμεμβράνης, και το γονίδιο IGF1R βρίσκεται στο χρωμόσωμα 15q26, η οποία κωδικοποιεί ένα απλό πολυπεπτίδιο των 1367 αμινοξέων που εκφράζεται ιδιοσυστατικά στα περισσότερα κύτταρα [5]. ενεργοποίηση IGF1R οδηγεί σε αυτοφωσφορυλίωση επί τυροσίνες 1131, 1135 και 1136 στην περιοχή κινάσης, που ακολουθείται από φωσφορυλίωση τυροσινών παραμεμβρανική και καρβοξυ-τερματικό σερίνες [6]. Αυτό ακολουθείται από την πρόσληψη συγκεκριμένων ενδιαμέσων σύνδεσης, συμπεριλαμβανομένης της ινσουλίνης υποδοχέα υποστρώματος-1 (IRS-1), Shc και πρωτεΐνες 14-3-3 [7], [8]. Αυτά τα μόρια συνδέουν το IGF1R να μονοπατιών σηματοδότησης ποικιλόμορφη, επιτρέποντας την επαγωγή της ανάπτυξης, μετασχηματισμού, τη διαφοροποίηση και την προστασία έναντι της απόπτωσης [9]. Κατά IGF-1 δεσμευτική, IGF1R ενεργοποιεί το ΡΙ3Κ /Akt καταρράκτη, η οποία προωθεί G1 στην S πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και ανυψώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [10], [11]. IGF1R υπερεκφράζεται κατά την διάρκεια του παχέος καρκινογένεση, με την υψηλότερη έκφραση παρατηρήθηκε στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα στη βάση των κρυπτών του κόλου [11], [12]. Ωστόσο, ο ρόλος της IGF1R στον καρκίνο του παχέος εντέρου παραμένει να διευκρινιστεί.

Κατά την τελευταία δεκαετία, μια νέα κατηγορία μικρών μορίων RNA είναι γνωστό ως microRNAs (miRNAs) έχει αναδειχθεί ως κύριους ρυθμιστές της έναρξης και εξέλιξης της ανθρώπινης καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος [13] – [15]. miRNAs είναι μικρές (long -22-νουκλεοτίδιο), μονόκλωνα μόρια RNA μη κωδικεύουσα που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του γονιδίου με σύνδεση προς την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) των μορίων mRNA στόχου, η οποία οδηγεί σε αποδόμηση είτε της μεταγραφής ή αναστολή της μετάφρασης [16] – [18]. Πολλοί miRNAs λειτουργούν σε συνδυασμό με ένα άλλο με την έκφραση της πρωτεΐνης πρόστιμο συντονιστείτε σε παγκόσμιο επίπεδο. Έτσι, miRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής μετα-μεταγραφικό. Σημαντικά, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η κακή ρύθμιση του miRNAs σχετίζεται με ανθρώπινες κακοήθειες και να προτείνει μια αιτιώδη ρόλο των miRNAs στην αιτιολογία του καρκίνου [19]. miRNAs πιθανώς παίζουν ένα ρόλο στον καρκίνο, επειδή μπορούν να επηρεάσουν τη μετάφραση και τη σταθερότητα των στοχευμένων ογκογονιδίων ή καταστολέων όγκων που επηρεάζουν τελικά την κυτταρική φυσιολογία [19], [20]. Για παράδειγμα, miR-143 και miR-145 (MIR-143/145), οι οποίες βρίσκονται σε ένα σύμπλεγμα μέσα στο 5q32-33 χρωμοσωμική περιοχή, οι μειωτικά σε πολλούς τύπους καρκίνων, περιλαμβανομένων του ορθοκολικού καρκίνου [21], [22] . miR-143 και miR-145 έχει δειχθεί ότι κατέχουν αντι-ογκογόνο δράση, συμπεριλαμβανομένης της συμμετοχής σε διάφορες διαδικασίες σχετικά με τον καρκίνο όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση και εισβολή [23].

Αν και απορύθμιση της IGF1R και miRNAs σχετίζεται με ογκογένεση σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, λίγα είναι γνωστά για miRNAs που δρουν επί IGF1R. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι IGF1R άμεσα ρυθμίζεται από miR-143 και miR-145 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Επιπλέον, δείξαμε ότι miR-143/145 μπορούν να αναστείλουν την έκφραση IGF1R να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινος ιστός

παχέος καρκινικούς ιστούς και ζεύγη γειτονικών noncancerous ιστών ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργικές επεμβάσεις στο πρώτο Affiliated Νοσοκομείο Anhui Medical University (Hefei, Κίνα). Και οι δύο όγκοι και noncancerous ιστοί υποβλήθηκαν σε ιστολογική ανάλυση για διαγνωστικούς επιβεβαίωση. Η παθολογική τύπος κάθε καρκίνος ταυτοποιήθηκε ως αδενοκαρκίνωμα. Γραπτή συγκατάθεση δόθηκε από όλους τους ασθενείς ή τους κηδεμόνες τους, καθώς και η Επιτροπή Δεοντολογίας της πρώτης Affiliated Νοσοκομείο Anhui Medical University ενέκρινε όλες τις πτυχές αυτής της μελέτης. θραύσματα ιστού καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο κατά τη στιγμή της επέμβασης και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών αναφέρονται στον Πίνακα S1in S1 αρχείου.

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές Caco2, ΗΤ29 και SW480 αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας, κινέζικα Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). κύτταρα Caco2 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% CO

2? ΗΤ29 και SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% CO

2.

απομόνωση του RNA και ποσοτική RT-PCR

το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα καλλιεργημένα κύτταρα και τους ιστούς χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δοκιμασίες για την ποσοτικοποίηση ώριμη miRNAs διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ανιχνευτές TaqMan microRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση ΑΜν (Takara, Dalian, Κίνα) και ενός εκκινητή stem-loop RT, και το ένα δέκατο των cDNA χρησιμοποιήθηκε ανά αντίδραση qPCR (Applied Biosystems). Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν ως εξής: 16 ° C για 30 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά και 85 ° C για 5 λεπτά. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan PCR και ένας Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε 96 φρεατίων οπτική πλάκα στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν. Αφού οι αντιδράσεις ήταν πλήρης, το όριο του κύκλου (C

T) δεδομένα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τις ρυθμίσεις σταθερό όριο, και η μέση C

Τ προσδιορίστηκε από τριπλούν PCRs. Μια συγκριτική μέθοδος Γ

T χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει κάθε κατάσταση με τις αντιδράσεις ελέγχου. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος, και η σχετική ποσότητα του miRNA κανονικοποιήθηκαν προς U6 υπολογίστηκε με την εξίσωση 2

-ΔΔCT, στην οποία ΔΔC

T = (C

T miRNA-C

Τ U6)

στοχοθέτησης (C

T miRNA-C

T U6)

έλεγχο.

Για την ποσοτικοποίηση IGF1R και GAPDH mRNA, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ολίγο ά (Τ) 18 εκκινητές (Takara) και ThermoScript ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen). Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν ως εξής: 42 ° C για 60 λεπτά και 70 ° C για 10 λεπτά. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια με το προϊόν RT, SYBR Green χρωστική (Invitrogen) και ειδικούς εκκινητές για IGF1R και GAPDH. Οι αλληλουχίες των εκκινητών ήταν ως εξής: IGF1R (με νόημα): 5′-GCCAAGCTAAACCGGCTAAA-3 ‘? IGF1R (αντιπληροφοριακό): 5’-TATCCTGTTTTGGCCTGGACATA-3 ‘? GAPDH (με νόημα): 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ‘? και GAPDH (αντιπληροφοριακό): 5’-CGCTCATTGCCGATAGTG-3 ‘. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 95 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s και 72 ° C για 1 λεπτό. Αφού οι αντιδράσεις ήταν πλήρεις, η C

τιμές Τ προσδιορίστηκαν με τον καθορισμό ενός σταθερού κατωφλίου. Η σχετική ποσότητα του mRNA IGF1R κανονικοποιήθηκε σε GAPDH.

miRNA υπερέκφραση

miRNA υπερέκφραση επετεύχθη με επιμόλυνση κυττάρων με ένα miRNA μιμητικό, ένα συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο RNA duplex μιμούνται τον πρόδρομο miRNA. Συνθετικά μόρια RNA, συμπεριλαμβανομένων των προ-miR-143, προ-miR-145 και ένα κωδικοποιημένο αρνητικό RNA ελέγχου (pre-miR-ελέγχου), αγοράστηκαν από GenePharma (Σανγκάη, Κίνα). Caco2, SW480 ΗΤ29 και κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) την επόμενη ημέρα όταν τα κύτταρα ήταν περίπου 70% συρρέοντα. Για τα πειράματα υπερέκφρασης miRNA, 100 pmol του προ-miR-143, 100 pmol του προ-miR-145 ή 50 pmol τόσο του προ-miR-143 και προ-miR-145 χρησιμοποιήθηκαν. Στις 6 ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο για τα κύτταρα Caco2 άλλαξε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 2% ορό εμβρύου μόσχου, και το μέσο για τα κύτταρα ΗΤ29 και SW480 αλλάχθηκε σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 2% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για την απομόνωση του συνολικού RNA ή πρωτεΐνης, αντίστοιχα.

κατασκευή πλασμιδίου και siRNA

δοκιμασία παρεμβολής

Ένα πλασμίδιο έκφρασης θηλαστικού (pReceiver-M02 -IGF1R) σχεδιασμένη για να εκφράσει ειδικά το πλήρους μήκους ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) του ανθρώπινου IGF1R χωρίς το miR-143/145 αποκρίνεται 3′-UTR αγοράστηκε από GeneCopoeia (Germantown, MD, USA). Ένα άδειο πλασμίδιο χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Το siRNA (νόημα: 5′-GCGGCUGGAAACUCUUCUATT-3 ‘? Αντινόημα: 5′-UAGAAGAGUUUCCAGCCGCTT-3’) στοχεύει ανθρώπινο IGF1R σχεδιάστηκε και συντέθηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Ένα κωδικοποιημένο siRNA (Invitrogen) συμπεριλήφθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Το πλασμίδιο υπερέκφραση ή siRNA διαμολύνθηκαν σε κύτταρα Caco2 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA ή πρωτεΐνη απομονώθηκε 24 ώρες ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. επίπεδα IGF1R mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν με ποσοτική RT-PCR και κηλίδωση Western.

λουσιφεράσης ανταποκριτής

δοκιμασία

Το σύνολο του 3′-UTR του ανθρώπινου IGF1R ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ανθρώπινη γονιδιωματική DNA ως ένα πρότυπο. Τα προϊόντα PCR στη συνέχεια εισάγεται εντός του πλασμιδίου ρ-MIR-ανταποκριτή (Ambion, Austin, ΤΧ, USA). Η ένθεση επιβεβαιώθηκε ότι είναι σωστή δια προσδιορισμού σειράς DNA. Προκειμένου να ελεγχθεί η εξειδίκευση δέσμευσης, οι αλληλουχίες που αλληλεπιδρούν με την αλληλουχία σπόρο του miR-143 και miR-145 μεταλλάχθηκαν (από UUGGGAG προς AACCCUC για τη θέση σύνδεσης miR-143 και από UUGGGAG προς AACCCUC για τη θέση σύνδεσης miR-145), και η μεταλλαγμένη IGF1R 3′-UTR εισήχθη σε ένα ισοδύναμο λουσιφεράσης ανταποκριτή πλασμίδιο. Για λουσιφεράση δοκιμασίες ρεπόρτερ, Caco2, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και συν-επιμολύνθηκαν με 0.8 μα πυγολαμπίδας πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης, 0,8 μg του β-γαλακτοσιδάσης (β-gal) πλασμίδιο έκφρασης (Ambion), και ίση ποσότητες (20 pmol) του miR-143/145 μιμούνται ή ένα κωδικοποιημένο RNA ελέγχου αρνητικού χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Το πλασμίδιο β-gal χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA).

απομόνωσης πρωτεϊνών και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα ή οι ιστοί υποβλήθηκαν σε λύση σε ένα RIPA ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% ΝΡ-40, 0,25% δεοξυχολικό νάτριο και 1 mM EDTA, ρΗ 8,0) με κοκτέιλ προσφάτως προστιθέμενου αναστολέα πρωτεάσης (Roche) επί 30 λεπτά επί πάγος και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 16.000 χ g στους 4 ° C για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε με BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (Bio-Rad). Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Bio-Rad) και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 4 ° C για 12 ώρες. Μετά από τρεις πλύσεις σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενούς αντισώματος για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις, οι μεμβράνες επωάστηκαν με το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας SuperSignal West Pico (Pierce). Η ίδια μεμβράνη επίσης διερευνήθηκαν με αντίσωμα GAPDH για να χρησιμεύσει ως έλεγχος φόρτωσης. IGF1R και GAPDH αντισώματα αγοράστηκαν από την κυτταρική σηματοδότηση (# 3018) και Santa Cruz Biotechnology (SC-25778), αντίστοιχα.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Caco2 κύτταρα απλώθηκαν σε 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και στη συνέχεια επωάζονται όλη τη νύκτα σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μετά την επιμόλυνση, 10 μL of Cell Μετρώντας Kit-8 (# C0038, Beyotime) προστέθηκε στην αντίστοιχη δοκιμή καλά και επωάστηκαν για 1 ώρα. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε μήκος κύματος 450 nm.

edu πολλαπλασιασμό δοκιμασία

Για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα Caco2 σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Τα κύτταρα επωάστηκαν υπό πρότυπες συνθήκες σε πλήρες μέσο. Η επιμόλυνση των κυττάρων εκτελέστηκε την επόμενη ημέρα, όπως περιγράφεται παραπάνω. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας την ενσωμάτωση της 5-αιθυνυλ-2′-δεοξυουριδίνη (EDU) με την ΕΠΑ κυτταρικού πολλαπλασιασμού Assay Kit (Ribobio, Guangzhou, Κίνα). Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 μΜ edu για 3 ώρες πριν από την στερέωση, διαπερατοποίηση και χρώση ΕΠΑ, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (Sigma) σε συγκέντρωση 1 μg /mL για 10 λεπτά. Το ποσοστό των κυττάρων που ενσωματώνονται EDU προσδιορίστηκε με μικροσκοπία φθορισμού.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα εικόνες Western και δοκιμασία πολλαπλασιασμού είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Ποσοτικές αναλύσεις RT-PCR και αναφοράς λουσιφεράσης διεξήχθησαν εις τριπλούν και κάθε επιμέρους πείραμα επαναλήφθηκε αρκετές φορές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Παρατηρούμενες διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε ρ & lt?. 0.05 χρησιμοποιώντας έλεγχος τ

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των διατηρημένων miR-143 και miR-145 θέσεις στόχους εντός της 3′-UTR της IGF1R

Τρεις υπολογιστικών αλγορίθμων, συμπεριλαμβανομένων TargetScan [24] και RNAhydrid [25], χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό για τον εντοπισμό δυνητικών miRNAs που στοχεύουν IGF1R. Και οι τρεις αλγόριθμοι προβλέψει miR-143 και miR-145 ως ρυθμιστές της IGF1R. Οι προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις μεταξύ miR-143/145 και των θέσεων στόχου εντός της 3′-UTR του IGF1R απεικονίζεται στο Σχήμα 1Α. Ένα προβλέψει υβριδοποίηση παρατηρήθηκε μεταξύ των δύο miR-143 και miR-145 και του 3′-UTR της IGF1R. Αν και οι δύο θέσεις στόχους εντός της 3′-UTR του IGF1R ήταν κοντά το ένα το άλλο, οι θέσεις ήταν μη-επικαλυπτόμενα. Υπήρχε τέλεια συμπληρωματικότητα μεταξύ της περιοχής σπόρου (πυρήνα ακολουθία που περιλαμβάνει τα πρώτα 2-8 βάσεις της ώριμης miRNA) και τα συγγενή τους στόχους. Οι ελάχιστες ελεύθερη ενέργεια τιμές των υβριδοποιήσεις μεταξύ miR-143 και IGF1R και μεταξύ των miR-145 και IGF1R ήταν -19,8 και -24,8 kcal /mol, αντίστοιχα, τα οποία είναι καλά μέσα στην περιοχή των γνήσιων ζευγάρια miRNA-στόχο. Επιπλέον, οι αλληλουχίες πρόσδεσης miR-143/145 της IGF1R 3′-UTR ήταν εξαιρετικά διατηρημένη μεταξύ των ειδών. Έτσι, επιλέχθηκαν miR-143 και miR-145 ως υποψήφιες για περαιτέρω πειραματική επαλήθευση.

(Α) Σχηματική περιγραφή των υποθετικών διπόλων που σχηματίζονται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των θέσεων πρόσδεσης στο IGF1R 3′-UTR (top ) και miR-143/145 (κάτω). Η προβλεπόμενη ελεύθερη ενέργεια αξίας κάθε υβριδικό ενδείκνυται. Οι θέσεις αναγνώρισης σπόρος συμβολίζεται, και όλα τα νουκλεοτίδια σε αυτές τις περιοχές είναι εξαιρετικά διατηρημένες κατά μήκος πολλών ειδών, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου, ποντικού και αρουραίου. (Β) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR του miR-143 και τα επίπεδα miR-145 σε έξι ζεύγη ορθοκολικό καρκινικό ιστό (C) και noncancerous ιστού (Ρ) δείγματα. (Γ και Δ) Ανάλυση Western blot των επιπέδων της πρωτεΐνης IGF1R σε έξι ζεύγη C και Ρ δείγματα. C: αντιπροσωπευτική εικόνα? D: ποσοτική ανάλυση. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Αναγνώριση μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-143/145 επίπεδα και τα επίπεδα της πρωτεΐνης IGF1R στον καρκίνο του παχέος εντέρου ιστούς

Ενδιαφέροντος

στον πίνακα miR-143/145 και IGF1R υποστηρίχθηκε επίσης από την πρόσφατη ταυτοποίηση των δύο αυτών miRNAs ως καταστολείς υποψήφιος του όγκου [26] και IGF1R ως ογκογονίδιο στον καρκίνο του παχέος εντέρου [8]. Στην συνέχεια διερευνήσαμε κατά πόσον τα επίπεδα miR-143/145 συσχετίζονταν αντίστροφα με την έκφραση της πρωτεΐνης IGF1R σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς. Μετά τον προσδιορισμό των επιπέδων του miR-143/145 και τα επίπεδα πρωτεΐνης IGF1R σε έξι ζεύγη παχέος καρκινικούς ιστούς και τα αντίστοιχα noncancerous ιστούς, δείξαμε ότι miR-143 και τα επίπεδα miR-145 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω με συνέπεια σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς (Σχήμα 1 Β) , ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης IGF1R ήταν δραματικά υψηλότερα στα παχέος καρκινικούς ιστούς (Σχήμα 1 C και 1 D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-143/145 επίπεδα έκφρασης είναι αντιστρόφως ανάλογα με την έκφραση της πρωτεΐνης IGF1R στην ανθρώπινη παχέος καρκινικούς ιστούς.

Επικύρωση IGF1R ως άμεσο στόχο του miR-143/145

Η συσχέτιση μεταξύ miR-143/145 και IGF1R εξετάστηκε περαιτέρω με αξιολόγηση έκφρασης IGF1R στο ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές Caco2, SW480 ΗΤ29 και μετά η υπερέκφραση του miR-143/145. Σε αυτά τα πειράματα, η υπερέκφραση επιτεύχθηκε με επιμόλυνση Caco2, ΗΤ29 και κύτταρα SW480 με προ-miR-143 και /ή προ-miR-145, τα οποία είναι συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια RNA που μιμούνται τις προδρόμους miR-143 και miR-145. Η αποτελεσματική υπερέκφραση του miR-143/145 που φαίνεται στο Σχήμα 2Α, 2F και 2K. Όπως αναμενόταν, η υπερέκφραση του miR-143 ή /και miR-145 κατέστειλε σημαντικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης IGF1R σε Caco2, ΗΤ29 και κύτταρα SW480 (σχήμα 2Β, 2C? 2G, 2Η? Και 2L, 2Μ). Να καθορίζουν το κανονιστικό επίπεδο στο οποίο miR-143/145 επηρέασε την έκφραση IGF1R, επαναλάβαμε τα παραπάνω πειράματα και εξετάσαμε την έκφραση του IGF1R mRNA μετά την επιμόλυνση. Η υπερέκφραση του miR-143/145 δεν επηρέασε IGF1R mRNA σταθερότητα (Σχήμα 2D, 2Θ και 2Ν). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι miR-143/145 ρυθμίζει ειδικά την έκφραση IGF1R στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, το οποίο είναι το πιο κοινό μηχανισμό για miRNAs των ζώων.

(Α, F και Κ) Ποσοτική RT-PCR ανάλυση του miR -143 /145 επίπεδα σε Caco2, ΗΤ29 και κύτταρα SW480 σε επεξεργασία με ένα κωδικοποιημένο ελέγχου, προ-miR-143, προ-miR-145 ή και τα δύο προ-miR-143 και προ-miR-145. (B, C? G, Η? Και τα L, Μ) Ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων πρωτεΐνης IGF1R σε κύτταρα Caco2 επεξεργασία με ένα περιπλεγμένο έλεγχο, προ-miR-143, προ-miR-145 ή και τα δύο προ-miR-143 και προ -miR-145. Β, Γ και Ε: αντιπροσωπευτική εικόνα? C, Η και Μ: ποσοτική ανάλυση. (D, Ι και Ν) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR των επιπέδων mRNA IGF1R σε Caco2, ΗΤ29 και κύτταρα SW480 σε επεξεργασία με ένα περιπλεγμένο έλεγχο, προ-miR-143, προ-miR-145 ή και τα δύο προ-miR-143 και προ- miR-145. (E, J και Ο) Άμεση αναγνώριση του IGF1R 3′-UTR με miR-143/145. Caco2, SW480 ΗΤ29 και κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με πυγολαμπίδας ρεπόρτερ λουσιφεράσης που περιέχουν είτε αγρίου τύπου (WT) ή μεταλλαγμένου (MUT) miR-143/145 ιστοσελίδες δέσμευσης στην IGF1R 3′-UTR και κωδικοποιημένα ελέγχου, προ-ΜΙΚ 143, προ-miR-145 ή και τα δύο προ-miR-143 και προ-miR-145. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως ο λόγος της δραστηριότητας λουσιφεράσης πυγολαμπίδας στο ΜΙΚ-143/145 επιμολυσμένα κύτταρα με τη δραστηριότητα στα κύτταρα ελέγχου. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Για να καθοριστεί εάν οι αρνητικές ρυθμιστικές επιδράσεις του miR-143/145 για την έκφραση IGF1R έγιναν με τη μεσολάβηση της πρόσδεσης του miR-143/145, για τις προβλεπόμενες θέσεις στόχου στο 3 «-UTR του mRNA IGF1R, το πλήρους μήκους 3′-UTR του IGF1R που περιέχουν τα δύο προβλεπόμενη miR-143/145 ιστοσελίδες πρόσδεσης εισήχθη προς τα κάτω του γονιδίου της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας σε ένα πλασμίδιο ανταποκριτή. Το προκύπτον πλασμίδιο διαμολύνθηκε σε Caco2, ΗΤ29 και κύτταρα SW480 μαζί με ένα πλασμίδιο ελέγχου διαμόλυνση (β-gal) και είτε προ-miR-143/145 ή ομελέτα αρνητικός RNAs ελέγχου. Όπως αναμενόταν, η δραστικότητα λουσιφεράσης μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-143 και /ή προ-miR-145 (Σχήμα 2Ε, 2J και 2O). Επιπλέον, εισαγάγαμε μεταλλάξεις σημείου στις αντίστοιχες συμπληρωματικές θέσεις στο 3′-UTR του IGF1R για την εξάλειψη των προβλεπόμενων miR-143/145 ιστοσελίδες πρόσδεσης. Αυτή η μεταλλαγμένη αναφοράς λουσιφεράσης δεν επηρεάστηκε από υπερέκφραση του miR-143/145 (Σχήμα 2Ε, 2J και 2O). Αυτό το εύρημα πρότεινε ότι οι θέσεις δέσμευσης miRNA συνέβαλε σημαντικά στην miRNA: mRNA αλληλεπιδράσεων που μεσολαβεί την μετα-μεταγραφική καταστολή της έκφρασης IGF1R. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι miR-143/145 αναγνωρίζει άμεσα και συνδέεται με το 3′-UTR της μεταγραφής IGF1R mRNA για να καταστείλει την έκφραση IGF1R σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα.

MiR-143 και miR-145 μπορεί καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

επόμενο επικεντρώθηκε στη μελέτη των ρόλων του miR-143/145 ρύθμιση IGF1R. Επειδή IGF1R είναι απαραίτητη για την ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της προόδου του κυτταρικού κύκλου, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της miR-143/145 για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας δοκιμασία CCK-8. Προς στήριξη της έννοιας ότι το miR-143/145 λειτουργούν ως βασικό καρκίνο καταστέλλεται miRNAs [26], Caco2, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-143/145, έδειξε κατέστειλε πολλαπλασιασμό (Σχήμα 3Α, 3Ε και 3θ). Επιπλέον, αξιολογήθηκε ο ρόλος των IGF1R επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Να γκρεμίσουμε IGF1R, ένα siRNA που στοχεύει IGF1R σχεδιάστηκε και μεταφέρθηκε σε Caco2, ΗΤ29 και κύτταρα SW480. Για να υπερεκφράζουν IGF1R, ένα πλασμίδιο που εκφράζει το IGF1R ORF επιμολύνθηκε σε Caco2, ΗΤ29 και κύτταρα SW480. Η αποτελεσματική υπερέκφραση ή knockdown του IGF1R φαίνεται στο Σχήμα S1 στο S1 αρχείου. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι IGF1R προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [27], Caco2, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με το πλασμίδιο IGF1R υπερέκφραση πολλαπλασιάστηκαν σε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό (Σχήμα 3C, 3G και 3K), ενώ IGF1R knockdown με το siRNA σημαντικά κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό (Σχήμα 3Β, 3F και 3J). Έτσι, η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του IGF1R knockdown ήταν παρόμοια με miR-143/145 υπερέκφραση. Επιπλέον, κατασκευάσαμε ένα πλασμίδιο υπερέκφραση IGF1R ανθεκτικό σε miR-143/145 (με εξάλειψη του 3′-UTR του). Σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-143/145 κύτταρα επιμολύνονται με προ-miR-143/145 και το πλασμίδιο IGF1R υπερέκφραση εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3D, 3Η και 3L), υποδηλώνοντας ότι miR-143/145 ανθεκτικών IGF1R διασώθηκε την καταστολή της IGF1R με miR-143/145 και εξασθενημένα την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του miR-143/145.

(Α, Ε και Ι) δοκιμασίες CCK-8 βιωσιμότητα διεξήχθησαν 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση Caco2 (Α), ΗΤ29 (Ε) και τα κύτταρα SW480 (Ι) με ένα περιπλεγμένο έλεγχο, προ-miR-143, προ-miR-145 ή και τα δύο προ-miR-143 και προ -miR-145. (B, F και J) κύτταρα CCK-8 δοκιμασίες βιωσιμότητας διεξήχθησαν 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση Caco2 (Β), ΗΤ29 (F) και SW480 (J) είτε με ένα κωδικοποιημένο ελέγχου siRNA ή IGF1R siRNA. (C, G και Κ) κύτταρα CCK-8 δοκιμασίες βιωσιμότητας διεξήχθησαν 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση Caco2 (C), ΗΤ29 (G) και SW480 (Κ) είτε με φορέα αναφοράς ή υπερέκφραση IGF1R διάνυσμα. (D, Η και L) CCK-8 δοκιμασίες βιωσιμότητας διεξήχθησαν 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων Caco2 (D), ΗΤ29 (H) και SW480 (L) με είτε ένα περιπλεγμένο ελέγχου, προ-miR -143 /145 ή και τα δύο προ-miR-143/145 και το διάνυσμα IGF1R υπερέκφραση. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Για να ελέγξετε περαιτέρω τη βιολογική επίδραση του IGF1R στοχευμένες miR-143/145 για την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, την επίδραση των miR-143/145 και IGF1R στο κελί πολλαπλασιασμός εξετάστηκε με μια δοκιμασία edu, μια ανοσοχημική μέθοδο ανίχνευσης που μετρά ανάλογο νουκλεοτιδίου ενσωμάτωση στο νέο αναπαραχθεί DNA. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από την δοκιμασία CCK-8, το ποσοστό των edu-θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-143/145 (Σχήμα 4Α και 4Β). Παρομοίως, σημαντικά περισσότεροι edu-θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν στα κύτταρα με υπερέκφραση IGF1R, ενώ IGF1R-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν το αντίθετο αποτέλεσμα επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 4C και 4D). Αυτά τα αποτελέσματα και πάλι αποδειχθεί ότι τα μειωμένα επίπεδα IGF1R απέδωσε τον ίδιο φαινότυπο που παρατηρείται από το miR-143/145 υπερέκφραση. Για να εξεταστεί περαιτέρω η λειτουργική σχέση μεταξύ miR-143/145 και IGF1R, τα κύτταρα Caco2 ταυτοχρόνως επιμολύνθηκαν με προ- miR-143/145 και το πλασμίδιο IGF1R υπερέκφραση. Όπως ήταν αναμενόμενο, η υπερέκφραση του IGF1R διασωθεί δραματικά την κατασταλτική δράση του miR-143/145 για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 4Ε και 4F). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι miR-143/145 καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με φίμωση IGF1R.

Τα ερυθρά φθορίζοντα κύτταρα είναι στη φάση S της μίτωσης, και τα μπλε φθοριζόντων κυττάρων αντιπροσωπεύουν όλα τα κύτταρα. (Α και Β) Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού edu εκτελέστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων Caco2 με ένα περιπλεγμένο έλεγχο, προ-miR-143, προ-miR-145 ή και τα δύο προ-miR-143 και προ-miR-145. Α: αντιπροσωπευτική εικόνα? Β: αναλογία edu-θετικά κύτταρα Caco2. (Γ και Δ) Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού edu εκτελέστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων Caco2 με ένα περιπλεγμένο ελέγχου siRNA, IGF1R siRNA, φορέα ελέγχου ή τον φορέα IGF1R υπερέκφραση. C: αντιπροσωπευτική εικόνα? D: αναλογία edu-θετικά κύτταρα Caco2. (Ε και ΣΤ) Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΕΠΑ έγινε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων Caco2 με ένα κωδικοποιημένο ελέγχου καθώς και τον έλεγχο των φορέων, μια ομελέτα ελέγχου συν φορέα υπερέκφραση IFG1R, προ-miR-143/145 συν τον έλεγχο φορέα, ή προ-miR -143 /145 συν IFG1R φορέα υπερέκφραση. Ε: αντιπροσωπευτική εικόνα? F: αναλογία edu-θετικά κύτταρα Caco2. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, σημαντικές προόδους στην κατανόηση μας για ορθοκολικό καρκίνο βιολογίας έχουν οδηγήσει σε βελτιωμένη διαγνωστική και προγνωστική τεχνικές και για την ανάπτυξη νέων στοχευμένες θεραπείες. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα των νέων θεραπειών παραμένει περιορισμένη από ένα συνδυασμό αντοχής σε φάρμακο και από την περιορισμένη κατανόηση της μονοπατιών σηματοδότησης κυττάρου όγκου. Πρόσφατα, ένας σημαντικός ρόλος για IGF1R στη γένεση και την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου έχει προκύψει [28] – [30]. Έτσι, IGF1R προσφέρει μια ιδιαίτερα υποσχόμενη μοριακός στόχος για τον ορθοκολικό θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ρύθμιση της έκφρασης IGF1R σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Έτσι, πρέπει να διευκρινιστεί πλήρως οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν IGF1R ρυθμιστικά μονοπάτια.

Σε αυτή τη μελέτη, είχαμε προβλέψει IGF1R να είναι ένας στόχος του miR-143 και miR-145, το οποίο είναι ένα σύμπλεγμα miRNAs που έχουν αναφερθεί σε πολλές μελέτες για να ρυθμίζεται προς τα κάτω και να λειτουργήσουν ως καταστολείς όγκων σε περισσότερες μορφές καρκίνου [21], [22]. Μετά τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης του miR-143/145 και IGF1R σε ανθρώπινο ορθοκολικό καρκινικό ιστό και αντιστοιχισμένο noncancerous ιστού, εντοπίσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-143/145 επίπεδα και επίπεδα πρωτεΐνης IGF1R. Επιπλέον, από υπερεκφράζουν το miR-143/145 κύτταρα Caco2, έχουμε πειραματικά επικυρωμένη ότι το miR-143/145 απευθείας ανέστειλε τη μετάφραση IGF1R. Τέλος, δείξαμε ότι το miR-143/145 ανέστειλε την έκφραση IGF1R και, κατά συνέπεια, κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου

στο

vitro

. Τα αποτελέσματα σκιαγραφούν μια νέα ρυθμιστική δίκτυο που απασχολούν miR-143/145 και IGF1R να τελειοποιήσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Έχουμε παρείχε επίσης ενδείξεις ότι η αποκατάσταση της έκφρασης IGF1R μπορεί να αντιστρέψει το miR-143/145-κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, είχε προηγουμένως δείξει ότι miR-145 μπορούν να στοχεύσουν υπόστρωμα-1 υποδοχέα ινσουλίνης (IRS-1) και IGF1R σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [31] – [33]. Ωστόσο, ενώ ένα IRS-1 ανθεκτικό σε miR-145 μπορεί να διασώσει καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα από miR-145 που προκαλείται από αναστολή της ανάπτυξης, ένα ανθεκτικό σε miR-145 IGF1R απέτυχε να διασώσει κύτταρα καρκίνου κόλου από την αναστολή της ανάπτυξης [33]. Αυτό δεν είναι σύμφωνο με τα ευρήματά μας. Φαίνεται ότι αν miR-145 μπορούν να στοχεύουν IGF1R να ρυθμίσει την ανάπτυξη των κυττάρων εξαρτάται από τους τύπους των κυττάρων και του όγκου. Υπό διαφορετικές συνθήκες, miR-145 μπορεί να ασκήσει διαφορετικές λειτουργίες. Παρ ‘όλα αυτά, τα ευρήματα μας και άλλοι τονίζουν ότι το miR-143/145 μπορεί να λειτουργήσει ως ογκο-κατασταλτικά miRNAs, και ότι η στόχευση των IGF1R μπορεί να είναι ένας μηχανισμός με τον οποίο το miR-143/145 σύμπλεγμα ασκεί τη λειτουργία καταστολής όγκου του. Ως εκ τούτου, η διαμόρφωση των IGF1R από miR-143/145 μπορεί να εξηγήσει γιατί η προς τα κάτω ρύθμιση των miR-143/145 κατά τη διάρκεια του παχέος καρκινογένεση μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του καρκίνου.

miRNAs που βρίσκονται κοντά στο γονιδίωμα (μέσα σε 10 kb) θεωρούνται ότι ανήκουν σε ένα ενιαίο σύμπλεγμα. Τα miRNA συστάδες μεταγράφονται συντονισμένα ως πολυκιστρονικών μονάδες που υποβάλλονται σε επεξεργασία για την παραγωγή των μεμονωμένων μελών miRNA, που καταλήγουν σε συν-έκφραση των miRNAs.