Abstract

Τα καρκινικά κύτταρα είναι εγγενώς ετερογενή και συχνά εμφανίζουν μειωμένη πρόσφυση, με αποτέλεσμα την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων στην κυκλοφορία για να σχηματίσουν κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTCs). Ένα κλάσμα από αυτά είναι ζωντανά ΚΜΑ με το δυναμικό του μεταστατικού αποικισμού, ενώ άλλοι βρίσκονται σε διάφορα στάδια της απόπτωσης που τους καθιστά πιθανό να είναι λιγότερο σχετικές με την κατανόηση της νόσου. Απομόνωση και χαρακτηρισμός των ζωντανών ΚΜΑ μπορεί να αυξήσει πληροφορίες που προκύπτουν από το πρότυπο απαρίθμηση για να βοηθήσει τους γιατρούς να καθορίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια τη διάγνωση, να επιλέξουν τη θεραπεία, την παρακολούθηση της ανταπόκρισης και παρέχει πρόγνωση. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν σε μια ομάδα εγγύς υπέρυθρο χρωστικές (NIR) heptamethine καρβοκυανίνη που είναι ειδικά και μεταφέρεται ενεργά σε ζωντανά καρκινικά κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, αυτό βιώσιμο κυττάρου όγκου-ειδική συμπεριφορά χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση ζωντανών CTCs σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) από 40 ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη, μαζί με 5 ασθενείς με μεταστατική νόσο βάφτηκαν με IR-783, το πρωτότυπο βαφή κυανίνης heptamethine. Βιτρώ κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τον εντοπισμό ζωντανών (NIR

+) ΚΜΑ από την πισίνα του συνολικού ΚΜΑ, που εντοπίστηκαν από EpCAM χρώσης. Σε ασθενείς με εντοπισμένο όγκο, ζωντανή μετράει CTC αντιστοιχούσε με συνολικό αριθμό CTC. Υψηλότερες ζωντανή μετράει CTC παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με μεγαλύτερους όγκους και τα άτομα με πιο επιθετική παθολογικά χαρακτηριστικά συμπεριλαμβανομένων των θετικών περιθωρίων ή /και λεμφαδένων εισβολή. Ακόμη μεγαλύτεροι αριθμοί CTC (ζωντανά και σύνολο) ανιχνεύθηκαν σε ασθενείς με μεταστατική νόσο. Ζωντανά μετράει CTC μειώθηκε όταν οι ασθενείς ελάμβαναν αποτελεσματικές θεραπείες, και αντιστρόφως οι μετρήσεις έτειναν να αυξάνονται κατά το χρόνο της εξέλιξης της νόσου. Η μελέτη μας αποδεικνύει τη σκοπιμότητα της εφαρμογής αυτής της τεχνικής χρώσης για τον εντοπισμό ζωντανών ΚΜΑ, δημιουργώντας μια ευκαιρία για περαιτέρω μοριακή ανάκριση ενός πιο βιολογικά σχετικό πληθυσμό CTC

Παράθεση:. Shao C, Liao CP, Χου P, Chu CY , Zhang L, Bui MHT, et al. (2014) Ανίχνευση Ζωντανή Κυκλοφορούν Tumor Cells από μια κλάση της Εγγύς Υπέρυθρο Heptamethine καρβοκυανίνη Βαφές σε ασθενείς με εντοπισμένο και Μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (2): e88967. doi: 10.1371 /journal.pone.0088967

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 19 του Σεπ 2013? Αποδεκτές: 14 του Γενάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Shao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Καρκίνου του προστάτη, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας /Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (2PO1CA098912 και 1RO1CA122602) και του Διοικητικού συμβουλίου των Διοικητών Cancer Research πρόεδρος (LWKC), και από το Πρόγραμμα του Διεθνούς Κέντρου Επιστήμης και Τεχνολογίας συνεργασίας της Κίνας (Όχι . 2011DFA33110). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στερεά όγκοι βρίσκονται σε συνεχή εξέλιξη με την προοδευτική ετερογένεια [1], [2]. Η διαδικασία της μεταστατική εξέλιξη συνοδεύεται από πολλαπλές φαινοτυπικές εναλλαγές που οδηγούν σε μειωμένη κολλητικότητα και αυξημένη κυτταρική κινητικότητα μεταξύ άλλων αλλοιώσεις [3]. Μερικά κινητικά καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να διαδώσουν σε απομακρυσμένες θέσεις μέσω του αγγειακού συστήματος και του λεμφικού κανάλια και εισβάλλουν ιστού που οδηγεί στο σχηματισμό ενός μεταστατική βλάβη [4]. Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ) σχηματίζουν έτσι ένα βασικός σύνδεσμος μεταξύ πρωτογενών όγκων και απομακρυσμένων μεταστάσεων τους, οριοθετούν μη αναστρέψιμη εξέλιξη της νόσου. Απομόνωση και χαρακτηρισμός αυτών των ζωντανών και ενεργών καρκινικά κύτταρα μπορεί να βελτιώσει την πρόγνωση της νόσου, όπως έχει καταδειχθεί σε καρκίνο του προστάτη (PCA) [5].

Η αποβολή του ΚΜΑ είναι μια δυναμική διαδικασία που συμβαίνει και με τις δύο πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκων. Το γεγονός ότι διαδίδονται καρκινικά κύτταρα μπορούν να ανιχνευθούν στο αίμα ασθενών προστάτη μετά από προστατεκτομή [6] δείχνει ότι ΚΜΑ μπορεί να αποβάλλεται από είτε υπολειμματικά όγκου στο κρεβάτι του προστάτη ή από μεταστατικό καταθέσεις. Μοριακή διερεύνηση αυτών των κυττάρων μπορεί να παρέχει πληροφορίες σε πραγματικό χρόνο σχετικά με την κατάσταση της κακοήθη εξέλιξη. Καθώς η συλλογή της ΚΜΑ απαιτεί συνήθως χαμηλού όγκου πρότυπο φλεβοτομία, μερικοί έχουν προτείνει ότι η ΚΜΑ μπορεί να αξιοποιηθεί ως ένα ιδανικό υποκατάστατο ιστού ή υγρού βιοψία για τη μέτρηση της κατάστασης της νόσου [7]. Μια τέτοια πηγή ιστού θα παρέχουν μια απλή, ελάχιστα επεμβατική πηγή ιστού που θα μπορούσε να έχει πρόσβαση σε σειρά για να παρέχουν υψηλή χρονική οριοθέτηση της εξέλιξης της υποκείμενης νόσου.

Η προγνωστική αξία της ΚΜΑ βασίζεται στην τεχνική πρόοδος να εξασφαλίζεται η αξιόπιστη ανίχνευση και απομόνωση. CTCs αποτελούν μόνο ένα μικρό μέρος μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PMBCs). Πολλές νέες τεχνολογίες σήμερα δοκιμάζονται για την ανίχνευση και την απομόνωση [8] CTC. Το πλέον κοινώς χρησιμοποιούμενα στρατηγική στηρίζεται στην επιθηλιακά γράμμωσης-ειδικούς δείκτες όπως EpCAM [9] ή σε διαφορές του μεγέθους σε σχέση με PBMCs [10]. Το μόνο εγκεκριμένο από την FDA δοκιμασία CTC χρησιμοποιεί ανοσομαγνητικό τεχνική διαχωρισμού με βάση την έκφραση του epitheial επιφανειακών δεικτών [11], [12]. Η σχετικά χαμηλή ευαισθησία του προσδιορισμού, σε συνδυασμό με την απαίτηση για προ-στερέωση κάνει τις απομονώσεις ακατάλληλα για μοριακή ανάλυση πέρα ​​ανοσοφθορισμού. Η εξάρτηση από την έκφραση δείκτης δεν επιτρέπει για την πλήρη ανίχνευση του ετερογενούς πισίνα CTC. Είναι επίσης γνωστό ότι δεν είναι κάθε CTC θα οδηγήσει σε ένα νέο μεταστατική βλάβη. Η πισίνα του ΚΜΑ αποτελείται από ζωντανά και ενεργά μεταστατικά κύτταρα και τους παρευρισκομένους που παθητικά ρίξει στην κυκλοφορία [5], [13] – [15], σε συνδυασμό με αποπτωτικό κύτταρο όγκου συντρίμμια [16] – [18]. Οι εναλλακτικές στρατηγικές ανίχνευσης CTC απαιτείται, να απομονωθεί το κλάσμα μετάστασης, η οποία είναι πιο πιθανό να βρεθεί στο live πισίνα CTC.

Για να αναπτυχθεί μια οικονομικά αποδοτική μέθοδος για τον εντοπισμό ζωντανών ΚΜΑ, αξιολογήσαμε τη δυνατότητα χρησιμοποίησης μια ομάδα συνθετικών εγγύς υπέρυθρο (NIR) χρωστικές heptamethine καρβοκυανίνη. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι αυτές οι οργανικές χρωστικές μεταφέρονται ειδικά σε καρκινικά κύτταρα και μπορούν να διακρίνουν τα κακοήθη από μη-κακοήθη κύτταρα σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ή αυθόρμητες όγκους

in vivo,

και σε χειρουργικά δείγματα όγκου

in vivo

ή

ex vivo

[19], [20]. Αυτές οι βαφές παραλαμβάνεται και συσσωρεύονται από τα καρκινικά κύτταρα μέσω ενός ενεργού ανεξάρτητο σύστημα μεταφοράς του χρησιμοποιούνται συμβατικά επιθηλιακά δείκτη επιφανείας (EpCAM). Περαιτέρω πρόσληψη της χρωστικής απαιτεί ενεργή (ΑΤΡ-καθοδηγείται) μεταφοράς και επομένως μπορεί να θεωρηθεί ως μία λειτουργική δοκιμασία για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα από την μελέτη δείχνουν ότι IR-783, το πρωτότυπο αυτής της ομάδας των επιλεγμένων βαφών NIR, μπορούν να ενσωματωθούν σε διάφορα πρωτόκολλα ανίχνευσης για τον εντοπισμό ζώντων CTCs. Αυτά τα ζωντανά ΚΜΑ θα μπορούσαν να απομονωθούν από ασθενείς με καρκίνο πριν και κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής παρέμβασης δεδομένων των σχετικά μη-επεμβατικά μέσα προμηθειών. Περαιτέρω μοριακή ανάκριση θα μπορούσε στη συνέχεια να προκύψουν ακόμη και σε επίπεδο ενός κυττάρου [21].

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) μονοκλωνικά συζευγμένο ποντίκι αντίσωμα (mAb) για την ανθρώπινη EpCAM (κλώνος 9C4) και φυκοερυθρίνη (ΡΕ) mAb ποντικού για CD45, μαζί με καθαρισμένο ισότυπο IgG1 και IgG2b, αγοράστηκαν από την BioLegend (San Diego, CA). Η πηγή και η χρήση άλλων αντισωμάτων έχει αναφερθεί στο παρελθόν, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων κατά της ανθρώπινης RANKL, HIF-1α, ΕΠΜ-1, και VEGF, καθώς και εκείνες για φωσφορυλιωμένη c-ΜΕΤ και την ρ65 υπομονάδα της ΝΡκΒ [22]. Οι πηγές και ο καθαρισμός των heptamethine βαφών καρβοκυανίνη έχουν αναφερθεί προηγουμένως [19], [20]. Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 αγοράστηκε από την GE Healthcare (Piscataway, NJ), και Histopaque-1077 αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).

Cell Culture

Ανθρώπινο PC -3 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA), πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml). Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με 0,05% θρυψίνη /ΕϋΤΑ (Invitrogen, Carlsbad, CA), πλύθηκαν σε Ca

2 + – και Mg

2 + -δωρεάν ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS, Invitrogen), και επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο καλλιέργειας . Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε μετρητή κυττάρων TC10 Αυτοματοποιημένο (Bio-Rad, Hercules, CA), με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου για να επιβεβαιώσετε τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

κλινικά δείγματα αίματος

δείγματα αίματος των ασθενών χρησιμοποιήθηκαν με γραπτή επιγνώσει συναίνεση μέσω Cedars-Sinai Medical Center θεσμική αναθεώρηση βιο-banking πρωτόκολλα συμβούλιο εγκεκριμένο (IRB # Pro00025217 και # Pro00030418). Κλινικά δείγματα αίματος συλλέχθηκαν προεγχειρητικά από 40 ασθενείς με προστάτη που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή στο Cedars-Sinai Medical Center. Πολλαπλά δείγματα αίματος ελήφθησαν από επανειλημμένες επισκέψεις του 5 ασθενείς με ανεξάρτητο από ανδρογόνα ασθένεια. Ελήφθησαν Επιπλέον δείγματα αίματος από 34 υγιείς άρρενες δότες ηλικίας μεταξύ 32 και 70 ετών. Περίπου 7,5 ml φλεβικού αίματος συλλέχθηκε σε ένα EDTA που περιέχει λεβάντα επάνω σωλήνα (BD, Franklin Lakes, NJ), και φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε φυγόκεντρο Heraeus CLINIFUGE (Thermo Scientific, Logan, UT). Αφού το κλάσμα πλάσμα συλλέχθηκε για διαγνωστικούς σκοπούς, το συσκευασμένο κλάσμα των κυττάρων του αίματος μεταφέρθηκε σε πάγο στο εργαστήριο έρευνας εντός 3 ωρών από τη συλλογή.

Απομόνωση των PBMC

PBMCs απομονώθηκαν με πρότυπες πυκνότητα κλίση φυγοκέντρηση. Το συσκευασμένο δείγμα αίματος αραιώθηκε με ίσο όγκο ενός ισορροπημένο διάλυμα άλατος που περιέχει 0.01% γλυκόζη (β /ο), 5 μΜ CaCl

2, 9,8 μΜ MgCl

2, 540 μΜ ΚΟΙ, 126 mM NaCl, και 14,5 mM Tris, ρΗ 7.6. Μια 2-ml υποπολλαπλάσιο του αραιωμένου δείγματος επιστρώθηκε πάνω σε 3 ml Ficoll-Paque μαξιλάρι και υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση στα 400 χ g σε θερμοκρασία δωματίου για 40 λεπτά. Τα κύτταρα στο κλάσμα εμπύρηνων κυττάρων συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, και επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 5% FBS για περαιτέρω αναλύσεις.

Tumor κυττάρων εμβολιασμού και χρώση

Δείγματα του PBMCs έγιναν έτσι ώστε κάθε περιείχε ένα ισοδύναμο αριθμό κυττάρων από την 1η αίματος ml δότη, περίπου 2 × 10

6 κύτταρα /δείγμα. Για ακίδα με καρκινικά κύτταρα, που είναι γνωστή αριθμού ζωντανών PC-3 κύτταρα σε RPMI 1640 που περιέχει 5% FBS προστέθηκαν στο κλάσμα PBMC. Κατά τον έλεγχο μελέτες εμπλουτίστηκε με νεκρά κύτταρα καρκίνου, PC-3 κύτταρα σε εναιώρημα απλού κυττάρου σκοτώθηκαν σε 75% αιθανόλη και ανακτήθηκε στο ίδιο μέσο. Τα εμβολιασμένα δείγματα στη συνέχεια βάφτηκαν με βαφές NIR 20 μΜ στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά από πλύσιμο δύο φορές σε PBS για να απομακρυνθεί η ελεύθερη βαφές, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, και επαναιωρήθηκαν σε 400 μΙ κυττάρων ρυθμιστικό υλικό κηλιδώσεως (BioLegend). Για την περαιτέρω λεκέ για επιφανειακούς δείκτες, τα δείγματα επωάστηκαν πρώτα με ισότυπο IgG σε πάγο για 10 λεπτά, και στη συνέχεια αντιδρά ταυτόχρονα με FITC-συζευγμένο mAb προς EpCAM και ΡΕ-συζευγμένου mAb προς CD45 για 20 λεπτά. Η αναλογία εργασίας των mAbs ήταν 0,1 μg /10

6 κύτταρα. Μετά από πλύση δύο φορές με το κύτταρο χρώσης Buffer, τα κύτταρα βάφτηκαν με 4 ‘, 6’-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, Invitrogen) πριν να υποβληθεί στην ανίχνευση.

Ανίχνευση CTC με φθορισμό διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένων (FACS)

Δύο FACS μέσα (BD Biosciences, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Για να απομονωθεί ΚΜΑ, ένα FACSAria III χρησιμοποιήθηκε για να ταξινομήσετε τα θετικά σημασμένα κύτταρα πάνω σε μια APES επικαλυμμένο με κυτταρολογία slide (Bio-World, Dublin, ΟΗ). Να απαριθμήσει ΚΜΑ, μια LSRII κυτταρομετρητή ροής χρησιμοποιήθηκε. ακολουθήθηκαν συνιστώμενες διαδικασίες ανίχνευσης κατασκευαστή. Παράλληλα με την ανίχνευση από κάθε δείγμα ανθρώπινου αίματος, 1 × 10

4 PC-3 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να ακίδα ένα δείγμα 1 ml του δείγματος. Το προφίλ κυτταρομετρίας ροής εμβολιασμένο δείγμα χρησιμοποιήθηκε για να καθοδηγήσει την πύλης θετικότητα. δεδομένα FACS αναλύθηκε περαιτέρω με λογισμικό FlowJo.

φθορισμού Imaging

χρωματισμένων κυττάρων που έχουν απομονωθεί με διαλογέα FACS σε διαφάνειες υποβλήθηκαν τόσο απεικόνιση φθορισμού και εγγύς υπέρυθρη απεικόνιση με προηγουμένως αναφερθείσα διαδικασία μας [19] , [20], [22], με ένα μικροσκόπιο φθορισμού Nikon Eclipse Ti διεγείρεται από μια πηγή φωτός xenon τόξου. Κοντά υπέρυθρες εικόνες αποκτήθηκαν μέσα από μια Ινδο φίλτρου (780-840 nm).

Πολλαπλές Quantum Dot Labeling (mQDL)

Βιτρώ κύτταρα συλλέγονται με διαλογέα FACS σε γυάλινες πλάκες υποβλήθηκαν σε περαιτέρω χρώση με το πρωτόκολλο mQDL όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, τα δείγματα υποβλήθηκαν αρχικά σε επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα απογύμνωσης για την απομάκρυνση του mAb που χρησιμοποιείται για την απομόνωση CTC, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε διαδοχικές χρώση με αντισώματα που αντιδρούν σε μια ομάδα προστάτη σχετίζονται με βιοδείκτες, συμπεριλαμβανομένων RANKL, HIF-1α, ΕΠΜ-1, VEGF , pc-ΜΕΤ, και ρ-ρ65, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22], με το ίδιο πρωτόκολλο χρώσης. Τέλος, τα δείγματα αντίθετα με DAPI πριν υποβληθεί σε φασματική απεικόνιση και ποσοτικοποίηση του σήματος σε ένα σύστημα φασματικής απεικόνισης CRI με το λογισμικό Nuance (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ).

Στατιστική Ανάλυση

Μέσα, τυπικές αποκλίσεις και διάμεσοι χρησιμοποιήθηκαν για να συνοψίσει τις συνεχείς μεταβλητές. Οι συχνότητες και τα ποσοστά υπολογίστηκαν για τις κατηγορικές μεταβλητές. Συσχετίσεις Spearman υπολογίστηκαν μεταξύ συνεχείς μεταβλητές στα δεδομένα λόγω λοξή διανομές. Συγκρίσεις των ζωντανών CTC μεταξύ των κατηγοριών ενδιαφέροντος έγιναν χρησιμοποιώντας τεστ Wilcoxon Rank Sum. Ένα γραμμικό μεικτό μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ του αριθμού των κυττάρων που εμπλουτίστηκε και ανακτώνται, όπου οι επαναλαμβανόμενες μετρήσεις για τους δότες διαμορφώθηκαν με μια ετερογενή δομή συνδιασποράς ένωση συμμετρική. Όλες οι αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας SAS έκδοση 9.3.

Αποτελέσματα

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ενεργά την πρόσληψη και τη διατήρηση των βαφών NIR από καλλιεργημένα ανθρώπινα προστάτη LNCaP, C4-2, PC-3, DU-145 , ARCaP

Ε και ARCaP

Μ κυττάρων [19], [20]. Όπως λίγα όσο δέκα PC-3 κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε 1 ml ανθρώπινο αίμα δότη μπορεί να ανιχνευθεί με τη χρήση IR-783. Νεκρά κύτταρα PC-3 εμπλουτίστηκε με τον ίδιο τρόπο απέτυχαν να εμφανίζουν κάθε απορρόφηση IR-783. Λόγω πρόσληψη IR-783 απαιτεί τη χρήση ενός ΑΤΡ που απαιτεί μεταφορέα οργανικού ανιόντος, βαφή πρόσληψη μόνη της είναι μια λειτουργική δοκιμασία, η οποία δείχνει προς τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων. Για την αξιολόγηση εφαρμογής αυτής της προσέγγισης για την ανίχνευση ζωντανά CTCs σε δείγματα αίματος ασθενών, ενσωματώσαμε χρώση χρωστική NIR σε ανάλυση FACS. Το ευρέως χρησιμοποιούμενο EpCAM

+ CD45

-Προφίλ [9], [12] εκδόθηκε για την εδραίωση της CTC φύση του ανιχνεύεται NIR

+ κύτταρα.

1. Ταυτοποίηση και απομόνωση του Ζωντανά (NIR

+) κύτταρα από ανθρώπινο αίμα

δείγματα αίματος των ασθενών υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση βαθμίδωσης τότε διαδοχική κηλίδωση: πρώτα με NIR χρωστικής για τη χρώση ζώντων ΚΜΑ, στη συνέχεια με φθορισμό σημασμένα αντισώματα να EpCAM και CD45 για επιβεβαίωση. Τέλος, το δείγμα κηλιδώθηκε με DAPI για την οπτικοποίηση των κυτταρικών πυρήνων.

Ως μάρτυρας για τη βαθμονόμηση της απόδοσης του συστήματος ανίχνευσης, ελέγξαμε πρώτα το πρωτόκολλο χρώσης με υγιή δότη αίματος εμπλουτίστηκε με PC-3 κύτταρα σε ποικίλους αριθμούς. Στην ανάλυση FACS, τα χρωματισμένα δείγματα ταξινομήθηκαν για να απομονώσει το EpCAM

+ CD45

– πληθυσμού. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια κατέφυγε να προσδιοριστεί ο αριθμός των NIR

+ DAPI

+ κύτταρα (Σχήμα 1Α). PC-3 κύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως τα εμπύρηνα κύτταρα (DAPI

+) που εκφράζουν EpCAM αλλά όχι CD45 (Εικόνα S1). Σε επαναλαμβανόμενες δοκιμές, όταν το τελικό EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ μετρήσεις μοντελοποιηθεί ως συνάρτηση του αριθμού των κυττάρων καρφιά, μια σημαντική αυξητική τάση παρατηρήθηκε με συντελεστή συσχέτισης 0.997 ( Το Σχήμα 1Β και S1). Η εξαιρετικά γραμμική συσχέτιση πρότεινε ότι αυτό το πρωτόκολλο FACS ήταν χρησιμοποιήσιμο για την ανίχνευση CTCs με αμελητέο αριθμό μη ειδικές αριθμήσεις. Προσδιορίσαμε επίσης ότι τα ανακτηθέντα κύτταρα PC-3 σε πλακίδια μικροσκοπίου θα μπορούσε εύκολα να φανεί με μικροσκοπία φθορισμού (Σχήμα 1 C). Χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο, ανιχνεύσαμε 2.8 ± 1.7 EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ γεγονότα σε μια σειρά από μελέτες με δείγματα αίματος που συλλέχθηκαν από 34 υγιή άτομα δότη (Εικόνα 1Β). Αυτή η ανίχνευση ήταν καλά σε συμφωνία με άλλες μελέτες για EpCAM

+ κυττάρων σε υγιή δείγματα αίματος του δότη αναλύθηκαν με τη χρήση νέας γενιάς CTC πλατφόρμες [23], και πιθανώς αντανακλά το επίπεδο υποβάθρου των κυκλοφορούντων επιθηλιακών κυττάρων. Είναι σημαντικό ότι, σε παράλληλες μελέτες, όπου νεκροί PC-3 κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε εμβολιασμού, η EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ μετρήσεις διατηρήθηκαν στο επίπεδο φόντου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εμπλουτίστηκε νεκρούς PC-3 κύτταρα δεν πάρει τη χρωστική (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι μελέτες ελέγχου αποδεικνύουν συλλογικά την καταλληλότητα των NIR χρωστικής για τη χρώση και τον εντοπισμό ζώντων CTCs.

Ανθρώπινο προστάτη PC-3 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικά κύτταρα ελέγχου. Α, PC-3 κύτταρα βάφονται διαδοχικά με όλους τους τέσσερις παράγοντες ανίχνευσης υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS. Άνω του πίνακα: το δείγμα ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά για το θετικό EpCAM (FITC), αλλά αρνητική CD45 (ΡΕ) λεκέ (οριοθετημένα κλάσμα). Κάτω πίνακας: η περίφραξη κλάσμα ερωτηθούν για το IR-783 (NIR) και πυρηνικών (DAPI) λεκέ. NIR

+ EpCAM

+ DAPI

+ CD45

– μετρήσεις θεωρήθηκαν ως ζωντανά καρκινικά κύτταρα. ανίχνευση PC-3 χρησιμοποιήθηκε παράλληλα με την ανάλυση της κάθε κλινικό δείγμα ως οδηγός σε ρύθμιση πύλη. Β, Αποτελεσματικότητα της στρατηγικής ανίχνευσης εκτιμήθηκε με σύγκριση του αριθμού των αιχμηρών και ανιχνεύθηκαν κύτταρα PC-3 με ανάλυση FACS. Κάθε σημείο δεδομένων ήταν ο μέσος όρος ανιχνεύεται PC-3 κύτταρα εμπλουτίστηκαν για 6 δείγματα υγιούς δότη. C, Μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει PC 3-κυττάρων που ανακτήθηκαν πάνω σε ένα γυάλινο πλακίδιο. Άνω γραμμή δείχνει τις εικόνες ενός αντιπροσωπευτικού πεδίου με χαμηλή μεγέθυνση (40 ×? Bar = 250 μm), με δύο κύτταρα (που σημειώνονται με 1 και 2), που παρουσιάζεται σε μεγάλη μεγέθυνση στα κατώτερα δύο σειρές (400 ×? Bar = 25 μm) .

Η

2. Ανίχνευση Ζωντανή ΚΜΑ σε ασθενείς με εντοπισμένο προστάτη ριζικές προστατεκτομή

Χρησιμοποιώντας την λειτουργική ανάλυση FACS μετά από χρώση NIR, ελέγξαμε η ανίχνευση της EpCAM

+ CD45

-DAPI

+ κύτταρα, εφεξής αναφέρεται ως

συνολική

ΚΜΑ, σε ασθενείς κλινική προστάτη με έμφαση στην EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ εκδηλώσεων (αναφέρεται στο εξής ως

ζήσουν

ή

NIR

+

CTCs). PBMCs απομονώθηκαν από προεγχειρητική δείγματα αίματος από 40 ασθενείς με διάγνωση εντοπισμένες διαταραχές. Λεπτομερείς χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών συνοψίζονται στον πίνακα 1.

Η

Αυτή η σειρά ανάλυση αποκάλυψε ότι τα ζώντα CTC μετράει ποικίλη αξιοσημείωτα μεταξύ των ασθενών. EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ μετράει κυμαίνεται από 0 έως 439 κύτταρα /ml (μέσος όρος 25 κύτταρα /ml? Διάμεσος 10 κύτταρα /ml) για αυτή την ομάδα των ασθενών περιεγχειρητικής (Πίνακας 1). Σε αυτή τη μελέτη, η καταμέτρηση των λιγότερο από 5 θεωρήθηκε φυσιολογικό, ως υγιούς δωρητών μας είχε 2.8 ± 1.7 EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ μετράει (Εικόνα 1Β). Η μέθοδος χρώσης ανιχνεύονται αναπαραγωγικά περισσότερο από 5 ζωντανά CTCs /ml σε 30 από τους 40 ασθενείς. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από την ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής δείχνεται στο Σχήμα 2Α. Δείξαμε επίσης ότι τα ΚΜΑ θα μπορούσαν να απομονωθούν άμεσα επάνω πλάκες μικροσκοπίου, και θα μπορούσε να απεικονιστεί με μικροσκοπία φθορισμού (Σχήμα 2Β). Σε αυτές τις αναλύσεις, ζωντανή ΚΜΑ διακρίνονται από τα νεκρά κύτταρα με βάση την πρόσληψη της χρωστικής NIR (Εικόνα 2Β).

Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα ανίχνευσης εμφανίζεται. Α, πάνω σειρά δείχνει την ανίχνευση CTC από τον ασθενή 6, όπου βρέθηκαν 10 ζωντανές ΚΜΑ. Κάτω γραμμή δείχνει την ανίχνευση του 148 ζωντανών ΚΜΑ από ασθενή 14. Για κάθε δείγμα, ρύθμιση πύλη σκηνοθεσία παράλληλη χρώση της PC-3 κύτταρα. Β, ΚΜΑ ανιχνεύονται από τον ασθενή 14 απομονώθηκαν σε μια πλάκα μικροσκοπίου και οπτικοποιούνται άμεσα από την απεικόνιση φθορισμού. Χαμηλή μεγέθυνση εικόνες ενός αντιπροσωπευτικού πεδίου (40 ×? Bar = 250 μm) εμφανίζονται στην άνω σειρά. Παρακάτω, οι εικόνες υψηλής μεγέθυνσης των 2 ζωντανές ΚΜΑ (NIR

+) από τον ίδιο χώρο παρουσιάζεται στα επόμενα δύο σειρές, σε σύγκριση με 2 νεκρούς ΚΜΑ (NIR

-) κατά τα τελευταία δύο σειρές (400 ×? bar = 25 μm).

Η

Η ζωντανή CTC μετράει ανιχνεύονται από αυτή την ομάδα δεν συσχετίζονται σημαντικά με την προεγχειρητική επίπεδο PSA ορού (r = 0,12,

σ

= 0.47, Σχήμα S2), παθολογική Ν-στάδιο (δίνεται μόνο 1 κόμβο θετικό ασθενή), το σκορ Gleason, ή το καθεστώς του περιθωρίου (Σχήμα S3). Συγκρίνοντας CTC μετράει με την προγνωστική μονόγραμμα Stephenson, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική σχέση μεταξύ ζωντανών μετράει CTC και της πρόβλεψης μονόγραμμα Stephenson.

Υπήρχαν 10 ασθενείς με 5 ή λιγότερα ζωντανά ΚΜΑ /ml (Πίνακας 1), και όλα τα είχαν νόσο Τ2 με αρνητικά χειρουργικά όρια. Μόνο ένας από αυτούς τους ασθενείς (ασθενής 26) είχε μια συγκέντρωση PSA ανιχνεύσιμη στον ορό 2 εβδομάδες μετά από ριζική προστατεκτομή. PSA στον ορό του έγινε μη ανιχνεύσιμο στις 6 εβδομάδες μετά την επέμβαση. δεδομένου ότι ο ασθενής έχει παραμείνει ελεύθερη υποτροπής. Υπήρχαν 3 ασθενείς με θετικά χειρουργικά όρια (ασθενείς 2, 13, και 25, Πίνακας 1). Αυτοί οι ασθενείς έχουν επίσης παρέμειναν ελεύθεροι υποτροπών για περισσότερο από δύο χρόνια μέχρι σήμερα, χωρίς πρόσθετες αντικαρκινικές θεραπείες.

Υπήρχαν 3 ασθενείς είχαν ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις του PSA στον ορό μέσα σε 3 μήνες μετά από ριζική προστατεκτομή (Πίνακας 1). Ασθενής 26 είχε ένα pT2cN0 Gleason 3 + 3 καρκίνου με αρνητικά περιθώρια κέρδους. Είναι ενδιαφέρον, είχε μόνο 3 ζωντανή ΚΜΑ /ml αίματος. Ορού PSA σε αυτόν τον ασθενή έγινε μη ανιχνεύσιμο αργότερα χωρίς πρόσθετη παρέμβαση. Ασθενής 29 είχε ένα pT3aN0 Gleason 4 + 5 καρκίνο με θετικά περιθώρια κέρδους, και ανιχνεύθηκε με 46 ζωντανά CTCs /ml. επίπεδο PSA στον ορό του έγινε μη ανιχνεύσιμο μετά από 6 μήνες θεραπείας στέρησης ανδρογόνων που συνεχίζεται μέχρι αυτή τη στιγμή. Ο ασθενής 39 είχε λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες κατά τη στιγμή της επέμβασης και βρέθηκε να έχει υψηλή προεγχειρητική απαριθμήσεις CTC (439 /ml). Πρόσθετες περιπτώσεις υποτροπής πρέπει να εξεταστούν προκειμένου να καθοριστεί εάν πριν από τη λειτουργία CTC μετρήσεις θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως παράμετρος για την πρόβλεψη υποτροπής της νόσου.

Επίσης, σε σύγκριση με ζωντανή CTC μετράει στην κατάσταση χειρουργική περιθώριο. Οι 25 ασθενείς με αρνητικά περιθώρια είχαν κατά μέσο όρο 25 ζωντανά ΚΜΑ /ml (εύρος 0-148), σε σύγκριση με τα 15 ασθενείς με θετικά περιθώρια κέρδους που είχαν κατά μέσο όρο 54 ζωντανά ΚΜΑ /ml (εύρος 2 έως 439). Η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική, πιθανώς λόγω της έντονης διακύμανσης μεταξύ των ατόμων και του περιορισμένου μεγέθους του δείγματος.

Αν και οι περισσότεροι από τους ασθενείς στην ομάδα μας είχε Gleason 6 ή 7 παθολογίες, δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ Gleason σκοράρει και ζουν οι αριθμοί CTC. Από την άλλη πλευρά, οι ασθενείς με υψηλότερο ζωντανές μετρήσεις CTC κινήθηκαν προς έχοντας περισσότερο προχωρημένη νόσο από σταδιοποίηση του όγκου. Υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ ζωντανών μετράει CTC και το στάδιο Τ, με τους ασθενείς ρΤ3 έχουν υψηλότερες μετρήσεις από τις περιπτώσεις pT2 (διάμεση τιμή 8 έναντι 19,

σ

= 0,02). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ο μόνος ασθενής με θετικούς λεμφαδένες ρΝ1 νόσος είχε την υψηλότερη ζωντανή καταμέτρηση CTC (439 ΚΜΑ /ml, ασθενής 39, Πίνακας 1). Υψηλή ζωντανή μετράει CTC, ως εκ τούτου, φάνηκε συσχετίζεται με προχωρημένα στάδια όγκου.

3. Εκτιμήσεις της ζωντανής ΚΜΑ σε ασθενείς με μεταστατικό Ασθένειες

διαδοχικά δείγματα αίματος ελήφθησαν από 5 ασθενείς προστάτη των οποίων η νόσος είχε υποτροπιάσει και μετάσταση μετά την αρχική θεραπεία. Αυτοί οι ασθενείς υποβάλλονταν σε διάφορους τύπους συστηματική θεραπεία. Σε αντίθεση με τη ζωντανή και συνολική CTC μετράει σε ασθενείς με εντοπισμένη νόσο, μεγαλύτερη ανισότητα μεταξύ του συνόλου και να ζήσουν μετράει CTC θεωρήθηκε (Πίνακας 2), ενώ η CTC μετράει σε όλη περιπτώσεις έδειξαν μικρή συσχέτιση του ορού συγκέντρωσης PSA (Εικόνα 3). Παρ ‘όλα αυτά, όταν αναλυθούν σε βάθος χρόνου για μεμονωμένους ασθενείς, εντοπίσαμε ενδιαφέρουσες τάσεις στην οποία ζουν μετράει CTC φάνηκε να συσχετίζονται αντιστρόφως με το παρατηρηθεί κλινικό όφελος σε απάντηση σε θεραπείες.

CTC μετράει ανιχνεύεται από ασθενείς mCRPC αναλύθηκαν μαζί με το πρόοδο της θεραπευτικής παρέμβασης. Δύο αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Α, η προοδευτική αύξηση της CTC μετράει σε ασθενή 41 συσχετίζεται με την κλινική μεταστατική εξέλιξη. Β, η επίμονη χαμηλή CTC μετράει σε ασθενή 42 συσχετισθεί με ευεργετικές αντικαρκινικές θεραπείες.

Η

Ο ασθενής 41 άρχισε βικαλουταμίδη θεραπεία κατά την έναρξη της συλλογής δειγμάτων για μεταστατική ευνουχισμό ανθεκτικά προστάτη (mCRPC). Βίωσε ασυμπτωματική βιοχημική (

δηλ.,

PSA ορού) εξέλιξη για δύο μήνες, κατά την οποία ζουν CTC μετράει αρχικά μειώθηκε, αλλά ανέκαμψε γρήγορα. Η θεραπεία άλλαξε σε οξεικό αμπιρατερόνη, η οποία απέτυχε να παράγει μια βιοχημική απόκριση. Ο ασθενής ανέπτυξε συμπτωματική οστική μεταστατική νόσο και την απαιτούμενη θεραπεία ακτινοβολίας. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου, συνολικές μετρήσεις CTC διατηρήθηκαν, αλλά η ζωντανή αναλογία CTC αυξήθηκε μαζί με το επίπεδο του PSA στον ορό (Πίνακας 2 και Σχήμα 3Α).

Ο ασθενής 42 υποβλήθηκε σε ανίχνευση CTC προ του πρώτου κύκλου της θεραπείας docetaxel, η οποία οδήγησε σε μια εξαιρετική ανταπόκριση κρίνεται από τη συνεχιζόμενη πτώση του επιπέδου στον ορό του PSA ακόμα και μετά τη θεραπεία τελείωσε. Η ασθενής παρέμεινε ασυμπτωματική για ακόμη 4 μήνες πριν χρειαστεί να αναλάβουν άλλα 8 κύκλοι docetaxel για τη συμπτωματική εξέλιξη. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, οι μετρήσεις CTC του ασθενούς μειώθηκε σημαντικά, από 82 μέχρι 6, και ζωντανές CTCs μειώθηκε ανάλογα, από 37 έως 0%. Αυτή η ασθενής παρουσίασε ανάκαμψη στο σύνολο και live ΚΜΑ κατά τη διάρκεια της αγωγής με docetaxel από την ημέρα-20 με τη μέρα-139. Προς το τέλος της αγωγής με docetaxel (από την ημέρα-102 σε μέρα-139), παρατηρήσαμε ζωντανά ΚΜΑ ριμπάουντ 14-94% (Πίνακας 2 και Σχήμα 3Β).

Ο ασθενής 43 έλαβε αρχικά θεραπεία με docetaxel κατά την οποία ο εμφανίζεται αρχική βιοχημικές και κλινικές αποκρίσεις. Ο δεύτερος κύκλος της αγωγής με docetaxel, όμως, ακολούθησε ταχεία εξέλιξη της νόσου με προοδευτική κλινική επιδείνωση (

δηλ.

, Επιδείνωση πόνο και απώλεια βάρους) και την αύξηση του PSA στον ορό. Σημειώσαμε μια δραματική αύξηση στο ποσοστό των ζωντανών ΚΜΑ (από 2% έως 97%), χωρίς ουσιαστικές αλλαγές της συνολικής ΚΜΑ (κυμάνθηκε από 36 έως 44). Ο ασθενής έληξε κατά τους επόμενους 2 μήνες, με ταχεία κλινική επιδείνωση. Η ζωντανή καταμέτρηση CTC αυξήθηκαν σημαντικά, μαζί με την επιδείνωση (Πίνακας 2).

Ο ασθενής 44 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με βικαλουταμίδη για mCRPC. Η θεραπεία δεν είχε ως αποτέλεσμα βιοχημικής όφελος, αλλά μια απότομη πτώση στην CTC μετράει από 1.052 έως σημειώθηκε 54. Παρά την δραματική μείωση της συνολικής ΚΜΑ, ωστόσο, το ποσοστό των ζωντανών ΚΜΑ δεν άλλαξε ουσιαστικά παραμένουν στην περιοχή από 63 σε 88%. Οι μετρήσεις CTC αυξήθηκε 54-196 μεταξύ ημέρα 25 έως την ημέρα-73 κατά το χρόνο τερματίστηκε βικαλουταμίδη θεραπεία. Αυτός ο ασθενής απαιτείται ανακουφιστική ακτινοβολία και τεταρτοταγούς ορμονικών χειρισμών (Πίνακας 2).

Ασθενής 45 είχε ευνουχισμό ευαίσθητο προστάτη και υποβλήθηκε σε διαλείπουσα ανδρογόνων θεραπεία καταστολής που είχε ξεκινήσει 4 μήνες πριν από την πρώτη ανίχνευση CTC. Ζωντανή καταμέτρηση CTC ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης, σε καλή συμφωνία με την καλά κατέστειλε τη συγκέντρωση του PSA στον ορό (Πίνακας 2). Σε αυτήν την περίπτωση, η επακόλουθη άνοδος των ζωντανών μετρήσεων CTC ήταν 4 μήνες νωρίτερα από την ανάκαμψη PSA, το οποίο αργότερα κατασταλεί με θεραπεία στέρησης ανδρογόνων. Αξίζει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι αυτός ο ασθενής είχε ένα υψηλό ποσοστό των ζωντανών ΚΜΑ (83-84%), παρά την ορμονική θεραπεία καταστολής.

4. Απομόνωση των Ζωντανά ΚΜΑ για περαιτέρω Μοριακός Χαρακτηρισμός

χρώση NIR διευκόλυνε τον εντοπισμό και την απομόνωση των ζωντανών ΚΜΑ από κλινικά δείγματα αίματος (Σχήμα 2). Δοκιμάσαμε τις απομονωμένες ΚΜΑ για την περαιτέρω διερεύνηση του προστάτη που σχετίζονται με μοριακές αλλαγές. Σε μια τέτοια έρευνα, κέντρα θεραπείας χολέρας σε ασθενείς προστάτη απομονώθηκαν με βάση EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ βαφή. Η έκφραση της πρωτεΐνης στα CTCs ανιχνεύθηκε με mQDL και διεξήχθη για να επαληθευτεί η έκφραση ενός πάνελ πρωτεΐνης βιοδεικτών που σχετίζονται με προστάτη εξέλιξη και τη μετάσταση που η ομάδα μας είναι ενεργά μελετά [22]. Αυτές οι δοκιμασίες έδειξαν ότι η μη φυσιολογική έκφραση του ΚΑΝΚΕ, ο HIF-1α, ΕΠΜ-1 και πρωτεϊνών VEGF δει σε κλινικά δείγματα όγκου προστάτη [22] θα μπορούσε να ανιχνευθεί εύκολα στις απομονωμένες ΚΜΑ (Σχήμα 4Α). Ομοίως με την κλινική όγκους, ενισχυμένη φωσφορυλίωση του c-Met, καθώς και την ρ65 υπομονάδα του ΝΡκΒ, ανιχνεύθηκε με τον ίδιο πληθυσμό CTC. Περιέργως, η ποσοτικοποίηση του σήματος των χρωματίστηκαν CTCs αποκάλυψε αξιοσημείωτη ετερογένεια μεσοκυττάρια, ως μεμονωμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ποικίλα επίπεδα μεταξύ ΚΜΑ (Σχήμα 4Β). Περαιτέρω έρευνα, ωστόσο, είναι απαραίτητη για να εκτιμήσει την έκταση της CTC ετερογένεια στο επίπεδο έκφρασης του γονιδίου.

Ζωντανή ΚΜΑ από το πρώτο δείγμα από τον ασθενή 44 (Πίνακας 2) απομονώθηκαν σε μια πλάκα μικροσκοπίου και υποβάλλονται σε χρώση mQDL για το καθεστώς μιας ομάδας πρωτεϊνών τεκμηριωθεί ότι σχετίζονται με την εξέλιξη της ΣΕΣΣ. Οι A, φασματικές εικόνες από δύο αντιπροσωπευτικά ΚΜΑ που εμφανίζονται στις δύο πρώτες πλάκες (8 εικόνες καθένα που αντιπροσωπεύουν το επίπεδο έκφρασης του RANKL, pc-Met, HIF-1α, ρρ65, ΕΠΜ-1 και VEGF? 400 ×? bar = 50 μm ). Β, Ποσοτικοποίηση των φασματικών εντάσεων εικόνας των έξι πρωτεϊνών που αναφέρονται στον Πίνακα Α από πέντε προετοιμασμένα κύτταρα από τον ίδιο ασθενή. Το σχετικό επίπεδο της έκφρασης του γονιδίου υπολογίστηκε με βάση την έκφραση του HIF-1α που αποδόθηκε ως 1,0.

Η

Συζήτηση

Έχουμε αναπτύξει ένα πρωτόκολλο για την αξιολόγηση της παρουσίας των ζωντανών ΚΜΑ βασίζονται στην ενεργό πρόσληψη πρωτότυπο IR-783 heptamethine καρβοκυανίνη βαφή [19], [20]. Σε συνδυασμό με αντισώματα προς EpCAM χρώσης, IR-783 προσδιορίζονται ζωντανά κύτταρα PC-3 ανθρώπινος εμπλουτίστηκε σε υγιές αίμα δότη με υψηλή επαναληψιμότητα και συντελεστή συσχέτισης (Σχήμα 1). Έχουμε προσδιορίσει ότι η ενεργός μεταφορά του IR-783 σε κύτταρα όγκου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως λειτουργική δοκιμασία για να αποδειχθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων του όγκου (Σχήμα 2Β). Αυτό το εύρημα τονίζεται περαιτέρω από την έλλειψη IR-783 πρόσληψη χρωστικής στα νεκρά κύτταρα όγκου (ψύξης-απόψυξης και /ή αιθανόλη σταθερό) εμπλουτίστηκε σε υγιές αίμα του δότη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εμείς επιτυχώς ανιχνεύθηκε και απομονωμένων ζωντανών CTCs από κλινικά δείγματα πρωτογενούς προστάτη (Σχήμα 2 και Πίνακας 1) και οι ασθενείς mCRPC (Σχήματα 3 και Πίνακας 2). Σε μια μελέτη απόδειξη της ιδέας, τα απομονωμένα ζωντανά ΚΜΑ ήταν επιδεκτικοί multiplex ανίχνευση των επιπέδων της πρωτεΐνης στο επίπεδο του απλού κυττάρου σε προσφάτως απομονωθέντα CTCs χρησιμοποιώντας μια μέθοδο mQDL (Σχήμα 4). Τα αποτελέσματα συλλογικά δείχνουν ότι: 1) IR-783 χρώση μπορεί να διαφοροποιήσει ζωντανά ΚΜΑ από ένα σύνολο καταγραμμένων πληθυσμού CTC σε έναν δεδομένο ασθενή σε πραγματικό χρόνο? μπορούν να καθοριστούν 2) συσχετίσεις μεταξύ του ποσοστού των ζωντανών ΚΜΑ και την ανάπτυξη της προοδευτικής και θεραπευτικών ανθεκτική ασθένεια?