Αφηρημένο

Οι αντι-επεμβατική και αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις των betulins και αβιετανίου παράγωγα συστηματικά δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο οργανοτυπικό σύστημα των προηγμένων, ο ευνουχισμός ανθεκτικά καρκίνους του προστάτη. Μια προκαταρκτική οθόνη του αρχικού συνόλου 93 ενώσεων πραγματοποιήθηκε σε δύο διαστάσεων συνθήκες (2D) ανάπτυξη χρησιμοποιώντας επιθηλιακά κύτταρα μη μετασχηματισμένα προστάτη (EP156T), ένα ευαίσθητο σε ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή (LNCaP) και η ευνουχισμός ανθεκτικά, ιδιαίτερα επεμβατική κυτταρικής σειράς PC-3. Οι 25 πιο ελπιδοφόρα ενώσεις ήταν όλα τα παράγωγα βετουλίνης. Αυτά επιλέχθηκαν για μια εστιασμένη δευτερεύουσα οθόνη σε τρισδιάστατη συνθήκες (3D) ανάπτυξη, με στόχο να εντοπίσει τις πιο αποτελεσματικές και συγκεκριμένες αντι-επεμβατική ενώσεις. Πρόσθετες δοκιμές ευαισθησίας και κυτταροτοξικότητας διεξήχθησαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα εκτεταμένο πάνελ κυτταρική γραμμή. Τα αποτελέσματα αυτών των ενώσεων στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, μίτωση, πολλαπλασιασμό και μη ειδική κυτταροτοξικότητα έναντι ικανότητά τους να παρεμβαίνουν ειδικά κυτταρικής κινητικότητας και των καρκινικών κυττάρων εισβολή απευθυνόταν. Για τον εντοπισμό πιθανών μηχανισμών της δράσης και πιθανοί στόχοι ένωση, multiplex προφίλ της ένωσης επιπτώσεις για μια ομάδα 43 ανθρώπινης πρωτεϊνικών κινασών έγινε. Αυτές οι μελέτες de έλικας στόχου, σε συνδυασμό με την φαινοτυπική ανάλυση των πολυκύτταρων organoids σε 3D μοντέλα, αποκάλυψε ειδική αναστολή της ΑΚΤ σηματοδότηση που συνδέεται με επιπτώσεις στην οργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού ως η πιο πιθανή οδηγός αλλοιωμένης κυτταρικής μορφολογίας και κινητικότητα.

Παράθεση: Härmä V, Haavikko R, Virtanen J, Ahonen Ι, Schukov HP, Alakurtti S, et al. (2015) Βελτιστοποίηση της Εισβολή-ειδικές επιδράσεις της Βετουλίνη Παραγώγων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω Επικεφαλής Ανάπτυξης. PLoS ONE 10 (5): e0126111. doi: 10.1371 /journal.pone.0126111

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, ΑΥΣΤΡΑΛΙΑ

Ελήφθη: 3 Φεβ, 2015? Αποδεκτές: 23 Μαρτίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 12, 2015

Copyright: © 2015 Härmä et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς παρακαλούνται αναγνωρίζουν την οικονομική στήριξη (αριθμός έργου 252.308? BARC – Betulins, abietans και ρητίνες ως νέες ενώσεις μολύβδου για τον καρκίνο) από την Ακαδημία της Φινλανδίας ( να KMOC), και στο μικροπεριβάλλον του όγκου & amp? Μετάσταση σε ευνουχισμός-Resistant του καρκίνου του προστάτη (αριθμός έργου 267326) για να MN. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Εκτός από τον καρκίνο του δέρματος, καρκίνο του προστάτη (PRCA) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες, ειδικά στην Ευρώπη. PRCA είναι τυπικά εξαρτώνται από τις ορμόνες και ο ρόλος των ανδρογόνων στην πρόοδο από ανδρογόνο-εξαρτώμενη να ορμονοάντοχου PRCA είναι καθιερωμένη [1]. Πρώιμα στάδια PRCA μπορεί να αντιμετωπισθεί επιτυχώς με τη λειτουργία μόνο του και οι επαναλαμβανόμενες όγκοι αντιμετωπίζονται με εκτομή των κυκλοφορούντων ανδρογόνων από χημικό ευνουχισμό. Σε αντίθεση, όψιμη φάση ευνουχισμός ανθεκτικά PRCA (CRPC) με χαρακτηριστικό μεταστατικό διάδοση του πρωτογενούς όγκου, συνήθως στο οστό, παραμένει η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζεται με το θάνατο. Παρά το γεγονός ότι σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στην αντιμετώπιση της πρωτοβάθμιας και ανδρογόνα-ευαίσθητο όγκους του προστάτη, επί του παρόντος δεν υπάρχουν ιαματικές θεραπείες που στοχεύουν ειδικά τη μεταστατική εξάπλωση των προηγμένων και επιθετική CRPC. Εν μέρει, αυτό σχετίζεται με την έλλειψη πειραματικών συστημάτων μοντέλο που αντιπροσωπεύουν πιστά τα χαρακτηριστικά της εισβολής και της κινητικότητας των κυττάρων

in vitro

ή

in vivo

.

Ούτε πρότυπο δύο τρισδιάστατα μοντέλα (2D) καλλιέργειας κυττάρων (κυτταρικές σειρές), ούτε ζωικά μοντέλα (ξενομοσχεύματα ποντίκι) αντιπροσωπεύουν με ακρίβεια την πλήρη πολυπλοκότητα της κλινικής όγκων. 2D μοντέλα στερούνται ιδιαίτερα το μικροπεριβάλλον του όγκου (ΤΜΕ), την εξωκυτταρική μήτρα (ECM), και τα είδη των στρωματικών κυττάρων. Τέτοια μοντέλα μόνο ελάχιστα ανταποκρίνονται με ευαισθησία φαρμάκου που παρατηρήθηκαν

in vivo

[2]. Αυτές οι λειτουργικές ανεπάρκειες των προκλινικών ανακάλυψη φαρμάκων που ανακλάται από τα υψηλά ποσοστά τριβή για φάρμακα κατά του καρκίνου (& gt? 95%) [3] στις επόμενες κλινικές μελέτες. Έτσι, βιολογικά πιο σχετική

in vitro

πρέπει να αναπτυχθούν για τη βελτίωση της παραγωγικότητας των ανακάλυψη φαρμάκων και τη μείωση του αριθμού των ζώων που απαιτούνται στην ανάπτυξη φαρμάκων [4] μοντέλα όγκου. παρασκευάσματα ECM από διαφορετικές προελεύσεις έχουν αποδειχθεί ιδιαίτερα κρίσιμη για τη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου και διαφοροποίηση σε 3D καλλιέργεια [5]. Ολοκληρωμένη, ισχυρή και τυποποιημένη 3D πλατφόρμες έχουν γίνει συμβατό τόσο για υψηλής απόδοσης (HTS) και διαλογής υψηλής περιεκτικότητας (HCS) ρυθμίσεις [2], και την αποτελεσματική μετάφραση του 3D μεθόδους καλλιέργειας κυττάρων από τη βασική έρευνα για βιομηχανικές εφαρμογές είναι σε εξέλιξη [6 ]. Βιολογικά σχετικοί ECM όπως κολλαγόνα ή λαμινίνη πλούσια σε εκχυλίσματα της βασικής μεμβράνης, όπως Matrigel είναι πλέον ευρέως χρησιμοποιούνται για τη μελέτη κυτταρικών μηχανισμών όπως κυτταρική κινητικότητα και εισβολή. Το φάσμα των πολυκύτταρων μορφολογιών που σχηματίζονται από επιθηλιακά κύτταρα και τον καρκίνο του προστάτη σε 3D καλλιέργειες κυμαίνεται από πλήρως λειτουργικό αδενικό acini, δυσλειτουργική σφαιροειδή όγκου? σε επεμβατικές αστεροειδής δομές [7,8] που στερούνται πιο διαφοροποιημένες ιδιότητες. Έτσι, η διαφορετική μορφολογία εκδηλώνεται σε καλλιέργεια 3D lrECM είναι ένα στερεό δείκτης που συσχετίζεται με διάφορα στάδια της κακοήθη πρόοδο. Τέτοια βιομιμητικά μοντέλα 3D κυττάρων παρέχουν ένα ισχυρό μέσο για την ποσοτικοποίηση του καρκίνου που σχετίζονται με βιολογικές διεργασίες. Εισβολή και μετάσταση είναι τα πιο κρίσιμα χαρακτηριστικά του καρκίνου που μπορεί να μετατρέψει τον καρκίνο εντοπισμένη σε μια απειλητική για τη ζωή ασθένεια [9]. Σε 3D πολιτισμό, καρκινικών κυττάρων εισβολής εκδηλώνεται είτε από μεμονωμένα κύτταρα ή συσσωματώματα κυττάρων που εισβάλλουν ενεργά την περιβάλλουσα ECM, χρησιμοποιώντας διαφορετικούς τρόπους κινητικότητας (π.χ. amoeboid ή συλλογικής εισβολή) [10]. PC-3 είναι ένα από τα λίγα κυτταρικές σειρές PRCA που εμφανίζει χαρακτηριστικά συλλογική εισβολή τόσο

in vitro

και

in vivo

[7,11]. Τέτοια σύνθετα πολυκύτταρων διαδικασίες δεν μπορούν να αναπαραχθούν σε αγκυροβόλιο-ανεξάρτητο, μη-προσκολλημένα συστήματα 3D που δεν διαθέτουν βιολογικά λειτουργική ECM, όπως πολυ-ΗΕΜΑ [12], μαλακό άγαρ [13] ή «κρέμονται-drop» καλλιέργειες απομονωμένων σφαιροειδή [14] . Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου του μαστού κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 3D lrECM ήταν πολύ πιο κοντά στο

in vivo

από μονοστοιβάδα ή καλλιέργειες πολυ-ΗΕΜΑ [15]. Τα υψηλά οθόνες περιεχόμενο (HCS) χρησιμοποιούν πλατφόρμες που βασίζονται lrECM έχουν αναφερθεί για προστάτη [16], του μαστού [15], παγκρεατικό [17], και των ωοθηκών [18]. Τέτοιες καλά τυποποιημένες και σε μικρογραφία μοντέλα ιστό σαν απαιτείται για να συλλάβει συστηματικά τις επιδράσεις του μικρού μορίου ενώσεων /ναρκωτικών, siRNAs, βιολογικές (π.χ. αντισώματα και πεπτίδια), παράγοντες ανάπτυξης, ή τοξίνες της βιολογίας των όγκων. Αυτές οι πολύπλοκες βιομιμητικά προσεγγίσεις είναι χρήσιμες ως πιστοί προ-κλινικά εργαλεία για τη διερεύνηση βραχυπρόθεσμες και μακροπρόθεσμες απαντήσεις των ναρκωτικών, αποτυχία θεραπείας, ή η ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα [19]. Σε συνδυασμό με την υψηλή περιεκτικότητα σε μικροσκοπικές μεθόδους απεικόνισης και ανάλυσης εικόνας, 3D μοντέλα φαινοτυπική μπορεί επίσης να είναι πολύ κατατοπιστική για το μόλυβδο ανακάλυψη και μελέτες μολύβδου βελτιστοποίησης (LD ή LO, αντίστοιχα), ιδίως εάν ο στόχος μοριακό φάρμακο είναι άγνωστη, και πολύπλοκους μηχανισμούς όπως ως ιστο-ειδικά διαφοροποίηση και κυττάρου-κυττάρου-αλληλεπιδράσεις μπορεί να εκτιμηθεί με βάση την αμερόληπτη, πολυπαραμετρική read-out. Πολυπλεξία του ανάγνωσης απεικόνισης που βασίζονται επιτρέπει επίσης την ταυτόχρονη εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας, απόπτωση, και αποτελέσματα επί του κυτταρικού κύκλου, π.χ. με τη χρήση κατάλληλων φθοριζόντων ανιχνευτών [2,20], μειώνοντας έτσι την ανάγκη για υπερβολικό μελέτες επικύρωσης. Επιπλέον, σε πραγματικό χρόνο και τα ζωντανά κυτταρικούς προσδιορισμούς 3D βασίζονται στην ανάλυση υψηλής περιεκτικότητας εικόνα μπορεί να συνδυαστεί με τις μελέτες τελικό σημείο αντιμετώπιση της έκφρασης των βιοδεικτών, όπως περιγράφεται στις προηγούμενες δημοσιεύσεις [7,11].

Φυσικά προϊόντα ( ΣΔ) έχουν ανεκτίμητη ως εργαλεία για την αποκρυπτογράφηση της λογικής της βιοσύνθεσης και ως πρώτες ύλες για την ανάπτυξη φαρμάκων πρώτης γραμμής [21]. Πράγματι, η πλειοψηφία των νέων χημικών οντοτήτων που έχουν εγκριθεί ως φάρμακα από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) έχουν σταθερά είτε ΣΔ ή NP-προέρχεται ενώσεις [22]. Οι πεντακυκλικόν τριτερπενοειδή, δευτερογενείς μεταβολίτες των φυτών που βρέθηκαν σε αφθονία σε φλούδες φρούτων, φύλλα και φλοιό του κορμού, έχουν προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον ως θεραπευτικοί παράγοντες και τα συμπληρώματα διατροφής [23,24]. Επιπλέον, ημι-συνθετικά παράγωγα των αυτοφυών τριτερπενοειδή έχουν ενεργά μελετηθεί σε έρευνα για νέους αντικαρκινικούς παράγοντες, με ιδιαίτερη έμφαση στις ιδιότητες αντι-διεισδυτικότητα [24-29]. Βετουλίνη και betulinic οξύ είναι lupane τύπου πεντακυκλικόν τριτερπένια άφθονο στον φλοιό σημύδας είδη του γένους

Betula

L. [30]. παράγωγα betulinic οξύ και άλλα βετουλίνης έχουν αντιϊκή, αντι-φλεγμονώδη, αντι-ελονοσίας, και αντικαρκινικές επιδράσεις [31]. Επιπλέον, betulinic οξύ ταυτοποιήθηκε ως επιλεκτικός επαγωγέας της απόπτωσης σε κύτταρα μελανώματος [32], προκαλώντας ένα έντονο ενδιαφέρον για τριτερπένια ως αντικαρκινικών παραγόντων. Επιπλέον, βετουλίνης βρέθηκε να εμποδίσει τις επεμβατικές ιδιότητες των κυττάρων του εγκεφάλου και καρκίνο του πνεύμονα, αρκετά κάτω από κυτταροτοξική συγκέντρωση του, γεγονός που υποδηλώνει μια πολλά υποσχόμενη χημειοπροληπτική επίδραση έναντι μεταστάσεων [33]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε χρησιμοποιήσει ένα συνδυασμό των μοντέλων των κυττάρων 2D και 3D PRCA και τις μεθόδους HCS βασίζεται στην απεικόνιση και αυτοματοποιημένη ανάλυση εικόνας, για την αξιολόγηση και την επικύρωση των αντινεοπλασματικών και αντι-επεμβατική ιδιότητες μιας βιβλιοθήκης 93 ενώσεις. Σε αυτή την βιβλιοθήκη, έχουμε συμπεριλάβει τη γονική ενώσεις βετουλίνης, betulinic οξέος (2) και ημι-συνθετικά παράγωγά τους, και ενώσεις από άλλη κατηγορία τερπενοειδή με λιγότερο μελετημένο βιολογικές επιδράσεις, οι abietanes. Συνολικά, η βιβλιοθήκη αποτελείται 78 betulins και 15 abietanes.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Σύνθεση μιας βιβλιοθήκης βετουλίνης και αβιετανίου παράγωγα

Ένα σύνολο των 76 παράγωγα βετουλίνης παρασκευάστηκε εκκίνησης από βετουλίνης και betulinic οξύ (1), ενώ το 13 παράγωγα παρασκευάστηκαν από αφυδροαβιετικόν οξύ και dehydroabietylamide (Σχήματα 1-3, βλέπε επίσης S1 File), χρησιμοποιώντας την τεχνογνωσία μας για φυσική χημεία προϊόντα και ακολουθώντας είτε έχουν αναφερθεί στο παρελθόν διαδικασίες ή εκείνες των άλλων μας [ ,,,0],34-37]. Betulonic οξύ (2) ελήφθη από βετουλίνης με οξείδωση Jones, και χρησιμοποιείται ως ένα ευέλικτο ενδιάμεσο για χημικές συνθέσεις. Διαφορετικούς υποκαταστάτες εισήχθησαν στις θέσεις 3 και 28 του πυρήνα lupane. Ορισμένα παράγωγα παρασκευάστηκαν επίσης με σύντηξη ετεροκύκλων στον δακτύλιο Α, στις θέσεις 2 και 3. Άλλες ενώσεις περιείχε ένα επιπλέον δακτύλιο συντηγμένο προς δακτυλίους C, D και Ε Μείωση της πλευρικής isoproprenyl αλυσίδα του πυρήνα τριτερπενίου έγινε για μερικές από τις παραγώγων . αναδιάταξη των πλευρικών αλυσίδων οδήγησε επίσης σε ενώσεις germanicane τύπου. Στις abietanes που οι ενώσεις που παρασκευάζονται αποτελούνταν κυρίως από παράγωγα ουρίας και αμιδίου.

Η

Η

High Throughput Screening (HTS) για βιοδραστικότητα

Οι ενώσεις αυτές συντάχθηκαν ως βιβλιοθήκη και η βιολογική δραστικότητα ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας 2D καλλιέργειες κυττάρων σε πλάκες 384-φρεατίων σε λεπτομερή εξέταση υψηλής απόδοσης (HTS) μορφή (S1 Εικ). Οι κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν EP156T (μη-μετασχηματισμένα προστάτη επιθήλιο), LNCaP (ανδρογόνο ευαίσθητο PRCA), και PC3 (ευνουχισμό ανθεκτικά, επεμβατική PRCA). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις της ένωσης (0.1, 1 και 10 μΜ) εις τριπλούν, χρησιμοποιώντας CellTiterGlo ως καταληκτικό σημείο αναγνώσεως για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Μια ομάδα 25 παραγώγων βετουλίνης συντέθηκε σύμφωνα με τις πιο αποτελεσματικές και ειδική για τον καρκίνο ενώσεις που ταυτοποιούνται στην προκαταρκτική οθόνη 2D, και επιλέγονται για περαιτέρω μελέτες.

διαλογή υψηλής περιεχομένου (HCS) για δραστικότητα εισβολή αποκλεισμού

στη συνέχεια, αυτά τα 25 πιο αποτελεσματικές ενώσεις δοκιμάστηκαν σε 3D ρυθμίσεις για ειδικά αντι-επεμβατική ιδιότητες. Τρεις πρότυπο των ενώσεων φροντίδας που χρησιμοποιούνται ευρέως κατά PRCA προστέθηκαν ως μάρτυρες? δηλαδή, ο enzalutamide ανταγωνιστή υποδοχέα ανδρογόνου (MDV3100), η C17α-υδροξυλάση /C

αναστολέας 17,20-λυάσης αμπιρατερόνη (Zytiga), και το κλασικό πακλιταξέλη μιτωτικό αναστολέα. Θεραπείες άρχισε την ημέρα 4, όταν καθιερώθηκαν καλά διαφοροποιημένο γύρο acini. Ένωση έκθεση ήταν τότε συνεχίστηκε για έξι ημέρες, όταν τα περισσότερα από τα μη επεξεργασμένα πολυκύτταρων δομών είχε μετατραπεί σε μια ιδιαίτερα επεμβατική φαινότυπο.

Ανάλυση

Αυτοματοποιημένα μορφομετρικών εικόνας (Άμιδας) και στατιστική

αξιολόγηση

Η ζωντανή 3D κυττάρων καλλιέργειες στη συνέχεια βάφονται με δραστικές βαφές Calcein ΑΜ για την ανίχνευση ζωής, και ομοδιμερές αιθίδιο για να ανιχνεύσει τα νεκρά κύτταρα. Εικόνες (Σχήμα 4Α) αποκτήθηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο δεδομένα εικόνας και αναλύθηκαν με το λογισμικό Άμιδας [38]. Οι αρχές της μορφομετρικής ανάλυσης εικόνας που περιγράφεται συνοπτικά στο S2 Σχ.

PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 3D Matrigel ECM για 4 ημέρες και υποβάλλονται σε θεραπεία για 6 ημέρες με 25 παράγωγα βετουλίνης (από οθόνες 2D υψηλής απόδοσης), DMSO /ελέγχου του οχήματος, και τρεις ενώσεις αναφοράς. Α) Εκπρόσωπος μέγιστη προβλέψεις έντασης των εικόνων στοίβα ομοεστιακό μικροσκόπιο για την επιλεγμένη ένωση θεραπείες στα 300 ηΜ συγκέντρωση (5 × στόχο, την κλίμακα 100 μm). Β) Τρεις γραφικές παραστάσεις που δείχνουν την σχετική επίδραση στις τρεις μορφομετρικών παραμέτρων για 7 παράγωγα βετουλίνης, DMSO ελέγχου, και μία ένωση ελέγχου (paclitaxel). κλιμάκωση των δεδομένων: εμφανίζει τη σχετική διαφορά μεταξύ διάμεσου Λόγος Περιοχή /Πολυπλοκότητα /Περιοχή, για τον έλεγχο DMSO. Οι θεραπείες πακλιταξέλη και τους ελέγχους DMSO έχουν ανατεθεί τιμές των -100 και 0, αντίστοιχα. Γ) Ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε με τη χρήση τριών μορφολογικών παραμέτρων που προέρχονται από organoids PC3: μέγεθος σφαιροειδές (περιοχή), η πολυπλοκότητα και ο αριθμός των νεκρών κυττάρων. Δ) Ναρκωτικά επούλωσης της πληγής καμπύλες των δύο παραγώγων βετουλίνης 4 και 20, αναδεικνύοντας το επίπεδο αποκοπής 50% (πορτοκαλί διακεκομμένη γραμμή).

Η

Το σχήμα 4Α δείχνει αντιπροσωπευτικές εικόνες ομοεστιακό μικροσκόπιο για μερικά από τα παράγωγα βετουλίνης . Η άκρως αποτελεσματική, αντιμιτωτικά έλεγχο πακλιταξέλη ναρκωτικών ξεχώρισαν ακόμη και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (30 και 100 nM), που δείχνει μια ισχυρή επίδραση σε όλα τα μορφομετρικά μέτρα (Σχήμα 4Β): αυτό οδήγησε σε μικρότερα (μειωμένη περιοχή), λιγότερο επεμβατικές organoids (μειωμένη πολυπλοκότητα ), με αύξηση του αριθμού των νεκρών κυττάρων. Το ενώσεις ελέγχου αμπιρατερόνη και enzalutamide δεν είχε καμία αξιοσημείωτη επίδραση στο PC-3 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, betulinic οξύ (1) και betulonic οξέος (2) δεν έδειξε σημαντική αντι-επεμβατική αποτελέσματα, ενώ ένωση 3, που φέρει έναν υποκαταστάτη ισοπροπυλίου σε C19, ήταν ένας από τους πιο ισχυρούς παράγοντες αναστολής αντι-επεμβατική, ανάπτυξη. Ομοίως, οι ισοξαζόλης παράγωγα 4 και 5 εμφανίζεται ισχυρή ανασταλτική της ανάπτυξης και αντι-επεμβατική επιδράσεις σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (τόσο χαμηλά όσο 100 ηΜ για 4 και 300 ηΜ για 5). Όλες αυτές οι αποτελεσματικές ενώσεις διαφέρουν μόνο στη θέση C19: ένωση 4 έχει μία ισοπροπύλ πλευρική αλυσίδα, ενώ η ένωση 5 έχει το αρχικό ισοπροπενυλο πλευρικής αλυσίδας. Επιπλέον, όταν ο δακτύλιος ισοξαζολίου 5 αντικαταστάθηκε με ένα δακτύλιο πυραζόλης, η προκύπτουσα ένωση 6 ήταν ακόμη πιο ισχυρή και αποδείχθηκε ότι είναι ειδικά αντι-επεμβατική. Σε αντίθεση, τα παράγωγα ισοξαζόλης με έναν φορμυλ (7) ή μία ακετοξυ ομάδα (8), ένα πρωτοταγές αμίδιο (9) ή μια υδροξυ (10) ομάδα στη θέση C28 εμφανίζονται αμελητέες επιδράσεις στην επεμβατική φαινότυπο. Η σημασία του αρχικού καρβοξυλική ομάδα στην θέση C28 (betulonic οξύ, 2) για αντι-επεμβατική ή κυτταροτοξική δράση μελετήθηκε με την αντικατάσταση αυτής της ομάδας με διάφορες αμιδίου ομάδες. Καμία από αυτές τις ενώσεις παρουσίασαν σημαντική αντι-επεμβατική επιδράσεις (11, 12, 13, και 14) (δεν φαίνεται). Επίσης η ένωση 15 εμφάνισε ισχυρή αντι-επεμβατική επιδράσεις στο 1,0 μΜ, χωρίς καμία αναστολή της ανάπτυξης. Ωστόσο, όταν καρβοξυλομάδα του σε C17 μετετράπη σε ομάδα πρωτοταγούς αμιδίου, η προκύπτουσα ένωση 16 είχε το ίδιο υψηλό επίπεδο των αντι-επεμβατική επιδράσεις ως ένωση 15. Σε αντίθεση, τα παράγωγα με τριτοταγές αμίδιο (17) ή οι ομάδες νιτριλίου (18) σε C17 ήταν ανενεργά (δεν φαίνεται). Δύο παράγωγα πυριδίνης δοκιμάστηκαν επίσης. Καμία απώλεια σε αντι-επεμβατική δραστηριότητα παρατηρήθηκε κατά πόσον το άζωτο πυριδίνης ήταν δίπλα στη θέση C3 του αρχικού σκελετού lupane (19), ή δίπλα στη θέση C2 του σκελετού lupane (20). Είναι ενδιαφέρον ότι, και οι δύο ενώσεις 19 και 20 ήταν ισχυρά αντι-επεμβατική σε σημαντικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις, σε σύγκριση με την ένωση 15.

Στη συνέχεια, οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν για την ερμηνεία των πολύπλοκων δεδομένων εικόνας (σχήμα 4Β και 4C). Για λόγους απλότητας, επικεντρωθήκαμε μόνο σε τρεις, βασικές παράμετροι μορφολογική από την πολυπαραμετρική Άμιδας ανάγνωσης (Σχήμα 4Β): 1) Περιοχή (υποδεικνύοντας αύξηση της organoids), 2) δομική πολυπλοκότητα (ως μέτρο της έντασης της εισβολής), και 3) σχετική επιφάνεια των νεκρών κυττάρων μέσα organoids (κόκκινο σήμα ως μέτρο της κυτταροτοξικότητας ή απόπτωση). Περιοχή (Μέγεθος organoids? Σχ 4Β, άνω πάνελ) μετρήθηκε ως ο αριθμός των εικονοστοιχείων εντός μιας τμηματικής δομής. Η λογαριθμική μετατροπή των δεδομένων Περιοχή /Μέγεθος χρησιμοποιήθηκε, η οποία έδειξε μια στενή σε Gaussian (κανονική) κατανομή μέσα στις εικόνες. Διαμορφώστε Πολυπλοκότητα (Σχήμα 4Β, μεσαίο πάνελ) λήφθηκε χρησιμοποιώντας το μέγεθος δομή (περιοχή) και την περίμετρο (αριθμός των συνοριακών pixels). Η πιο τακτική το σχήμα ενός οργανοειδούς, όσο πιο κοντά είναι σε ένα τέλειο κύκλο, ελαχιστοποιώντας έτσι την περίμετρο σε σχέση με αντιρρήσεις μέγεθος. Παρατηρήσαμε μια σχεδόν γραμμική εξάρτηση μεταξύ log (Περιοχή) και log (περιμετρικά), υποδεικνύοντας μια φυσική (λειτουργικά) η σχέση μεταξύ αυτών των δύο χαρακτηριστικών. Τοποθέτηση μια γραμμή παλινδρόμησης στα δεδομένα κάποιο χρήσιμο εκτίμηση της μέσης περιμέτρου κάθε οργανοειδούς δομής. Αποκλίσεις από το μέσο όρο (υπολείμματα) ερμηνεύτηκαν ως μέτρο για το σχήμα πολυπλοκότητα της organoids. Ως λογική κατώτερο όριο για το μέτρο αυτό (που αντιπροσωπεύεται από έναν τέλειο κύκλο), έχουμε προσαρμοστεί το σημείο τομής (επίπεδο ύψος) της γραμμής παλινδρόμησης για να καταστήσει όλα τα επέστρεψε κατάλοιπα ως θετικοί αριθμοί. Αυτή η απλοποιημένη, ταχεία μέτρο της πολυπλοκότητας πολυκύτταρων έδειξαν ότι ο λογάριθμος των υπολειμμάτων οδηγεί σε μια σχεδόν συμμετρική κατανομή των τιμών. Ιεραρχική συσταδοποίηση, χρησιμοποιώντας αυτά τα τρία βασικά μέτρα από καλλιέργειες PC3 απέδωσε ένα απλό δενδρόγραμμα με δύο κύριους κλάδους: το πρώτο σύμπλεγμα περιλάμβανε τις πιο ισχυρές αντι-πολλαπλασιαστική και αντι-επεμβατική ενώσεις (σχήμα 4Γ: κίτρινο). Η δεύτερη συστάδα αντιπροσωπεύει αδύναμη (Σχήμα 4C: κόκκινο) και μη αποτελεσματική (Σχήμα 4C: γκρι). Ενώσεις

Επικύρωση της αντι-επεμβατική ιδιότητες

Με βάση την πρωτογενή οθόνη, έχουμε επιλέξει έξι παράγωγα βετουλίνης για περαιτέρω επικύρωση των αντι-επεμβατική αποτελέσματα με πρόσθετες μεθόδους. Σε ένα πρότυπο προσδιορισμό επούλωσης τραύματος πραγματοποιείται σε μονοστρωματική καλλιέργεια 2D, η αποτελεσματικότητα ορισμένων ενώσεων ήταν εντυπωσιακά διαφορετική στις ρυθμίσεις 3D. Για παράδειγμα, οι ενώσεις 4 και 20 μειώνεται εντελώς εισβολή σε 3D ήδη στα 300 nm, αντίστοιχα (Εικόνα 4Α), αλλά έδειξε μόνο το 50% μείωση του κλεισίματος του τραύματος μετά από 64 ώρες (Σχ 4D) στην ίδια συγκέντρωση. Επίσης, η ένωση 5 ανέστειλε αποτελεσματικά επεμβατική μεταμόρφωση του PC-3 σφαιροειδή ήδη στα 300 nm σε 3D (S3A σχήμα), μετρούμενη ως «% στρογγυλάδα» διατηρούνται μετά από 10 ημέρες), αλλά συγκεντρώσεις άνω του 1 μΜ όφειλαν στον πολιτισμό 2D για συγκρίσιμα αποτελέσματα (S3b σχήμα). Επίσης, οι πιο ισχυρές αντι-επεμβατική παράγοντες 6, 16 και 19 (που δραστηριοποιούνται σε 100 ηΜ σε 3D συνθήκες) μειωμένη κλείσιμο της πληγής σε 2D μόνο κατά 50% σε 3 μΜ και 1 μΜ, αντίστοιχα (Εικ S3b). Ένωση 21 περιλαμβάνεται εδώ ως παράδειγμα για αδρανή παράγωγα. Το γεγονός ότι πολλές ενώσεις δεν είχε την ίδια ισχύ με τον συμβατικό 2D μονοστρωματική καλλιέργεια υποδηλώνει ότι οι βιολογικούς στόχους ή οδών που εμπλέκονται στην κυτταρική κινητικότητα δεν είναι εξίσου δραστικές σε κυτταρική μετανάστευση επί πλαστικών επιφανειών. Είναι επίσης πιθανό ότι η κυτταρική κινητικότητα σε 2D μονοστρωματική καλλιέργεια ελέγχεται από άλλους μηχανισμούς από τις συλλογικές εισβολή σε ένα 3D ικρίωμα.

Δευτεροβάθμια 3D οθόνες.

Στη συνέχεια, οι 25 επιλεγμένες παράγωγα βετουλίνης που απεικονίζονται στα σχήματα 1-3 περιλαμβανομένων ενώσεων ελέγχου ξανά ελεγχθεί διεξοδικά σε όλη την ίδια ομάδα του προστάτη που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται ήδη στην προκαταρκτική, 2D οθόνη υψηλής απόδοσης. Τα προκύπτοντα δενδρογράμματα είτε δημιουργούνται χωριστά για κάθε κυτταρική σειρά (S4 Σχήμα), συνδυάζονται σε μία ενιαία δενδρόγραμμα (Σχήμα 5Α), ή εμφανίζεται ως μειωμένη οργανοειδούς μεγεθών (περιοχή? Σχήμα 5Β). Στα μη επεμβατική, αλλά ορμόνη ευαίσθητη organoids LNCaP, οι περισσότερες ανεπιθύμητες ένωση ήταν σχετικά ήπιες. Μη αποτελεσματικές θεραπείες περιλαμβάνουν την συντριπτική πλειοψηφία του γραφήματος (S4 Εικ: γκρι), ενώ οι λίγες αποτελεσματικές ενώσεις εμπίπτουν σε δύο συνδεδεμένα κλάδους (κίτρινο και κόκκινο). Όπως ήταν αναμενόμενο, το ανδρογόνο ανταγωνιστής enzalutamide αλλά δεν αμπιρατερόνη ήταν μεταξύ των αποτελεσματικών θεραπειών. συστάδες Paclitaxel μαζί με τα παράγωγα βετουλίνης σε υψηλότερες συγκεντρώσεις αυτών των ενώσεων-ήσαν επίσης αποτελεσματικές σε ανθεκτικά ορμόνη, επεμβατική κύτταρα PC-3. Το δενδρόγραμμα για ορμόνη που εξαρτώνται, μη επεμβατική LAPC-4 (S4B σχήμα) αποδεικνύει και πάλι την αποτελεσματικότητα όλων των θετικών μαρτύρων (abiraterone, enzalutamide και πακλιταξέλη? Στο κίτρινο και κόκκινο clusters). Τα πιο δραστικά παράγωγα βετουλίνης πάλι πέφτουν μέσα σε αυτά τα ίδια συμπλέγματα (3, 4, 6, 16, 19 και 20) δίπλα σε θετικούς ελέγχους. Σε αντίθεση με κυτταρικές σειρές PRCA, η μη μετασχηματισμένα, η κανονική-σαν Ep156T κυτταρική γραμμή (Σχ S4C) ανταποκρίθηκαν επίσης να betulonic οξύ (2), τουλάχιστον στην υψηλότερη συγκέντρωση. Σε γενικές γραμμές, όπως και με τα κύτταρα LNCaP και LAPC4, οι επιδράσεις στην ανάπτυξη Ep156T ήταν ήπιες (σχήμα 5Β).

Πειραματικό παράγωγα βετουλίνης και οι ενώσεις ελέγχου εξετάστηκαν σε ένα πάνελ των γραμμών καρκίνου του προστάτη (LNCaP, LAPC-4) και μη μετασχηματισμένα, προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (EP156T) σε 3D καλλιέργεια. Α) Το δενδρόγραμμα βασίζεται σε τρεις κύριες μορφολογικές παραμέτρους και συνδυάζει όλα τα δεδομένα από την πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια οθόνες 3D. Οι αποτελεσματικές θεραπείες ένωση αναφέρεται σε κόκκινο και κίτρινο, κίτρινο είναι το πιο εισβολή ειδικών. Β) Boxplots δείχνει τον αντίκτυπο των επιλεγμένων ενώσεων με το μέγεθος σφαιροειδές (Περιοχή). κλιμάκωση των δεδομένων:. όπως περιγράφεται στο Σχήμα 4, γ) τα αποτελέσματα όλων των παραγώγων βετουλίνης και οι ενώσεις ελέγχου σε κυτταρικό θάνατο (αριθμός των νεκρών κυττάρων)

Η

Για να βοηθήσει λειτουργική κατηγοριοποίηση των παραγώγων βετουλίνης μας, σε συνδυασμό όλα τα δεδομένα σε ένα ενιαίο δενδρόγραμμα, που φαίνεται στο Σχήμα 5Α. Επιπλέον, πολυπαραμετρική εκπροσώπηση όλων των πειραματικών δεδομένων ως ενιαίο heatmap είναι άκρως κατατοπιστική (S5 Εικ) και ένας ισχυρός τρόπος για να απεικονίζουν τις επιδράσεις των ενώσεων επί της ανάπτυξης, δομική πολυπλοκότητα και τον κυτταρικό θάνατο σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές. Χωρίσαμε τις ενώσεις και τους ελέγχους σε τρεις συστάδες: 1) Η αύξηση ανασταλτικές ενώσεις, 2) ισχυρά και ασθενή αντι-επεμβατική ενώσεις, και 3) ανενεργές ενώσεις. Οι μορφολογικές επιδράσεις σε 3D καλλιέργεια συνοψίζονται στο S6 Σχ τα πιο ισχυρά αντι-επεμβατική επιδράσεις (στο PC-3 κύτταρα) δεικνύεται από τις ενώσεις 3, 4, 6, 15, 19 και 20, σε συγκεντρώσεις 300 ηΜ ή μικρότερη (με η εξαίρεση της ένωσης 15), χωρίς αισθητές συνέπειες για τις άλλες κυτταρικές γραμμές. Οι περισσότερες από αυτές τις ενώσεις, ωστόσο, έδειξε ανασταλτική της ανάπτυξης αποτελέσματα σε όλες τις κυτταρικές σειρές σε συγκεντρώσεις 1 μΜ ή υψηλότερη. Εν κατακλείδι, πολλά παράγωγα βετουλίνης είναι κυτταροτοξικά και αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις (& gt? 1 μΜ). Ωστόσο, σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις, οι ενώσεις αυτές μπορούν να δράσουν ως ισχυροί και ειδικοί αναστολείς της κυτταρικής εισβολής και κινητικότητα.

Εκτίμηση των αντι-επεμβατική vs κυτταροτοξική δράση.

Για να αποκλειστεί ότι κυτταροτοξικά και αντιμιτωτική επιδράσεις είχαν παρερμηνευθεί ως αντι-επεμβατική, εξετάσαμε ενώσεις 4, 5, 6, 19 και 20 για την αναστολή του πολλαπλασιασμού και διέγερση θανάτου κυττάρου σε μία καλλιέργεια μονοστοιβάδας 2D (συνοψίζονται στο Σχήμα 6). Ένα ευρύ φάσμα της ένωσης συγκεντρώσεις (1 nM έως 30 μΜ) χρησιμοποιήθηκαν για PC-3, κυτταρικές σειρές LNCaP και Ep156T, και αναλύονται με PerkinElmer Οπερέτα υψηλής περιεκτικότητας ξηρής εμφάνισης. Σε κύτταρα PC3, οι περισσότερες ενώσεις δεν έδειξαν αξιοσημείωτη επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από 10 μΜ (Σχήμα 6Α). LNCaP κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα, με την αναστολή της ανάπτυξης /κυτταροτοξικότητα ξεκινώντας από 3 μΜ. Οι επιδράσεις επί μη μετασχηματισμένα, απόπτωση ευαίσθητα κύτταρα Ep156T ήταν ισχυρότερες. Εδώ, κυτταροτοξικά αποτελέσματα ήταν συνήθως παρατηρούνται ήδη στα 0.3-1 μΜ. Καμία από τις ενώσεις που επάγεται ειδικώς θάνατο κυττάρου σε PC-3 ή LNCaP κύτταρα σε συγκεντρώσεις κάτω από 30 μΜ (Σχήμα 6Β και 6C? Εκτός για την ένωση 19). Εμείς περαιτέρω υπολογισμένη ΕΚ

50 τιμές για τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και τον κυτταρικό θάνατο για κάθε ένωση, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Αρμονία PerkinElmer (επικύρωση της μεθόδου φαίνεται στο Σχ S7). Η μόνη δοκιμασία που παρήγαγε αποτελέσματα συμφωνούν με εκείνα των παραγώγων βετουλίνης ελέγχθηκαν στο μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας 2D ήταν η δοκιμασία πολλαπλασιασμού (Πίνακας 1).

Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων /αριθμός κυττάρων, Β) προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση ), και γ) τον αριθμό των νεκρών κυττάρων αξιολογήθηκαν με συνηθισμένες δοκιμασίες, σε συνδυασμό με την υψηλή περιεκτικότητα μικροσκοπία (Οπερέτα). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις πέντε πιο αποτελεσματικά παράγωγα βετουλίνης, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου πακλιταξέλη για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε ως ο συνολικός αριθμός των πυρήνων (= κύτταρα), η απόπτωση ως αναλογία της κασπάσης-3 θετικά έναντι όλων των κυττάρων, και θάνατο των κυττάρων ως αιθίδιο ομοδιμερές-2 θετικών πυρήνων έναντι όλων των κυττάρων.

Η

επιδράσεις στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της μίτωσης

στη συνέχεια εξετάσαμε εάν τα παράγωγα βετουλίνης είχαν ειδικές επιπτώσεις στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της μίτωσης σε συγκεντρώσεις των 300 ηΜ (δεν φαίνεται) και 1 μΜ σε 2D καλλιέργεια (Σχ 6D και S8 σχήμα). Δεν υπήρχαν αξιοσημείωτες διαφορές στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε απόκριση σε οποιαδήποτε από τις δοκιμαζόμενες ενώσεις. Εκτιμήσαμε επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μίτωση μετρώντας PCNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης Β1 (S8B Εικ). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα παράγωγα βετουλίνης δεν έδειξε καμία επίδραση στην έκφραση είτε πρωτεϊνών στη συγκέντρωση δοκιμάστηκαν. Αυτά τα ευρήματα και πάλι υποστηρίζουν ότι τα παράγωγα βετουλίνης είναι μόνο κυτταροτοξικά ή να προκαλέσει βλάβη στο DNA σε υψηλές συγκεντρώσεις (PRCA ΕΚ

50 τιμές που κυμαίνονται 1-90 μΜ), ενώ προωθούν σημαντικές αντι-εισβολής αποτελέσματα σε χαμηλές συγκεντρώσεις nanomolar.

πιθανή μηχανισμός (ες) της δράσης των παραγώγων βετουλίνης.

για να διευκρινιστεί πιθανός μηχανισμός δράσης για τα παράγωγα βετουλίνης μας, χρησιμοποιήσαμε ένα φωσφο-κινάσης σειρά που ανιχνεύει ποσοτικά τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των κινασών 43 σε Προϊόντα λύσης κυττάρου (Σχήμα 7). Τα λύματα που προέρχονται από το 3D κυτταρικών καλλιεργειών PC-3 κύτταρα, και εκτέθηκαν σε ενώσεις βετουλίνη προερχόμενων για σύντομες (4 ώρες) ή μακροχρόνια (6 ημέρες) περιόδους. Για τις μελέτες αυτές, επιλέξαμε τα δύο αντιπροσωπευτικά παράγωγα 5 και 20 ως τις πιο συγκεκριμένη, τουλάχιστον κυτταροτοξική αναστολείς της κυτταρικής εισβολής. Η βραχυπρόθεσμη (4 ώρες) έκθεση πραγματοποιήθηκε σε σχετικά υψηλή συγκέντρωση 1 μΜ, ενώ για την μακροπρόθεσμη έκθεση (6 δ), σε συγκέντρωση μόλις 300 χρησιμοποιήθηκε nM? τόσο πολύ κάτω από την κυτταροτοξική ΕΚ

50 τιμές (10 μΜ για την ένωση 5 και 67 μΜ για την ένωση 20). Οι συστοιχίες κινάση επίσης ποσοτικά με πυκνομετρία εικόνας (Εικ 7Α). τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των τεσσάρων κινασών, τόσο βραχυπρόθεσμα όσο και μακροπρόθεσμα χρηματοδοτικά ανοίγματα, ήταν σαφώς μειωμένη: STAT3 (Y727), c-Jun (S63), eNOS (S1177) και PLC-γ1 (Y783) (Σχήμα 7Α πάνω και κάτω πάνελ) . Και οι δύο ενώσεις επίσης μειωμένη p53 (S15) φωσφορυλίωση σε βραχυπρόθεσμη έκθεση και p70 κινάσης S6 (T389), p53 (S392) και φωσφορυλίωση ΡΥΚ2 (Y402) στο 6-d έκθεσης, και την αύξηση της AMPKα1 (T174) φωσφορυλίωση. Ένωση-ειδικά εφέ για την ουσία 20 που περιλαμβάνονται διαφορική φωσφορυλίωση Hck (Y411), παν-JNK, η GSK-3α /β (S21 /S9), STAT3 (Y705) και WNK1 (Τ60) sites. Akt (S473) φωσφορυλίωση αναστάλθηκε μόνο από το 6-d έκθεση. Η Ένωση 20 αύξησε επίσης τη φωσφορυλίωση της mTOR (S2448), Fyn (Y420) και Src (Y419). Σε αντίθεση, η ένωση 5 δεν προκάλεσε συγκεκριμένες αλλαγές στην δραστικότητα της κινάσης της βραχυπρόθεσμης έκθεσης, και έδειξε μόνο λίγες διακριτές μεταβολές στην μακροχρόνια θεραπεία. Πιο συγκεκριμένα, Akt (T308) φωσφορυλίωση επίσης καταργηθεί σχεδόν εξ ολοκλήρου σε απάντηση της έκθεσης με την ένωση 5, ενώ η φωσφορυλίωση των χώρων p53 S46 και S392 ήταν σταθερά μειωμένη (Σχήμα 7Α). Η μείωση της δραστηριότητας ΑΚΤ με αμφότερες τις ενώσεις ελέγχθηκε με κηλίδωση Western, χρησιμοποιώντας μια ανεξάρτητη, ρ-ΑΚΤ ειδικό αντίσωμα (Σχήμα 7Β). Οι σύντομες θεραπείες προκάλεσε μόνο μικρές αλλαγές, με μέγιστη μείωση της φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών κατά 2-φορές (20: GSK-3α /β S21 /S9 και STAT3 Y705). επίπεδα φωσφορυλίωση μόνο τριών κινασών μεταβλήθηκε περισσότερο από 2-φορές στις μακροπρόθεσμες ανοιγμάτων, δηλαδή ΑΚΤ (T308), ρ53 (S46) και eNOS (S1177), που προκαλείται από νανομοριακές συγκεντρώσεις της ένωσης 5. Η ένωση 20 είχε πολύ λιγότερο δραματική επιδράσεις στην φωσφορυλίωση της κινάσης όταν συγκρίνεται με την ένωση 5, παρά γενικά πιο έντονη αντι-επεμβατική αποτελέσματά της. Συνοπτικά, η παρατηρούμενη μειωμένη ΑΚΤ και δραστικότητα ρ53 καθώς και τα τροποποιημένα επίπεδα φωσφορυλίωσης αρκετών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων eNOS, παν-JNK και GSK-3α /β, προτείνουμε να επιβραδύνεται ο μεταβολισμός των κυττάρων ή μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων.

PC -3 σφαιροειδή εκτέθηκαν σε δύο αντιπροσωπευτικά παράγωγα βετουλίνης, 5 και 20, για 4 h (σε 1 μΜ) και 6 ημέρες (0,3 μΜ). Α) Υπολογιστική ποσοτικοποίηση των εντάσεων σήματος από τις συστοιχίες κινάσης, ευθυγραμμισμένες με τις αλλαγές που παρατηρούνται φορές (αριστερά προς τα δεξιά). Β) κηλίδα Western του συνόλου και φωσφο-Akt (S473) φαίνονται τόσο για σύντομες όσο και μακροχρόνια έκθεση σε 20 και 5.

Η

Θα διερευνηθούν επίσης οι 3D πολυκύτταροι μορφολογίες του PC-3, LNCaP και σφαιροειδή Ep156T εκτίθενται στα 5 επιλεγμένα παράγωγα βετουλίνης τόσο για μικρές και μεγάλες χρονικές περιόδους 4 ωρών και 6 ημερών. Από μια λεπτομερή ανάλυση του κυτταροσκελετού ακτίνης (χρώση φαλλοϊδίνη), κατέστη προφανές ότι οι ενώσεις 5, 6, 15 και 20 διαταράσσεται αποτελεσματικά την οργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού μετά από 48 ώρες έκθεσης (Σχήμα 8Α). Είναι ενδιαφέρον, ένα σχεδόν πανομοιότυπο ακτίνης «ανοιχτήρι» φαινότυπος παρατηρήθηκε στην κανονική acini Ep156T και PC-3 σφαιροειδή (σχήμα 8Α: πάνελ μεγέθυνση στα δεξιά), ενώ ο τυπικός φλοιώδη οργάνωση της ακτίνης σε LNCaP σφαιροειδή παρέμεινε άθικτο. Αυτό υποδηλώνει ότι αυτά τα παράγωγα βετουλίνης μπορούν να στοχεύουν σχετικών περιόδων acinar μορφογένεση και δυναμικές διαδικασίες που εμπλέκονται στην κυτταρική κινητικότητα (επίσης κύτταρα EP156T σχηματίζουν δυναμική «διακλάδωση» δομές που διαπερνούν την ECM). Για φαινοτυπική συγκρίσεις, εξετάσαμε ένα πάνελ των ενώσεων αναφοράς στόχευσης Akt, Rac, ROCK, Src, και άλλων οδών, σε γενικές γραμμές συνδέονται με το κυτταρικό σκελετό ακτίνης. Καμία από τις ενώσεις που δοκιμάστηκαν ελέγχου επηρέασε την κυτταροσκελετού σε συγκρίσιμη τρόπο, με την εξαίρεση του μη ειδικού, παν-κινάσης αναστολέα σταυροσπορίνη. Ωστόσο, οι επιπτώσεις αυτές δεν ήταν ομοιόμορφες σε πίνακα των κυτταρικών σειρών (Σχήμα 8Β, μεγέθυνσης στα δεξιά).

ακτίνη του κυτταροσκελετού (νηματοειδή ή F-ακτίνη) βάφονται πράσινα (phalloidin), πυρήνες με μια κόκκινη χρωστική ουσία (