Abstract

Η ενεργοποίηση των υποδοχέων NOTCH στηρίζεται στην ενδοκυτταρική πρωτεόλυση τους από το σύμπλοκο γ-εκκριτάσης. Η διάσπαση αυτή απελευθερώνει την εγκοπή ενδοκυτταρική περιοχή (NIC) επιτρέποντας έτσι την μετατόπιση του NIC προς τον πυρήνα για τη συναρμολόγηση σε μια μεταγραφική πλατφόρμα. Λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με τα κανονιστικά μέτρα που δραστηριοποιούνται στην NIC μετά την απελευθέρωσή της από τον διαμεμβρανικό υποδοχέα μέχρι τη σύνδεσή του με την μεταγραφική εταίρους. Παρεμβαίνοντας με αυτά τα κανονιστικά μέτρα θα μπορούσαν ενδεχομένως να επηρεάζει την πυρηνική έκβαση της σηματοδότησης Notch. Στο παρόν, έχουμε αναπτύξει ένα αξιόπιστο μοντέλο για τη μελέτη των μοριακών γεγονότων που συμβαίνουν μετά την διάσπαση Notch 1. Σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, παλμός ενεργοποίησης Notch 1 οδήγησε σε αυξημένη έκφραση των γονιδίων στόχων NOTCH δηλαδή HES1 και c-myc. Εμείς αποκάλυψε ότι, μετά την απελευθέρωση του, το Notch 1 ενδοκυτταρική περιοχή, Nic1, υποβάλλεται σε μια σειρά από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που περιλαμβάνουν φωσφορυλίωση. Πιο ενδιαφέρον είναι, βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού /ERK ΜΕΚ προάγει έκφραση HES1. Η αναστολή του συμπλόκου γ-εκκριτάσης εμπόδισε την MEK /ERK που επάγεται έκφραση HES1 υποδηλώνοντας μια εγκοπή-εξαρτώμενο μηχανισμό. Τέλος, τα υψηλότερα επίπεδα από Nic1 είχαν βρεθεί ότι σχετίζονται με τους εταίρους της μεταγραφής του [CBF1, Su (H) και LAG-1] (CSL) και MASTERMIND-LIKE 1 (MAML1) κατά την ενεργοποίηση ΜΕΚ /ERK παρέχοντας ένα δυναμικό μηχανισμό με τον οποίο ο MEK /ERK μονοπάτι προάγει έκφραση των γονιδίων στόχων Notch. Για πρώτη φορά, τα δεδομένα μας εκτίθεται ένα σηματοδοτικό μονοπάτι, δηλαδή τον /ERK μονοπάτι ΜΕΚ που επηρεάζει θετικά στην NOTCH πυρηνική αποτέλεσμα.

Παράθεση: Tremblay Ι, Pare Ε, Arsenault D, Douziech Μ, Boucher M-J (2013) Η MEK /ERK Διαδρομή Προωθεί ΕΓΚΟΠΗ σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (12): e85502. doi: 10.1371 /journal.pone.0085502

Επιμέλεια: Irina V Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 του Αυγούστου 2013? Αποδεκτές: 27 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Tremblay et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (IC1-102949 και MOP-106456 σε MJB). MJB είναι ένας λόγιος από το Fonds de Recherche Santé Κεμπέκ (FRQ-S) και μέλος της FRQ-S-χρηματοδοτείται Centre de Recherche Clinique Étienne-Le Bel. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι υποδοχείς ΕΓΚΟΠΗ ενορχηστρώσει μια σειρά από αναπτυξιακές διαδικασίες, εκτός από την εξασφάλιση της ομοιόστασης των ενηλίκων ιστού [1,2]. Αυτή η εξαιρετικά διατηρημένη μονοπατιού σηματοδότησης έχει μια σχετικά απλή μοριακή αρχιτεκτονική. Την δέσμευση συνδέτη, οι υποδοχείς διαμεμβράνης εγκοπή (NOTCH 1-4) υποβάλλονται σε διαδοχική διασπάσεις με ADAM-μεταλλοπρωτεάσες και το σύμπλοκο γ-εκκριτάσης. Η τελευταία, εμποδίζεται από τους αναστολείς γάμμα-εκκριτάσης, απελευθερώνει Notch ενδοκυττάριας περιοχής (NIC) που είναι ελεύθερο να μετατοπίζεται προς τον πυρήνα να συνεργαστεί με την πρωτεΐνη δέσμευσης DNA [CBF1, Su (H) και LAG-1] (CSL) και ο συν-ενεργοποιητής MASTERMIND-LIKE 1 (MAML1) για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Τα καλύτερα χαρακτηρίζεται γονιδίων στόχων του μονοπατιού ΕΓΚΟΠΗ είναι σίγουρα μέλη του τριχωτού ενισχυτή SPLIT (HES) οικογένεια, οι ίδιοι ρυθμιστές της μεταγραφής [1-3]. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του μονοπατιού σηματοδότησης εγκοπή έτσι ο διπλός ρόλος του υποδοχέα δηλ ανίχνευσης του σήματος και την επίτευξη της απόκρισης. Λίγα είναι γνωστά για τα κανονιστικά μέτρα που δραστηριοποιούνται στην NIC μετά την απελευθέρωσή της από τον υποδοχέα διαμεμβρανική στη δράση της μεταγραφής του. Ωστόσο, η πυρηνική έκβαση της σηματοδότησης εγκοπής, κατά πάσα πιθανότητα, ελέγχονται αυστηρά, προκειμένου να διασφαλιστεί η ακριβής ρύθμιση της ισχύος του σήματος και τη διάρκεια. Περαιτέρω μελέτες είναι έτσι σαφώς απαιτούνται για να διαλευκάνουν τους μηχανισμούς με τους οποίους το διασπασμένο υποδοχέα συντονίζει τη γονιδιακή έκφραση. Επιπλέον, ο εντοπισμός των πιθανών ρυθμιστή σηματοδότησης ΕΓΚΟΠΗ θα πρέπει να βελτιώσει την κατανόησή μας για αυτή την προφανή απλοϊκή οδού.

Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση ΕΓΚΟΠΗ φάνηκε να παίζει σημαντικό ρόλο στις αιματολογικές κακοήθειες [4] και ορισμένων συμπαγών όγκων [2], όπως πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDA). Πράγματι, η επανενεργοποίηση της σηματοδότησης NOTCH παρατηρείται νωρίς στην παθογένεση PDA και παραμένει καθ ‘όλη τη πρόοδο της νόσου [5-8]. αλληλούχιση exome ιστών ανθρώπινης PDA παρέχονται περαιτέρω στήριξη ενός κρίσιμο ρόλο για τη σηματοδότηση Notch σε παγκρεατικά καρκινογένεση [9]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο αποκλεισμός του Notch σηματοδότηση με αναστολέα γ-εκκριτάσης απέτρεψε την εξέλιξη προκακοήθων αλλοιώσεων του παγκρέατος σε PDA σε ένα μοντέλο ποντικού της KRAS επαγόμενης PDA [10,11]. Αξίζει να σημειωθεί, KRAS κατάντη σηματοδότησης παίζει κρίσιμο ρόλο σε παγκρεατικά καρκινογένεση ως ογκογόνο μετάλλαξη στο γονίδιο KRAS βρίσκονται στο 95% του PDA [9,12]. Επιπλέον, η μειωμένη σηματοδότηση Notch σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές συσχετίζεται με μειωμένη ρυθμούς πολλαπλασιασμού, αυξημένη απόπτωση, μειωμένη ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και μειωμένη ιδιότητες εισβολή [11,13-16]. Αυτή η σύνδεση μεταξύ των Notch και σηματοδότηση RAS δεν είναι μοναδική σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Πράγματι, RAS και σηματοδότηση ΕΓΚΟΠΗ έδειξαν να συνεργαστούν για την προώθηση καρκινογένεση στα καρκινικά κύτταρα του μαστού, μελάνωμα και λευχαιμία [17-19]. Σε παγκόσμιο επίπεδο, με στόχο τη σηματοδότηση ΕΓΚΟΠΗ φαίνεται μια ελκυστική νέα θεραπευτική στρατηγική ειδικά για τους ασθενείς PDA [20]. Ωστόσο, μια καλύτερη κατανόηση της διαδρομής είναι κρίσιμο για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αναστολέων ή /και ανταγωνιστές NOTCH αφού αναστολείς γάμμα-εκκριτάσης, αν και χρήσιμα, δεν είναι Notch συγκεκριμένες και αδιακρίτως επηρεάσουν όλες οι οδοί σηματοδότησης που ρυθμίζονται από το σύμπλοκο γ-εκκριτάσης εκτός υποκίνηση γαστρεντερική τοξικότητα [21-23].

Σε αυτή τη μελέτη, θα αξιοποιηθεί ένα αξιόπιστο μοντέλο για τη μελέτη των μοριακών γεγονότων που συμβαίνουν μετά τη διάσπαση του υποδοχέα διαμεμβρανική Notch 1 μέχρι το πυρηνικό εντοπισμό της διασπαστεί κομμάτι Notch1 (Nic1). Εμείς αποκάλυψε ότι, μετά την απελευθέρωση της, Nic1 υφίσταται ιεραρχική φωσφορυλίωση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που συσχετίζεται με την έκφραση των γονιδίων στόχων NOTCH όπως HES1. Πιο ενδιαφέρον είναι, βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού /ERK ΜΕΚ προάγει έκφραση HES1 μέσω μηχανισμών NOTCH-εξαρτώμενη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και διαδικασία ενεργοποίησης ΕΓΚΟΠΗ

Το τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3 ΗΕΚ293Τ και ελήφθησαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Για να επάγουν έναν παλμό ενεργοποίησης Notch, προσθέσαμε αιθυλενογλυκόλη-δις (2-αμινοαιθυλαιθέρας) –

Ν, Ν, Ν

‘,

Ν’-τετραοξικό οξύ

(EGTA) (4 mM) επί 15 λεπτά για να εκθετικά αυξανόμενη MIA κύτταρα PaCa-2. EGTA στη συνέχεια απομακρύνθηκε με αντικατάσταση του μέσου με φρέσκο ​​μέσο κανονικό καλλιέργειας (ϋΜΕΜ).

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

Το ειδικό αντίσωμα που αναγνωρίζει μόνο την διασπάται Notch 1 (D3B8) (Nic1) ελήφθη από την Cell Σηματοδότηση. Αντισώματα έναντι διπλής φωσφορυλιωμένη (ενεργό) ERK1 /2 (pERK1 /2), CSL, MAML1 και GAPDH αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling. HES1 αντίσωμα ήταν από Abcam. Αντισώματος για την ανίχνευση του συνόλου των ERK1 /2 ήταν από την Santa Cruz. MYC και ΗΑ αντισώματα ελήφθησαν από την Roche. Η γ-σεκρετάσης αναστολέα Ν- [Ν- (3,5-Difluorophenacetyl-L-αλανυλ)] – S-φαινυλγλυκίνη

t

βουτυλεστέρας (DAPT) και το ΜΕΚ1 /2 αναστολέα U0126 αγοράστηκαν από την Calbiochem . Όλα τα άλλα υλικά ήταν από την Sigma, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Western Blot

Όπως προηγουμένως δημοσιευθεί [24], τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό Triton (1% Triton Χ-100, 50 mM Tris ρΗ 7.5, 100mM NaCl, 5mM EDTA, 0.2 mM ορθοβαναδικό, 40mM β-γλυκεροφωσφορικό, 50 mM φθοριούχο νάτριο, 10% γλυκερόλη, 1 mM PMSF, 0.5μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη και 0.5μg /ml απροτινίνης) και απαλλάχθηκε από τα κυτταρικά θραύσματα με φυγοκέντρηση. Ίση ποσότητα πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου) και οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν ανοσολογικά μετά ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης.

παροδικές επιμολύνσεις

Τα πειράματα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24-26]. Εν συντομία, κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Ο φορέας που κωδικοποιεί ένα MYC-tagged εκδοχή της κυτταροπλασματικής περιοχής του ποντικού

Notch 1

(ΠΛΟΙΑ-Nic1) λήφθηκε από Addgene (πλασμίδιο 15.131). ΗΑ-tagged αγρίου τύπου ΜΕΚ1 (ΜΕΚ1 WT) και ουσιαστικά δραστική μεταλλαγμένη του ΜΕΚ1 (ΜΕΚ1 CA) που κωδικοποιεί cDNA που προσεφέρθησαν ευγενώς από τον Ν Rivard (Université de Sherbrooke, Καναδάς) και είχαν περιγραφεί προηγουμένως [27]. Τα κύτταρα λύθηκαν είκοσι-Μετά τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση και προετοιμάστηκε για στύπωμα western.

Ανοσοκαταβύθιση, φωσφατάση και κινάση δοκιμασίες

ανοσοκαθιζήσεις πραγματοποιήθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25,26]. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Triton και απαλλάχθηκε από τα κυτταρικά θραύσματα με φυγοκέντρηση. Πρωτογενής αντίσωμα προστέθηκε σε 2 mg εκκαθαρίζονται κυτταρικά λύματα και επωάστηκαν για 3 ώρες στους 4 ° C υπό ανάδευση. Η ενδογενής Nic1 ανοσοκατακρημνίστηκε χρησιμοποιώντας το αντι-διασπάται Notch 1 (Nic1) αντίσωμα ενώ το αντίσωμα αντι-MYC χρησιμοποιήθηκε για να ανοσοκαθιζάνει το υπερεκφρασμένο Nic1 (MYC-tagged). Protein G-Sepharose (GE Healthcare) στη συνέχεια προστέθηκε για 1 ώρα στους 4 ° C υπό ανάδευση. Ανοσοσύμπλοκα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο ρυθμιστικό Triton. Στη συνέχεια, ανοσοσύμπλοκα είτε αποσυναρμολογηθεί με προσθήκη ρυθμιστικού δείγματος 4Χ Laemmli (1Χ = 62,5 mM Tris-HCl ρΗ 6,8, 2,3% SDS, 10% γλυκερόλη, 1 mM PMSF, 0,005% κυανούν βρωμοφαινόλης και 5% β-μερκαπτοαιθανόλη) ή να χρησιμοποιούνται για φωσφατάση και δοκιμασίες κινάσης.

Για δοκιμασίες φωσφατάση, ανοσοσυμπλέγματα πλύθηκαν περαιτέρω δύο φορές με 1Χ πακέτο NEBbuffer για Πρωτεΐνη MetalloPhosphatase (New England Biolabs Inc.) συμπληρωμένο με 1 mM ΜηΟΙ

2 και 1 mM PMSF, 0.5μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml pepstatin και 0,5 μg /ml απροτινίνη. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια εξίσου χωρίζονται σε δύο σωλήνες Eppendorf. 400 μονάδες πρωτεΐνης λάμδα φωσφατάσης (New England Biolabs Inc.) προστέθηκαν σε ένα από αυτά και οι δύο σωλήνες επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 30 ° C. Η αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη ρυθμιστικού δείγματος 4Χ Laemmli.

Για τις δοκιμασίες κινάσης, Triton-πλύθηκε ανοσοσύμπλοκα πλύθηκαν περαιτέρω δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης ERK1 (25mM Tris ρΗ 7,5, 0.02mM EGTA, 0,2 mM ορθοβαναδικό, 1 mM PMSF, 0.5μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη και 0,5 μg /ml απροτινίνης). Τα σφαιρίδια στη συνέχεια εξίσου χωρίζονται σε δύο σωλήνες Eppendorf και επωάζονται 30 λεπτά στους 30 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης ERK1 συμπληρωμένο με οξικό 10 mM μαγνήσιο, 0.1 mM ΑΤΡ και 2 μΟί [γ-

32Ρ] που περιέχει ΑΤΡ ή όχι 0.1 μg του δραστικού ERK1 ( Millipore). Η αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη ρυθμιστικού δείγματος 4Χ Laemmli. Ραδιοσημασμένη Nic1 διαχωρίστηκε με SDS-PAGE και υποβάλλονται σε επεξεργασία για αυτοακτινογραφία.

Παρουσίαση Δεδομένων

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τυπικές Western κηλίδες εμφανίζονται. Η πυκνομετρική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J 1.42.

Αποτελέσματα

αποσιδήρωσης

Το ασβέστιο ενεργοποιεί το

υποδοχέα Notch 1

Για την έγκαιρη ενεργοποίηση μελέτη Notch1, θα αξιοποιηθεί ένα μοντέλο που επιτρέπει τη σύγχρονη ενεργοποίηση του υποδοχέα Notch 1. Λόγω της φύσης των υποδοχέων NOTCH τα οποία αποτελούνται από δύο υπομονάδες συγκρατούνται μεταξύ τους μη ομοιοπολικά με ασβέστιο-εξαρτώμενη αλληλεπιδράσεις [1,2], είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι διασπάται εξάντληση ασβεστίου και ενεργοποιεί τους υποδοχείς NOTCH [28]. Η στρατηγική αυτή αποδείχθηκε μια αξιόπιστη μέθοδο για την ενεργοποίηση ΕΓΚΟΠΗ [29-34]. Ως εκ τούτου, προχωρήσαμε σε έναν παλμό ενεργοποίησης NOTCH εκθέτοντας παγκρεατικών κυττάρων Notch 1 που εκφράζουν τον καρκίνο στον EGTA χηλικοποιητή ασβεστίου. Όπως ήταν αναμενόμενο, 15 λεπτά με παλμό EGTA κατέληξε σε διάσπαση του υποδοχέα [28,31] που οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του διασπασμένου Nic1 θραύσμα (Σχήμα 1Α). Μετά την έκθεση EGTA, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επέστρεψαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους (δηλαδή, 30 έως 240 λεπτά) στην κανονική καλλιεργημένα κατάστασή τους, το οποίο περιείχε ασβέστιο. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης των γονιδίων στόχων Nic1 HES1 και c-MYC παρατηρήθηκαν, αν και με ελαφρώς διαφορετικό χρονικό προφίλ (Σχήμα 1Α). Η παρατήρηση αυτή είναι σε συμφωνία με μια πρόσφατη μελέτη που αποδεικνύει διακριτά προφίλ RNA του Notch γονιδίων που αποκρίνονται? μέλη του

E

(

spl

) οικογένεια γονιδίων (οι

Drosophila

ομόλογα του ανθρώπινου

HES

οικογένεια) είναι μοναδικό στην ταχύτητα του τους απόκριση στην ενεργοποίηση NOTCH [30].

Α. κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 αφέθηκαν χωρίς αγωγή (-) ή επεξεργασμένα με EGTA (4 mM) για 15 λεπτά (+). μέσον EGTA περιέχον απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με κανονικό μέσο καλλιέργειας (Ca

2+) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Β κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 προκατεργάστηκαν (+) ή όχι (-) με DAPT (25μΜ) για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε EGTA (4 mM) για 15 λεπτά (+). μέσον EGTA περιέχον απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με κανονικό μέσο καλλιέργειας (Ca

2+) που περιέχει DMSO (-) ή DAPT (25μΜ) για 90 λεπτά. κύτταρα C. ΜΙΑ PaCa-2 αφέθηκαν χωρίς αγωγή (-) ή επεξεργασμένα με EGTA (4 mM) για 15 λεπτά (+). μέσον EGTA περιέχον απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με κανονικό μέσο καλλιέργειας (Ca

2+) που περιέχει DMSO ή ακτινομυκίνη D (1 μg /ml) για τους υποδεικνυόμενους χρονικές περιόδους. αναλύσεις κηλίδος Western πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση των κατάλληλων αντισωμάτων.

Η

Για την υποστήριξη των μηχανισμών NOTCH εξαρτώμενη εμπλέκονται στην έκφραση HES1 EGTA επαγόμενη, έχουμε προ-επεξεργασμένα των κυττάρων με τον αναστολέα DAPT γ-εκκριτάσης, γνωστή για να εμποδίσει τη διάσπαση Notch. Προ-επεξεργασία των κυττάρων με DAPT απέτρεψε την EGTA επαγόμενη Nic1, HES1 και εκφράσεις πρωτεΐνη c-myc (Σχήμα 1 Β και δεδομένα δεν παρουσιάζονται) υποστηρίζουν ότι οι επιπτώσεις EGTA HES1 έκφραση μέσω ενεργοποίησης των υποδοχέων Notch. Επίσης, η προσθήκη του αναστολέα της μεταγραφής ακτινομυκίνη D έκθεση εξής EGTA δεν επηρεάσει σημαντικά την EGTA επαγόμενη έκφραση Nic1 αλλά απέτρεψαν έκφραση του HES1 και c-MYC (Σχήμα 1C και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας είναι σύμφωνα με ό, τι έχει προηγουμένως αποδειχθεί σε άλλες κυτταρικές σειρές [29-34] δηλαδή παροδική έκθεση σε EGTA οδηγεί στην ενεργοποίηση Notch 1 απελευθερώνοντας το ενδοκυτταρικό Nic1 τομέα, επιτρέποντάς της να μετατοπίζεται προς τον πυρήνα να διαμορφώνει τη μεταγραφή γονιδίων . Υποκυτταρική κλασματοποίηση επιβεβαίωσε ότι Nic1 ανευρίσκεται κυρίως μέσα στον πυρήνα μετά από έκθεση EGTA (Σχήμα S1).

Nic1 φωσφορυλιώνεται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Είναι ενδιαφέρον, ανιχνεύσαμε διαφορετικές μορφές μοριακού βάρους Nic1 μετά από ένα παλμό ενεργοποίησης Notch1 από EGTA με τις μορφές, κυρίως υψηλού μοριακού βάρους σταδιακά παρατηρείται πάροδο του χρόνου (Σχήμα 1Α ). Αξίζει να σημειωθεί, 240 λεπτά μετά την έκθεση EGTA, Nic1 έκφραση επέστρεψε σε επίπεδα συγκρίσιμα με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα υποδηλώνει μια γρήγορη εναλλαγή των Nic1 μετά την δράση της μεταγραφής του. Κατά συνέπεια, HES1, μια βραχύβια πρωτεΐνη [3], εκφράστηκε μόνο παροδικά, και κορυφώθηκε σε 90-120 λεπτά μετά την έκθεση EGTA και επιστρέφοντας σχετικά με τα επίπεδα ελέγχου μετά από 240 λεπτά.

Για να εξηγήσει το διαφορετικό προφίλ μοριακού βάρους Nic1, ελέγξαμε εάν Nic1 υποβάλλεται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις μετά την απελευθέρωσή της από τον διαμεμβρανικό υποδοχέα. Πιο συγκεκριμένα, αναλύσαμε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης Nic1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα δηλαδή ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές εμφανίζουν βασική ενεργοποίηση του υποδοχέα Notch 1 όπως δηλώνεται από την έκφραση του διασπασμένου Nic1 θραύσμα Notch 1 (Σχήμα 2). Αξίζει να σημειωθεί, εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 εμφανίζουν χαμηλότερο επίπεδο ενεργοποίησης Notch 1 σε σύγκριση με BxPC-3. δοκιμασίες Φωσφατάση αποκάλυψε ότι Nic1 φωσφορυλιώνεται σε εκθετικά αυξανόμενη ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3 κύτταρα (Σχήμα 2). Επιπλέον, ακολούθησε η ενεργοποίηση Notch 1 EGTA επαγόμενη σε ΜΙΑ PaCa-2, Nic1 βρέθηκε βασικά σε μια φωσφορυλιωμένη κατάσταση (Σχήμα 2).

Nic1 ανοσοκαταβυθίστηκε (IP Nic1) από το σύνολο των προϊόντων λύσεως των εκθετικά αυξανόμενης ΜΙΑ PaCa-2 (MIA), ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με EGTA (4 mM) για 15 λεπτά και στη συνέχεια επέστρεψαν στα φυσιολογικά μέσα καλλιέργειας τους για 90min, ή εκθετικά αυξανόμενη BxPC-3 (Βχ). Μετά Nic1 ανοσοκαταβύθιση, δοκιμασίες φωσφατάση διεξήχθησαν (+) χρησιμοποιώντας το φωσφατάση λάμδα (λ φωσφατάση). Η Nic1 IP δεν επωάζονται με το φωσφατάση λάμδα ενδείκνυται ως pNIC1. Ένας εκπρόσωπος κηλίδα Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ενάντια Nic1 εμφανίζεται.

Η

Στην προσπάθεια μας για τον εντοπισμό δυνητικών κινάσες που ρυθμίζουν φωσφορυλίωση Nic1, προχωρήσαμε σε μεταβατικές επιμολύνσεις σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μορφές υψηλότερου μοριακού βάρους ενός εξωγενούς Nic1 όταν τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με ένα συστατική δραστική μορφή του ΜΕΚ1 (ΜΕΚ1 CA) που οδηγούν στην ενεργοποίηση 2 ERK1 /(Σχήμα 3Α). δοκιμασίες Φωσφατάση στοιχεία που αποδεικνύουν ότι Nic1 φωσφορυλιώνεται όταν εκφράζεται σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ (Σχήμα 3Β αριστερά, Nic1 + ΜΕΚ1 WT). Ωστόσο, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης Nic1 αυξήθηκαν σημαντικά όταν η οδός /ΕΚΚ ΜΕΚ ενεργοποιείται με την παρουσία ενός ΜΕΚ1 CA (Σχήμα 3Β δεξιά). Παρόμοια Nic1 μέλη φωσφορυλίωση ανιχνεύθηκαν όταν τα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με ένα ογκογόνο RAS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η οδός MEK /ERK θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του Nic1. Η ERK1 /2 είναι καλά γνωστές σε φωσφορυλιώνει έναν αριθμό των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων μετεγγραφικών ρυθμιστών [35,36]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε εάν Nic1 θα μπορούσε να είναι ένας άμεσος στόχος της ERK1 /2. Είναι ενδιαφέρον, ένα ενεργό ERK1 ήταν σε θέση να φωσφορυλιώνει Nic1 σε

in vitro

δοκιμασίες κινάσης (Σχήμα 3C). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Nic1 είναι φωσφορυλιωμένη σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Σύμφωνα με την παρατήρηση μας ότι Nic1 φωσφορυλίωσης αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου μετά την έκθεση EGTA ταυτόχρονη μείωση στην έκφραση, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι Nic1 μπορεί να υποβληθεί σε ιεραρχική γεγονότα φωσφορυλίωσης μετά την απελευθέρωσή της από τον διαμεμβρανικό υποδοχέα που συντονίζουν την έκφραση Nic1 καθώς και την ενεργοποίηση της μεταγραφής Nic1-εξαρτώμενη και εξασθένηση. Επιπλέον, κατά συνέπεια τα αποτελέσματά μας, η πιθανή εμπλοκή του μονοπατιού /ERK ΜΕΚ στη ρύθμιση της λειτουργίας Nic1 σίγουρα αξίζει περαιτέρω προσοχής.

Α. ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με ΠΛΟΙΑ-Nic1 (MYC-tagged) κατασκεύασμα μαζί με ένα cDNA που κωδικοποιεί ένα άγριου τύπου (WT) ή συστατική δραστική (CA) έκδοση του ΜΕΚ1 (ΗΑ-tagged). Τα κύτταρα λύθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Nic1 έκφραση αναλύθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-MYC. Το επίπεδο έκφρασης του εξωγενούς ΜΕΚ1 αξιολογείται με κηλίδα western με χρήση ενός αντισώματος αντι-ΗΑ. Dual-φωσφορυλιωμένη και τα επίπεδα της ολικής ERK1 /2 έκφραση αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Η ΜΕΚ1 CA-επαγόμενη μορφή μεγαλύτερου μοριακού βάρους του Nic1 υποδεικνύεται από έναν αστερίσκο *. B. ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με ΠΛΟΙΑ-Nic1 κατασκεύασμα μαζί με ένα cDNA που κωδικοποιεί ΜΕΚ1 WT ή ΜΕΚ1 CA. Τα κύτταρα λύθηκαν και Nic1 ανοσοκατακρημνίστηκε (IP Nic1) χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-MYC. δοκιμασίες φωσφατάση διεξήχθησαν στη συνέχεια (+) με τη χρήση η περιεχόμενη φωσφατάση λάμδα (λ φωσφατάση). Οι φωσφορυλιωμένες μορφές Nic1 συμβολίζεται pNIC1. Η ΜΕΚ1 CA-επαγόμενη μορφή μεγαλύτερου μοριακού βάρους του Nic1 υποδεικνύεται από έναν αστερίσκο *. Nic1 έκφραση αναλύθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-MYC. Γ Nic1 ανοσοκατακρημνίστηκε (IP Nic1) από ΠΛΟΙΑ-Nic1 επιμολυσμένα ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-MYC. δοκιμασίες κινάσης διεξήχθησαν στη συνέχεια όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Η αυτοραδιογραφία που απεικονίζει φωσφορυλιωμένη Nic1 (pNIC1) εμφανίζεται. Μετά την ηλεκτρομεταφορά της πηκτής, η ποσότητα του Nic1 ανοσοκατακρημνίστηκε επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western (WB) με τη χρήση ενός αντισώματος αντι-MYC.

Η

Η ενεργοποίηση της οδού ΜΕΚ /ΕΚΚ προωθεί NOTCH σηματοδότησης

Εμείς επόμενο απευθύνεται κατά πόσον το μονοπάτι /ΕΚΚ ΜΕΚ θα μπορούσε να επηρεάσει σηματοδότηση NOTCH ιδιαίτερα σε παγκρεατικά μοντέλο καρκινικού κυττάρου μας ΜΙΑ PaCa-2, η οποία εμφανίζει βασική έκφραση Notch 1 ενεργοποίηση /Nic1 αλλά επαγώγιμη ενεργοποίηση Notch 1 (βλέπε Σχήμα 1Α). Αξιοσημείωτα, όπως και τα περισσότερα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 φέρουν μετάλλαξη KRAS που οδηγεί σε βασικοκυτταρικό 2 ενεργοποίηση /ERK1, η τελευταία είναι απαραίτητη για ΜΙΑ PaCa-2 κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [37]. Για έντονα και με βιώσιμο τρόπο την τόνωση της οδού MEK /ERK, θα αντιμετωπίζονται ΜΙΑ κύτταρα PaCa-2 με φορβόλη 12-μυριστικό 13-οξικό (PMA). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, η προσθήκη ΡΜΑ οδήγησαν γρήγορα σε παρατεταμένη ενεργοποίηση ERK1 /2, η οποία συσχετίζεται με αυξημένη HES1 και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης c-MYC. Για να εξασφαλιστεί ότι η επίδραση ήταν NOTCH-εξαρτώμενο, προ-επεξεργασμένα των κυττάρων με DAPT να πέσει έκφραση Nic1 (Σχήμα 4Α) και πιθανότατα αναστέλλουν την διάσπαση των άλλων υποδοχέων Notch. Προ-θεραπεία με DAPT εμπόδισε σημαντικά το PMA-επαγόμενη έκφραση HES1, ενώ οι επιπτώσεις στο c-myc ήταν μερική (Εικόνα 4Α). Αυτό θα μπορούσε ενδεχομένως να εξηγηθεί από το γεγονός ότι, αν και c-MYC έχει ταυτοποιηθεί ως Notch 1 απευθείας γονίδιο στόχο [38,39], c-MYC είναι επίσης γνωστό ότι ρυθμίζεται άμεσα από την ERK1 /2 [35,36]. Ως εκ τούτου, θα μπορούσε να είναι δυνατό ότι c-MYC ρυθμίζεται και από τις δύο δύο και τριών ERK-εξαρτώμενοι μηχανισμοί στο μοντέλο μας. Αξίζει να σημειωθεί, στο μοντέλο μας, DAPT κατήργησε εντελώς το PMA-επαγόμενη έκφραση HES1 γεγονός που υποδηλώνει ότι PMA προωθεί σε μεγάλο βαθμό την έκφραση HES1 μέσω των υποδοχέων ΕΓΚΟΠΗ αντίθεση με προηγούμενες μελέτες που προτείνουν μια ΜΕΚ-εξαρτώμενη ΕΓΚΟΠΗ-ανεξάρτητη ρύθμιση της HES1 [40,41].

Α. ΜΙΑ κύτταρα PaCa-2 προ-αγωγή (+) ή όχι (-) με DAPT (25 μΜ) επί μία νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΡΜΑ (100 ηΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. κύτταρα Β ΜΙΑ PaCa-2 αφέθηκαν χωρίς αγωγή (-) ή επεξεργασμένα με EGTA (4 mM) για 15 λεπτά (+). μέσον EGTA περιέχον απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με κανονικό μέσο καλλιέργειας (Ca

2+) που περιέχει DMSO, ΡΜΑ (100 nm) ή ΡΜΑ + U0126 (10 μΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Α και Β κύτταρα λύθηκαν και αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. C. Από παρόμοια πειράματα που παρουσιάζονται σε Β, μια γραφική παράσταση που απεικονίζει σχετική έκφραση HES1, για κάθε χρονική περίοδο, σε επεξεργασμένα κύτταρα (ΡΜΑ, ΡΜΑ + U0126) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (DMSO-επεξεργασία) δείχνεται. D. Από παρόμοια πειράματα που παρουσιάζονται σε Β, μια γραφική παράσταση που απεικονίζει σχετική έκφραση c-myc, για κάθε χρονική περίοδο, σε επεξεργασμένα κύτταρα (ΡΜΑ, ΡΜΑ + U0126) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (DMSO-επεξεργασία) δείχνεται. Γ και Δ Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0.005, *** ρ & lt? 0,0005 σε σύγκριση με την αντίστοιχη χρονική περίοδο σε κύτταρα DMSO-θεραπεία. # Ρ & lt? 0,05, ## ρ & lt? 0.005, ### ρ & lt? 0,0005 σε σύγκριση με την αντίστοιχη χρονική περίοδο ΡΜΑ-επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Για να διερευνήσει επίσης την επίδραση της ενεργοποίησης ERK1 /2 μετά από ένα παλμό ενεργοποίησης Notch1, προσθέσαμε PMA τα μέσα μαζικής ενημέρωσης μετά το πλύσιμο έξω EGTA. Η προσθήκη ΡΜΑ προώθησε την EGTA επαγόμενη HES1 και έκφραση c-myc, μια επίδραση που ακυρώθηκε από τη παρουσία του αναστολέα ΜΕΚ U0126 (Σχήμα 4Β-D). Αξίζει να σημειωθεί ότι υποδηλώνεται μια αύξηση /2 φωσφορυλίωση ERK1 που μειώθηκε συναρτήσει του χρόνου μετά την αντικατάσταση του μέσου του EGTA-κατεργασμένων κυττάρων με φυσιολογική μέσα καλλιέργειας (βλέπε ελέγχου () κύτταρα DMSO-επεξεργασία? Σχήμα 4Β). Αυτή η μικρή αύξηση θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει ένα περιορισμό της μεθόδου (που απαιτεί την απομάκρυνση του EGTA) και θα μπορούσε να είναι μόνο επακόλουθη αντικατάστασης του EGTA μέσα που περιέχουν με φρέσκα μέσα καλλιέργειας, /2 φωσφορυλίωση ERK1 είναι αρκετά ευαίσθητες σε μέσο αλλαγής. Αποκλείσαμε ένα ρόλο για τη σηματοδότηση Notch σε διαμόρφωση 2 δραστηριότητες ERK1 /διότι i) DAPT αγωγή απέτρεψε την EGTA επαγόμενη έκφραση Nic1 (Εικόνα 1Β), χωρίς να επηρεάζεται /2 φωσφορυλίωση ERK1 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) και ii) αναστολή της σηματοδότησης εγκοπή με την DAPT κατεργασία δεν ρυθμίζει σημαντικά /2 φωσφορυλίωση ERK1 (Σχήμα 4Α). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν προς μια θετική ρύθμιση της έκφρασης HES1 ΕΓΚΟΠΗ που εξαρτώνται από την οδό /ERK ΜΕΚ.

Διαπιστώθηκε ότι οι EGTA-επαγόμενη έκφραση HES1 απαιτούνται μεταγραφικά γεγονότα (Σχήμα 1C) υποστηρίζουν ένα μοντέλο όπου ο κυκλοφόρησε Nic1 μετατοπίζεται προς τον πυρήνα για να επηρεάσουν την έκφραση του γονιδίου (

HES1

). Εγγενής σε αυτό, η σύνδεση των Nic1 με δέσμευσης του DNA-CSL εταίρους της και το MAML1 συν-ενεργοποιητής, ως εκ τούτου, αποτελούν λειτουργική μεταγραφική μονάδα, είναι σίγουρα απαραίτητη προϋπόθεση για την διαμόρφωση του γονιδίου [1,2]. Ως εκ τούτου, για να ξεκινήσει την οριοθέτηση των μηχανισμών που ευθύνονται για την θετική επίδραση του μονοπατιού MEK /ERK για σηματοδότηση Notch, ερευνήσαμε εάν η ενεργοποίηση του μονοπατιού /ERK ΜΕΚ θα μπορούσε να προωθήσει τη σύνδεση των Nic1 είτε με CSL ή MAML1. Σε αντίθεση με Nic1, CSL και τα επίπεδα έκφρασης MAML1 δεν διαμορφώνεται κατά την κατεργασία EGTA (Σχήμα 5Α). Κατά συνέπεια, ανοσοκατακρημνίσαμε CSL και MAML1 και δοκιμαστεί ένωση Nic1. Μετά από παλμό ενεργοποίησης Notch 1, υψηλότερα επίπεδα Nic1 βρέθηκαν συνδέεται είτε με CSL ή MAML1 (Σχήμα 5Β) ενισχύοντας πάλι το μοντέλο μας σύμφωνα με την οποία, κατόπιν EGTA-μεσολαβητική ενεργοποίηση Notch 1, το απελευθερωμένο Nic1 συναρμολογείται σε ένα ενεργό σύμπλοκο μεταγραφικού να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε σύγκριση με κύτταρα DMSO-θεραπεία, θεραπεία με ΡΜΑ προωθείται από σχεδόν 2-φορές με τη σύνδεση των Nic1 είτε με CSL (Σχήμα 5C) ή MAML1 (Σχήμα 5D). Η προσθήκη U0126 εμπόδισε τόσο το PMA-επαγόμενη Nic1 /CSL και σύνδεσης Nic1 /MAML1 (Σχήμα 5C-D) που υποστηρίζουν ΜΕΚ που εξαρτώνται από μηχανισμούς.

ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς αγωγή (-) ή επεξεργασμένα με EGTA (4 mM) για 15 λεπτά (+). μέσον EGTA περιέχον απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με κανονικό μέσο καλλιέργειας (Ca

2+) που περιέχει DMSO, ΡΜΑ (100 nm) ή ΡΜΑ + U0126 (10 μΜ) για 90 λεπτά. Α Nic1, MAML1 και τα επίπεδα έκφρασης CSL αξιολογήθηκαν με στύπωμα western χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα αντισώματα. Β CSL και MAML1 ανοσοκατακρημνίστηκαν (IP) πριν από την Western Blot αναλύσεις χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Γ CSL ανοσοκατακρημνίστηκε (IP) που ακολουθείται από στύπωμα Western αναλύσεις Nic1 (αριστερά). Μια γραφική παράσταση που απεικονίζει την σχετική ποσότητα Nic1 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με CSL (Nic1 /CSL) παρουσιάζεται (δεξιά). Δ MAML1 ανοσοκατακρημνίστηκε (IP) που ακολουθείται από στύπωμα Western αναλύσεις Nic1 (αριστερά). Μια γραφική παράσταση που απεικονίζει την σχετική ποσότητα Nic1 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με MAML1 (Nic1 /MAML1) παρουσιάζεται (δεξιά). Γ και Δ Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με κύτταρα DMSO-θεραπεία.

Η

Συζήτηση

Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [29-34], τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μια παροδική έκθεση σε EGTA είναι ένα χρήσιμο και αξιόπιστο μοντέλο για την έγκαιρη ενεργοποίηση μελέτη Notch1 στη NOTCH1- εκφράζοντα κύτταρα. Πράγματι, αυτό μας επέτρεψε να ανακαλύψουμε ότι, κατά την απελευθέρωση από τον υποδοχέα διαμεμβράνης, Nic1 υποβάλλεται σε μια σειρά από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που περιλαμβάνουν φωσφορυλίωση. Θα επιβεβαιώνεται επίσης προηγουμένως καθιερωμένη έννοια σύμφωνα με την οποία Nic1 είναι μια βραχύβια πρωτεΐνη [1], όπως, μέσα σε ένα χρονικό πλαίσιο 4 ώρες, η έκφραση του πρόσφατα διασπαστεί Nic1 σχεδόν εξαφανιστεί εντελώς. Μαζί με την αυξημένη έκφραση Nic1, μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και του κύκλου εργασιών, ήμασταν σε θέση, για πρώτη φορά, για την ανίχνευση αυξημένης έκφρασης του ενδογενούς στόχων NOTCH προτείνοντας ότι το EGTA επαγόμενη έκφραση Nic1 μεταφράζεται σε μια λειτουργική μεταγραφική μονάδα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η κύρια καινοτομία της έρευνάς μας είναι η απόδειξη ότι η οδός /ERK ΜΕΚ προάγει την έκφραση των HES1 στόχο την εγκοπή του. Αν και σίγουρα θα χρειαστούν περισσότερες μελέτες για να καθοριστεί εάν οι επιπτώσεις ενεργοποίησης /ERK ΜΕΚ όλα ή μόνο ένα υποσύνολο των στόχων Notch, τα δεδομένα μας παρέχουν αποδείξεις ότι η οδός /ERK ΜΕΚ ενισχύει την έκφραση HES1 πιθανότατα μέσω των μηχανισμών που εξαρτώνται από τους υποδοχείς ΕΓΚΟΠΗ, διότι προ κατεργασία των κυττάρων με έναν αναστολέα γ-σεκρετάσης (DAPT) απέτρεψε την ΡΜΑ-επαγόμενη έκφραση HES1. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν επίσης αντίκτυπο του μονοπατιού RAS για ΕΓΚΟΠΗ σηματοδότηση [18,42]. Οι μελέτες αυτές, γίνεται κυρίως στο πλαίσιο ενεργοποίησης παρατεταμένη RAS ή την αναστολή της ΜΕΚ, πρότεινε ότι RAS σηματοδότηση προωθεί υποδοχέα Notch 1 διάσπαση /ενεργοποίησης. Τα ευρήματά μας είναι καινοτόμες, δεδομένου ότι αποκαλύπτουν ότι ο /ERK μονοπάτι σηματοδότησης ΜΕΚ είναι αποτελεσματική σε, λίγα λεπτά μετά την διάσπαση Notch 1, άμεσα επηρεάζουν Nic1 μεταγραφική λειτουργία. Μια υπόθεση που προκύπτουν από τα αποτελέσματα μας είναι ότι η οδός MEK /ERK προάγει τη δημιουργία μιας λειτουργικής Nic1 μεταγραφικής μονάδας με CSL και MAML1. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να οριοθετηθούν οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους η οδός MEK /ERK προωθεί τη σηματοδότηση Notch.

Είναι ενδιαφέρον, ότι είχε προταθεί προηγουμένως ότι η μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, κυρίως φωσφορυλίωση, είναι σχεδόν βέβαιο διαμόρφωση Nic1-εξαρτώμενη μεταγραφής [1]. Αρχικά στο

Drosophila

[43], αλλά αργότερα σε θηλαστικά, υπερφωσφορυλίωση της ενδοκυτταρικής περιοχής του Notch1 και Notch2 ανιχνεύθηκε μετά την απελευθέρωσή τους από τον υποδοχέα διαμεμβρανική [44,45]. Αξίζει να σημειωθεί, υπερφωσφορυλίωση της Nic1 συνδέθηκε με i) Nic1 πυρηνική συσσώρευση [45-48], ii) αλληλεπίδραση Nic1 με CSL [44], iii) αύξηση της CSL-εξαρτώμενη μεταγραφή [44,47,48] και iv) η ικανότητα Nic1 μετατροπή [ ,,,0],48]. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η φωσφορυλίωση Nic1 μπορεί να προωθήσει την μεταγραφική δυναμικό του συμπλόκου Nic1 /CSL. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, ως επί το πλείστον οι κινάσες που ρυθμίζουν αρνητικά την λειτουργία Nic1 έχουν ταυτοποιηθεί: ΑΚΤ δείχθηκε να προωθήσει Nic1 κυτταροπλασματική εντόπιση [49], η φωσφορυλίωση του Nic1 με DYRK1A εξασθενημένου σηματοδότηση NOTCH [50], και Nic1 φωσφορυλίωση NLK εξαρτώμενη μειώθηκε ο σχηματισμός του το συγκρότημα Nic1 /CSL [51]. ομάδα Capobianco προϋπόθεση πρόσφατα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι, πριν ή κατά τη διάρκεια Nic1 /CSL /MAML1 σύνθετη ένωση, Nic1 φωσφορυλιώνεται από CK2 επιτρέποντας την προσβασιμότητα σε μια επόμενη θέση φωσφορυλίωσης [52]. Και τα δύο γεγονότα φωσφορυλίωσης εμφανίστηκε απαιτούνται για τη διάσταση του συμπλόκου από το DNA. Επιπλέον, το συγκρότημα /CDK8 CycC θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην διαταράξεως της Nic1 /CSL /MAML1 με φωσφορυλίωση Nic1 στο C-τερματικό της περιοχής PEST επακόλουθη FBW7 μεσολάβηση ουμπικουιτίνωση Nic1 και την υποβάθμιση [53]. Παρ ‘όλα αυτά, μέχρι σήμερα, δεν εντοπίστηκαν θετικές ρυθμιστές Nic1 (κινάσες) και σχεδόν όλες οι θέσεις φωσφορυλίωσης για Nic1 μένει να καθοριστεί. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν τώρα τη βάση για τη διερεύνηση της θετική συμβολή του μονοπατιού MEK /ERK σε σηματοδότηση NOTCH ιδίως στο πλαίσιο των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Αξιοσημείωτη, είχε προηγουμένως δείξει ότι η αναγκαστική έκφραση του Nic1 στον παγκρεατικό επιθήλιο ποντικού προάγει τον σχηματισμό των προκαρκινικών αλλοιώσεων του παγκρέατος ξεκίνησε από ένα ογκογόνο

KRAS

[54] υποδηλώνοντας ότι KRAS και Notch σηματοδότηση συνεργάζονται για την προώθηση του παγκρέατος καρκινογένεση.