Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατες εκθέσεις έχουν προτείνει μια πιθανή εμπλοκή του single-minded ομόλογο 2 (SIM2) σε ανθρώπινους καρκίνους στερεών , συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος της SIM2 στον καρκίνο γενικά, και στον καρκίνο του προστάτη, ιδίως, παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να διαλευκανθεί ο ρόλος της SIM2 στον καρκίνο του προστάτη χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση shRNA που βασίζεται στην κυτταρική σειρά καρκίνου προστάτη PC3.

Μέθοδοι

λεντοϊών Τα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν για την αναστολή της SIM2 γονιδίου και της πρωτεΐνης επίπεδα σε κύτταρα PC3. Ποσοτική RT-PCR και διακλαδισμένης DNA διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η έκφραση μεταγράφου. επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης SIM2 μετρήθηκε με western blot. Προφίλ της γονιδιακής έκφρασης που εκτείνονται σε ολόκληρο το γονιδίωμα, καθώς και πολικές μεταβολισμική των πολλών σημαντικών μεταβολικών οδών έγινε για τον εντοπισμό μεγάλων dysregulations μονοπάτι.

Αποτελέσματα

γονιδίου και της πρωτεΐνης προϊόντα SIM2 σημαντικά μειωτικά από lenti -shRNA στην κυτταρική σειρά PC3. Αυτή η χαμηλή έκφραση του SIM2 επηρεάζονται προφίλ γονιδιακής έκφρασης, αποκαλύπτοντας σημαντικές αλλαγές σε σημαντικές σηματοδότηση μονοπατιών, τα δίκτυα και τις λειτουργίες. Επιπλέον, επλήγησαν κύριων μεταβολικών οδών.

Συμπέρασμα

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν συμμετοχή της SIM2 σε βασικά γνωρίσματα του προστάτη καρκινικών κυττάρων βιολογία και μπορεί να διέπουν τη συμβολή αυτού του παράγοντα μεταγραφής να προστάτη εμφάνιση του καρκίνου και την εξέλιξη

Παράθεση:. Lu Β, Asara JM, Sanda MG, Arredouani MS (2011) Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα SIM2 στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 6 (12): e28837. doi: 10.1371 /journal.pone.0028837

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 26 Αυγούστου, 2011? Αποδεκτές: 16 Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 Δεκεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Lu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το ΝΙΗ-NCI ερευνητικό δίκτυο έγκαιρης ανίχνευσης χορηγήσει UO1-CA11391 (Μ Sanda), του Υπουργείου άμυνας του καρκίνου του προστάτη Κατάρτισης Βραβείο W81XWH-09-1-0626 (Β Lu), και του καρκίνου του προστάτη Βραβείο Νέου ερευνητή του Ιδρύματος (MS Arredouani ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Single-minded ομόλογο 2 (SIM2) του γονιδίου βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 21q22.2 και είναι μέλος των βασικών PAS έλικα-βρόχος-έλικα [ανά Arnt-Sim] (bHLH-PAS) της οικογένειας μεταγραφής παραγόντων [1], [2]. SIM2 αρχικά σκέφτηκε να συμβάλει στην σύνδρομο Down (DS) [3]. Ως μεταγραφικός παράγοντας (TF), ποντικού SIM2 (mSIM2) μεσολαβεί γονιδιακής έκφρασης μέσω του ΚΝΣ μέση γραμμή ενισχυτή στοιχείο (CME) με ARNT εταίρο διμερισμό του μέσω ARNT καρβοξυ-άκρο [4]. Ο παράγοντας μεταγραφής c-myb ρυθμίζει SIM2 μεταγραφή σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος, και ένα σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) μεσολαβεί πυρηνικό εντοπισμό της SIM2 [5].

Μια προηγούμενη

in silico

βιοπληροφορική προσέγγιση με το Καρκίνος Γονιδιώματος Ανατομία έργου (CGAP) βάση δεδομένων του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (NCI) προσδιορίζονται SIM2 όπως αυτές σχετίζονται με παχέος εντέρου, του παγκρέατος και του προστάτη καρκινώματα, ενώ απουσιάζει στους αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς [6]. Δύο διαφορετικές συγκολλημένα ισομορφές της SIM2 μεταγραφής, SIM2 μήκους (SIM2-λ) και SIM2-short (SIM2-s), έχουν αναφερθεί ενώ διαφορική λειτουργία τους σε ανθρώπους που δεν είναι ακόμη γνωστά [1]. SIM2-S εκφράζεται ειδικά στα πρώτα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. αναστολή της έκφρασης Αντινοηματικά SIM2-s με αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια προκάλεσε αναστολή της ανάπτυξης και της απόπτωσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή RKO και την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνούς ποντικούς και επίσης σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή Capan-1 [7], [8]. Απόπτωση προκλήθηκε με SIM2-s αναστολή στην καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή RKO [9]. SIM2-s βρέθηκε επίσης να έχουν δραστικότητα κατασταλτική του όγκου στον καρκίνο του μαστού [10]. Το δυναμικό εισβολή του γλοιοβλαστώματος μειώθηκε σημαντικά από την αναστολή SIM2s, συμβαδίζει με μείωση στην έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 2 τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης [11].

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως SIM2 ως δυνητικό βιοδείκτη και ανοσοθεραπεία στόχευση για τον καρκίνο του προστάτη στον άνθρωπο [12]. Αν και η έκφραση SIM2-s (όπως μετράται με ανοσοϊστοχημεία των δειγμάτων προστατεκτομή) έχει συσχετιστεί με την επιθετική ιστοπαθολογία στον καρκίνο του προστάτη, και υπερεκφράζουν έκτοπη SIM2s ενισχυμένη επιβίωση σε ορισμένες συνθήκες σε PC3AR + κύτταρα [13], [14], ο λειτουργικός ρόλος του γονιδίου SIM2 σε προστάτη καρκινικό κύτταρο είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

σε αυτή τη μελέτη επιδιώξαμε να διαλευκανθεί ο λειτουργικός ρόλος του SIM2 σε προστάτη χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση γονιδιακή σίγηση και τον χαρακτηρισμό των μοριακών και λειτουργικές αλλαγές τόσο από προφίλ γονιδιακής έκφρασης και μεταβολομική προφίλ.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Η ανθρώπινη PC3, κυτταρικές σειρές LNCaP, VCAP και DU145 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο ATCC του. Καλοήθη κύτταρα PrEC, όπως περιγράφεται στο Berger R et al, 2004, ευγενικά από τον Dr. W. Hahn στο Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA.

Μεταγωγή Σωματίδια

Η pLKO σωματίδια μεταγωγή λεντοϊού ελέγχου 0.1-puro, λουσιφεράσης ΑΠΟΣΤΟΛΗ έλεγχο shRNA σωματίδια μεταγωγής λεντοϊού και την αποστολή SIM2 shRNA σωματίδια λεντοϊού μεταγωγής χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν PC3 κυτταρική σειρά (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ).

επιλογής του δείγματος, καθαρισμού RNA και αντίστροφη μεταγραφή

Δέκα δείγματα καλοήθεις και ριζική δεκατέσσερις όγκου προστατεκτομή ιστού ελήφθησαν και το σύνολο των RNAs υπέστησαν την επεξεργασία που περιγράφεται στην προηγούμενη εργασία μας [12]. Η γραμμή κυττάρων απομονώθηκε ολικό RNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Καθαρισμένο RNA μετρήθηκε ποσοτικά από NanoDrop ND-1000 Φασματοφωτόμετρο (NanoDrop, Wilmington, DE). 500 ng από κάθε ολικό RNA των κυττάρων μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ολίγο dT και εκθέτη III ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μικροσυστοιχίες Γονιδιακή έκφραση και ανάλυση

250 ng ολικού RNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ MessageAmp ΙΙ mRNA ενίσχυση Ambion του. Βιοτίνη-UTP ενσωματώθηκε κατά τη διάρκεια της ολονύκτιας in vitro βήμα μεταγραφή σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Affymetrix του (Santa Clara, CA) array GeneChip U133 (Plus 2.0 chip) συστοιχίες που εκπροσωπούν όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα μεταγραφές. 15 μg cRNA ήταν κατακερματισμένη και υβριδοποιημένου συστοιχίες »σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται προηγουμένως [15]. Η ποιότητα των σαρωμένων εικόνων συστοιχίες προσδιορίστηκαν με βάση τις τιμές υποβάθρου, τοις εκατό παρούσες προσκλήσεις, απολέπιση παράγοντες, και 3′-5 αναλογία »της β-ακτίνης και ΟΑΡϋΗ χρησιμοποιώντας τα πακέτα BioConductor R. Η τιμή του σήματος για κάθε μεταγραφή συνοψίστηκε χρησιμοποιώντας PM-μόνο με βάση τον αλγόριθμο προσομοίωσης σήμα που περιγράφεται σε dchip. Οι PM μόνο με βάση τη μοντελοποίηση με βάση τις αποδόσεις αλγόριθμο λιγότερο αριθμό των ψευδώς θετικών σε σύγκριση με το πρότυπο PM-MM. Με αυτόν τον τρόπο, η τιμή του σήματος αντιστοιχεί στο απόλυτο επίπεδο έκφρασης ενός μεταγραφήματος [16]. Αυτές οι κανονικοποιημένες και διαμόρφωσε τις τιμές των σημάτων για κάθε μεταγραφή χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω υψηλού επιπέδου ανάλυση της βιοπληροφορικής. Κατά τον υπολογισμό των τιμών των σημάτων έκφρασης με βάση το μοντέλο, συστοιχία και ακραίες τιμές ανιχνευτή ανακρίνονται και εικόνες ακίδα αντιμετωπίζονται ως ακραίες τιμές του σήματος. Η ανίχνευση ακραία διεξήχθη χρησιμοποιώντας dchip αλγόριθμος ανίχνευσης ακραία. Ένα τσιπ θεωρείται ως μια ακραία περίπτωση ο καθετήρας, ποσοστό μόνο ή συστοιχία ακραία τιμή υπερβαίνει ένα προεπιλεγμένο όριο του 5%. Κατά τη σύγκριση των δύο ομάδων των δειγμάτων για την ταυτοποίηση γονιδίων εμπλουτισμένο σε ένα δεδομένο φαινότυπο, αν το 90% χαμηλότερη εμπιστοσύνη δεσμευμένο (LCB) της πτυχής μεταβολή (FC) μεταξύ των δύο ομάδων ήταν πάνω από 1,2, το αντίστοιχο γονίδιο θεωρήθηκε να εκφράζονται διαφορικά. LCB είναι μια αυστηρή εκτίμηση της FC και έχει αποδειχθεί ότι είναι η καλύτερη κατάταξη στατιστική [17] Έχει προταθεί ότι ένα κριτήριο για την επιλογή των γονιδίων που έχουν LCB πάνω από 1,2 πιθανότατα αντιστοιχεί σε γονίδια με μια «πραγματική» πάσο αλλαγή σε τουλάχιστον 2 στην έκφραση γονιδίων [18]. Τα δεδομένα προέρχονται από CEL αρχεία και κανονικοποιούνται χρησιμοποιώντας RMAexpress (https://rmaexpress.bmbolstad.com/). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού MeV (https://www.tm4.org/mev/)

κυτταρική σηματοδότηση μονοπατιού ανάλυση

εφευρετικότητα Pathways Ανάλυση (Ingenuity Systems®, http:. //www.ingenuity.com) εφαρμογές χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία δικτύων και την αξιολόγηση στατιστικά σχετική βιολειτουργίες, κανονικά μονοπάτια και τα δίκτυα που συνδέονται με τα διαφορικά εκφρασμένων προφίλ γονίδιο που εξάγεται από τα δεδομένα μεταγραφικό.

διακλαδιασμένης DNA και ποσοτική Real-Time PCR ( qRT-PCR)

Διακλαδισμένο DNA πραγματοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η έκφραση SIM2s και SIM2L γονίδιο στο συνολικό RNA δείγματα ανθρώπινου προστάτη και ομαλοποιήθηκε με 2 γονίδια ελέγχου ALSA1 και HPRT (QuantiGene 2.0 Σύστημα Αντιδραστηρίων, Affymetrix Inc, Fremont, CA ). Για την ποσοτική RT-PCR, 1 μΐ cDNA χρησιμοποιήθηκε για κάθε καλά RT-PCR αντιδράσεις. Τα δείγματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Taqman καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιήθηκε για δύο στάδια πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση επί όργανο Applied Biosystems 7900HT Prism. Taqman πραγματικού χρόνου PCR εναρκτήρες για GAPDH (4310884E) και SIM2L (hs00231925_m1) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Foster City, CA). Taqman πραγματικού χρόνου PCR εκκινητές για SIM2s έχουν σχεδιαστεί από την ομάδα μας και αγοράστηκαν από Biosearch Technologies (Novato, CA). SIM2s πρόσθιο εκκινητή: 5′-gtgccaagct acgaaggtg-3 ‘? SIM2s αντίστροφο εκκινητή: 5’-acttagaagcagaaagagggcaag-3 ‘? ανιχνευτής: TCAGGTCTGCTCGTGGGGAAGGTG. αξία Έκφραση SIM2s ή SIM2L σε ένα δεδομένο δείγμα κανονικοποιήθηκε με την αντίστοιχη έκφραση του GAPDH. Το 2

-ΔΔCt μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό σχετική έκφραση γονιδίου SIM2 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [20].

λεντοϊών μεταγωγή και σταθερή κυτταρική γραμμή επιλογής

1.6 X 10 κύτταρα

4 PC3 απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 20 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και προσετέθησαν 110 μΙ φρέσκου μέσου που περιέχει βρωμιούχο εξαδιμεθρίνης σε τελική συγκέντρωση 8 μg /ml. Λεντοϊών σωματίδια προστέθηκαν σε κατάλληλα φρεάτια στο 5 ΜΟΙ (πολλαπλότητα μόλυνσης) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε στη συνέχεια και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 2 ημέρες, ακολουθούμενη από μία καλλιέργεια 10-12 ημερών με πουρομυκίνη (2 ng /ml) προστέθηκε κάθε 3 ημέρες.

Παροδική μεταγωγή επιτεύχθηκε πάνω από ένα 3-ημερών επώαση.

Western blot

τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS δύο φορές πριν συλλέχθηκαν με απόξεση. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (50 mmol /L Tris-HCI ρΗ 8.0, 20 mM EDTA, 1% SDS, και 100 mM NaCl) που περιέχει ένα δισκίο μίγμα αναστολέα ενζύμου (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, ΙΝ) και PMSF ( Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Scientific, Rockford, IL). Συνολικά 20-50 μα εκχυλίσματος πρωτεΐνης κλασματώθηκε με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Immobilon-Ρ? Millipore). Η μεμβράνη αποκλείσθηκε με TBS-T (0.1% Tween 20 σε PBS) που περιέχει 3% ξηρό γάλα και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα SIM2s (Santa Cruz, sc-8715, ισομορφή NM_009586) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από τρεις πλύσεις με ΤΒδ-Τ, η μεμβράνη επωάστηκε με HRP-συζευγμένο δευτερεύον Ab για 1 ώρα και στη συνέχεια πλύθηκε με 0,05% Tween 20 σε PBS. Τα ανοσοσυμπλέγματα εντοπίστηκαν με μεθόδους ECL (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Μεταβολικά προφίλ χρησιμοποιώντας στοχευμένες Υγρή χρωματογραφία Tandem Φασματομετρίας Μάζας (LC /MS /MS)

10

6 κύτταρα εκθετικά αναπτυσσόμενα σε βασικά μέσα με διαπιδυμένο ορό συλλέχθηκαν σε 3 mL 80% ν /ν μεθανόλης βαθμού HPLC σε ξηρό θερμοκρασίες πάγου. Φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε 24 ώρες και 2 ώρες πριν από την εκχύλιση. Το αδιάλυτο υλικό σε προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκε στις 4000 rpm για 15 λεπτά και το προκύπτον υπερκείμενο υγρό (περιεκτικότητα μεταβολίτης) εξατμίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ψυγείο SpeedVac σε ένα σφαιρίδιο. Τα δείγματα επαναιωρήθηκαν χρησιμοποιώντας 20 μL νερό καθαρότητας HPLC για ανάλυση φασματομετρίας μάζας. 10 μι ενέθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα τριπλό φασματόμετρο 5500 QTRAP τετραπολικό μάζας (ΑΒ /Sciex) σε συνδυασμό με ένα σύστημα Τονίζονται UFLC HPLC (Shimadzu) μέσω επιλεγμένων έλεγχος της αντίδρασης (SRM) σε σύνολο 255 ενδογενών υδατοδιαλυτών μεταβολιτών για σταθερή κατάσταση αναλύσεις δείγματα. Ορισμένοι μεταβολίτες στόχευαν τόσο θετικές όσο και αρνητικές λειτουργία ιόντων για ένα σύνολο 298 μεταβάσεις SRM. τάσης ESI ήταν + 4900V σε λειτουργία θετικών ιόντων και -4500V σε λειτουργία αρνητικών ιόντων. Ο χρόνος παραμονής ήταν 5 ms ανά μετάβαση ΕΥΚ και ο συνολικός χρόνος κύκλου ήταν 2,09 δευτερόλεπτα. Περίπου 8-10 σημεία δεδομένων αποκτήθηκαν ανά ανιχνεύθηκαν μεταβολίτη. Τα δείγματα παραδίδονται στο MS μέσω χρωματογραφίας κανονικής φάσης χρησιμοποιώντας ένα 2,0 χιλιοστά εσωτερική διάμετρος x 15 cm Luna στήλη NH2 HILIC (Phenomenex) σε 285 μL /min. Κλίσεις έτρεξαν ξεκινώντας από 85% ρυθμιστικό διάλυμα Β (HPLC βαθμού ακετονιτρίλιο) έως 42% Β από 0-5 λεπτά? 42% Β έως 0% Β από 5-16 λεπτά? 0% Β πραγματοποιήθηκε 16 με 24 λεπτά? 0% Β έως 85% Β 24-25 λεπτά? 85% Β κρατήθηκε για 7 λεπτά για την εκ νέου εξισορρόπηση της στήλης. Ρυθμιστικό Α αποτελούνταν από 20 mM υδροξείδιο του αμμωνίου /20 mM οξικό αμμώνιο (ρΗ = 9.0) σε 95: 5 νερό: ακετονιτρίλιο. Peak περιοχές από το συνολικό ρεύμα ιόντων για κάθε μετάβαση μεταβολίτη SRM ολοκληρώθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό MultiQuant v1.1 (ΑΒ /Sciex).

Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν ανά αριθμό κυττάρων. Μόνο μεταβολιτών που προσδιορίστηκαν σε όλες τις 6 δείγματα διατηρήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας MetaboAnalyst [21], [22].

Στατιστική ανάλυση

δεδομένα συστοιχία γονιδιακή έκφραση αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Με βάση την προηγούμενη εργασία μας [12], θα δοκιμαστεί για SIM2 ρύθμιση προς τα πάνω σε όγκους σε σχέση με τους ελέγχους με μια μονόπλευρη t-test και συγκρίνεται με ένα όριο p-τιμή του 0,05.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT -PCR).

Επικύρωση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων διεξήχθη με qRT-PCR. 200 ng RNA δείγματα υψηλής ποιότητας μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA πρώτου κλώνου και 1 μΐ cDNA χρησιμοποιήθηκε για κάθε φρεάτιο αντίδρασης RT-PCR. Τα δείγματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιήθηκε για δύο στάδια πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση επί όργανο Applied Biosystems 7900HT Prism. Οι αλληλουχίες εκκινητές PCR για στοχευμένη γονίδια φαίνονται στον Πίνακα S3. Οι αλληλουχίες για GAPDH: GAPDH-F (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC -3 ‘) και GAPDH-R (5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3’). αξία Η έκφραση του στοχευόμενου γονιδίου σε ένα δεδομένο δείγμα κανονικοποιήθηκε με την αντίστοιχη έκφραση του GAPDH. Το 2

-ΔΔCt μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό σχετική έκφραση των στοχευόμενων γονιδίων.

Αποτελέσματα

SIM2 γονίδιο εκφράζεται διαφορικά σε προστάτη φυσιολογική και προστατεκτομή καρκίνου και κυτταρικές σειρές

έχουμε αξιολογηθεί γονιδιακής έκφρασης SIM2 σε ένα σύνολο 24 φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων προστατεκτομή φαίνεται στον πίνακα 1. Επειδή υπάρχει SIM2 γονίδιο σε δύο ισομορφές, SIM2 σύντομη (SIM2s) και SIM2 καιρό (SIM2L), επιβεβαιώσαμε την έκφραση και των δύο ισομορφών σε RNA που εκχυλίζεται από προστατεκτομή με χρήση διακλαδισμένου τεχνική DNA (Σχήμα 1Α & amp?. 1Β). SIM2s και SIM2L παρουσίασαν σημαντική υπερέκφραση σε δείγματα όγκων σε σύγκριση με καλοήθη δείγματα, με p & lt? 0.000003 και η P & lt? 0.00005, αντιστοίχως. Ωστόσο, η αναλογία των SIM2s να SIM2L έκφραση ήταν καμία διαφορά μεταξύ καλοήθων και καρκινικών (πίνακας 1, Τ-test με ρ = 0,85). Η έκφραση SIM2s και SIM2L ήταν 7.03 και 6.95 φορές υψηλότερες αντίστοιχα στους όγκους συγκρίνοντας τα μέσα των δύο ομάδων μετά από προσαρμογή καταγραφής για να εξασφαλίσει την ομαλότητα και σταθερή διακύμανση εντός της κάθε ομάδας. Έκφραση των SIM2s και SIM2L αξιολογήθηκε επίσης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου τέσσερα ανθρώπινο προστάτη, PC3, LNCaP, DU145 και vCap, και στην κανονική κυτταρική σειρά επιθηλιακών προστάτη PrEC. Τόσο SIM2s και ισομορφές SIM2L ήταν εντόνως εκφρασμένο σε κύτταρα VCAP, ενώ υπήρχε ένα μέτριο επίπεδο έκφρασης σε κύτταρα PC3 και πολύ χαμηλή έκφραση σε DU145, LNCaP, και τα κύτταρα PrEC (Εικ. 1 C). Επειδή υπάρχουν μόνο λίγα διαθέσιμα αντισώματα για να SIM2, έχουμε μόνο ήταν σε θέση να προσδιορίσει με σαφήνεια την μικρή ισομορφή του SIM2 (SIM2s) σε κυτταρικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης με κηλίδα western. Αυτή η σπανιότητα των αντισωμάτων πολύπλοκο έργο μας για τη μελέτη της λειτουργίας της SIM2 μακριά ισομορφή. Το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης SIM2s ήταν σύμφωνο με έκφραση γονιδίου του σε προστάτη φυσιολογικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές. (Εικ. 1 D).

ποσοτική έκφραση της SIM2 βραχείας ισομορφής (Α) και SIM2 μακριά ισομορφή (Β) αξιολογήθηκαν με διακλαδισμένη τεχνική DNA σε 10 φυσιολογικούς και 14 δείγματα ανθρώπινου καρκίνου προστατεκτομή. Τα δεδομένα ποσοτικά με τη χρήση ALSA1 και HPRT ως ομαλοποίηση. (Γ) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης SIM2 βραχυπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα ισομορφές »στο ανθρώπινο προστάτη φυσιολογική και καρκινικές κυτταρικές σειρές με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα δεδομένα ποσοτικοποιήθηκαν με το ΔΔC

T μέθοδος και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH. Στήλη στο λευκό αντιπροσωπεύει SIM2 μικρή ισομορφή και στήλη σε γκρι αντιπροσωπεύει SIM2 μεγάλη ισομορφή. (Δ) κηλίδος Western διεξήχθησαν σε προστάτη φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών για SIM2s.

Η

Σίγαση έκφραση SIM2 στα κύτταρα PC3

Για να επιτευχθεί το υψηλότερο προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης SIM2 χρησιμοποιώντας λεντοϊού shRNA, έχουμε επιλέξει το PC3 κυτταρική σειρά ως πρότυπο. PC3 κύτταρα μετάγονται με πέντε διαφορετικούς φορείς έκφρασης SIM2 shRNA, εκ των οποίων τέσσερις (shRNA48, shRNA49, shRNA50 και shRNA51) παρουσίασαν σημαντική ανασταλτική δράση σε σύγκριση με τον έλεγχο Τα siRNAs. Πάνω από το 80% σίγηση της γονιδιακής έκφρασης επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας shRNA51 (σχήμα 2Α & amp?. Β). Δύο κυτταρικές γραμμές ελέγχου δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας είτε ένα φορέα που εκφράζει σταθερά λουσιφεράσης στόχευσης shRNA ή ένα άδειο φορέα. Ένα παρόμοιο πρότυπο αναστολής παρατηρήθηκε για γονιδιακή έκφραση σε αυτά τα SIM2L σταθερώς μολυσμένα κυτταρικές σειρές PC3. Ομοίως, αποτελεσματική παροδική σίγηση του SIM2S και SIM2L επετεύχθη σε PC3 (Εικόνα S1).

πραγματικού χρόνου RT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν (Α) και η έκφραση της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με κηλίδα western (Β). Έλεγχος 1: διάνυσμα λουσιφεράσης shRNA, Έλεγχος 2: διάνυσμα PLKO. sh48, sh49, sh50, sh50, SH51 και SH52: φορείς που εκφράζουν Τα siRNAs που στοχεύουν γονίδιο SIM2 σε διαφορετικές θέσεις. Στήλη με «*» αντιπροσωπεύει σημαντική αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης SIM2 από shRNA σε σύγκριση με τα δύο του ελέγχου 1 και ελέγχου 2 (P & lt? 0,05).

Η

Επιπτώσεις της SIM2 σίγηση στο γονίδιο προφίλ έκφρασης σε κύτταρα PC3

Παρά ύποπτο ρόλο της στον καρκίνο, πολύ λίγα είναι γνωστά για τη συμβολή του μεταγραφικού παράγοντα SIM2 για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [23]. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε τις επιδράσεις της προς τα κάτω ρύθμιση της SIM2 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Για το σκοπό αυτό, επιλέχθηκε ο shRNA που απέδωσε το υψηλότερο ποσοστό αποσιώπηση του SIM2, δηλ shRNA51. PC3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με shRNA51 συγκρίθηκαν με έναν έλεγχο shRNA (shRNAc).

προφίλ γονιδιακής έκφρασης των PC3 SIM2

χαμηλή και PC3 έλεγχο κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν με τη χρήση συστοιχίας Affymetrix GeneChip U133 (Plus 2.0 chip) που αποτελείται από & gt? 52.000 αντίγραφα από όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα μεταγραφές. Το σχήμα 1 είναι ένας χάρτης θερμότητας που δείχνει το γονίδιο απορύθμιση μετά από να χτυπήσει κάτω την έκφραση της SIM2 στα κύτταρα PC3. Η έκφραση ενός μεγάλου αριθμού των αντιγράφων παρουσίασαν αλλαγή τουλάχιστον 2-φορές (Σχήμα 3Α και στον Πίνακα S4). ανάλυση Pathway αποκάλυψε ότι πολλά υψηλά διαφορικά εκφραζόμενα μετάγραφα αντιπροσωπεύουν γονίδια τα οποία ανήκουν σε γνωστές μονοπάτια σηματοδότησης, όπως η ΡΤΕΝ και /ΑΚΤ μονοπατιών σηματοδότησης ΡΙ3Κ (Σχήμα 3Β), των οποίων η συμμετοχή σε ογκογένεση είναι καλά τεκμηριωμένη [24], [25]. Τα συγκεκριμένα γονίδια που εμπλέκονται σε κάθε οδό σηματοδότησης που φαίνονται στον Πίνακα S1. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, CCL5, MAPK1, Ρ38, DDR1 και ERK διαδραμάτισε κεντρικό ρόλο στο δίκτυο οδού (Εικόνα 4). Τα γονίδια σε αυτό το δίκτυο εμπλακεί σε κυτταρικό θάνατο, το μεταβολισμό, την κυτταρική ανάπτυξη, και την παρουσίαση του αντιγόνου του όγκου. Τα περισσότερα γονίδια που εμπλέκονται στα υψηλότερα σκορ δίκτυα που φαίνονται στον Πίνακα S2. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι μια σειρά από σημαντικές βιολογικές λειτουργίες που απορυθμίζεται μετά από SIM2 σίγηση (Σχήμα 3C). Είναι ενδιαφέρον, πολλές κυτταρικές λειτουργίες που σχετίζονται με το μεταβολισμό, όπως ο μεταβολισμός του φαρμάκου και μεταβολική νόσος, είναι μεταξύ των top κατατάσσονται λειτουργίες.

Α. Ελέγχου Α: λουσιφεράσης PC3 shRNA? Ελέγχου Β: διάνυσμα PC3 PLKO? SIM2 C: SIM2 sh48? SIM2 D: SIM2 SH51. γονιδιακή έκφραση ήταν είτε προς τα πάνω ή προς τα κάτω περισσότερο από 2 φορές στη SIM2

χαμηλή εισήχθησαν. Β Top απορυθμίζεται μονοπάτια σηματοδότησης σε SIM2

χαμηλή κύτταρα PC3. Γ Top απορυθμίζεται λειτουργίες των κυττάρων σε SIM2

χαμηλή κύτταρα PC3.

Η

Το δίκτυο αυτό περιλαμβάνονται 16 γονίδια εστίαση με σκορ 29. Διαφορετικά σχήματα του κόμβου αντιπροσωπεύουν διαφορετικές ομάδες των γονιδίων εστίασης. Η ένταση του χρώματος κόμβου έδειξε το βαθμό της πάνω (κόκκινο) και προς τα κάτω το επίπεδο έκφρασης (πράσινο) γονίδιο. Οι κορυφαίες λειτουργίες αυτού του δικτύου είναι κυτταρική κίνηση, η κυκλοφορία του ανοσοποιητικού κυττάρου, οργανικό τραυματισμό και ανωμαλίες.

Η

Επικύρωση με RT-PCR από μια ομάδα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (Πίνακας S3) εν μέρει επιβεβαιώθηκε μας in silico ανάλυση σταθερών και παροδικών κύτταρα επιμόλυνσης PC3 (Σχήματα 5 & amp? 6)

επικύρωση qRT-PCR του mRNA επίπεδα έκφρασης των μεμονωμένων γονιδίων διεξήχθη με δύο σταδίων πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση επί Applied Biosystems 7900HT Prism. όργανο. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? .001. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD.

Η

qRT-PCR επικύρωση των επιπέδων έκφρασης του mRNA των μεμονωμένων γονιδίων διεξήχθη με δύο σταδίων πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση επί Applied Biosystems 7900HT Prism όργανο. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? .001. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

PC3 SIM2

χαμηλή κύτταρα παρουσίασαν σημαντικές μεταβολές στο μεταβολικό προφίλ τους

Σας ζητείται να προσδιοριστεί αν οι αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης να οδηγήσει σε σημαντικές αλλαγές στις μεταβολικές οδούς σε PC3 SIM2

χαμηλή κύτταρα. Αυτό αντιμετωπίστηκε με τη μέτρηση 255 πολικούς μεταβολίτες χρησιμοποιώντας στοχευμένες φασματομετρία μάζας (LC /MS /MS). Σύγκριση της μεταβολικό προφίλ των κυττάρων ελέγχου προς shRNA-SIM2 επεξεργασμένα κύτταρα έδειξαν σημαντικές αλλαγές σε πολλές μεταβολικές οδούς και την παραγωγή του 39 μεταβολιτών (Πίνακες 2 & amp? 3). Η οδός μεταβολισμού της πουρίνης ήταν η κορυφή ενός απορυθμισμένη μονοπάτι με 11 μεταβολίτες σημαντικά επέκτασης ή υποβιβασμού ρυθμίζονται επίπεδα επί συνόλου 92 μεταβολιτών σε αυτή την οδό σε SIM2 φίμωση κύτταρα PC3. μονοπάτι μεταβολισμό πυριμιδίνης αναφέρονται ως το δεύτερο απορρυθμισμένη μονοπάτι με 6 από τους 60 συνολικά μεταβολιτών με σημαντικά αλλαγμένη επίπεδα (Πίνακας 2, Σχ. 7). Οι σημαντικές μεταβολές στον μεταβολισμό του νουκλεϊκού οξέος μπορεί να υποδεικνύει τον σημαντικό ρόλο της στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη.

Οι μεταβολίτες εκχυλίστηκαν από SIM2

κύτταρα χαμηλής και κανονικής PC3 με χρήση μεθανόλης και της αφθονίας των 239 μεταβολιτών μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας στοχευμένη LC /MS /MS. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό MetaboAnalyst. Οι μεταβολικές οδοί διατάσσονται σύμφωνα με τις βαθμολογίες από εμπλουτισμό ανάλυση (άξονας Υ) και από την ανάλυση τοπολογία (άξονας χ). μετρήσεις τριπλούν έγιναν.

Η

Η

Συζήτηση

Σε προηγούμενες προσπάθειες για την αναγνώριση των βιοδεικτών μας, έχουμε εντοπίσει SIM2 ως πιθανό βιοδείκτη για την PCA. Χάρη στην υπερέκφραση της σε όγκους του προστάτη και εξαιρετικά περιορισμένη έκφρασή της σε ανθρώπους, προτείναμε να χρησιμοποιήσετε SIM2 ως στόχο την ανοσοθεραπεία και ήταν σε θέση να προσδιορίσουν 5 HLA-A2.1, SIM2 που προέρχονται ανοσογόνα επιτόπια [12]. Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να χαρακτηρίσει τον ρόλο της SIM2 στον καρκίνο του προστάτη χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση σίγηση μικρή φουρκέτα RNA επαγόμενη γονιδίων σε κύτταρα PC3 ως μοντέλο. Εστιάσαμε σε προφίλ τόσο το μεταγραφικό και μεταβολιτών σε SIM2

χαμηλά και φυσιολογικά κύτταρα PC3, και αξιολόγησε τον αντίκτυπο της SIM2 σιγαστήρα στην κυτταρική σηματοδότηση και τη λειτουργία.

Η ισομορφή SIM2s έχει αναφερθεί ότι εκφράζεται στο παχύ έντερο , οι όγκοι του παγκρέατος, του προστάτη και ενώ απουσιάζει στους αντίστοιχους καλοήθεις ιστούς [8]. Βρήκαμε ότι τα γονίδια SIM2 είναι ανιχνεύσιμα σε όλες αυτές τις κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε πραγματικό χρόνο PCR. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης σε DU145 και LNCaP είναι σχετικά χαμηλότερη από ό, τι άλλα κύτταρα καρκίνου του προστάτη, ενώ τα κύτταρα PC3 εκφράζουν μέτριο επίπεδο SIM2 γονίδια που είναι συνεπείς με τις άλλες έκθεση [14].

Το όλο το φάσμα της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης από ο παράγοντας μεταγραφής SIM2 εξακολουθεί να είναι ακαθόριστα. Το επίπεδο της ρύθμισης θα μπορούσε να αντικατοπτρίζεται από τη διαφορική έκφραση των περίπου 200 γονίδια, όπως αποκαλύπτεται μέσα από προφίλ γονιδιακής έκφρασης των PC3 SIM2

χαμηλή κύτταρα. Άλλες ομάδες έχουν αναφέρει συγκεκριμένα γονίδια που ρυθμίζονται από SIM2. Οι /μεταγραφικού παράγοντα ΠΑΣ bHLH ενιαίο minded 2s αναφέρθηκε στην προώθηση του μαστικού αδένα λακτογόνων διαφοροποίηση από τον κανονισμό της Csn2 έκφρασης [26]. SIM2 ρυθμίζει την έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΤΙΜΡ-2, η οποία οδηγεί το ρόλο της σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος [11]. SIM2s καταστέλλει BNIP3, ένα προ-αποπτωτικών γονιδίων, μέσα από το στοιχείο της υποξική απόκριση σε κύτταρα PC3 [14]. Το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης μας στο PC3 SIM2

χαμηλή κύτταρα παρουσίασαν σημαντική αλλαγή στην PTEN, PI3K /AKT και ΤοΙΙ (TLR) οδών που εμπλέκονται σε μεγάλο βαθμό στην εξέλιξη του όγκου σηματοδότησης. ΡΤΕΝ ελέγχει αρνητικά την οδό σηματοδότησης της ΡΙ3Κ για την κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση με αποφωσφορυλιώσεως των 3 θέση του φωσφοϊνοσιτιδίων [24], [25]. TLR ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση και την κεντρική μόρια σηματοδότησης που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και ΡΙ3Κ παίζουν ρόλους κλειδιά [27]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η αναστολή του γονιδίου Sim2 στα κύτταρα PC3 επηρεάζει την έκφραση πολλών γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που είναι οργανωμένες σε ένα δίκτυο γύρω από p38MAPK. Αυτές οι πρωτεΐνες, οι οποίες περιλαμβάνουν CCL5, MAPKs, ERK και DDR1 (Σχήμα 4), έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται στην ανάπτυξη του όγκου. Η CCL5 χημειοκίνης έχει αναφερθεί ότι εκφράζεται από κύτταρα του προστάτη και να επηρεάσει την ανάπτυξη και την επιβίωσή τους. Μετά την ενεργοποίηση του MAPKs p38 και ERK1 /2 σε κύτταρα LNCaP, η έκφραση των αυξήσεων CCL5, έχοντας σαν αποτέλεσμα αυξημένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων [28], [29]. πολλαπλασιασμό των PC3 κυττάρων και εισβολή επίσης κατέστειλε σημαντικά μετά DDR1 νοκ ντάουν από siRNA [30], [31].

Τα στοιχεία μας RT-PCR αποκάλυψε διαφορές μεταξύ παροδική και σταθερή αποσιώπηση της SIM2 στα κύτταρα PC3. Αυτό μπορεί να είναι αποτέλεσμα 1) την παρουσία των δύο ισομορφών της SIM2 που σιγήσει σε διαφορετικό βαθμό και στις δύο ρυθμίσεις, ή 2) SIM2 μπορούν να ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση άλλων γονιδίων είτε άμεσα είτε έμμεσα.

Ανάλυση λειτουργίας και αποκάλυψε ότι τρεις λειτουργίες που σχετίζονται με το μεταβολισμό των κυττάρων είχε απορυθμίζεται στα χαμηλά κύτταρα PC3 SIM2

. Αυτό πρότεινε ότι SIM2 θα μπορούσε να έχει συνέπειες μεταβολισμού. Έχουμε αξιολογήσει την παραγωγή με PC3 κύτταρα 255 μεταβολιτών που περιλαμβάνουν ένα μεγάλο αριθμό οδών ανθρώπινης μεταβολικών. Από αυτά, τα δεδομένα ελήφθησαν για 239 μεταβολίτες. Η ανάλυσή μας έδειξε σημαντικές αλλαγές σε μεταβολίτες που αποτελούν κλειδί οδούς, όπως οι οδοί πουρίνης και πυριμιδίνης.

Καταστολή της SIM2 βραχείας ισομορφής (SIM2s) με αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια μειωμένη ανάπτυξη του όγκου σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου και επάγεται Capan-1 παγκρεατικού κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης [7], [8], [9]. SIM2s αναφέρθηκε επίσης να είναι μια επιθετική βιοδείκτης του καρκίνου του προστάτη από το SIM2s πρωτεΐνη συνδέθηκε με αυξημένο ειδικό αντιγόνο προστάτη προεγχειρητική ορού (PSA), υψηλής ποιότητας ιστολογικό, διεισδυτική ανάπτυξη όγκου και αυξημένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [13]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι SIIM2s μπορεί να μετριάσει τις διαδικασίες κυτταρικού θανάτου μέσω BNIP3 καταστολή στην PC3AR + κύτταρα. Ωστόσο, knockdown του SIM2s σε κύτταρα καρκίνου του μαστού MCF-7 αυξημένη ογκογένεση και έτσι έδειξαν δραστηριότητα καταστολέα όγκου [32], [33]. Οι περισσότερες από τις προηγούμενες μελέτες επικεντρώθηκαν στις SIM2s είτε απρόσκλητος ή εξουδετέρωση των SIM2s, μας λείπουν τα στοιχεία αποσαφήνιση του λειτουργικού ρόλου της SIM2 πρωτεΐνης, συμπεριλαμβανομένων τόσο των ισομορφών του. Η μελέτη μας ανέφερε ένα συνδυασμένο ρόλο των δύο ισομορφών της SIM2 εμπλέκονται στην κυτταρική καρκίνου του προστάτη. Η διάκριση των ρόλων των SIM2s και SIM2L μπορεί να έχουν πιο βαθιά έννοια για να κατανοήσουν το λειτουργικό ρόλο της SIM2 στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, το οποίο είναι το επόμενο βήμα μας για να αποκαλύψει μεγαλύτερη σημασία αυτού του γονιδίου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1 .

Παροδική αποσιώπηση των SIM2s και SIM2L έκφρασης σε κύτταρα PC3. PC3 κύτταρα μετάγονται είτε με ένα μάρτυρα (Ctrl) ή shRNA51 (SH51) και καλλιεργήθηκαν με την παρουσία πουρομυκίνης για 3 ημέρες. Real time RT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν για την αξιολόγηση γονιδιακή έκφραση των SIM2 s (άνω τμήμα) και SIM2L (κάτω πίνακας)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028837.s001

(ΔΕΘ)

Πίνακας S1.

η κορυφή κακή ρύθμιση μονοπάτια σηματοδότησης σε SIM2

χαμηλή κύτταρα. Top δυσρυθμισμένη κανονική οδοί αναγνωρίσθηκαν μέσω της ανάλυσης των διαφορικά εκφρασμένων δεδομένων γονιδίων, χρησιμοποιώντας το πακέτο Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028837.s002

(DOC)

Πίνακας S2.

Τα μόρια στις υψηλότερες Δίκτυα Σκορ στο SIM2

χαμηλή κύτταρα. Δεδομένα που αντιπροσωπεύουν διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων υποβλήθηκαν σε πακέτο Ingenuity Pathway Ανάλυση και δικτύων υψηλής βαθμολογίας εντοπίστηκαν

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028837.s003

(DOC)

Πίνακα S3.

Κατάλογος εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για RT-PCR ποσοτικοποίηση της έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Pimer3:. https://frodo.wi.mit.edu/primer3/

doi: 10.1371 /journal.pone.0028837.s004

(DOC)

Πίνακας S4.

γονιδιακή έκφραση που ήταν είτε πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται μεγαλύτερη από 2 φορές στη SIM2

χαμηλή

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028837.s005

(XLSX)