Αφηρημένο

Τα νεοπλασματικά επιθηλιακά κύτταρα παράγουν τις πιο επιθετικές μορφές καρκίνου όπως αυτές που βρίσκονται στο πνεύμονα, του μαστού, του παχέος εντέρου, του προστάτη και των ωοθηκών. Κατά τη διάρκεια προχωρημένα στάδια του καρκίνου του προστάτη, τα επιθηλιακά κύτταρα που συνδέονται με την εμφάνιση όγκων ανδρογόνο-ανεξάρτητες, ένα αποπτωτικό ανθεκτικό φαινότυπο που υπεραναπτύσεται τελικά και προωθεί μεταστατικό γεγονότα. Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως και ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριζόμενη μια νέα Ca

2 + διαπερατοί στα κανάλι ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια της απόπτωσης στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη επιθηλιακά ανεξάρτητος από ανδρογόνο, LNCaP. Επιπλέον, αναφέρθηκε για πρώτη φορά την κλωνοποίηση και χαρακτηρισμό αυτού του καναλιού μόριο που μοιάζει με το όνομα απόπτωση ρυθμίζεται πρωτεΐνη 2 (ARP2) που συνδέεται με μια θανατηφόρο εισροή Ca

2+ σε ποσοστό

Xenopus ωοκύτταρα

. Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα LNCaP και κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO κυτταρική σειρά) επιμολυσμένα με

arp2-

cDNA επάγονται να υποστούν απόπτωση που δείχνει σημαντική επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων και την ενεργοποίηση των κασπασών 3 και 7 σε σύγκριση με ορό στερηθεί καλλιεργούνται κύτταρα και ιονομυκίνη επεξεργασμένα κύτταρα. Η υποκυτταρική εντόπιση του ARP2 σε κύτταρα CHO που υφίστανται απόπτωση μελετήθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Ενώ η απόπτωση προχωράει, ARP2 αρχικά εντοπίζεται στο περι-πυρηνική περιοχή των κυττάρων μεταναστεύει με το χρόνο προς την περιοχή της μεμβράνης πλάσματος. Με βάση τα σημερινά αποτελέσματα και αυτά προηγούμενων μελετών μας το γεγονός ότι ARP2 αποτελεί μια καινοτόμο κανάλι κατιόν υποστηρίζεται. Ως εκ τούτου, ARP2 γίνεται ένας πολύτιμος στόχος για τη διαμόρφωση της εισροής και της συγκέντρωσης του ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων δείχνει έναν αποπτωτικό φαινότυπο ανθεκτικό κατά την έναρξη ενός αποπτωτικού συμβάντος

Παράθεση:. Mas-Oliva J, Navarro -Vidal E, Tapia-Vieyra ΚΕ (2014) ARP2, μια πρωτεΐνη Novel προ-αποπτωτική Εκφράζεται σε επιθηλιακό καρκίνο του προστάτη LNCaP κύτταρα και επιθηλιακά Ωοθηκών CHO μετασχηματισμένα κύτταρα. PLoS ONE 9 (1): e86089. doi: 10.1371 /journal.pone.0086089

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 15 του Μάρτη του 2013? Αποδεκτές: 11 Δεκ 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Mas-Oliva et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από CONACYT (Grant 141.588) και DGAPA-UNAM (Grant IN-205711/2) που χορηγείται προς τον Jaime Mas-Oliva. Enrique Navarro-Vidal υποστηρίχθηκε από υποτροφίες από το Consejo Nacional de Επιστήμης y Tecnología, (CONACYT) (251.040). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα καρκινώματα που βρίσκουν την προέλευσή τους σε επιθηλιακά κύτταρα είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου σε ενήλικες και συμπληρώνονται μέχρι 80-90% όλων των καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που βρίσκονται στον πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη, των ωοθηκών και του παχέος εντέρου. Τα επιθηλιακά κύτταρα μεταξύ άλλων εντοπισμοί, γραμμή εσωτερικών κοιλοτήτων και σχηματίζουν την επένδυση του αδενικού ιστών. Ο αδένας του προστάτη αποτελείται κυρίως από τα επιθηλιακά κύτταρα και διάμεση στρωματικά κύτταρα που επικοινωνούν μεταξύ τους και ελέγχου, όχι μόνο τη φυσιολογική ανάπτυξη του αδένα, αλλά και την έναρξη της νεοπλαστικής ανάπτυξης [1]. Ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο συχνά διαγιγνώσκεται noncutaneous καρκίνους. Τα αρχικά στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη εξαρτάται από ανδρογόνα που αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό και αναστέλλουν την απόπτωση. Ως εκ τούτου, η θεραπεία στέρησης ανδρογόνων-υπήρξε η κύρια πορεία της θεραπείας σε επαναλαμβανόμενες και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. προστατικά κύτταρα επιθηλιακά τα οποία είναι κατά κύριο λόγο του αυλού περιλαμβάνει ένα μίγμα διαφόρων τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων βασικών και νευροενδοκρινών κυττάρων [2], [3], ενώ το παρακείμενο στρωματικά κύτταρα, που αποτελείται από ένα μίγμα ινοβλαστών, των νεύρων, και τα λεία μυϊκά κύτταρα [2], [ ,,,0],4], [5], να παρεμβαίνει στην ανάπτυξη των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων και επηρεάζουν την απόκρισή τους στις ορμόνες [6]. Κατά τη διαδικασία της καρκινογένεσης, αν και ο αριθμός των νευροενδοκρινών κυττάρων αυξάνει σε πιο προχωρημένα στάδια του καρκίνου του προστάτη, τα επιθηλιακά κύτταρα που αντιπροσωπεύουν τον κύριο τύπο καρκινικού κυττάρου είναι στη μεγαλύτερη έκταση υπεύθυνο για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από ανδρογόνο αναίσθητη [7]. Αυτά τα κύτταρα παρουσιάζουν ένα απόπτωση ανθεκτικό φαινότυπο, δεν υφίστανται απόπτωση σε απόκριση προς φυσιολογικούς διεγέρτες [8], [9], και ως εκ τούτου δεν ανταποκρίνονται στη συμβατική χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [10] – [13].

Εν τω μεταξύ, επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών έχει βρεθεί να είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες με τα υψηλότερα ποσοστά να παρατηρούνται στις βόρειες ευρωπαϊκές χώρες και τις ΗΠΑ, ενώ τα χαμηλότερα ποσοστά βρίσκονται στον αναπτυσσόμενο κόσμο. Λόγω του γεγονότος ότι παθογένεση του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών είναι ελάχιστα κατανοητή, η έγκαιρη ανίχνευση ήταν κυρίως ανεπιτυχής και νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις σπανίζουν. Επειδή τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα ωοθηκών έχουν επίσης βρεθεί να δείχνουν μια απόπτωση ανθεκτικό φαινότυπο, λόγω της υπερέκφρασης των αντι-αποπτωτικών γονιδίων όπως Bcl-2, Bcl-XL και Σουρβιβίνης [14], η ανακάλυψη και η ενεργοποίηση των νέων προ-αποπτωτικών οδών υπήρξε μια σημαντική προσέγγιση για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού και της ανάπτυξης αυτού του μετασχηματισμένου κυτταρικού τύπου [15]

η απόπτωση, ένας τύπος προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου [16] – [20]., έχει δειχθεί ότι είναι κρίσιμης σημασίας για την ομοιόσταση των κυττάρων, την εμβρυϊκή ανάπτυξη και διάφορες ασθένειες όπως ο καρκίνος [21], [22]. Η απόπτωση ενεργοποιείται από ειδικούς μηχανισμούς κυτταρικό τύπο [16], [22], και λαμβάνει χώρα σε διάφορα στάδια [19], [21], [23], [24]. Το πρώτο στάδιο σχετίζεται με εσωτερικά ή εξωτερικά ερεθίσματα, ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει μηχανισμούς μεταγωγής σήματος. Το τρίτο στάδιο αποτελείται από μηχανισμούς εκτέλεσης που αφορούν την πρωτεολυτική δραστηριότητα των κασπασών, μια βιοχημική βάση για την αποπτωτικό φαινότυπο [25] – [28], και, τέλος, το τέταρτο στάδιο που αντιστοιχεί σε συμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης, πυρηνική κατακερματισμό και φαγοκυττάρωση αποπτωτικών σωμάτων από τα γειτονικά κύτταρα ή μακροφάγα [24], [29]. Συνολικά, μια παρατεταμένη αύξηση της [Ca

2+] ι έχει δειχθεί ότι ενεργοποιούν μια σειρά κυτταροτοξικών μηχανισμών που σχετίζονται με την απόπτωση σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους [30], [31]. Δεδομένου ότι η απόπτωση έχει προταθεί να είναι ένας μηχανισμός που ρυθμίζει την ανάπτυξη του όγκου, τη διαμόρφωση των μηχανισμών απόπτωσης ενεργοποίησης έχει θεωρηθεί ως ένα πολύτιμο στόχο για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού και της ανάπτυξης των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων [32] – [36]. Από την άποψη αυτή, ανάλογα με την κατάσταση της μεμβράνης του πλάσματος των μετασχηματισμένων κυττάρων και το ποσό της εξωκυτταρικό ασβέστιο που εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα, μια λεπτή ισορροπία επιτυγχάνεται μεταξύ της έναρξης του αποπτωτικού συμβάντος και /ή την ενεργοποίηση ενός νεκρωτικό οδού θανάτου [37 ], [38]

σε απάντηση σε δύο διαφορετικές επαγωγέων της απόπτωσης.? ιονομυκίνης και στέρηση ορού, έχουμε δείξει στο παρελθόν με βάση ηλεκτροφυσιολογική ευρήματα, η ενεργοποίηση ενός Ca

2+ διαπερατά, μη επιλεκτικό κανάλι κατιόντων στον προστάτη επιθηλιακά κύτταρα LNCaP [15]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω αυτά τα αποτελέσματα, μια σειρά από Ca

2 + διαπερατοί στα κανάλια που εκφράζονται κατά τη διάρκεια της απόπτωσης αναλύθηκαν [15], [39] – [41]. Κατά τη διάρκεια αυτών των μελετών, δύο cDNA,

arp1

και

ARP2

, που αντιστοιχούν σε δύο μόρια συντίθενται κατά την απόπτωση που επάγεται από στέρηση ορού, κλωνοποιήθηκαν. Όταν

ARP2

mRNA εγχύθηκε σε

Xenopus laevis

ωοκυττάρων, η έκφραση ARP2 προκλήθηκε ακολουθείται από την εισροή Ca

2+ μήκος της κυτταρικής μεμβράνης και διέγερση απόπτωσης [40].

Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα περισσότερα επιθηλιακά κύτταρα μοιράζονται χαρακτηριστικά την οργάνωση ιστού καθώς και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ογκογένεση [42], η παρούσα μελέτη δείχνει ότι

ARP2

cDNA επιμόλυνση πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας τις αρχικές επιθηλιακά κύτταρα καρκίνου προστάτη (κυτταρική σειρά LNCaP) από το οποίο περιγράφηκε το προ-αποπτωτικό διαύλου ασβεστίου, προάγει τον κυτταρικό θάνατο μέσω μιας αποπτωτικής διαδικασίας, όταν η βιωσιμότητα των κυττάρων και την ενεργοποίηση κασπασών μετρώνται. Προκειμένου να καταστεί σαφές ότι οι αποπτωτικών μηχανισμών έναρξη και υλοποίηση από κοινού από διάφορους επιθηλιακά κύτταρα, η μελέτη μας έχει επεκταθεί με την επιμόλυνση με

ARP2

cDNA των επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών μετασχηματίζονται (κυτταρική σειρά CHO). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη υποστηρίζουν προηγούμενα ευρήματα μας και να κρατήσει ψηλά την αντίληψη ότι ARP2, μία νέα διαύλου ασβεστίου τοποθετείται στη μεμβράνη των κυττάρων του πλάσματος κατά τη διάρκεια ενός γεγονότος που μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τη βιωσιμότητα των κυττάρων και θα οδηγούσε σε απόπτωση, θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ένα νέο πολύτιμο στόχος για τον έλεγχο της ανάπτυξης από τις πιο επιθετικές επιθηλιακών τύπους καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

το ανθρώπινο ανδρογόνο αναίσθητη κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη, LNCaP, και ο κινεζικού χάμστερ κυττάρων ωοθηκών γραμμή, CHO (

Cricetulus griseus

), ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), όπου τακτικά επαληθεύονται με δοκιμές γενοτυπικών και φαινοτυπικών. Αρχικό κυτταρικές σειρές LNCaP ελήφθησαν από ATCC περιλαμβάνονται ανδρογόνο ευαίσθητα και ανδρογόνο-αναίσθητη κύτταρα. Κατά τη διάρκεια της χρήσης τους κατά μήκος των ετών, έχουν παρουσιαστεί διαφοροποιημένη αποκρίσεις σε ανάπτυξη, ανάλογα με την παρουσία ή την απουσία των αναλόγων ανδρογόνων. Όλα τα αντιδραστήρια για μέσα κυτταρικής καλλιέργειας ελήφθησαν από την Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA). Φορείς που χρησιμοποιήθηκαν περιλάμβαναν: pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO φορέα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pcDNA3.1 /V5-His-TOPO

lacZ

φορέα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), και το φορέα pEGFP-Ν1 (Clontech, Mountain View, CA, USA). Lipofectamine και Fura-2 /AM ελήφθησαν από την Invitrogen /Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, USA). Δις-ακρυλαμίδιο, Nonidet-P40, βρωμιούχο αιθίδιο, απρωτινίνη, φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), βενζαμιδίνη, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), ιονομυκίνη και διθειοθρεϊτόλη (DTT) ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). r

Tth ϋΝΑ πολυμεράση

XL ελήφθη από τη Roche Molecular Systems (Branchburg, NJ, USA) και dNTPs δεοξυριβονουκλεοτίδιο ελήφθησαν από την Boehringer Mannheim-GmbH (Mannheim, Germany).

κατασκευή πλασμιδίου για ARP2 έκφραση

για ενίσχυση του

ARP2

cDNA, 20 picomolar ενός εκκινητή αίσθησης (5′-TGACAGTGATGCGGGAGAAGG-3 ‘) και ένα εκφυλισμένο εναρκτήρα αντινόημα που αντιστοιχεί σε μια διατηρημένη περιοχή της οικογένειας του Trp πρωτεΐνες (5’-TGY-TCK-MGC-AAA-ΥΤΤ-CCA-YTC-3 ‘) χρησιμοποιήθηκαν [40], [43] – [45]. PCR αντιδράσεις περιλάμβανε επίσης 10 ng /mL γραμμικοποιημένο pCR 4Blunt-ΤΟΡΟ-ARP2 πλασμίδιο, 10 × ρυθμιστικό, 25 mM MgCl

2, και 10 mM dNTPs. Οι ακόλουθοι κύκλοι διεξήχθησαν: 94 ° C για 5 λεπτά, 30 κύκλοι των 94 ° C για 45 s, 65 ° C για 45 s, 72 ° C για 2 λεπτά, και ένα τελικό κύκλο στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν και οπτικοποιούνται σε 1% w πηκτώματα αγαρόζης /ν που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο, και ζώνες αποκόπηκαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα εκχύλισης Concert γέλη (Gibco, Gaithersburg Maryland). Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν στον φορέα 3.1 /V5-His-TOPO pcDNA τότε πολλαπλασιάζεται σε

E. coli ϋΗ5α

ικανά κύτταρα (American Type Culture Collection, Manassas νΑ, USA). Το πλασμίδιο που ελήφθη ονομάστηκε pcDNA3.1 ARP2 V5-His. Το cDNA που κωδικοποιεί για την ενίσχυση της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (

eGFP

) στη συνέχεια εισάγεται μεταξύ του

Xhol

και

Xbal

περιοχές του pcDNA3.1 ARP2 V5-His πλασμίδιο, δημιουργώντας έτσι το pcDNA3.1 ARP2 ΕΟΡΡ V5-His πλασμιδίου.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμολύνσεις για παροδική έκφραση

ανδρογόνων-αναίσθητη κύτταρα LNCaP και κύτταρα CHO καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 και DMEM /F -12 μέσο, ​​αντίστοιχα. Αυτά τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώνονται με 10% ν /ν εμβρυϊκό ορό βοοειδούς (FBS), 2 mM Ε-γλουταμίνη, 0,2% β /ο όξινο ανθρακικό νάτριο, και 1% v /v πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 έως ότου κύτταρα έφθασαν 60-70% συρροή. Η απόπτωση που επάγεται από επώαση κυττάρων με μέσο καλλιέργειας στερούνται FBS για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Ιονομυκίνη παρασκευάστηκε ως 5 mM διαλύματα αποθέματος σε DMSO. Ιονομυκίνη σε μια τελική συγκέντρωση 10 μΜ εφαρμόστηκε σε CHO και LNCaP κύτταρα καλλιέργειες και επωάστηκαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Αμφότερες οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1 ARP2 V5-His (αποδοτικότητες Επιμόλυνση: TE /LNCaP 32%? ΤΕ /ΟΗΟ 46%) και pcDNA3.1 /V5-His-TOPO

lacZ

πλασμίδια (ΤΕ /LNCaP 43%? ΤΕ /ΟΗΟ 54%) για την επαγωγή της παροδικής έκφρασης ARP2-V5 και V5 γαλακτοσιδάση-β, αντίστοιχα. Για την εξομάλυνση των προσδιορισμών κυτταρικής βιωσιμότητας, και οι δύο κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν επίσης με πλασμίδιο pcDNA3.1 V5-His (χωρίς

ARP2

cDNA) (ΤΕ /LNCaP 68%? ΤΕ /ΟΗΟ 80%). κύτταρα CHO επιμολύνθηκαν με pEGFP-Ν1 (ΤΕ 82%) και ροϋΝΑ3.1 ARP2 ΕΟΡΡ V5-His πλασμίδια (ΤΕ 50%) για να ληφθούν eGFP και έκφραση ARP2-eGFP, αντίστοιχα. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000, όπως περιγράφεται στο pcDNA3.1 /V5-His ΤΟΡΟ ΤΑ ένθετο Expression Kit από Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

[Ca

2+] ι μετρήσεις σε ολόκληρο κυτταρικά εναιωρήματα χρησιμοποιώντας Fura-2

ανδρογόνων-αναίσθητη κύτταρα LNCaP και κυττάρων CHO καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως, απομακρύνθηκαν από δίσκους καλλιέργειας χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα συγκομιδής που περιέχει 10 mM HEPES-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα 0,9% συν 0,05 EDTA, ρΗ 7,4 σύμφωνα με το Hirst et al. [46]. Τα κύτταρα τοποθετούνται σε εναιώρημα, και με βάση την ίδια μέθοδο καθιζάνουν στα 500 χ

g

σε φυγόκεντρο χαμηλής ταχύτητας για 3-5 λεπτά και ξεπλένονται δύο φορές με Krebs ρυθμιστικού HEPES που περιέχει 140 mM Na

+, 4.7 mM Κ

+, 1,3 mM Mg

2+, 125 mM Cl

-, 25 mM ΕΤ

3, 1,2 mm H

2 ΡΟ

4, 1.2 mm έτσι

4

2-, 10 mM γλυκόζη, 0,1 mM EGTA και 10 mM HEPES, ρΗ 7.4. Τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν με ρυθμιστικό Krebs HEPES. Μια Fura-2 /AM (3 μΜ) χρόνο φόρτωσης 30 λεπτών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό Krebs HEPES στους 37 ° C στο σκοτάδι. Αφού ολοκληρωθεί αυτή η διαδικασία, τα κύτταρα καθιζάνουν στα 500 χ

g

, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Krebs HEPES και επωάστηκαν περαιτέρω για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να επιτραπεί για de-εστεροποίηση του Fura-2 /AM.

Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα δύο φορές καθιζάνουν στα 500 χ

g

για 3 λεπτά και επαναιωρείται σε Krebs-HEPES Ca

2+ ρυθμιστικό (παραλείποντας EGTA και προστέθηκαν 2,5 mM Ca

2+ ). Fura-2 /AM παρασκευάστηκε ως ένα διάλυμα στοκ (1 mM) με διαλυτοποίηση σε διμεθυλοσουλφοξείδιο και κλάσματα (10 μΙ) αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι να χρειαστούν.

κυτταρικά εναιωρήματα διατηρήθηκαν σε πάγο και για κάθε πείραμα τοποθετούνται σε κυψελίδες από χαλαζία και επωάστηκαν για 2 λεπτά στους 37 ° C πριν από τις μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν. Μια SLM-Aminco φασματοφθορίμετρο (Rochester, ΝΥ) με την χρησιμοποίηση ενός αναλογία διέγερσης 340/380 τιμών εκπομπής fura-2 φθορισμού nm και μέγιστο στα 510 nm. Η βαθμονόμηση του φθορισμού πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη 0,1% Triton Χ-100 για να παράγει την κυτταρική λύση απελευθερώνοντας fura-2 εντός του Ca

2+ ή EGTA μέσων που περιέχουν. Μέγιστες και ελάχιστες τιμές φθορισμού υποκαταστάθηκαν στο Grynkiewicz, Poenie & amp? εξίσωση για τον υπολογισμό Tsien [Ca

2+] ι [47].

Western ανάλυση κηλίδος

Πρόσκαιρη έκφραση του ARP2 και β-Gal επιτεύχθηκε σε κύτταρα LNCaP και κυττάρων CHO με επιμόλυνση με

ARP2

cDNA και

lacZ

cDNA, αντίστοιχα. Αυτές οι πρωτεΐνες εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης με το επιτόπιο V5 στο καρβοξυλικό άκρο του κάθε (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 16, 24, 48, και 72 ώρες, στη συνέχεια συγκομίζονται και υποβάλλονται σε λύση με την ακόλουθη ρυθμιστικό διάλυμα: 10 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 μg /mL απροτινίνη, 1 mM PMSF , και 5 mM βενζαμιδίνη. Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μιας μεθόδου δικιγχονινικού οξέος (BCA) (Pierce, Rockford, IL, USA), και 20 μg ολικής πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτώματα SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια ηλεκτροστυπώθηκαν σε 0,45 μm μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Trans-Blot Μεταφορά μέσο Bio-Rad, Hercules, CA, USA), στη συνέχεια δεσμεύτηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C με ένα διάλυμα «κορεσμού» [αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) ( ρΗ 7.6), 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4), 100 mM NaCl, 0.1% ν /ν Tween-20, και 2.5% β /ο αποβουτυρωμένο γάλα]. Πρωτογενής αντι-V5 μονοκλωνικό αντίσωμα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) αραιώθηκε στο ίδιο διάλυμα κορεσμού (1:5000) και επωάζεται με μεμβράνες για 12 ώρες στους 4 ° C. Μετά μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με κορεσμό διαλύματος στους 37 ° C (15 λεπτά η κάθε πλύση), οι μεμβράνες επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες με δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) αραιωμένο σε κορεσμό διάλυμα ( 1:5000). Μεμβράνης στη συνέχεια πλύθηκαν με TBS /0,1% ν /ν Tween-20 τρεις φορές για 15 λεπτά στους 37 ° C, που ακολουθείται από μια τέταρτη πλύση με TBS στους 37 ° C. Ίση φόρτωση επαληθεύτηκε με επώαση των μεμβρανών με αντι β-ακτίνης αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Οπτικοποίηση της δέσμευσης αντισώματος επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μια ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) κιτ ανίχνευσης (Pierce, Rockford, IL, USA) και την έκθεση των μεμβρανών σε ακτινογραφικά φιλμ (Kodak, Rochester, ΝΥ, USA).

3- ( 4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) βρωμιούχου τετραζολίου -2,5-διφαινυλ (ΜΤΤ)

τα μη επεξεργασμένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με ορό (αρνητικός έλεγχος), ενώ τα αποπτωτικά κύτταρα λήφθηκαν με τον ορό στέρηση (θετικός έλεγχος). Τα κύτταρα (2 χ 10

4 /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για 16, 24, 48, και 72 ώρες. Στη συνέχεια, 30 μλ διαλύματος αποθέματος ΜΤΤ (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο σε μια τελική συγκέντρωση 0.5 mg /mL αντιδραστήριο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C επί 4 ώρες για να επιτρέψει την ανάπτυξη των κρυστάλλων φορμαζάνης, τα οποία στη συνέχεια διαλύονται με την προσθήκη ρυθμιστικού λύσης [20% SDS, 50% Ν, Ν-διμεθυλοφορμαμίδιο (ρΗ 3.7)]. Οι πλάκες επωάστηκαν για 12 ώρες, και τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός. Η βιωσιμότητα σε κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδιο pcDNA3.1-V5-His θεωρήθηκε για ομαλοποίηση των αποτελεσμάτων βιωσιμότητας pcDNA3.1 ARP2 V5-His επιμολυσμένων κυττάρων. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές (n). Η Φοιτητών δίπλευρη

t-

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών σε σχέση με τους ελέγχους. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM Χ και

ρ & lt?

0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Σύμβολα δηλώνουν:

#

σ

& lt? 0,05, *

σ

& lt? 0,01,

¶

σ

& lt? 0.001

Trypan blue κυτταρικής βιωσιμότητας δοκιμασία

κύτταρα LNCaP επωάστηκαν για 16, 24, 48, 72, 96, και 120 ώρες, ενώ τα κύτταρα CHO επωάζονται για 16, 24, 48, και 72 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με 0,1% ν /ν trypan μπλε χρωστική ουσία στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε θαλάμους Neubauer. Ένα σύνολο 300 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας MOTIC φωτεινό πεδίο οπτικό μικροσκόπιο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων επιμολυσμένων με πλασμίδιο pcDNA3.1-V5-His θεωρήθηκε για ομαλοποίηση του pcDNA3.1 ARP2 V5-His επιμολυσμένων κυττάρων. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές (n). Η Φοιτητών δίπλευρη

t-

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών σε σχέση με τους ελέγχους. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM Χ και

ρ & lt?

0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Σύμβολα δηλώνουν:

#

σ

& lt? 0,05, *

σ

& lt? 0,01,

¶

σ

& lt? 0.001

οι μετρήσεις της ραδιενέργειας των κασπασών 3 και 7

CHO και LNCaP κύτταρα (3 χ 10

5 /φρεάτιο) επιστρώθηκαν και καλλιεργήθηκαν για 16, 24, 48, και 72 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε τέσσερις κύκλους ψύξης-απόψυξης σε ένα ρυθμιστικό λύσης (10 mM HEPES (ρΗ 7.0), 40 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl

2). Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 30 λεπτά στους 15 800

x

g. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης για τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BCA (Pierce, Rockford, IL). Δείγματα (συνολική πρωτεΐνη, 20 μα) αραιώθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας (50 mM HEPES, 10% σακχαρόζη, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT) σε ένα τελικό όγκο 1000 μΐ. Το ρυθμιστικό δοκιμασίας συμπληρώθηκε επίσης με Ζ-Asp-Glu-Val-Asp-7-αμινο-4-τριφθορομεθυλοκουμαρίνη (Ζ-DEVD-AFC), φθορισμογόνο υπόστρωμα από κασπάσες 3 και 7, και τα δείγματα επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 30 ΝΤΟ. Ο φθορισμός μετρήθηκε σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο Molecular Probes χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο φωταύγειας. Το μήκος κύματος διέγερσης ήταν 365 nm και το μήκος κύματος εκπομπής ήταν 505 nm. Το μέγιστο μήκος κύματος απορρόφησης βρέθηκε να είναι 488 nm. Ο φθορισμός μετρήθηκε σε ελεύθερο κυττάρων εκχύλισμα κενό δείγματα με σκοπό τον εντοπισμό του λόγου σήματος-προς-θόρυβο των δειγμάτων. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές (n). Η Φοιτητών δίπλευρη

t-

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών σε σχέση με τους ελέγχους. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM Χ και

ρ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Σύμβολα δηλώνουν:

#

σ

& lt? 0,05, *

σ

& lt? 0,01,

¶

σ

& lt? 0.001

συνεστιακή μικροσκοπία και διαφορική μικροσκοπία αντίθεσης παρεμβολές (DIC)

ομοεστιακή εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας φασματικές Fluoview FV 1000 με λέιζερ σύστημα συνεστιακής σάρωσης (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) επισυνάπτεται /διασυνδέεται με την Olympus IX81 ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός με 10 × και 40 × στόχους πετρελαίου-βύθισης. eGFP ήταν ενθουσιασμένος στα 488 nm χρησιμοποιώντας κρυπτόν /γραμμής λέιζερ αργού και εκπεμπόμενος φθορισμός ανιχνεύθηκε μεταξύ 515 nm και 540 nm χρησιμοποιώντας φίλτρο διέλευσης ζώνης. λειτουργία λέιζερ διεξήχθη σε χαμηλή ισχύ (97-99% εξασθένιση) η οποία μείωσε σημαντικά φωτολεύκανση και φωτογήρανσης σε δείγματα. DIC εικόνες μικροσκοπία ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus IX81 και έναν πυκνωτή IX2-LWUCD με 10 × 40 × και στόχων. Ομοεστιακή και DIC εικόνων έγιναν ορατές, επεξεργασία και μετατρέπονται σε εικόνες TIFF μορφοποιηθεί χρησιμοποιώντας το 6.1 λογισμικό FV10-ASW (Όλυμπος).

Αποτελέσματα

έκφραση ARP2 και τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα LNCaP

δοκιμασίες κηλίδος Western δείχνουν την έκφραση του ARP2-V5 σε κύτταρα LNCaP παρατηρήθηκε για πρώτη φορά 16 ώρες μετά την επιμόλυνση, με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης να ανιχνεύεται 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση (Σχήμα 1Α). Αυτή η δοκιμασία δείχνει λωρίδες με μοριακά βάρη χαμηλότερα από εκείνο για την πρωτεΐνη σύντηξης ARP2-V5 (54 kDa) ανιχνεύθηκε 24, 48, και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Αυτές οι ζώνες είναι πιθανότατα σχετίζονται με τα προϊόντα αποδόμησης του ARP2-V5 δημιουργείται κατά τη διάρκεια της απόπτωσης.

(Α) κηλίδες Western ανιχνεύθηκε έκφραση της β-gal-V5 (112 kDa) και ARP2-V5 (54 kDa) συνολικά κυτταρικά λύματα. (Β) Κανονικοποιημένη κυτταρική βιωσιμότητα% των μαρτύρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ με 2 × 10

4 κύτταρα που καλλιεργούνται απουσία ορού ή επιμολυσμένο με

ARP2

cDNA. Βιωσιμότητα των δύο αυτών ομάδων αγωγής αναλύθηκαν στα 16, 24, 48, και 72 ώρες χρονικά σημεία. (C) Κανονικοποιημένη κυτταρική βιωσιμότητα% των ελέγχων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μία trypan blue μέθοδο αποκλεισμού. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εν τη απουσία ορού ή επιμολυσμένα με

ARP2

cDNA και προσδιορίστηκε σε 16, 24, 48, 72, 96, και 120 h χρονικά σημεία. Οι μέσες τιμές που παρουσιάζονται (n = 3, Χ ± SEM),

#

σ

& lt? 0,05, *

σ

& lt? 0,01,

¶

p

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου

η

Κανονικοποιημένη κυτταρική βιωσιμότητα% των ελέγχων των κυττάρων LNCaP καλλιεργούνται απουσία ορού, καθώς και κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με

ARP2

cDNA , μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρατηρήθηκε να μειώνεται σημαντικά μετά από 16 ώρες, και μια επιπλέον μείωση παρατηρήθηκε στις 72 ώρες (Εικόνα 1Β). Μια μείωση ~ 63% της βιωσιμότητας των κυττάρων παρατηρήθηκε σε

ARP2

cDNA-επιμολυσμένα κύτταρα σε 72 h, η οποία είναι υψηλότερη σε σύγκριση με μείωση ~ 23% της βιωσιμότητας για τα κύτταρα LNCaP καλλιεργούνται απουσία ορού. Ως εκ τούτου, είναι πολύ πιθανό ότι ανδρογόνο αναίσθητος LNCaP κύτταρα απουσία ορού ενεργοποιούν αποπτωτικών μηχανισμών καθυστερημένα σε σχέση με

ARP2

cDNA-επιμολυσμένα κύτταρα. Ομαλοποιημένη κυτταρικής βιωσιμότητας% των ελέγχων αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας το μπλε μέθοδο αποκλεισμού trypan. Ένα ήπιο μείωση στη βιωσιμότητα ανιχνεύθηκε εντός των πρώτων 24 ωρών και για τις δύο πειραματικές συνθήκες (Σχήμα 1 C). Η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε περαιτέρω για ορό υποβαθμισμένες και

ARP2

cDNA επιμολυσμένα κύτταρα έως 120 ώρες, με μείωση του ~44% και ~42% της βιωσιμότητας των κυττάρων, αντίστοιχα.

έκφραση ARP2 και βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα CHO

δοκιμασίες κηλίδος Western δείχνουν την έκφραση του ARP2-V5 σε κύτταρα CHO ανιχνεύεται για πρώτη φορά σε 16 ώρες μετά την επιμόλυνση, φθάνοντας τα υψηλότερα επίπεδα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η υποβάθμιση των ARP2-V5 (54 kDa) δείχνεται με ένα κάτω ζώνη μοριακού βάρους ανιχνεύονται μεταξύ 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, υποδηλώνει ότι η αποπτωτική συμβάν λαμβάνει επίσης χώρα σε αυτό τον κυτταρικό τύπο κατά τον ίδιο τρόπο όπως δείχνεται προηγουμένως για τα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον να επισημάνουμε ότι η καθυστέρηση στην εμφάνιση αυτών των προϊόντων αποδόμησης όταν τα κύτταρα CHO σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP, θα μπορούσε να σχετίζεται με το γεγονός ότι τα κύτταρα CHO αποτελούν ένα εξαιρετικό μοντέλο για την έκφραση των πρωτεϊνών ετερόλογο αφού αποδόμηση πρωτεΐνης διατηρείται στο ένα ελάχιστο.

(α) κηλίδες Western ανιχνεύθηκε έκφραση της β-gal-V5 (112 kDa) και ARP2-V5 (54 kDa) σε συνολικά κυτταρολύματα. (Β) Κανονικοποιημένη κυτταρική βιωσιμότητα% των μαρτύρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ με 2 × 10

4 κύτταρα που καλλιεργούνται απουσία ορού ή επιμολυσμένο με

ARP2

cDNA. Βιωσιμότητα των δύο αυτών ομάδων αγωγής αναλύθηκαν στα 16, 24, 48, και 72 ώρες χρονικά σημεία. (C) Κανονικοποιημένη κυτταρική βιωσιμότητα% των μαρτύρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια μέθοδο κυανού τρυπανίου αποκλεισμού. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εν τη απουσία ορού ή επιμολυσμένα με

ARP2

cDNA και προσδιορίστηκε σε 16, 24, 48, και 72 ώρες χρονικά σημεία. Οι μέσες τιμές που παρουσιάζονται (n = 3, Χ ± SEM),

#

σ

& lt? 0,05, *

σ

& lt? 0,01,

¶

p

& lt?. 0.001, σε σύγκριση με ομάδες ελέγχου

Η

Κατά προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας που απασχολούν μείωση του ΜΤΤ, μία σταθερή μείωση στην βιωσιμότητα παρατηρήθηκε για τα κύτταρα CHO μεταξύ 16 ώρες και 72 ώρες καλλιέργειας. Στις 72 ώρες, η βιωσιμότητα μειώθηκε κατά ~44% για τα κύτταρα στερούνται ορού, ενώ η βιωσιμότητα των

ARP2

κύτταρα cDNA επιμολυσμένα μειώθηκε κατά ~51% (Σχήμα 2Β). Trypan δοκιμασίες μπλε κυτταρικής βιωσιμότητας δεν δείχνουν σημαντικές μεταβολές στα κύτταρα CHO που παρατηρείται έως και 48 ώρες μετά από στέρηση ορού. Ωστόσο, μια δραστική μείωση στη βιωσιμότητα ανιχνεύθηκε μετά από 72 ώρες επώαση, υποδηλώνοντας ότι μέχρι αυτή τη στιγμή η αποπτωτική συμβάν άρχισε να επηρεάζει την ακεραιότητα της μεμβράνης του πλάσματος. Για

ARP2

cDNA-επιμολυσμένα κύτταρα, παρατηρήθηκε σταδιακή μείωση στη βιωσιμότητα μεταξύ 16 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα ποσοστά των βιώσιμων κυττάρων για τις δύο ομάδες σε 72 ώρες ήταν πολύ παρόμοια, με ~51% βιωσιμότητα που παρατηρήθηκε για τα κύτταρα στερούνται ορού και ~53% βιωσιμότητα παρατηρήθηκε για

ARP2

cDNA-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2C). Ως εκ τούτου, παρόμοια με τα κύτταρα LNCaP, ο δείκτης κυτταρικού θανάτου για τα κύτταρα CHO φαίνεται να εξαρτάται από το επίπεδο της έκφρασης ARP2-V5. Είναι ενδιαφέρον να επισημανθεί ότι στην περίπτωση του

ARP2

cDNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα στερούμενα ορού κύτταρα, οι διαφορές που λαμβάνονται μεταξύ των δύο δοκιμασιών που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων είναι πιθανό σχετικές με το γεγονός ότι κρίσιμες μεταβολικές οδούς που συνδέεται με μία ενδοκυτταρική υπερφόρτωση ασβεστίου και την απώλεια των ενδοκυτταρικών οργανιδίων ακεραιότητας επηρεάζονται κυρίως, πριν από την κυτταρική μεμβράνη καταστραφεί.

Fura-2 μέτρηση του κυτοσολίου δωρεάν Ca

2+ σε LNCaP και CHO κύτταρα

Δεδομένου ότι η χρήση του Fura-2 για να μετρήσει τις αλλαγές του ενδοκυτταρικού ασβεστίου χρησιμοποιώντας ολόκληρα κυτταρικά εναιωρήματα υπήρξε ένας από τους πιο επιτυχημένους διαδικασίες έχουν σχεδιαστεί για το σκοπό αυτό, εναιωρήματα κυττάρων LNCaP και CHO φορτώθηκαν με Fura-2 και [Ca

2+] ί μετρηθεί. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, Fura-2 φορτωμένα κύτταρα ελέγχου εκτέθηκαν σε ιονομυκίνη (10 μΜ) υπό την παρουσία ενός ασβέστιο που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, που παράγεται σε ένα σύντομο χρονικό διάστημα μια αύξηση στην [Ca

2+] ί. Είναι ενδιαφέρον, LNCaP και CHO

ARP2

επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν επίσης αυξημένη [Ca

2+] ι καταδεικνύοντας μία ενισχυμένη διαπερατότητα ασβεστίου σε σύγκριση με τον έλεγχο κυτταρικές γραμμές. Αν και τα κύτταρα επωάστηκαν απουσία βόειου εμβρυϊκού ορού δοκιμάστηκαν επίσης, διαρροή 2 Fura-φορτωμένα κύτταρα ήταν σημαντική και συνεπώς διαφορές μεταξύ των πειραμάτων πολύ μεγάλο για να συμπεριληφθούν σε αυτό το σύνολο των αποτελεσμάτων.

Η

Απόπτωση εξέλιξης και η ενεργοποίηση των κασπασών 3 και 7 σε κύτταρα CHO και LNCaP

οι κασπάσες 3 και 7 που ταξινομούνται ως κασπάσες ενέργειας ενεργοποιούνται από κασπάσες 8 και 9 (επίσης γνωστή ως εκκινητές). Οι κασπάσες 3 και 7 έχουν επίσης αποδειχθεί ότι συμβάλλουν κατά τη διάρκεια της απόπτωσης στη διάσπαση υποστρωμάτων όπως πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα και λιπίδια. Το Σχήμα 3 δείχνει τα επίπεδα δραστηριότητας ανιχνεύονται για κασπασών 3 και 7. Η βασική γραμμή αντιπροσωπεύει την δραστηριότητα των κασπασών σε μη κατεργασμένα κύτταρα (ελέγχου), δεδομένου ότι η επεξεργασία των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σχεδόν 30 λεπτά και ένας ορισμένος βαθμός ενεργοποιήσεως του ενζύμου είναι πάντα ανιχνευθεί. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό τιμές σε σχέση με το θετικό μάρτυρα. Για τα κύτταρα CHO στερούνται ορού, η σταδιακή ενεργοποίηση των κασπασών 3 και 7 ανιχνεύθηκε μεταξύ 24 και τις 48 ώρες, με τα υψηλότερα επίπεδα ενεργοποίησης που βρέθηκαν μετά από 72 ώρες και ενεργοποίηση ποσοστά 75% παραπάνω ελέγχους. Ενώ

ARP2

cDNA-επιμολυσμένα κύτταρα CHO ή ιονομυκίνη (10 μΜ) κατεργασμένων κυττάρων CHO παρουσίασαν σταδιακή αύξηση ενεργοποίηση της κασπάσης, η αύξηση που παρατηρήθηκε μεταξύ 24 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση ή ιονομυκίνη θεραπείας ήταν χαμηλότερος από ό, τι τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με CHO κύτταρα επωάζονται απουσία ορού στα ίδια χρονικά σημεία (Σχήμα 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, κασπάσες ενεργοποίηση σε κύτταρα LNCaP καλλιεργούνται απουσία ορού,

ARP2

της cDNA-επιμολυσμένα κύτταρα, ή ιονομυκίνη επεξεργασμένα κύτταρα, έδειξαν το ίδιο επίπεδο ενεργοποίησης, αποτελέσματα που συσχετίζονται καλά με τα παραπάνω δεδομένα βιωσιμότητας. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν και πάλι το γεγονός ότι τα κύτταρα LNCaP φαίνεται να είναι πιο ανθεκτικά στην έναρξη ενός αποπτωτικών γεγονός από κύτταρα CHO (Σχήμα 3Β).

δραστικότητα κασπάσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία φθορομετρική δοκιμασία που χρησιμοποιεί Ζ-DEVD-AFC ως ένα υπόστρωμα. (Α) κύτταρα CHO αναπτύχθηκαν σε απουσία ορού, επιμολύνθηκαν με

ARP2

cDNA ή επωάστηκαν με 10 μΜ ιονομυκίνη δοκιμάστηκαν στα 16, 24, 48 και 72 χρονικά σημεία h. (Β) LNCaP κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία ορού, επιμολύνθηκαν με

ARP2

cDNA (72 ώρες) ή επωάστηκαν με 10 μΜ ιονομυκίνη δοκιμάστηκαν στα 16, 24, 48 και 72 χρονικά σημεία h. Οι μέσες τιμές που παρουσιάζονται (n = 3, Χ ± SEM),

#

σ

& lt? 0,05, *

σ

& lt? 0,01,

¶

p

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου

η

υποκυτταρικός εντοπισμός

για να απεικονίσει τον υποκυτταρικό εντοπισμό των ARP2, την έκφραση της eGFP-επισημασμένη-ARP2 πρωτεΐνη σύντηξης στην κυτταρική σειρά CHO με επιμόλυνση με

ARP2

–

EGFP

cDNA και

EGFP

cDNA (έλεγχος) μελετήθηκε σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας ένα 10 × αντικειμενικό φακό. Σε σύγκριση με ε

GFP

cDNA επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου CHO (Σχήμα 4Α),

ARP2-EGFP

cDNA-επιμολυσμένα κύτταρα παρουσίασαν σήμα φθορισμού εντοπισμένη γύρω από την πυρηνική μεμβράνη (Σχήμα 4C). Τα ίδια πεδία αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας DIC μικροσκοπία (Σχήμα 4, Β και D).