Αφηρημένο

Τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) θεωρείται ότι συσχετίζεται με κακοήθεια των καρκινικών κυττάρων και είναι υπεύθυνη για την εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Αναφέραμε προηγουμένως ότι μακρινή μετάσταση σχετίστηκε με υποξία σε γαστρικό καρκίνο. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η επίδραση των υποξικών κατάσταση με ΕΜΤ του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Γαστρικό καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε νορμοξία (21% O

2) ή υποξία (1% O

2) για 24 ώρες. EMT αξιολογήθηκε ως το ποσοστό των κυττάρων σχήματος ατράκτου σε ολικά κύτταρα. Επίδραση του μετασχηματισμού β1 αυξητικού παράγοντα (TGFβ1) ή αναστολείς της τυροσινικής κινάσης στην EMT αξιολογήθηκε. Το επίπεδο έκφρασης του

TGFβ1

και

TGFβR

αξιολογήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Η παραγωγή TGFβ1 από καρκινικά κύτταρα μετρήθηκε με ELISA. Υποξία τονωθεί EMT της OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα, αλλά όχι εκείνη των κυττάρων OCUM-2M. Το επίπεδο έκφρασης του

TGFβ1

mRNA κάτω από υποξία ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνο που υπό φυσιολογική οξυγόνωση σε όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές. Το επίπεδο έκφρασης του

TGFβR

mRNA αυξήθηκε σημαντικά από υποξία σε κύτταρα OCUM-2MD3, αλλά όχι σε κύτταρα OCUM-2Μ. αναστολέας TGFβR, SB431542 ή Ki26894, κατέστειλε σημαντικά EMT της OCUM-2MD3 και OCUM-12. παραγωγή TGFβ1 από OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα ήταν σημαντικά αυξημένη υπό υποξία σε σύγκριση με το ότι, σύμφωνα με φυσιολογική οξυγόνωση. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να υποδηλώνουν ότι η υποξία διεγείρει την EMT των γαστρικών καρκινικών κυττάρων μέσω αυτοκρινούς σηματοδότησης TGFβ /TGFβR

Παράθεση:. Matsuoka J, Yashiro Μ, Ντόι Υ, Fuyuhiro Υ, Κάτω Υ, Σίντο O, et al. (2013) Η υποξία διεγείρει την EMT της καρκινικά κύτταρα γαστρικού μέσω Αυτοκρινές TGFβ σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (5): e62310. doi: 10.1371 /journal.pone.0062310

Επιμέλεια: Claudio M. Costa-Neto, Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο, Βραζιλία

Ελήφθη: 19 Οκτ 2012? Αποδεκτές: 19 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 Μάη 2013

Copyright: © 2013 Matsuoka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου του Ταμείου Έρευνας και Ανάπτυξης (23-Α-9), καθώς και από επιχορηγήσεις-in ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (KAKENHI, αρ. 20591573, 22390262 και 23390329) από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών, Αθλητισμός, Πολιτισμός και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα. KS, TS, και AM είναι υπάλληλοι της Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Ki26894, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, είναι ένα προϊόν της Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν . Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Τα επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικά (EMT) χαρακτηρίζεται από τις αλλαγές στην μορφολογία κυττάρων κατά τη διάρκεια της οποίας τα επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν ιδιότητες μεσεγχυματικά ενώ η απώλεια των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου και apicobasal πολικότητα [1], [2]. Σε επιθηλιακών καρκίνων, EMT αναγνωρίζεται ως ένας από τους μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την έναρξη των επεμβατική και μεταστατικό συμπεριφορές [3] – [5]

Ένα περιβάλλον υποξίας υπάρχει σε ορισμένες περιοχές των στερεών καρκίνων που παρουσιάζουν ταχεία ανάπτυξη λόγω της αγγειογένεσης. σε καρκινώματα είναι ετερογενή [6]. Η υποξία θεωρείται ότι σχετίζονται με επιθετική φαινοτύπους όγκου γαστρικά καρκινώματα [7], [8], περιλαμβανομένων των μεταστατικών ικανότητα των καρκινικών κυττάρων [6], [9]. Κλινικά και πειραματικά δεδομένα παρέχουν επίσης αποδείξεις ότι υπάρχει συσχετισμός μεταξύ του περιβάλλον υποξίας και φτωχή πρόγνωση [10], [11]. Είναι επομένως σημαντικό για τη μελλοντική ανάπτυξη των θεραπειών του καρκίνου να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός της μετάστασης που επάγεται από υποξία.

Έχει αναφερθεί ότι διάφορα διαλυτών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού-β1 (TGFβ1) [12], [ ,,,0],13], του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) [14], ινσουλινοειδής αυξητικός παράγοντας-1 (IGF1) [15], του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGF) [16], αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) [17] συσχετίσθηκαν με EMT . σήματα ΤΟΡβ έχουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες πτυχές της μεταστατικής εξάπλωσης των καρκινικών κυττάρων, όπως η μετανάστευση, εισβολή, και ΕΜΤ [12], [13]. Οι συνδετήρες ΤΟΡβ δεσμεύονται με τον ΤΟΡβ υποδοχέα τύπου II (ΤΟΡβΚΙΙ), η οποία στη συνέχεια σχηματίζει ένα σύμπλοκο με είτε τύπου TGFβR Ι ή II. TGFβR τύπου Ι (TGFβRI) μεταδίδει σήματα εντός του κυττάρου μέσω πρωτεϊνών Smad δεύτερου αγγελιοφόρου [13], [18]. Οι μεταγενέστεροι σήματα διαδίδονται μέσω TGFβRI, η οποία φωσφορυλιώνει τον υποδοχέα ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών Smad [19], [20]

Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η υποξική κατάσταση θα μπορούσε να προκαλέσει EMT των καρκινικών κυττάρων [21] – [24]., αλλά ο μοριακός μηχανισμός που ευθύνεται για EMT κάτω από μια υποξική κατάσταση παραμένει ασαφής. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η επίδραση της υποξίας επί των μορφολογικά χαρακτηριστικά των γαστρικών καρκινικών κυττάρων για την αποσαφήνιση των μηχανισμών που ευθύνονται για την υποξία-επαγόμενη EMT.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και κυτταρικές σειρές

χρησιμοποιήθηκαν επτά κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου. OCUM-2MD3 [25], OCUM-12 [26], OCUM-2M [27], ΚΑΤΩ-III [28], και ΜΚΝ-45 [29] προήλθαν από διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνωμα. ΜΚΝ-74 [29] και ΜΚΝ-7 [29] προήλθαν από εντερική τύπου. OCUM-2Μ, OCUM-2MD3 και OCUM-12 establised το εργαστήριο μας, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [25] – [27]. Εν συντομία, OCUM-12was προέρχεται από ασκίτη που σχετίζεται με διάχυτη τύπου γαστρικού καρκινώματος, και τα κύτταρα OCUM-2MD3, μια κόρη κυτταρική σειρά με υψηλό δυναμικό της περιτοναϊκής μετάστασης, καθιερώθηκαν από κύτταρα OCUM-2M χρησιμοποιώντας ορθοτοπικό πρότυπο όγκου, η γονική ασκίτη κυτταρική σειρά που σχετίζονται με διάχυτη τύπου γαστρικού καρκινώματος. Οι άλλες κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την τράπεζα κυττάρων JCRB (Osaka, Japan) ή την American Type Culture Collection (Rockville, MD). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 21% O

2 (νορμοξία) ή 1% O

2 (υποξία). Συνθήκες υποξίας διατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια σπονδυλωτή θάλαμο επώασης (Hirasawa, Τόκιο, Ιαπωνία) με

2 και 1% O

2 ισορροπημένο με Ν

2 αέριο 5% CO. Το μέσο καλλιέργειας αποτελούνταν από τροποποιημένο μέσο Eagle Dulbecco (DMEM?. Nikken Bio, Osaka, Japan) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (. Nichirei Bio), 100 IU /ml πενικιλίνη (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA), 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (ICN Biomedicals) και 0,5 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Cambrex, Walkersville, MD).

μορφολογικές αλλαγές

τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 24 ώρες, και η μορφολογία των κυττάρων παρατηρήθηκε μικροσκοπικά. EMT είχε προσδιοριστεί όταν το πολυγωνικό ή άτρακτος σχήμα βρέθηκε σε καρκινικά κύτταρα με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Η συχνότητα του ΕΜΤ αξιολογήθηκε με το ποσοστό της πολυγωνική ή ατρακτοειδή κύτταρα σε όλα τα καρκινικά κύτταρα? EMT ρυθμός = ο αριθμός των πολυγωνικά ή ατράκτου κύτταρα σχήμα /συνολικός αριθμός των κυττάρων × 100 (%).

Επιπτώσεις των διάφορων διαλυτών παραγόντων στις μορφολογικές αλλαγές

Εμείς εξέτασε τις επιπτώσεις των διαφόρων διαλυτών παραγόντων , συμπεριλαμβανομένων των EGF (ΡβρίΌ Tec, Rocky Hill, NJ), IGF1 (ΡβρίΌ Tec), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα κυττάρων (VEGF? Ε & amp? συστήματα D, Minneapolis, MN), βασικό FGF (Sigma, Saint Louis, ΜΟ), των αιμοπεταλίων προερχόμενο αυξητικός παράγοντας ΒΒ ομοδιμερές (PDGF-BB? ΡβρίΌ Tech), HGF (ΡβρίΌ Tech), TGFβ1 (King Brewing, Kakogawa, Ιαπωνία), σχετικά με τη μορφολογία των καρκινικών κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει ένα από ανωτέρω παράγοντες στην απαιτούμενη συγκέντρωση σε 37 ° C σε φυσιολογική οξυγόνωση. μορφολογία των κυττάρων εξετάστηκε μετά από 24 ώρες. Τα πειράματα διεξήχθησαν για κάθε παράγοντα εις διπλούν.

Επιδράσεις της εξουδετέρωσης αντισωμάτων επί μορφολογικές αλλαγές

Χρησιμοποιήσαμε εξουδετερωτικά αντισώματα, όπως αντι-HGF αντίσωμα (Genzyme Techne, MPLS, ΜΝ, USA), αντίσωμα αντι-ΤΟΡβ (R &? συστήματα D), αντι-PDGF-BB (Genzyme), αντι-FGF7 (R &? συστήματα D), αντι-VEGFR3 (R &? συστήματα D). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει ένα από παραπάνω αντισωμάτων στα 100 μg /ml στους 37 ° C σε υποξία. μορφολογία των κυττάρων εξετάστηκε μετά από 24 ώρες.

Επίδραση των διαφόρων αναστολέων phospholylation για μορφολογικές αλλαγές

Μετά κύτταρα έφθασαν ημι-συρροή, τα κύτταρα προστέθηκαν σε TGFβ ή κάθε αναστολέα και επωάστηκαν υπό υποξικές συνθήκες ή φυσιολογική οξυγόνωση για 24 ώρες. Στη συνέχεια, μορφολογικές ευρήματα εξετάστηκαν σε σύγκριση με τον έλεγχο. Πέντε μικρές-συνθετικούς αναστολείς phospholylation, Ki26894 (αναστολέας TGFβRI, 10 μΜ? Kirin Pharma, Mishima, Ιαπωνία), SB431542 (αναστολέας TGFβRI, 10 μΜ? Sigma, Saint Louis, MO), το sunitinib (SU11248, 20 nM? Ένας αναστολέας της τυροσινικής κινάσης κατά VEGFR, PDGFR, c-KIT, FGFR2 και FLT3, LKT Laboratories, St. Δοχείο, ΜΝ), PD173074 (/υποδοχέα αναστολέας της τυροσινικής κινάσης FGF VEGF, 5 nM? Santa Cruz, CA), λαπατινίμπη (GW572016, 10 nM? α αναστολέας της τυροσινικής κινάσης έναντι EGFR και ErbB2, Toronto Research Chemicals), και PHA665752 (c-ΜΕΤ αναστολέα, 2 μΜ?. Pfizer, San Diego, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν

ποσοτική πραγματικού χρόνου ανάστροφης μεταγραφάσης-πολυμεράσης αλυσιδωτή αντίδραση (RT-PCR)

Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να εξετάσει

TGFβ1

,

TGFβRI, ΤΟΡβΚΙΙ,

και

εκφράσεις βιμεντίνης

mRNA. Τα καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν υπό νορμοξικές συνθήκες και υπό συνθήκες υποξίας για 24 ώρες. Μετά την επώαση, το ολικό κυτταρικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την απομάκρυνση του γονιδιωματικού DNA με ϋΝάση, cDNA παρασκευάστηκε από 2 μg RNA με τον ιό της λευχαιμίας ποντικού Maloney ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen) με χρησιμοποίηση τυχαίων εκκινητών (Invitrogen). Για τον προσδιορισμό αλλαγών φορές σε κάθε γονίδιο, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR πραγματοποιήθηκε στο ΑΒΙ Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμες δοκιμασίες έκφρασης γονιδίων για

TGFβ1

(Hs00998130,),

TGFβRI

(Hs00610319),

ΤΟΡβΚΙΙ

(Hs00559661),

vimentin

(Hs00958116),

Twist

(Hs01675818),

Zeb1

(Hs 00232783),

Snail1

(Hs00195591),

VEGFA

(Hs00900055). PCR πραγματοποιήθηκε στους 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 60 s για 40 κύκλους. Αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο για την ομαλοποίηση των επιπέδων mRNA για διαφορές στη συγκέντρωση του δείγματος και φόρτωση. Διπλώστε τις αλλαγές στην έκφραση του κάθε mRNA στόχου σε σχέση με GAPDH υπολογίστηκε με βάση τον κύκλο κατωφλίου (Ct) και 2

-Δ (ΔΟΙ), όπου ΔCt = Ct στον στόχο Ct GAPDH και Δ (ΔΟΙ) = ΔCt

υποξία-ΔΟΙ

φυσιολογική οξυγόνωση. Ποσοτική PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Western ανάλυση κηλίδος

Για την εξέταση της επίδρασης της υποξίας επί φωσφορυλίωσης Smad2, τα καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν κάτω από νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 24 ώρες, αντίστοιχα. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και δείγματα που περιείχαν 50 μg ολικής πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση θειικού-πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλ νάτριο? οι ζώνες πρωτεϊνών μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Billerica, ΜΑ). Η μεμβράνη επωάστηκε σε ΤΒδ-Τ (10 mM TBS και 0,05% Tween 20) συμπληρωμένου με 5% άπαχο γάλα ή αλβουμίνης 5% βοοειδών (Sigma) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Στη συνέχεια, η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε ένα διάλυμα ΤΒδ-Τ που περιέχει το πρωτογενές αντίσωμα ρ-Smad2 (Ser

465/467? 1: 1000? Cell Signaling Technology) ή Smad2 /3 (1: 1000? Cell Signaling Technology), βιμεντίνης (1: 1000? Cell Signaling Technology), αντι-βactin (1: 1000? Sigma) και αφήνεται να αντιδράσει στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, κάθε αντίσωμα πλύθηκε τρεις φορές με ΤΒδ-Τ επί 10 λεπτά, και ένα δευτερεύον αντίσωμα σημασμένο με υπεροξειδάση (GE Healthcare, Buckinghamsire, UK) που αντιδρούν με προστέθηκε το πρωτογενές αντίσωμα. Οι ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (Wako, Osaka, Japan).

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

Η παραγωγή TGFβ1 από καρκινικά κύτταρα μετρήθηκε με ποσοτικό ένζυμο σάντουιτς τεχνική ανοσοδοκιμασίας χρησιμοποιώντας κιτ Quantikine ανθρώπινη TGFβ1 ELISA, σύμφωνα με τις οδηγίες manufacturer`s (R &? συστήματα D). Τα καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν κάτω από υποξία ή νορμοξία για 24 ώρες, στη συνέχεια το μέσο αντικαταστάθηκε σε 3 ml DMEM χωρίς ορό. Τα κύτταρα επωάστηκαν κάτω από υποξία ή νορμοξία, για επιπλέον 24 ώρες. Υπό όρους μέσο (CM) συλλέχθηκε από κάθε τρυβλίο και υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 1000

g

για 5 λεπτά. TGFβ1 επίπεδο της ελεύθερης CM ορού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας kit ELISA. ELISA ανιχνεύεται τόσο την ενεργό και λανθάνουσα TGFβ.

Η στατιστική ανάλυση

Συγκρίσεις μεταξύ των συνόλων δεδομένων έγιναν με Μαθητή

t-test

ή Kruskal-Wallis μονόδρομη ANOVA με τάξεις που ακολουθείται από τεστ πολλαπλών σύγκριση του Dunn. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν η τιμή Ρ ήταν & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της υποξίας στο καρκινικό κύτταρο μορφολογία

Μια υποξική κατάσταση αύξησε σημαντικά τον αριθμό πολυγωνική ή ατρακτοειδή κύτταρα που υφίστανται ΕΜΤ μεταξύ OCUM-2MD3 ή OCUM-12 κύτταρα, αλλά όχι μεταξύ OCUM-2Μ, ΜΚΝ-7, ΜΚΝ-45, ΜΚΝ-74, ή κύτταρα ΚΑΤΟ-ΙΙΙ (Σχ. 1Α και το Σχ. S1). Η μορφολογία των κυττάρων του OCUM-2MD3 και OCUM-12 άρχισε να αλλάζει μετά από 4 ώρες στην υποξική πολιτισμό. Μετά από 12 ώρες καλλιέργειας, ένας αυξημένος ρυθμός EMT παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Το ποσοστό EMT της OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα ήταν υψηλότερη σε 24 ώρες υποξική πολιτισμό (Εικ. 1Β). Δεδομένου ότι οι μορφολογικές αλλαγές ήταν εμφανείς στις 24 ώρες καλλιέργειας υπό υποξίας, οι μοριακοί μηχανισμοί της ΕΜΤ αναλύθηκαν σε 24 ώρες καλλιέργειας υπό υποξικές συνθήκες με τη χρήση OCUM-2MD3, OCUM-12, και OCUM-2Μ κύτταρα.

(α) η αύξηση του πολυγωνικά ή ατράκτου σχήμα κυττάρων αναγνωρίστηκε στα OCUM-2MD3 και OCUM-12 κυττάρων υπό υποξία, αλλά όχι σε κύτταρα OCUM-2Μ. (Β) Η μορφολογία της OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα άρχισαν να αλλάζουν μετά από 4 ώρες στην υποξική πολιτισμό. EMT της OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα ήταν πιο εμφανής στις 24 ώρες της καλλιέργειας υπό υποξία. EMT είχε προσδιοριστεί όταν το πολυγωνικό ή άτρακτος σχήμα βρέθηκε σε καρκινικά κύτταρα με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης.

Η

Επιπτώσεις των διάφορων αυξητικών παραγόντων στη μορφολογία των καρκινικών κυττάρων

Οι διαλυτές παράγοντες χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις 10 ή 100 ng /ml. OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα έγινε σχήματος ατράκτου μετά την προσθήκη του TGFβ1 ή HGF, αλλά όχι μετά την προσθήκη του EGF, FGF2, FGF7, IGF1, VEGF ή PDGF-ΒΒ μετά από 24 ώρες κάτω από νορμοξία (Πίνακας 1). Σε αντίθεση, τα κύτταρα OCUM-2M δεν έδειξε καμία μορφολογική αλλαγή μετά την προσθήκη των παραγόντων (Εικ. 2).

Η μορφολογική αλλαγή βρέθηκε στην παρουσία των TGFβ και HGF στις 24 ώρες του πολιτισμού στην OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα, αλλά όχι FGF2.

η

Επιδράσεις των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στη μορφολογία καρκινικών κυττάρων κάτω από υποξία

ΕΜΤ που επάγεται από υποξία εν μέρει αναστέλλεται από αντι-ΤΟΡ-β1 αντίσωμα σε 100 μg /ml, αλλά όχι από αντι-ΗΟΡ αντίσωμα (Πίνακας 2).

η

Επιδράσεις της υποξίας στο

TGFβ1

,

TGFβRI

, και

ΤΟΡβΚΙΙ

έκφρασης του mRNA των γαστρικών καρκινικών κυττάρων

Το επίπεδο έκφρασης του

TGFβ

ήταν σημαντικά (p & lt? 0.001) αυξήθηκε κάτω από υποξικές συνθήκες σε όλες τις OCUM-2MD3, OCUM- 12, και OCUM-2Μ κύτταρα, σε σύγκριση με το επίπεδο κάτω από νορμοξία (Εικ. 3Α). Τα επίπεδα έκφρασης του

TGFβRI

και

ΤΟΡβΚΙΙ

αυξήθηκαν σημαντικά κάτω από μια υποξική κατάσταση στα κύτταρα OCUM-2MD3. Σε αντίθεση, τα επίπεδα του

TGFβR1

και

TGFβR2

έκφρασης μειώθηκαν σημαντικά κάτω από μια υποξική κατάσταση στα κύτταρα OCUM-2M (Σχ. 3Β).

(Α)

TGFβ

mRNA έκφραση ήταν σημαντικά (p & lt? 0.001) αυξήθηκε κάτω από υποξική κατάσταση στην OCUM-2Μ, OCUM2MD3 και OCUM-12 κύτταρα. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του

TGFβRI

και

ΤΟΡβΚΙΙ

ήταν σημαντικά (p & lt? 0.001) αυξήθηκε κάτω από υποξική κατάσταση στην OCUM-2MD3, αλλά όχι σε κύτταρα OCUM-2M. (Γ) παραγωγή TGFβ1 σε OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα ήταν σημαντικά (ρ = 0.001 και ρ & lt? 0.001) υψηλότερο υπό υποξία (232 pg /ml, 80 pg /m, αντίστοιχα) από ό, τι υπό νορμοξία (109 pg /ml, 34 pg /ml, αντίστοιχα). παραγωγή TGFβ1 στα κύτταρα OCUM-2M δεν ήταν διαφορετική μεταξύ φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία.

Η

Επίδραση της υποξίας στην παραγωγή TGFβ1 απελευθερώνεται από γαστρικά καρκινικά κύτταρα

παραγωγή TGFβ1 από OCUM-2MD3 και OCUM- 12 κύτταρα ήταν σημαντικά (p & lt? 0.001) αυξήθηκαν υπό υποξία σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση, αλλά δεν είναι ότι από τα κύτταρα OCUM-2M (Σχήμα 3C).

Επιδράσεις της υποξίας στην φωσφορυλίωση Smad2 των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου

.

σε OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα, η φωσφορυλίωση Smad2 αυξήθηκε κάτω από μια υποξική κατάσταση, σε σύγκριση με το ότι, σύμφωνα με μια ορθοξικές κατάσταση. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση Smad2 δεν αυξήθηκε κάτω από μια υποξική κατάσταση στα κύτταρα OCUM-2M (Εικ. 4).

Υποξική προϋπόθεση για 24 ώρες αυξημένη φωσφορυλίωση Smad2 της OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα (βέλη), αλλά όχι εκείνη των κυττάρων OCUM-2M. Smad2 /3 χρησιμοποιήθηκε ως διεθνούς ελέγχου για ρ-Smad2.

Η

Επιπτώσεις των αναστολέων φωσφορυλίωσης της κινάσης σε EMT και της έκφρασης vimentin σε υποξία

Είτε των αναστολέων φωσφορυλίωσης TGFβR, Ki26894 και SB431542, ανέστειλε τις μορφολογικές αλλαγές της OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα κάτω από ένα υποξική κατάσταση, αλλά τρεις άλλους αναστολείς, λαπατινίμπη, το sunitinib και PHA665752, δεν (Σχήμα 5Α, 5Β). Από την άλλη μεριά, κανένας από τους αναστολείς είχαν οποιαδήποτε επίδραση στην μορφολογία των OCUM-2MD3 και OCUM-12 κυττάρων υπό φυσιολογική οξυγόνωση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το επίπεδο έκφρασης του

βιμεντίνη

, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης EMT, αυξήθηκε σημαντικά από την υποξία, και μειώθηκε κατά είτε των αναστολέων TGFβR Ki26894 και SB431542 (Σχήμα 5C). πρωτεϊνικό επίπεδο βιμεντίνης ήταν επίσης αυξημένη κάτω από υποξία, και μειώθηκε κατά είτε των αναστολέων TGFβR Ki26894 και SB431542 (Σχήμα 5D)

(Α, Β) που προκαλείται από υποξία EMT ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0,01). αναστέλλεται από αναστολείς TGFβR (Ki26894 και SB431542). Άλλοι αναστολείς (λαπατινίμπη, το sunitinib και PHA665752) δεν είχε καμία επίδραση στην EMT υπό υποξία. (C)

βιμεντίνης

mRNA έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη στο πλαίσιο ενός υποξική κατάσταση στην OCUM-2M και OCUM-12 κύτταρα, και μειωμένη με αναστολείς TGFβR (Ki26894 και SB431542). (D) βιμεντίνης πρωτεΐνη αυξήθηκε υπό υποξία σε OCUM-12 και OCUM-2MD3, και μειωμένη με αναστολείς TGFβR (Ki26894 και SB431542).

Η

Επιδράσεις της υποξική κατάσταση σχετικά με τους παράγοντες που συνδέονται με την EMT.

Υποξική κατάσταση αυξηθεί σημαντικά

VEGF-A

επίπεδο mRNA σε OCUM-2Μ, OCUM-2MD3, και OCUM-12 κύτταρα. Το επίπεδο έκφρασης του

Twist

ή

Zeb1

αυξήθηκε σημαντικά από την υποξία σε OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα, αλλά μειώθηκε στα κύτταρα OCUM-2M. Η αυξημένη έκφραση του

Twist

ή

Zeb1

μειώθηκε είτε των αναστολέων TGFβR Ki26894 και SB431542 σε OCUM-12 κύτταρα. Υποξική κατάσταση δεν επηρεάζεται από το επίπεδο έκφρασης των

Snail1

(Σχήμα 6).

(Α) Ένα μόριο υποξία-στόχο,

VEGF-A

επίπεδο mRNA σε OCUM -2M, OCUM-2MD3, και OCUM-12 αυξήθηκε κάτω από υποξία. (Β, C) Υποξική κατάσταση αύξησε σημαντικά το επίπεδο έκφρασης του

Twist

και

Zeb1

σε OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα, αλλά όχι εκείνη στα κύτταρα OCUM-2M. (Δ) Το επίπεδο έκφρασης της Snail1 δεν επηρεάστηκε από υποξική κατάσταση.

Η

Συζήτηση

Πρόσφατα, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι ένα υποξικό μικροπεριβάλλον γύρω στερεών καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να συμβάλει στην εξέλιξη του καρκίνου [30] – [34]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που ευθύνονται για την εξέλιξη του καρκίνου σε υποξία παραμένουν ασαφείς. Έχει αναφερθεί ότι η υποξία είναι μία από τις ωθήσεις για ΕΜΤ [35]. Στην παρούσα μελέτη, ένα υποξικό κατάσταση επαγόμενη EMT στις διάχυτου τύπου γαστρικό καρκινικές κυτταρικές σειρές OCUM-2MD3 και OCUM-12, αλλά όχι σε κύτταρα εντερικού τύπου. Διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο χαρακτηρίζεται από υψηλότερη κακοήθεια από εντερική τύπου γαστρικού καρκίνου [36]. Το δυναμικό ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων κάτω από υποξία μπορεί να είναι ένας από τους λόγους για την υψηλή κακοήθους δυναμικού του διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο.

Πολλές μελέτες έχουν αναφέρει ότι διάφορα μόρια θα μπορούσαν να επηρεάσουν ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των TGFβ [23 ], [37], EGF [38], και PDGF [39]. Στην παρούσα μελέτη, TGFβ διεγείρονται EMT της OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα, αλλά EGF και PDGF δεν το έκανε. Επιπλέον, η επαγωγή ΕΜΤ κάτω από υποξικές όρο μειώθηκε σημαντικά από αντι-TGFβ εξουδετέρωσης αντισώματος ή αναστολείς φωσφορυλίωσης TGFβR τόσο OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το επίπεδο παραγωγής του ΤΟΡβ σε καρκινικά κύτταρα ήταν σημαντικά αυξημένη κάτω από υποξία, και τα επίπεδα έκφρασης του TGFβR και φωσφορυλίωσης Smad2 αυξήθηκαν κατά την υποξία. Βιμεντίνης είναι ένα χαρακτηριστικό στοιχείο των μεσεγχυματικών κυττάρων και δεν εκφράζεται συνήθως σε επιθηλιακά κύτταρα. Επειδή η έκφραση του

βιμεντίνη

σε επιθηλιακά κύτταρα παίζει ουσιαστικό ρόλο στην ΕΜΤ μέσω της αλληλεπίδρασης με την ακτίνη και άλλα ενδιάμεσα νημάτια [40], βιμεντίνη χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης EMT σε αυτή τη μελέτη. Το επίπεδο έκφρασης του

βιμεντίνη

αυξήθηκε σημαντικά από υποξία, και μειώθηκε από τους αναστολείς φωσφορυλίωσης TGFβR Ki26894 και SB431542. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η EMT κάτω από μια υποξική κατάσταση αυτή σχετίζεται με το αυτοκρινείς TGFβ /TGFβR σηματοδότησης σε διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο. Αρκετές μελέτες ανέφεραν τις συσχετίσεις μεταξύ EMT και TGFβ σηματοδότησης στην υποξία. [2], [21], [23], [32], [37] Σε γαστρικό καρκίνο, έχει αναφερθεί ότι EMT συσχετίζεται με κακοήθεια των καρκινικών κυττάρων και είναι υπεύθυνη για την εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την EMT των γαστρικών καρκινικών κυττάρων παραμένουν ασαφείς. Το παρόν έγγραφο διευκρινίζεται ότι EMT του γαστρικού καρκίνου κυττάρων που προκαλείται μέσω της TGFβ σηματοδότησης σύμφωνα με υποξία. αναστολείς TGFβR θα μπορούσε έτσι να είναι πολλά υποσχόμενη παράγοντες για τη θεραπεία του γαστρικού μετάστασης του καρκίνου.

Η υποξία διεγείρονται EMT των κυττάρων OCUM-2MD3, αλλά όχι εκείνη των κυττάρων OCUM-2M. EMT έχει εμπλακεί στην προαγωγή της εισβολής του καρκίνου και μετάσταση. Ενώ OCUM-2MD3 είναι ένα «κόρη» κυτταρική γραμμή του OCUM-2M [25], [34], τα κύτταρα OCUM-2MD3 έχουν υψηλότερη πιθανότητα για μετάσταση στο περιτόναιο σε γυμνούς ποντικούς από κύτταρα OCUM-2M [25], [34] . Τα καρκινικά κύτταρα ελεύθερα να μεταναστεύουν στην περιτοναϊκή κοιλότητα εκτίθεται σε υποξία λόγω της έλλειψης ενός σκάφους τροφοδοσίας εγγύς [41]. Το επίπεδο έκφρασης του

TGFβ1

mRNA υπό υποξία ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη κάτω από νορμοξία και στις τρεις κυτταρικές γραμμές. Αντιθέτως, το επίπεδο έκφρασης της

TGFβRI

και

ΤΟΡβΚΙΙ

mRNA αυξήθηκε σημαντικά από υποξία σε κύτταρα OCUM-2MD3, αλλά όχι σε κύτταρα OCUM-2Μ. Οι διαφορετικές απαντήσεις του

TGFβR

έκφρασης μεταξύ φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία μπορεί να είναι ένας από τους βασικούς λόγους για την υποξία που προκαλείται από EMT. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η γαστρική καρκινικά κύτταρα κάτω από υποξία έδειξε ΕΜΤ και υψηλή μεταναστευτικών και επεμβατικές δραστηριότητες, σε σύγκριση με καρκινικά κύτταρα σε νορμοξία [34]. Η προς τα πάνω ρύθμιση της EMT των υποξικών καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να είναι ένας από τους λόγους για τη μεγαλύτερη δυνατότητα για μετάσταση στο περιτόναιο στα κύτταρα OCUM-2MD3 σε σύγκριση με τα κύτταρα OCUM-2M.

Υποξική κατάσταση αύξησε σημαντικά το επίπεδο έκφρασης του

Twist

και

Zeb1

σε OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα, αλλά όχι ότι στα κύτταρα OCUM-2M. Η δραστηριότητα υποξία αύξηση του

Twist

και

Zeb1

έκφραση μειώθηκε με αναστολείς TGFβR (Ki26894 και SB431542) σε OCUM-12 κύτταρα. EMT στην υποξία μπορεί να ρυθμίζεται εν μέρει από μεταγραφικούς παράγοντες,

Twist

και

Zeb1.

Η

Αν και HGF επηρεάσει τη μορφολογία των καρκινικών κυττάρων σε OCUM-2MD3 και OCUM-12 κύτταρα, υποξία προκαλούμενη EMT δεν αναστάλθηκε από αντι-ΗΟΡ αντίσωμα εξουδετέρωσης ή αναστολέα c-Met είτε OCUM-2MD3 ή OCUM-12 κύτταρα. παραγωγή HGF δεν ανιχνεύθηκε σε OCUM-2MD3 ή OCUM-12 κυττάρων υπό είτε υποξία και νορμοξία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι περισσότεροι από HGF προέρχεται από στρωματικά κύτταρα σε γαστρικό καρκίνο [42]. Ενώ HGF μπορεί να μην παίζουν σημαντικό ρόλο για την υποξία-επαγόμενη EMT, HGF θα μπορούσε να τονώσει ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων μέσω της αλληλεπίδρασης του καρκίνου-στρωματικά.

Η υποξία προκαλούμενη ΕΜΤ κυττάρων OCUM-2MD3 εν μέρει αναστέλλεται από αναστολείς TGFβR αλλά διάφορα άλλα αναστολείς, συμπεριλαμβανομένων αναστολέας c-Met, αναστολέας PDGF, αναστολέα EGFR, και ο αναστολέας VEGFR, δεν είχε καμία επίδραση στην προκαλούμενη από υποξία EMT σε αυτή τη μελέτη. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι άλλος παράγοντας (ες) μπορεί να σχετίζεται με υποξία προκαλούμενη EMT σε μερικά καρκινικά κύτταρα. Σε μελλοντικές μελέτες, θα είναι απαραίτητο να εξεταστούν άλλα νέα στοιχεία που μπορεί να αλλάξει τη μορφολογία του καρκίνου.

Εν κατακλείδι, η αυτοκρινείς TGFβ /TGFβR σηματοδότησης σύμφωνα με υποξία μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που συνδέονται με την επιθετική φαινότυπο της EMT στην γαστρικά καρκινικά κύτταρα. αναστολείς σηματοδότησης TGFβ /TGFβR φαίνεται να είναι θεραπευτικά πολλά υποσχόμενη σε καρκίνο του στομάχου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

μορφολογικές μεταβολές των γαστρικών κυττάρων κάτω από μια υποξική κατάσταση. Σε ΜΚΝ-7, ΜΚΝ-45, ΜΚΝ-74, και ΚΑΤΩ-III, μορφολογικές αλλαγές δεν βρέθηκαν κάτω από υποξία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062310.s001

(ΔΕΘ)