Αφηρημένο

τεχνολογίες

Υπερήχων διαποτίζουν τον ιατρικό τομέα: ως μακρά τροπικότητα απεικόνισης στην κλινική διαγνωστική? και, με την εμφάνιση των στοχευμένων εστιασμένος υπέρηχος υψηλής έντασης, ως μέσο θερμικά εκτομής όγκων. Παράλληλα, το δυναμικό της [μη θερμικών] ενδιάμεσο ένταση υπερήχων ως ελάχιστα επεμβατική θεραπεία είναι επίσης υπό αυστηρά αξιολογηθεί. Εδώ, επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα έχει παρατηρηθεί, αν και οριστική ταυτοποίηση του υποκείμενου μηχανισμού έχει μέχρι στιγμής παραμείνει απροσδιόριστη. Μια πιθανή μέθοδος υποψήφιος έχει προταθεί να εμπλέξει sonochemical δραστηριότητα, όπου δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) διαμεσολαβούν την παραγωγή DNA μονής αλυσίδας. Εδώ όμως, μας παρέχουν πειστικές νέα αποδεικτικά στοιχεία που να υποστηρίζει σθεναρά μια αμιγώς μηχανικό μηχανισμό. Επιπλέον, με ένα συνδυασμό ειδικών δοκιμασιών (ουδέτερη ουρά κομήτη και χρώση για το σχηματισμό εστιών γH2AX) που αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η αμερικανική έκθεση σε ακόμα μέτρια ένταση παρουσιάζει γονοτοξικό δυναμικό, μέσω της διευκόλυνσης της να δημιουργεί βλάβες στο DNA σε πολλαπλές γραμμές καρκίνου. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αναλύσεις colocalization τονίζουν ότι η ιονίζουσα ακτινοβολία και υπερήχους έχουν σαφώς διαφορετικές υπογραφές στα αντίστοιχα σχέδια τους σχηματισμού εστιών γH2AX, πιθανόν αντανακλώντας τις διαφορετικές διανομές του στρες που ξεκίνησε το σχηματισμό βλάβη. Επιπλέον, παράλληλα ανοσοαποτύπωση υποδηλώνει ότι το DNA-PKcs έχουν προνομιακή ρόλο στην επιδιόρθωση των υπερήχων που προκαλείται από βλάβη

Παράθεση:. Furusawa Υ, Fujiwara Υ, Campbell P, Zhao QL, Ogawa R, Αλί Χασάν Μ , et al. (2012) DNA δίκλωνα σπασίματα Induced από σπηλαίωσης μηχανικές εφαρμογές των υπερήχων στις γραμμές καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 7 (1): e29012. doi: 10.1371 /journal.pone.0029012

Εκδότης: Martin Γ Marinus, Πανεπιστήμιο της Μασαχουσέτης Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Σεπτέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 18 του Νοεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 Γενάρη 2012

Copyright: © 2012 Furusawa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση γι ‘αυτό μελέτη που παρέχεται από μια Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Β) (22.390.229), την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υπερήχων (US) είναι απαραίτητη στις περισσότερες ιατρικές τομείς: (i) των ΗΠΑ σε πολύ χαμηλές εντάσεις ( (Ii) υψηλής έντασης των ΗΠΑ (HIFU, & gt? 10 MPa ακουστική πίεση) επικεντρώθηκε χρησιμοποιείται για θερμική εκτομή των όγκων? και (iii) μη-θερμικό χαμηλής έντασης ΗΠΑ (0,1-1,5 MPa ακουστική πίεση μεταξύ των δύο παραπάνω) ως πιθανό υποψήφιο για τη θεραπεία του καρκίνου είναι επί του παρόντος υπό έρευνα [1]. Οι ιστοί που εκτίθενται σε US ενέργεια μπορεί να προκαλέσει ένα φάσμα βιολογικής απόκρισης, το καθένα με ξεχωριστή θεραπευτική δυνατότητα [1] – [6], συμπεριλαμβανομένων πρόσληψης εξωγενούς μορίων [7] – [14], νέκρωση, και την απόπτωση [1], [3] , [6], [15], [16]. Οι βιοφυσικές λειτουργίες των ΗΠΑ χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες, θερμική, cavitational, και μη-θερμικές μη cavitational αποτελέσματα. Σπηλαίωση οδηγεί σε μια ποικιλία από μηχανικές καταπονήσεις, όπως η διατμητική τάση, κρουστικό κύμα, υψηλή πίεση, και χημική καταπόνηση λόγω του σχηματισμού ελεύθερων ριζών, οι οποίες αμφότερες έχουν συναχθεί να ενεργούν ταυτόχρονα σε όλα τα βιολογικά υλικά [15] – [17]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η έντονη ΗΠΑ, καθώς και χαμηλής έντασης των ΗΠΑ εξαιρουμένων θερμικό αποτέλεσμα την πρόκληση αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή, η ρευστότητα της μεμβράνης, τα διαλείμματα του DNA μονού κλώνου (SSB,) και αρκετές προηγούμενες μελέτες συνεπάγεται τη σημασία της SSB, που προκύπτουν από υπερηχοχημικώς παράγεται ROS όπως βλάβη του DNA έναρξη US-επαγόμενη θανάτωσης κυττάρων /death [2] – [4], [6], [15]. Ωστόσο, η άποψη αυτή είναι αμφισβητήσιμη, επειδή πολλές SSB, που προκαλείται, για παράδειγμα, με τη σειρά mmol /L H

2O

2 οδηγεί σε καθόλου ή πολύ λίγα δίκλωνα σπασίματα (DSBs), τα πιο κυτταροτοξικές αλλοιώσεις του DNA [18]. Μέχρι σήμερα, ωστόσο, δεν υπάρχει άμεση απόδειξη για επαγωγή DSBs και εάν μετέπειτα ενεργοποίηση της ανταπόκρισης βλάβη του DNA (DDR) πορείες μπορεί να συμβεί μετά από έκθεση σε US. Σε προφανή αντίθεση, τα στοιχεία για την κυτταρική απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR), συμπεριλαμβανομένης της επαγωγής της ϋδΒδ και την αντιμετώπιση ζημιών κατάντη του DNA (DDR) έχουν πιο εκτεταμένα αναφερθεί [19]. Εδώ, θα αντιμετωπίσει αυτό το σημείο την αξιολόγηση της γενοτοξικό δυναμικό της χαμηλής έντασης ΗΠΑ. Στη μελέτη μας, αξιολογήσαμε αρκετές οριστική παραμέτρους που σχετίζονται με το σχηματισμό και την επεξεργασία των βλαβών του DNA, συμπεριλαμβανομένων των DSBs, μετά την έκθεση στις ΗΠΑ με μια σειρά από πειράματα που πραγματοποιούνται παράλληλα με ακτινοβολία IR sering ως θετικοί μάρτυρες.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Ουδέτερη κομήτη ουρά δοκιμασία (NCTA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του DNA DSBs εμφανίζονται σε τέσσερις διαφορετικές γραμμές λευχαιμίας (U937, Molt-4, Jurkat, και HL-60), που είχαν υποβληθεί είτε σε IR ( 10 Gy, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά), ή των ΗΠΑ (όπως τα ανοίγματα χρησιμοποιώντας εντάσεις των 0,3 ή 0,4 W /cm

2 διαρκεί 1 λεπτό). Θετικά αποτελέσματα, από την άποψη της όλο κομήτη ουρές σε σύγκριση με μη-ακτινοβολημένα μάρτυρες, παρατηρήθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μετράται κατά την περίοδο αμέσως μετά την έκθεση (t = 0) (Σχήμα 1Α). Ποσοτική σύγκριση, όσον αφορά το μέσο όρο σε σχέση με ουρά κομήτη στιγμή (RCTM) που προκύπτει (Σχήμα 1Β) παρήγαγε την ακόλουθη τάση σε όλες τις κυτταρικές σειρές: RCTM

0.4US & gt? RCTM

IR & gt? RCTM

0.3US, η οποία υπογραμμίζει τη συγκρισιμότητα των αντίστοιχων δόσεων των ΗΠΑ και IR επιλέχθηκε για την παρούσα έρευνα, όσον αφορά την εγκατάσταση τους να προκαλούν παρόμοια επίπεδα βλάβης του DNA. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι IR που παράγονται κατά μέσο όρο RCTMs κυρίως μέσα στο εύρος 1,1 έως 3, ενώ οι αμερικανικές ανοίγματα οδηγούν σε ένα ευρύτερο φάσμα που προκύπτει RCTM, η διανομή των οποίων ήταν επίσης συνάρτηση της έντασης των ΗΠΑ (Σχήμα 1C και το σχήμα S1).

(Α) SYBR πράσινο-χρωματισμένο ουδέτερο κομήτη ουρές αμέσως μετά την έκθεση των 937 (

U

), Jurkat (

J

), Molt-4 (

Μ

) και τα κύτταρα στις ΗΠΑ (0,3 ή 0,4 W HL-60 (

H

) /cm

2) ή IR (10 Gy). (Β) Σχετική στιγμές ουρά (

n

= 100 κύτταρα, σημαίνει ± SD), κανονικοποιημένη με τις αντίστοιχες χωρίς θεραπεία ελέγχους (= 1,0). (C) ανομοιογενής κατανομή στο & gt? 3.0, 1.1~3.0 και 1 (= επίπεδο ελέγχου) μέση σχετική στιγμές της ουράς μετά από τις ΗΠΑ, αλλά μια ομοιόμορφη κατανομή σε 1,1 – 3 σε σχέση με την ουρά στιγμή μετά από 10 Gy σε -90 κύτταρα% U937 (

n

= 100 κύτταρα). Βλέπε Εικ. S1 για άλλες κυτταρικές σειρές. (D) Green-fluorescentγH2AX εικόνες σε U937, Jurkat, Molt-4 και HL-60 κύτταρα 30 λεπτά μετά 0,3 W /cm

2 ΗΠΑ (εικόνες κύτταρο ελέγχου που δεν φαίνεται λόγω καμία γH2AX + κύτταρα). (Ε) επαγωγή των κυττάρων γH2AX + σαν συνάρτηση της έντασης των ΗΠΑ πέρα ​​από το όριο του 0,1-0,2 W /cm

2 (

n

= 3, μέσος όρος ± Τ.Α.). εικόνων (F) γH2AX + κυττάρων και (G) FCM ιστογράμματα γH2AX + U937 κύτταρα 30 λεπτά μετά από 0,3 W /cm

2 και 10 Gy IR. Μαύρο, πράσινο, και κόκκινο προφίλ είναι για τον έλεγχο, ΗΠΑ, και IR, με ΝΧΙ των κυττάρων γH2AX + (5-100 γH2AX log)). (H) Επαγωγή /παρακμή του γH2AX + κύτταρα U937 (FCM) με το χρόνο μετά 0,3, 0,4 W /cm

2 (i) και 10 Gy IR (ii). (Ι) Μείωση στιγμές ουρά κατά την διάρκεια 3 h απόηχο 0,3 W /cm

2 ΗΠΑ (i) ή 10 Gy IR (ii). -ίτηκ σε 50 μmol /L χρησιμοποιήθηκε για την εξάλειψη των αποπτωτικών DSBs.

Η

ότι οι αναλύσεις NCTA θεωρούνται DSBs, η παρουσία διακριτών γH2AX εστιών μπορεί επίσης να αντιπροσωπεύει μια οριστική υπογραφή για DSBs [20]. Παρατηρήσαμε τέτοια χρώση γH2AX σε όλα τα κύτταρα που εκτίθενται σε 10 Gy (Σχήμα 1 F), και το σημαντικότερο, σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εκτίθενται σε US (Σχήμα 1 D) πάνω από ένα κατώφλι έντασης των περίπου 0,1-0,2 W /cm

2 (Σχήμα 1 Ε και σχήμα S2, S3), που δείχνει, για πρώτη φορά, ότι η αμερικανική έκθεση μπορεί να προκαλέσει ϋδΒδ και ως εκ τούτου παρουσιάζουν απτά γονοτοξικό κίνδυνο.

παρατήρησης μετά την έκθεση σε κύτταρα που εκτίθενται σε IR συγκρίνεται ευνοϊκά με τις προηγούμενες εκθέσεις [21 ] σε αυτό το γH2AX + κύτταρα παρουσίασαν διακριτές εστίες που διανέμονται σε όλο τον πυρήνα (Σχήμα 1 F), καθώς επίσης και την επόμενη χρονική χαρακτηριστικών του πληθυσμού γH2AX + παρουσίασαν κορυφώθηκε στα 30 λεπτά μετά την έκθεση, που ακολουθείται από σταδιακή παρακμή (Σχήμα S4). Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτή η τελευταία μείωση των συνολικών γH2AX + πληθυσμούς υπαγορευόταν ποιοτικά με τις τάσεις που παρατηρούνται, επίσης, χρησιμοποιώντας NCTA (σχήματα 1 (ii) και 1Θ (ii)), υποστηρίζοντας την επισκευή IR που προκαλείται ϋδΒδ.

Από US-εκτεθειμένο ( επεξεργασία με υπερήχους) κυττάρων, το σχετικό κλάσμα των γH2AX + ήταν εντονότερη, όπως επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπου γH2AX + επίπεδα ήταν περίπου τρεις φορές υψηλότερο σε σύγκριση με IR εκτεθειμένα κύτταρα (Σχήμα 1G). Επηρεάζονται τα κύτταρα παρουσίασαν επίσης μια παν-πυρηνικά γH2AX + διανομής, με περιστασιακές αλλά διακριτές εστίες υπέρθεση (Σχήμα 1 F). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο πληθυσμός γH2AX + κορυφώθηκε στα 60 λεπτά μετά την έκθεση τόσο για το 0,3 και 0,4 W /cm

2 περιπτώσεις ΗΠΑ χρησιμοποιηθεί, ακολουθούμενη από μία περίοδο ανάκαμψης που σταθεροποιήθηκαν μετά από 6 ώρες (Σχήμα 1 (i) και στο σχήμα S4).

Οι προφανείς διαφορές σε τυπικό γH2AX + καλύψεις που προκύπτουν για IR και των ΗΠΑ εκτίθενται τα κύτταρα, μαζί με διακριτικό σχετική κομήτη κατανομές τους ουρά στιγμή (σχήμα 1Γ), και σημαντικά διαφορετική + φορές οξύνοντας γH2AX, υποδηλώνει ότι οι αντίστοιχες DDR τους σηματοδότηση μονοπατιών είναι διαφορετικής φύσεως. Επιπλέον, στις περιπτώσεις όπου US εφαρμόστηκε έκθεση, η απασχόληση του αναστολέα παν-κασπάσης z-VAD-fmk να καταστείλει απόπτωση φαίνεται να έχουν αμελητέα επίδραση (Σχήμα 1Θ (i) και το Σχήμα S5), ενώ TRAIL-επαγόμενης γH2AX (κασπάσης με τη μεσολάβηση γH2AX) για παράδειγμα θα μπορούσε να καταργηθεί (Σχήμα S5):. πειστική απόδειξη ότι η παρατηρούμενη επαγωγή και μετά την κορύφωση απώλεια γH2AX σε όλες τις περιπτώσεις είναι πιθανόν σχετίζεται με βλάβες στο DNA και επιδιόρθωση

για να διερευνήσουν, αναλάβαμε συνεργασία εντοπισμός λεκέδες από γH2AX με δύο σημαντικά κινάσες υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση Η2ΑΧ, αταξία-τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) και DNA-PKcs [22]. Σχ. 2Α-Β δείχνουν ότι το μεγαλύτερο μέρος της φωσφο-NBS1 και -ATM εστίες colocalized να γH2AX εστίες μετά από τόσο ΗΠΑ

και

ανοίγματα IR, γεγονός που υποδηλώνει μια γενική και συντονισμένη πρόσληψη NBS1 και ΑΤΜ για να τονίσει προκαλείται από DSBs [23] , [24]. Το παν-πυρηνική χρώση των γH2AX που εμφανίζεται μόνο μετά από αμερικανική έκθεση μπορεί να προκύψει μέσα από την παγκόσμια ενεργοποίησης ΑΤΜ, ίσως μέσω αναδιαμόρφωσης χρωματίνης [25] για την αντιμετώπιση της φύσης των ΗΠΑ στρες.

(Α) Κοινός εντοπισμός των διακριτών NBS1 pS343 εστίες σε διακριτές γH2AX εστίες? (Β) Κοινός εντοπισμός των ATM pS1981 εστίες να γH2AX εστίες? (C) DNA-PKcs pT2609 εστίες σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητη από γH2AX εστιών. (D) US-και IR-επαγόμενη DNA-PKcs pS2056 και γH2AX εστιών. ΗΠΑ που προκαλείται περι-πυρηνική υψηλής φθορισμού DNA-PKcs pS2056 εστίες (

δεξιά

) ή ήταν παν-πυρηνικά με διακριτές εστίες

(αριστερά)

, ενώ και οι δύο εστίες μετά IR ήταν διαφορετικές και colocalized. Φθορίζουσες εικόνες αποκτήθηκαν 30 λεπτά μετά από 0,3 W /cm

2 ΗΠΑ και 3 Gy IR σε κύτταρα U937.

Η

Επιπλέον, έρευνες χρώση των δύο μεγάλων συστάδων φωσφορυλίωση (T2609 και S2056) που διατίθενται για DNA-PKcs (για το τέλος επεξεργασίας του DSB μέσω μη-ομόλογο τέλος ενώνει (NHEJ) [26] – [29]) αποκάλυψε (Σχήμα 2C), ότι οι εστίες DNA-PKcs-pT2609 ήταν σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητη από γH2AX μετά από τις ΗΠΑ και τα ανοίγματα IR , υποστηρίζοντας προηγούμενες προτάσεις που ΝΗΕΙ εμφανίζεται ξεχωριστά από ομόλογο ανασυνδυασμό HR [30], [31]. Αντίθετα, όλα τα IR-εκτεθέντα κύτταρα εμφανίζονται διακριτά, συν-εντοπισμένη DNA-PKcs-pS2056 /γH2AX + πυρηνικών εστίες (Σχήμα 2D), επίσης επιβεβαιώνοντας προηγούμενες αναφορές ότι DNA-PKcs συμπληρώνει Η2ΑΧ σε απόκριση IR [22]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσεις επί των ΗΠΑ επαγόμενη γH2AX + πληθυσμοί εμφάνισαν επίσης επικαλυπτόμενες περιοχές του συν-εντοπισμό με DNA-PKcs, αλλά επιπλέον, μια ξεχωριστή υπογραφή μη colocalized περι-πυρηνικό DNA-PKcs-pS2056 (Εικόνα 2D). Έτσι, προνομιακή φωσφορυλίωση του DNA-PKcs-pS2056 μπορεί να μεσολαβήσει τόσο επισκευής ΝΗΕΙ χύμα-πυρηνικά ΗΠΑ-που προκαλείται ϋδΒδ, αλλά και σηματοδοτούν να γH2AX παρουσία γύρω από την πυρηνική περιφέρεια (βλέπε επίσης Σχήμα S6). Ο μηχανισμός με τον οποίο DNA-PKcs S2056 κατανέμεται γύρω από την περιφέρεια του πυρήνα παραμένει ασαφής, ωστόσο, αυτό εντοπισμός μοτίβα του DNA-PKcs S2056 μπορεί να είναι μία από τις χαρακτηριστικές κυτταρικές αποκρίσεις σε US-επαγόμενη DSBs.

Αξιολογήσαμε περαιτέρω τις βιοχημικές ρόλους των ΑΤΜ και DNA-PK με την εφαρμογή των αντίστοιχων αναστολέων φαρμακολογικών κινάσης KU55993 (KU) και NU7026 (NU). Ανοσο-στυπώματα αποκάλυψε ότι IR προκάλεσε μια μεγαλύτερη φωσφορυλίωση ATM από ό, τι στις ΗΠΑ (Σχήμα 3Α), αντανακλώντας κάπως νωρίτερα παρατήρηση NCTA (Σχήμα 1Α) μας. Αξιοσημείωτα όμως, βρήκαμε ότι KU, αλλά όχι NU, εκλεκτικά μειώνει τα επίπεδα φωσφο-ATM μετά ΗΠΑ και IR (Σχήμα 3Α). Εδώ, η φωσφορυλίωση του DNA-PKcs-S2056 (pS2056) ήταν μεγαλύτερη από των ΗΠΑ από το IR. Όπως αναμενόταν, NU ανέστειλε φωσφορυλίωση S2056 σημαντικά, ενώ KU μειωμένη T2609 φωσφορυλίωση ATM-εξαρτώμενη [26], μετά τις ΗΠΑ και IR. Επιπλέον, KU μειωμένη μερικώς US-επαγόμενη DNA-PKcs-pS2056 τόσο ανοσοκαθήλωση και ανοσο-χρώση (Σχήμα 3Β, D), γεγονός που υποδηλώνει στιχομυθία μεταξύ ATM και DNA-PKcs-S2056 σε απόκριση σε US έκθεση.

(Α) ανοσοστυπώματα των κυττάρων U937 εξάγει 30 λεπτά μετά από τις ΗΠΑ ή IR και τα αποτελέσματα της KU και NU σε ΑΤΜ pS1981 και DNA-PKcs pS2056 /pT2609. (Β) Μεγαλύτερη καταστολή των ΗΠΑ που προκαλείται γH2AX από NU από KU έως 6 ώρες μετά από τις ΗΠΑ σε κύτταρα U937 σε WB ανάλυση. (Γ) Αποτελέσματα της KU ή /και NU: μια μεγαλύτερη καταστολή των ΗΠΑ που προκαλείται γH2AX + κύτταρα από NU από KU, και την κατάργηση του KU-συν-NU στην ανάλυση FCM. (

n

= 3, μέσος όρος ± Τ.Α.). *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KU και /ή NU (10 μmol /L) επί 1 ώρα πριν και μετά την έκθεση σε 0,3 W /cm

2 ΗΠΑ (i) ή 10 Gy IR (ii). (D) DNA-PK προηγήθηκε ATM για την επαγωγή γH2AX από ΗΠΑ: προτιμησιακό ρόλο του DNA-PK στην επαγωγή γH2AX προσδιορίστηκε με ανοσοχρώση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Σχ. 4C. ATM pS1981 (ΑΤ), DNA-PKcs pS2056 (ΡΚ), και γH2AX (Η2) θετικών /αρνητικών κυττάρων μετρήθηκαν τουλάχιστον 100 κύτταρα σε κάθε πείραμα. Τα στοιχεία δείχνουν τους μέσους όρους από 2 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Δεδομένου ότι ΗΠΑ φαίνεται να ενεργοποιεί το DNA-PK κατά προτίμηση σε ATM, αυτό ίσως δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι NU ήταν πιο αποτελεσματική στη μείωση των ΗΠΑ που προκαλείται από πρωτεΐνη γH2AX επίπεδα από ό, τι ήταν KU (όπως απεικονίζεται για την περίπτωση των κυττάρων U937 (Σχήμα 3Β), και στις άλλες κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα S7)) -ένα παρατήρηση που περαιτέρω ενισχύεται από συμπληρωματικές μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής (Σχήμα 3C και το Σχήμα S8), η οποία κατέδειξε επίσης πλήρη αναστολή όταν χρησιμοποιείται ένας συνδυασμός KU /NU (Σχήμα 3C (i)). Τέτοιες φαρμακολογικές αναστολές επιβεβαιώθηκαν και από ανοσο-χρώση και αναπαράγονται σε όλα τα κύτταρα (Figue 3D και αριθμοί S7, S9). Η εξάρτηση της DNA-PKcs επί US-επαγόμενη φωσφορυλίωση Η2ΑΧ επιβεβαιώθηκε επίσης με σύγκριση της US-απόκρισης της DNA-PKcs ελαττωματικό κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος (M059J) με εκείνη της γονικής κυτταρικές σειρές του (M059K) (Σχήμα S10). Συνοπτικά, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν σθεναρά προτιμησιακή ρόλο για DNA-PKcs πάνω ATM, πιθανώς χωρίς τη συμμετοχή του ATR, στις αρχές της δεκαετίας σηματοδότηση από την US-επαγόμενη DSBs να γH2AX, αλλά με την ακριβώς απέναντι αίσθηση της σηματοδότησης από IR-επαγόμενη DSBs (Σχήμα 3Α, C), όπως έχει αποδειχθεί στο παρελθόν [22].

Τέλος, θελήσαμε να εξερευνήσετε την φυσικο-χημικός μηχανισμός στις ΗΠΑ προκαλείται από βιο-επιπτώσεις από περαιτέρω έλεγχο της υπόθεσης ότι sonochemistry διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο. Εδώ, θα αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ ΗΠΑ-που προκαλείται από ΟΗ • ρίζες και επαγωγή DSB. Βρήκαμε ότι οι αμερικανικές επαγόμενη ΟΗ • επίπεδα (ϋΜΡΟ-ΟΗ προϊόντα προσθήκης) στον αερόβιο διάλυμα DMPO αυξήθηκε σε intensity-, και χρονικά έκθεσης, εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Α) όπου τα ποσοστά επαγωγή 1 και 2 DMPO-ΟΗ προσαγωγές ανά 0,3 και 0,4 W /cm

2 /λεπτό, αντίστοιχα, ήταν μία τάξη μεγέθους μικρότερες από τις 30 προσαγωγές ανά 10 Gy (Σχήμα 4Α) που παρατηρείται για την περίπτωση έκθεσης IR. Έτσι, το εξωκυτταρικό ΟΗ • επίπεδο μετα-ΗΠΑ ήταν λιγότερο από το 10% του εν λόγω συμβαίνουν μετά-IR, παρόλο που εφαρμόστηκαν ανάλογες δόσεις (από την άποψη των δυνατοτήτων τους για να δημιουργήσουν βλάβες στο DNA (

δηλαδή

Εικόνα 1Α). Επιπλέον, η προσθήκη μέσων δέσμευσης ριζών DMSO και NAC σε αντίστοιχα υψηλή ή χαμηλές συγκεντρώσεις σε διάλυμα DMPO, είτε καταργούνται, ή μερικώς μειωμένη US-επαγόμενη ΟΗ • επίπεδα (Σχήμα 4Α? βλέπε λεζάντα, και Μέθοδοι για περισσότερες λεπτομέρειες). στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τα ενδοκυτταρικά ΟΗ • επίπεδα αμέσως μετά των ΗΠΑ χρησιμοποιώντας ένα φλουορεσκεΐνη υδροξυφαινυλο (HPF) δοκιμασία [32]. Εδώ, η μέση ένταση φθορισμού (MFI) από μετατοπιστεί κυτταρομετρίας ροής ιστόγραμμα ήταν 1,57 ± 0,07 αμέσως μετά από έκθεση σε 0,3 W /cm

2 (Σχήμα 4Β), Έτσι, τα χαμηλά επίπεδα των δύο εξω- και ενδο-κυτταρικών ΟΗ • προκύπτουν σε απόκριση προς ΗΠΑ δεν μπορούν να εξηγήσουν πλήρως για την επαγωγή του DSBs ΗΠΑ. Επιπλέον, κανένα από τα μέσα δέσμευσης ριζών ήταν αποτελεσματική στην καταστολή της US-επαγόμενη γH2AX (Σχήμα 4C). αντιθέτως, N

2O αερίου, η οποία είναι γνωστό ότι καταστέλλει αδρανειακή σπηλαίωση του US [3], καταλυθεί τελείως την επαγωγή DMPO-ΟΗ προσαγωγές, γH2AX + κύτταρα και τον κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 4D-F ). Αυτές οι παρατηρήσεις που έγιναν στο σύνολό μας υποχρεώνουν στο συμπέρασμα ότι ΗΠΑ-μεσολάβηση μηχανική καταπόνηση, παρά οποιονδήποτε υπερηχοχημικώς δημιουργείται ριζική δραστηριότητα, δημιουργεί γονιδιωματική ϋδΒδ.

(Α) EPR ανίχνευση των ΗΠΑ- ή IR που προκαλείται από εξω και ενδοκυτταρικά επίπεδα της ΟΗ • ως ϋΜΡΟ-ΟΗ προσαγωγές (βλέπε Μέθοδοι)? Αύξηση OH • επίπεδα σε διάλυμα DMPO (10 mmol /L) ως συνάρτηση του χρόνου ηχητική επεξεργασία σε 0,3 (

αριστερά

) και 0.4 (

Μέση

) W /cm

2 ΗΠΑ ή σε δόση IR 5-20 Gy (

δεξιά, έκλεισε τον κύκλο

). Επαγωγή ϋΜΡΟ-ΟΗ προσαγωγές κατά 0,3 ή 0,4 W /cm

2 μειώθηκαν εν μέρει από 50 mmol /L DMSO (

ανοδική τρίγωνο

) ή 5 mmol /L NAC (

προς τα κάτω τρίγωνο

), και εξουδετερωθεί από μια 10-φορές υψηλότερες συγκεντρώσεις: 50 mmol /L NAC ή 500 mmol /L DMSO (

κλειστά διαμάντια

για τα δύο). Τα ένθετα δείχνουν πλάτη των σημάτων EPR της ϋΜΡΟ-ΟΗ. (Β) δοκιμασία HPF FCM-βάση για ενδοκυτταρικά επίπεδα ΟΗ • αμέσως μετά 0,3 W /cm

2 ΗΠΑ σε κύτταρα U937. Η μετατόπιση προς ιστόγραμμα υψηλής HPF φθορισμός από ΟΗ • οξείδωση ήταν μικρή, και έτσι, μια αύξηση στη μέση ένταση φθορισμού (MFI) ήταν 1,57 ± 0,07 φορές τον έλεγχο (

n

= 3, μέσος όρος ± SD), με μερική προστασία με προκατεργασία με 5 mmol /L NAC για 3 ώρες πριν από την κατεργασία με υπερήχους. (Γ) Δεν προστατευτικά αποτελέσματα των 5 mmol /L DMSO ή 5 mmol /L NAC (καθαριστών) προστίθεται σε καλλιέργειες αμέσως πριν από 0,3 και 0,4 W /cm

2 ΗΠΑ, ή άλλα 3 h-προεπεξεργασία με 5 mmol /L NAC (NAC-προ) κατά την επαγωγή της γH2AX + U937 κύτταρα 30 λεπτά μετα-ΗΠΑ. (

n

= 3, μέση τιμή ± s

ns

μέσα

δεν είναι σημαντική

). (D-F) Κορεσμένα Ν

2O αερίου προκάλεσε την κατάργηση των ΗΠΑ που προκαλείται από τα γεγονότα ως εξής: (Α) Η αμερικανική έκθεση απασχόλησης εξαρτάται από την επαγωγή της ΟΗ • σε διάλυμα ϋΜΡΟ /L 10 mmol σε 0.3 και 0.4 W /cm

2 (

n

= 3, μέση τιμή ± SD). : (Ε) Η επαγωγή των U937 κυττάρων γH2AX + 30 λεπτά μετά από 0,3 και 0,4 W /cm

2 (

n

= 3, μέσος όρος ± Τ.Α.). : (F) 20% μη βιώσιμων κυττάρων (trypan μπλε χρωστική δοκιμή αποκλεισμού) και την απώλεια του 30% στον αριθμό των κυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου 937 6 ώρες μετά 0,3 ή 0,4 W /cm

2 ΗΠΑ (

n

= 3, μέση τιμή ± SD).

η

Εδώ, έχουμε αποδείξει για πρώτη φορά ότι η μηχανική δράση των ΗΠΑ χρησιμοποιώντας το ενδιάμεσο εντάσεις επίπεδο μπορεί να προκαλέσει DSBs που έχουν ανακοινωθεί από την παρουσία του ουδέτερου κομήτη ουρά και γH2AX εστίες ανάμεσα σε μια κουβέρτα παν-πυρηνικά γH2AX με περι-πυρηνικό DNA-PKcs S2056. Επιπλέον, οι παρούσες εντάσεις των 0,3 και 0,4 W US /cm

2, η οποία οδήγησε σε 0,132 και 0,144 MPa κορυφή ακουστικές πιέσεις, αντίστοιχα [16], είναι πέρα ​​από το διαγνωστικό εύρος ΗΠΑ (& lt? 0,1 MPa) [1 ] και επιβεβαίωσε ότι ΗΠΑ στο 0,1 W /cm

2 (0,082 MPa) δεν θα μπορούσε να προκαλέσει ϋδΒδ (Εικ. 1 Ε). Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν την ασφάλεια των διαγνωστικών ΗΠΑ, ιδίως αν ληφθούν υπόψη τα ακόλουθα τρία σημεία: (i) πολύ βραχείς παλμούς (μια-δυο μικροδευτερόλεπτα) που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση, (ii) στάσιμα κύματα είναι απίθανο να συμβεί σε

στο vivo

ανοίγματα, και (iii) η εξασθένιση των ακουστικών κυμάτων στο ανθρώπινο σώμα. Εν κατακλείδι, ελπίζουμε ότι αυτές οι νέες και αναγκάζοντας τις παρατηρήσεις όχι μόνο θα παρέχει μια σταθερή βιοφυσική και βιοχημική βάση για την κατανόηση της γονιδιοτοξικό δυναμικό των ΗΠΑ, αλλά και καθοδηγούν τη μελλοντική μετάφραση όσον αφορά τα κατώτατα όρια ασφαλείας.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και κύτταρα

Ο αναστολέας της DNA-PK NU7026 και ΑΤΜ αναστολέας KU55933 αγοράστηκαν από την Calbiochem (Cambridge, UK). Ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές λευχαιμίας U937, Molt-4, και Jurkat-T ελήφθησαν εμπορικά (Japanese συλλογή της έρευνας Bioresources (JCRB) Cell Bank [32]. HL-60 ελήφθη επίσης από JCRB Τράπεζας Κυττάρων (IFO50022). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό Recombinant TRAIL /Apo2L ήταν από την PeproTech (London, UK)?. ένας αναστολέας παν-κασπάσης zVal-Ala-DL-Asp-φθορομεθυλ κετόνη (-ίτηκ) ήταν από Peptide Institute (Osaka, Japan)?

N

-ακετυλ-L-κυστεΐνη (NAC) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) ήταν από την Wako Pure Chemical (Tokyo, Japan)? 4 ‘, 6-διαμινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) και 5,5-διμεθυλο-1-pyrroline-

Ν

οξείδιο (ϋΜΡΟ) ήταν από Dojindo (Κουμαμότο, Ιαπωνία).

υπερήχους και ακτινοβόλησης

Low-intensity- παλμική ΗΠΑ με 100 Hz συχνότητα σταθερής επανάληψης παλμών και συντελεστή απόδοσης 10% (στη συνέχεια χαρακτηρίζεται ως US) δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 1,0 MHz ακουστική ρύθμιση [16], [33]. σε πειράματα ηχητική επεξεργασία, ένα 2 mL-δείγμα σε σταθερή πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /mL σε 35-mm δίσκο καλλιέργειας πολυαιθυλένιο (Corning, ΝΥ) υποβλήθηκε σε υπερήχους στους 0,1-0,4 W /cm

2 (επινοήσουν-υποδεικνύεται εντάσεις) για 1 λεπτό. Αυτές οι τέσσερις εντάσεις αντιστοιχούσε σε 0.061, 0.105, 0.132 και 0.144 MPa αιχμή ακουστικής πίεσης, αντίστοιχα [16]. Μια αύξηση του μέσου κατά τη διάρκεια της ηχητικής επεξεργασίας θερμοκρασία ήταν κάτω από 1 ° C [16]. Για τη θεραπεία IR, τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με 3 Gy (για την παραγωγή διακριτών IRIFs) ή 10 Gy (μια σχεδόν isoeffect δόση για την ουδέτερη κομήτη ουρές που επάγεται από 0,3 και 0,4 W /cm

2) με ρυθμό δόση 5 Gy /min χρησιμοποιώντας μια πρότυπη μονάδα MBR-1520R-3 ακτίνων Χ (Hitachi Medico Τεχνολογίας, Kashiwa, Ιαπωνία).

Ουδέτερη κομήτη δοκιμασία

Ουδέτερη κομήτη ουρές (DSBs) αξιολογήθηκαν σε ΗΠΑ-εκτεθειμένες κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας και ηλεκτροφόρηση μονάδα Comet (Trevigen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τουλάχιστον 50 κύτταρα ανά δείγματα αναλύθηκαν με τη χρήση ενός λογισμικού Comet Δοκιμασία IV (Leica Microsystems). Η σχετική ουρά στιγμή που δόθηκε από το λόγο του κομήτη στιγμές ουράς (μέσος όρος ± SD) των επεξεργασμένων κυττάρων με εκείνα των ελέγχων (λόγος = 1,0).

Ανοσοσήμανση

Για ανοσοφθορισμού εικόνες, paraformaldehyde- σταθερό έλεγχο και τα επεξεργασμένα κύτταρα διαπερατά /αποκλείστηκαν με 2% BSA /0.05% Triton Χ-100 /Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, και ανοσοχρώση για 2 ώρες με πρωτεύον μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb): αντι-φωσφο-Η2ΑΧ S139 (γH2AX, Milipore) , 1:400 ή αντι-ATM pS1981, 1:250 (Upstate Biotechnology) ή πρωτογενή πολυκλωνικό αντίσωμα (pAb), αντι-φωσφο-Η2ΑΧ S139 (γH2AX, Active Motif), 1:500, αντι-NBS1 pS343, 1:1000 (Novus Biologicals), ή αντι-DNA-PKcs pT2609 ή pS2056, 1:250 ή 1:600 ​​(Abcam), αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για 1,5 ώρα με το δευτερογενές αντίσωμα: Alexa Fluor 488 αντι-ποντικού F (ab ‘) IgG ή Alexa Fluor 555 αντι-κουνελιού F (ab’) IgG (Cell Signaling Technology), 1:400. Τέλος, οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 2 μg /mL DAPI, και τα δείγματα τοποθετούνται σε αντιξεθωριάσματος ™ (Molecular Probes). Φθορισμού εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ΒΧ-50 μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus Optics).

Για κυτταρομετρία ροής (FCM), τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% ψυχρή μεθανόλη όλη τη νύκτα, στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 2% BSA /0.05% Triton X-100 /Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και αντέδρασε με γH2AX mAb /Alexa Fluor 488 αντι-ποντικού IgG (1:400) για τη χρώση γH2AX + κύτταρα, που ακολουθείται από επώαση με 1 mg /mL RNase Α και 50 μg /mL PI κατανομής γH2AX + κύτταρα σε κάθε μία από τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου PI-based. Τα δείγματα έτρεξαν τελικά σε μια ροή Epics XL κυτταρόμετρο (Beckman Coulter).

Για ανάλυση ανοσοστυπώματος, εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν σε RIPA ρυθμιστικό λύσης που περιέχει ορθοβαναδικό νάτριο και κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Nacalai Tesque). μόρια υψηλού μοριακού βάρους από ΑΤΜ και DNA-PKcs διαχωρίστηκαν σε 5% πήγματα προκατασκευασμένων SDS-PAGE, ενώ άλλες μικροτέρου μοριακού βάρους πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν σε 15% γέλες προκατασκευασμένων SDS-PAGE. Μετά τη μεταφορά, οι πρωτεΐνες στις μεμβράνες Immobilon-P (Millipore) ήταν δυτικού καθάρισε χρησιμοποιώντας τα πρωτογενή αντισώματα: γH2AX mAb, ATM pAb (Santacruz), ATM pS1981 mAb (Epitomics), DNA-PKcs pAb (Epitomics), DNA-PKcs pS2056 pAb, DNA-PKcs pT2609 mAb, κασπάσης 3 pAb (κυτταρική σηματοδότηση) ή GAPDH mAb (αναφορά φόρτωση, Organon Teknika), και τα δευτερεύοντα συζευγμένο με HRP IgGs αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού (Cell Signaling). επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης έγιναν ορατές με ένα σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Nacalai Tesque), και οι εικόνες αποκτήθηκαν από ΣΕΝ-4000 αναλυτή φωταύγειας της εικόνας (Fuji Film).

Ανίχνευση εξω- και ενδο-κυτταρική ROS

Τα επίπεδα των ΗΠΑ- ή IR που προκαλείται από ΟΗ • στα εξωκυττάρια υγρά είχαν ποσοτικοποιηθεί από το ηλεκτρόνιο παραμαγνητικού συντονισμού (EPR) spin-μέθοδος παγίδευσης [3], [16]. Γι ‘αυτούς, 2-mL κλάσματα των 10 mM DMPO διανεμήθηκαν σε δίσκους των 35-mm και εκτέθηκαν σε 0,3 και 0,4 W /cm

2 για 1 έως 5 λεπτά ή να βαθμολογούνται δόσεις IR (5-20 Gy), ακολουθούμενο από η άμεση ανίχνευση των σημάτων προσαγωγού ϋΜΡΟ-ΟΗ χρησιμοποιώντας ένα RFR-30 EPR φασματόμετρο (Radical Research). DMPO-ΟΗ ενώσεις προσθήκης (OH •) εκφράστηκαν ως σχετικές ποσότητες προς εσωτερική αναφορά (Mn

2+). Για την ανίχνευση ενδοκυτταρική ΟΗ •, χρησιμοποιήθηκε κύτταρο-διαπερατό υδροξυφαινυλο φλουορεσκεΐνη (HPF) (Sekisui Ιατρική), το οποίο ανιχνεύει κυρίως ΟΗ • και οριακά ONOO

– (~ 1/10 το ΟΗ • ποσό) [31]. Τα κύτταρα φορτώθηκαν με 5 ηΜ HPF για 15 λεπτά στους 37 ° C, και εκτέθηκαν σε 0,3 W /cm

2, που ακολουθείται από την άμεση ανάλυση FCM του US-επαγόμενης ενδοκυτταρικής ΟΗ •. Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) της οξειδωμένης ανιχνευτή προσδιορίστηκε ποσοτικά να εκτιμηθεί φορές αύξηση του έναντι του μάρτυρα.

Στατιστικά

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι ± s.d. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ δύο συνόλων δεδομένων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t-test

με το Microsoft Excel 2007.

Υποστήριξη Πληροφορίες αταίριαστο Φοιτητών

Εικόνα S1.

Δοκιμασία για την ουδέτερη κομήτη ουρές σε Jurkat, Molt-4 και HL-60 κύτταρα αμέσως μετά 0,4 W cm

2 ΗΠΑ αποκάλυψε την άνιση ευρύτερη κατανομή 25-30, 35-50% και 10-23% κύτταρα /σε σειρές & gt? 3, 1,1 – 3 και 1 σχετική στιγμές ουρά, αντίστοιχα, σε σύγκριση με μια μάλλον ομοιόμορφη κατανομή των 80-90% πλειοψηφία των κυττάρων σε ένα μικρότερο εύρος των 1,1 έως 3 σε σχέση στιγμές μετά από 10 Gy IR. Σχετική ουρά στιγμή του 1,0 αντιπροσωπεύει κανένα επάγεται DSBs όπως στα κύτταρα ελέγχου. Μετά από 0,3 W /cm

2, ομοίως, 10-25, 30-40% και περίπου 50% των κυττάρων που προκύπτουν & gt? 3, 1,1 – 3 και 1 (δεν DSBs) σε σχέση στιγμές ουρά, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα Ανακεφαλαιώνοντας τα ευρήματα στα κύτταρα U937 (Σχήμα 1Α, Γ.)

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s001

(PDF)

Εικόνα S2.

φθορισμού εικόνες έδειξαν μοτίβο παν-πυρηνικά γH2AX κύτταρα 30 λεπτά μετά από 0,4 W /cm

2 ΗΠΑ, αλλά δεν γH2AX + κυττάρων μετά από 0,1 W /cm

2 U937. Τα κύτταρα με 10 Gy IR του χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για χρώση γH2AX

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s002

(PDF)

Σχήμα S3.

φθορισμού εικόνες γH2AX σε U937, Jurkat, Molt-4 και HL-60 κύτταρα χωρίς ΗΠΑ- ή IR-έκθεσης. Τα ποσοτικά δεδομένα φαίνεται στο Σχ. 1E

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s003

(PDF)

Εικόνα S4.

Εκπρόσωπος FCM ιστογράμματα έδειξε την επαγωγή και την παρακμή της γH2AX + U937 κυττάρων με το χρόνο έως και 6 ώρες μετά από 0,3 ή 0,4 W /cm

2 (1 λεπτό) των ΗΠΑ ή 10 Gy IR. χρονική εξέλιξη των μεταβολών στα κύτταρα γH2AX + μετά από τις ΗΠΑ ή IR (Εικ. 1) προήλθε από τη μέση τιμή του φθορισμού των ιστογράμματα (σκιασμένο). Σημείωση μέγιστη γH2AX + κλάσματα σε 0,5 ή 1 ώρα, που ακολουθείται από μειώσεις τους αργότερα, με κάποιες επίμονη γH2AX + κλάσματα περίπου 6 ώρες μετά το στρες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s004

(PDF)

Εικόνα S5.

Διαφορετικές Η2ΑΧ αποκρίσεις σε ΗΠΑ και TRAIL συνδέτη θάνατος-υποδοχέα σε U937, Jurkat, Molt-4, και HL-60 κύτταρα. (Α) Χρόνος που εξαρτώνται από αυξήσεις στην έκφραση της πρωτεΐνης γH2AX και ρ17 /ρ19 δραστικές μορφές διασπασμένη κασπάση 3, ένα ουσιώδες αποπτωτικό δείκτη, μετά την προσθήκη 0,1 mg /mL TRAIL. (Β) zVAD-κατασταλτικό κασπάσης-3 διάσπαση σε U937, Jurkat, Motl-4 και κύτταρα HL-60: Η αναστολή της κασπάσης-3 διάσπαση με κατεργασία με-ίτηκ για 6 ώρες μετά 0,3 W /cm

2 ΗΠΑ ( άνω) ή 3 ώρες μετά την TRAIL (κάτω). Z-VAD FMK προκατεργάστηκαν 1 ώρα πριν TRAIL treatement. (C) TRAIL-επαγόμενη, αποπτωτικών DSB με γνώμονα γH2AX + κύτταρα αλλά όχι DSB με γνώμονα γH2AX + κύτταρα νωρίς 30 λεπτά μετά από 0,3 W /cm

2 ΗΠΑ, καταργήθηκαν από την επεξεργασία όλων των κυτταρικών σειρών με 100 μmol /L-ίτηκ . Μπλε Χρώμα DAPI άλλαξε σε κόκκινο για εύκολη κίτρινο απεικόνιση στη συγχώνευση με το πράσινο γH2AX εικόνα χρησιμοποιώντας το Adobe Photoshop Elements 2.0. (Adobe Systems)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s005

(PDF)

Εικόνα S6.

ανοσοφθορισμού αναλύσεις των ΗΠΑ και της IR-επαγόμενη DNA-PKcs pS2056 και γH2AX εστίες. Pan-πυρηνικά πράσινο εστίες γH2AX και ιδιαίτερα κόκκινου φθορισμού εστίες DNA-PKcs pS2056 μετά από τις ΗΠΑ, αλλά με χαμηλό φθορισμού διακριτές γH2AX και DNA-PKcs pS2056 εστίες μετά IR. Ερυθρά βέλη υποδεικνύονται κυττάρων με περι-πυρηνικό DNA-PKcs pS2056 εστίες παρατηρήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους κύτταρα αλλά όχι σε ακτινοβολημένα κύτταρα. Μεγεθυσμένες εικόνες ήταν στο Σχ. 2D

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s006

(PDF)

Εικόνα S7.

Western blot αναλύσεις δείχνουν επιδράσεις της Ku55933 (KU) και /ή Nu7026 (NU) επί γH2AX 1 ώρα μετά των ΗΠΑ στην Jurkat, Molt-4, και HL-60 κύτταρα. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 mmol /L KU ή /και NU 1 ώρα πριν ΗΠΑ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s007

(PDF)

Σχήμα S8.

Τυπικά ιστογράμματα FCM δείχνοντάς μας που προκαλείται από γH2AX με την παρουσία ή απουσία Ku55933 (KU) και /ή Nu7026 (NU). Κατανομές φάσης του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Σημειώστε ότι ΗΠΑ που προκαλείται γH2AX δεν περιορίζεται στη φάση S και κατασταλτικές δράσεις της KU και /ή NU για γH2AX εντοπίστηκαν σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s008

(PDF )

Εικόνα S9.

Τυπικές εικόνες που δείχνουν US-επαγόμενη γH2AX, φωσφο-ATM σε S1981, φωσφο-DNA-PKcs στο S2056 με την παρουσία ή απουσία του Ku55933 (KU) και /ή Nu7026 (NU). Η επίδραση της KU ή NU στην έκφραση αυτών των πρωτεϊνών ποσοτικοποιήθηκε όπως στο Σχ. 4D

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029012.s009

(PDF)

Εικόνα S10.

Τυπικό ιστογράμματα FCM δείχνοντάς μας που προκαλείται από γH2AX στο DNA-PKcs κύτταρα καλά M059K αλλά όχι στο DNA-PKcs κύτταρα ανεπάρκεια M059J. Αυτά τα προσκολλητικά κυτταρικές γραμμές επαναιωρήθηκαν με θρυψινοποίηση και στη συνέχεια υφίσταται κατεργασία με υπερήχους σε 0,4 W /cm

2 για 60 δευτερόλεπτα σε μέσο καλλιέργειας. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε πλαστικούς σωλήνες αμέσως μετά κατεργασία με υπερήχους στη συνέχεια επωάζονται για 30 λεπτά που ακολουθείται από στερέωση.