Αφηρημένο

ERG, ένα μέλος της οικογένειας παράγοντα μεταγραφής ETS, συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του προστάτη, ως αποτέλεσμα της σύντηξης του στο αποκρίνονται στο ανδρογόνο γονίδιο TMPRSS2. Διαφορετικές γονιδιωματική ανακατατάξεις και εναλλακτικές εκδηλώσεις μάτισμα γύρω από την περιοχή του κόμβου οδηγήσει σε πολλαπλές συνδυασμό TMPRSS2: μεταγραφές σύντηξης ERG που συσχετίζονται με διαφορετικές επιθετικότητα του όγκου, αλλά συγκεκριμένες λειτουργίες τους και τις βιολογικές δραστηριότητες είναι ακόμα ασαφής. Η πολυπλοκότητα του προτύπου έκφρασης ERG αυτή συνδυάζεται με τη χρήση εναλλακτικών υποκινητών, θέσεις ματίσματος, θέσεις πολυαδενυλίωσης και θέσεις έναρξης της μετάφρασης τόσο στις φυσικές και σύντηξη πλαίσια. συστηματικού χαρακτηρισμού μας μητρική ERG και TMPRSS2: ERG παραλλαγές αποκαλύπτει ότι διαφορετικές ογκογόνο δυναμικό τους επηρεάζεται από την κατάσταση του τομέα Ets και τη διαμόρφωση της περιοχής UTR 5 ‘. Ειδικότερα, η έκφραση και η δραστικότητα της λειτουργικής ERG και TMPRSS2: Τα ERG παραλλαγές επηρεάζονται τόσο από τα σήματα έναρξης της μετάφρασης στο πλαίσιο των διαφόρων ισομορφών και με ανασταλτικές ανάντη Open Reading Frames (uORF) σε 5 ‘UTRs τους. Σταθερή έκφραση του ERG και TMPRSS2: ERG παραλλαγών που προωθείται κυτταρική μετανάστευση /εισβολή, προκάλεσε ένα μπλοκ του πολλαπλασιασμού και προκάλεσε μια γηρασμό κατάσταση όμοια, υποδηλώνοντας ένα ρόλο για τις εν λόγω παραλλαγές στη διαδικασία ογκογένεση του προστάτη. Εκτός από TMPRSS2: προϊόντα σύντηξης ERG, μια ομάδα συνδεδεμένων μητρική ισομορφές ERG είναι επίσης πολύ υπερ-εκφράζεται σε σύντηξη μεταφέρουν καρκίνους του προστάτη, και μοιράζονται την ίδια θέση έναρξης της μετάφρασης (σε ERG εξόνιο 4) με την κοινώς παρατηρηθεί TMPRSS2 exon1 συνδέεται με ERG εξόνιο 4 (Τ1: Ε4) παραλλαγή σύντηξης που προέρχονται. Χρήση αυτού του ATG μπορεί να είναι κατά προτίμηση κάτω-ρυθμίζονται με κατευθυνόμενη αντινόημα που βασίζεται ενώσεις, πιθανώς αντιπροσωπεύει την βάση μιας στοχευμένης προσέγγισης που διακρίνει μεταξύ σχετίζονται με όγκους και κανονικό ERG

Παράθεση:. Zammarchi F, G Boutsalis, Cartegni L (2013) 5 ‘UTR Ελέγχου των ιθαγενών ERG και του TMPRSS2: ERG Παραλλαγές Δραστηριότητα στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (3): e49721. doi: 10.1371 /journal.pone.0049721

Επιμέλεια: Bin Tian, ​​UMDNJ-New Jersey Medical School, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 του Ιούλ του 2012? Αποδεκτές: 19 Σεπτεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2013

Copyright: © 2013 Zammarchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εργασίας ήταν υποστηρίζεται από DOD PC081477 επιχορήγησης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

χρωμοσωμικές μετατοπίσεις έχουν καθιερωθεί βασικά γεγονότα στην εξέλιξη των αιματολογικών κακοηθειών και σαρκωμάτων [1]. Η αναγνώριση των επαναλαμβανόμενων μετατοπίσεων μεταξύ των ανδρογόνων ανταποκρίνεται TMPRSS2 γονίδιο και τα μέλη της οικογένειας Ets παράγοντες μεταγραφής στον καρκίνο του προστάτη (PCA) έχει αλλάξει το πανόραμα του προστάτη βιολογίας [2].

Περισσότερο από το 80% του προστάτη δείγματα λιμάνι ογκογόνο συγχωνεύσεις, συνηθέστερα αφορούν την περιοχή 5 ‘του τόπου TMPRSS2 (με τον ανάδοχο του) ενώνεται με ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) των διαφόρων Ets γονιδίων [3], αν και άλλοι συνδυασμοί έχουν περιγραφεί [4], [5] , [6]. Η πιο κοινή αναδιάταξη, TMPRSS2 exon1 συνδέεται με ERG εξόνιο 4 (Τ1: Ε4, ή παραλλαγή III) είναι παρούσα σε περίπου 50% των περιπτώσεων προστάτη [3]

συγχωνεύσεις γονιδίων Ets παίζουν ρόλο στη μετάβαση. από προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) για αδενοκαρκίνωμα και συνδέονται στην επιθετική αλλοιώσεις και φτωχή πρόγνωση [7], [8], [9], [10], [11]. Η υπερέκφραση του ERG σε κυτταρικές σειρές προστάτη ενεργοποιεί προγράμματα κύτταρο εισβολή και έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη των PINs σε ποντικούς, αλλά δεν μπορούν να οδηγήσουν την καρκινογένεση [5], [8], [10], [12], όπως η συνεργασία με ξεχωριστό γενετικό βλάβες, για παράδειγμα απώλεια του ΡΤΕΝ, είναι απαραίτητη για να προκαλέσει την εξέλιξη σε προχωρημένη νόσο [7], [13], [14].

Αρκετές παραλλαγές του κανονικού γονιδιακού προϊόντος ERG έχουν περιγραφεί, που προκύπτει από ένα συνδυασμό εναλλακτικού ματίσματος, πολυαδενυλίωσης και μεταγραφικής έναρξης [15], [16], [17], [18]. Οι ιδιαιτερότητες των γονιδιακών αναδιατάξεων εισαγάγει επίσης σημαντική δομική ετερογένεια στο 5 ‘περιοχή. Εκτός από την κοινή Τ1: Ε4 μεταγραφής, εξώνια TMPRSS2 1, 2 και 3 μπορούν να συνδυαστούν με ERG εξώνια 2, 3, 4, 5 και 6 σε διάφορες εναλλακτικές μορφές ματίσματος που μπορεί να δημιουργήσει τουλάχιστον 17 διακριτές TMPRSS2: μεταγραφές ERG [2 ], [19], [20], [21]. Αυτά μπορούν να χρησιμεύσουν ως δείκτες για την εξέλιξη της νόσου και συσχετίζονται με την επιθετικότητα των όγκων [8], [9], [19]. Ειδικότερα, το Τ2: παραλλαγή Ε4 (TMPRSS2-exon2: ERG-exon4 ή παραλλαγή VI), όπου η μητρική ΑΤΟ TMPRSS2 εξόνιο 2 είναι σε πλαίσιο με το ERG ORF, συνδέεται με παθολογικές και κλινικές πτυχές της επιθετικής νόσου [19] .

η μηχανιστική βάση για τη διαφορετική ογκογόνο δυναμικό των ισομορφών σύντηξης μένει να διευκρινιστεί, και θα μπορούσε να σχετίζεται με ενδογενείς διαφορές στην Ν-τελικές περιοχές ή στην επίδραση (ες) που διακύμανση της 5 ‘περιοχή του mRNA μπορεί να έχει για τη σταθερότητα του RNA ή έκφραση.

για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, θα αξιολογήσει τη χρήση των 3 εναλλακτικών υποκινητών, 2 κοινές εναλλακτικές εκδηλώσεις μάτισμα και 3 θέσεις πολυαδενυλίωσης (PAS) σε φυσιολογικούς ιστούς σε σχέση με TMPRSS2: ERG-εκφράζοντας όγκους του προστάτη. Αυτά τα ανεξάρτητα ρυθμιζόμενες γεγονότα συνδυάζονται για να παράγουν 30 ‘κύριος’ μητρική ισομορφές, μερικές από τις οποίες βρήκαμε να επίσης εξαιρετικά υπερεκφράζεται σε όγκους. Ο χαρακτηρισμός των θέσεων έναρξης μετάφρασης που χρησιμοποιείται από τα πιο κοινά εγγενή ERG και σύντηξη παραλλαγές αποκαλύπτει ότι η συγκεκριμένη οργάνωση της περιοχής UTR 5 ‘είναι μία από τις κύριες καθοριστικούς παράγοντες της βιολογικής τους δραστηριότητας και προσδιορίζει ένα ATG στο εξόνιο 4, ως υποθετικό στόχο για αντίθετης φοράς με βάση τη μετάφραση αναστολή στον καρκίνο του προστάτη.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Δομή των ERG Gene

Πολλαπλές μητρική ισομορφές ERG μπορεί να προκύψουν λόγω του συνδυασμού των εναλλακτικών υποκινητών, μάτισμα και πολυαδενυλίωσης. Αυτές οι ισομορφές μπορούν με τη σειρά τους συνδυάζονται με TMPRSS2 και άλλες 5 ‘εταίρους να παράγουν πολλά ERG που προέρχονται από παραλλαγές, με μεταβλητή προγνωστικές αξίες [8], [9], [19]. Για την καλύτερη κατανόηση των δραστηριοτήτων της ERG που προέρχονται από ογκογόνο προϊόντα, επιδιώξαμε να διευκρινιστεί αρχικά η δομή του γονιδίου ERG και να χαρακτηρίσει πρότυπο έκφρασης του.

Υπάρχουν σημαντικές ασυνέπειες στο δημοσιευμένο ονοματολογία ERG, με τουλάχιστον τέσσερις διαφορετικές κατάταξη συστήματα, με προφανή συνέπεια τη δημιουργία σύγχυσης στην κατανόηση και τη σύγκριση δεδομένων από διαφορετικές μελέτες (π.χ.: το μεγάλο τερματικό εξώνιο που περιέχει το ΣΕΔΕ και οι τομείς διενεργοποίησης είναι μεταβλητά αναφέρεται ως εξόνιο 11 [2], [22], 12 [3] , 16 [18], [23], 17 [24]).

Αναφέρουμε στο Σχήμα 1Α μία όψη up-to-ημερομηνία της δομής εξονίου-ιντρονίου του τόπου ~ 300 Kb ERG (ENSG000000157554) και να προτείνει μια ενιαία, ορθολογική ονοματολογία του RNA και των πρωτεϊνών παραλλαγές που στοχεύει στην ενσωμάτωση των πιο καθιερωμένες συμβάσεις. Η δομή βασίζεται κατά κύριο λόγο στις 11 εξώνια του NM_004449.4 εισόδου REFSEQ (UniProt P11308 εισόδου για ERG2), και ενσωματώνει την αρίθμηση εξόνιο που χρησιμοποιείται στο σπερματικό χαρτί Tomlins [2], [22] Η πρώτη περιγράφει την TMPRSS2: ERG σύντηξης. Εν ολίγοις, διατηρήσαμε ως «εξόνιο 4″ του 218nt εξόνιο που είναι ο κύριος εταίρος της TMPRSS2 και ως «εξόνιο 11″ το μεγάλο εξόνιο 3897nt κωδικοποιεί το πεδίο Ets? ονομάσαμε εξόνιο 1α, 1β, 1γ τις τρεις αλληλοαποκλείονται «πρώτη» εξώνια μετά τις τρεις επικυρωμένες υποστηρικτές P

A, P

Β και P

C. Για να εξασφαλιστεί η ορθολογική ένταξη πρόσθετων εξώνια που θα μπορούσαν να εντοπιστούν στο μέλλον, θα διακρίνεται από γράμματα τα εναλλακτικά εξόνια δεν αποτελεί μέρος από αυτά αναφοράς 11. Για παράδειγμα, το 72 nt εναλλακτικό εξόνιο που περιλαμβάνεται μεταξύ εξώνια 7 και 8 ονομάζεται «εξόνιο 7β ‘

(Α) Top:. Το ~ 300 Kb ανθρώπινη ERG τόπου, που κατά προσέγγιση σε κλίμακα. Οι κατά προσέγγιση μεγέθη ιντρόνιο υποδεικνύεται, μαζί με εξώνια θέση (μπάρες). Κόκκινο δείχνει πρώτα εξώνια, μπλε κοινές εναλλακτικές αυτές και γκρι ασυνήθιστο αυτά. Μέση: δομή εξόνιο, με εξόνιο μεγέθη στο κάτω μέρος. Μπλε πλαίσια δείχνουν τις κύριες προβλεπόμενες ΑΠΑ, λευκά κουτιά οι αμετάφραστες περιοχές και γκρι τα ασυνήθιστο εξώνια. Κόκκινοι κύκλοι υποδεικνύουν θέσεις πολυΑ. Κάτω: ευθυγράμμιση των εξώνια που αποτελούν το κύριο ORF (ERG-1β) με τους τομείς της πρωτεΐνης. Οι αριθμοί δείχνουν το μέγεθος σε αμινοξέα. PNT = μυτερό τομέα, AD = εναλλακτικές τομέα, τον τομέα Ets = Ets, TAD = μετενεργοποίηση τομέα. Asterisk και ο κύκλος υποδεικνύει τη θέση του πρώτου και του δεύτερου ATG. κύριες παραλλαγές (Β) Ανθρώπινα ERG. Ευθυγράμμιση των εξώνια που σχηματίζουν τις 30 κύριες παραλλαγές RNA της ανθρώπινης ERG. Μπλε δείχνει το ORF, γαλάζιο η πρόσθετη περιοχή από το ATG στο εξόνιο 3. Για κάθε παραλλαγή, η προτεινόμενη ονομασία αναγράφεται δίπλα στην προηγούμενη ονοματολογία (εάν είναι διαθέσιμο). Η προτεινόμενη ονομασία πρωτεΐνη έχει αναφερθεί κατά μήκος του προβλεπόμενου μεγέθους σε αα και kDa. Οι παραλλαγές που προέρχονται από την εναλλακτική χρήση του υποκινητή 1α και 1β ζεύγη ως αποτέλεσμα την σχετίζονται mRNAs και ταυτόσημες πρωτεΐνες

Η

Στη συνέχεια προσδιόρισε τις κύριες εναλλακτικές ρυθμιστικές γεγονότα που δημιουργούν την πλειοψηφία της ERG μεταβλητότητας:. 3 εναλλακτικές προωθητές (P

A, P

Β και P

C)? δύο κοινές εναλλακτικές γεγονότα ματίσματος (ένταξη /παράκαμψη του εξωνίου 4 ή 7β)? τρία ξεχωριστά σήματα ροΙγΑ (ΠΑΣ 7bpA, 11LpA και 12ΡΑ). Συνδυαστική χρήση των εναλλακτικών γεγονότων παράγει 30 πιθανές «μείζονος σημασίας» παραλλαγές ERG μεταγραφής (Σχήμα 1Β), το οποίο μπορεί να κωδικοποιεί 15 διαφορετικά προέβλεψε ERG-συναφή πολυπεπτίδια, με 3 διαφορετικά Ν-τερματικά, 3 διαφορετικές C-τερματικά και 1 δυνατότητα εσωτερικής παραλλαγή (συμπερίληψη ή παράλειψη των 24 aa στην Εναλλακτική τομέα που κωδικοποιείται από το εξόνιο 7β).

Εκτός από τα 30 «μείζονος σημασίας» παραλλαγές που περιγράφονται στο Σχήμα 1, ένας μεγάλος αριθμός των «ήσσονος σημασίας» ισομορφές έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία ή είναι υπάρχουν στις βάσεις δεδομένων. Ο κατάλογος περιλαμβάνει τις παραλλαγές που δείχνει παράλειψη της εξώνια 2, 5, 7 και 8? χρήση ενός εγγύς περιοχή (Short) polyA στο εξόνιο 11 (11SpA) ή ενός επιπλέον εσωνίων ένα κατάντη του εξόνιο 8 (8pA)? και την ένταξη των συμπληρωματικών εναλλακτικών εξονών 7c, 10β και των πολλαπλών εναλλακτικών εξονίων που προέρχονται από ιντρόνιο 3 (εξώνια 3b-h), που υποδεικνύεται σε γκρι στο σχήμα 1Α. Ισομορφές ERG4, ERG6 και ERG9 από την προηγούμενη μελέτη Owczarek [18] είναι ασήμαντες παραλλαγές και αναταξινομήθηκαν σε αυτή την ομάδα.

Από οποιαδήποτε από αυτές τις πρόσθετες δευτερεύουσες εκδηλώσεις θα μπορούσε να συνδυάσει ανεξάρτητα με όλα τα δομικά συμβατό κύριες ισομορφές, εκατοντάδες παραλλαγών θα μπορούσε δυνητικά να παραχθούν. Ωστόσο, αυτά τα γεγονότα φαίνεται να συμβαίνουν σποραδικά, και φυσιολογίας τους είναι άγνωστη

ERG Έκφραση: α. Ο καρκίνος που σχετίζεται με διακόπτη στο Διοργανωτή Χρήση

Σας έθεσε ως στόχο να διερευνήσει τη χρήση των υποκινητών, PAS ή σήματα ματίσματος με qPCR ανάλυση της έκφρασης ERG σε διαφορετικούς φυσιολογικούς ιστούς, όγκους και κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 2). Ενώ κάποιος βαθμός του ιστού-προς-ιστό μεταβλητότητα παρατηρείται (Εικ. S1 Α), γενικά υποκινητή Ρ

C (μέση Δc (t) = 10,2) φαίνεται να είναι ο πιο ενεργός σε φυσιολογικό ιστό (συμπεριλαμβανομένου του προστάτη), -25-φορές και περίπου 10 φορές πιο δραστικό κατά μέσο όρο από υποκινητές Ρ

Α (Δc (t) = 14,9) και Ρ

Β (Δc (t) = 13.4), αντίστοιχα (Σχήμα 2Α). Από την άλλη πλευρά, σε μια ομάδα 8 βασικά δείγματα προστάτη που εκφράζουν TMPRSS2-ERG συγχωνεύσεις, υποστηρικτής P

Β (μέση Δc (t) = 5.4) αντιπροσωπεύει την πλειοψηφία των ιθαγενών μεταγραφή ERG και είναι παρούσα σε επίπεδα συγκρίσιμα με εκείνα της ίδιας της σύντηξης (Δc (t) = 6), πάνω από 100 φορές πιο άφθονο από το ίδιο μετάγραφο σε κανονικό προστάτη (Δc (t) = 12,8) (Σχήμα 2Β και η Εικ. S1 Α). Πράγματι, σε αρκετές TMPRSS2: ERG-που μεταφέρουν τα δείγματα της φυσικής Ρ

υποστηρικτής Β, παρά το γονίδιο σύντηξης, είναι η κύρια πηγή της ERG μεταγραφή (Σχήμα S1B.). Σε σύγκριση με φυσιολογικό προστάτη, υποκινητές Ρ

Α (Δc (t) = 9) και Ρ

C (Δc (t) = 8) ενεργοποιούνται επίσης, αλλά όχι με το βαθμό Ρ

Β. Σε κυτταρικές σειρές προστάτη, P

Β είναι ο μόνος ενεργός μητρική ERG υποκινητή, με μη ανιχνεύσιμο σήματα από P

Α ή Ρ

C (Σχήμα 2C). Δύο από τις κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν PCa, VCAP και NCI-H660, εκφράζουν την TMPRSS2: ERG σύντηξης (Σχήμα 2C, πλήρης σύμβολα), η οποία είναι αντίθετα απουσιάζει σε κυτταρικές σειρές προστάτη που δεν περιέχει την TMPRSS2: ERG σύντηξης (LNCap, DU145, C4 2, ανοικτά σύμβολα και η Εικ. S1c). Όπως αναμενόταν, καμία έκφραση από οποιονδήποτε από τους γηγενείς προαγωγείς παρατηρήθηκε στην κυτταρική σειρά ΝΟΙ-H660, το οποίο φέρει την σύντηξη και στα δύο αλληλόμορφα και έχασε όλες τις ενδογενείς προαγωγούς [25].

Ποσοτικοποίηση με qPCR εναλλακτικών ERG παραλλαγών σε φυσιολογικό ιστό (Α, D), πρωτογενή δείγματα προστάτη (Β, Ε) και κυτταρικές σειρές του προστάτη. (C, F). (Α-Γ) Ποσοτικοποίηση χρήση προαγωγού. Primer σετ ειδικά για τα 3 διαφορετικούς προαγωγούς ERG και για την TMPRSS2: ERG σύντηξης όπου χρησιμοποιούνται, μαζί με ένα σύνολο εκκινητών που καλύπτει τα εξόνια 5-7 για την ποσοτικοποίηση σύνολο ERG. Φυσιολογικοί ιστοί δεν εκφράζουν το προϊόν σύντηξης. Έκφραση των παραλλαγών 1a και 1c είναι σχεδόν μη ανιχνεύσιμη στις κυτταρικές γραμμές του προστάτη που αναλύθηκαν. Για τον πίνακα C, ανοιχτά σύμβολα υποδεικνύουν LnCap, DU145 και C4-2 (δεν εκφράζουν TMPRSS2: ERG σύντηξης), πλήρη σύμβολα υποδεικνύουν vcap και NCI-H660 (εκφράζουν TMPRSS2: ERG σύντηξης). Βλέπε επίσης το Σχ. S1 A-C. (D-F) Ποσοτικοποίηση από qPCR της εναλλακτικής χρήσης πολυαδενυλίωσης. Primer σύνολα ειδικά για τις 3 διαφορετικές τοποθεσίες polyA όπου χρησιμοποιείται, μαζί με ένα σύνολο έναυσμα για την ποσοτικοποίηση συνολική ERG και ένα σετ για την ποσοτικοποίηση συνολική εξόνιο 11 επίπεδα, προκειμένου να συναγάγει τη χρήση 11SpA. Βλέπε επίσης το Σχ. S1 D-F. Σε όλες τις περιπτώσεις, κάθε υποδεικνύεται τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των ανεξάρτητων πειραμάτων ≥3 και παρουσιάζεται ως ΔΟ (t) κανονικοποιημένη με το γονίδιο GAPDH οικοκυρική, ως εκ τούτου ένα «υψηλό» αξία (t) ΔΟ σημαίνει χαμηλά επίπεδα έκφρασης και «χαμηλή» αξία σημαίνει υψηλό επίπεδο έκφρασης. Οριζόντιες γραμμές δείχνουν τη μέση. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν ότι το προϊόν δεν ανιχνεύθηκε στο δείγμα και ως εκ τούτου θα ήταν ισοδύναμο με ένα πειραματικό σημείο στην κορυφή του πίνακα, αλλά δεν αντανακλάται από την μέση τιμή.

Η

Από αυτή την πρώτη δέσμη πειράματα συμπεραίνουμε ότι ένας διακόπτης υποστηρικτής εμφανίζεται σε όγκους του προστάτη και κυτταρικές σειρές και ότι η αύξηση της χρήσης του φυσικού προαγωγού P

Β είναι συνεργάτης με (και ενδεχομένως συμβάλλει) τον φαινότυπο όγκου.

η υπερέκφραση της ERG σε προστάτη περιγράφηκε προηγουμένως [23], αλλά μετά την ανακάλυψη του TMPRSS2: ERG σύντηξης, έχει συνήθως αποδίδεται σε αυτή την εκδήλωση. Ωστόσο, το εύρημά μας ότι εκτός από τις μεταγραφές σύντηξης προερχόμενα, μερικοί γηγενείς παραλλαγές ERG μπορεί επίσης να είναι ιδιαίτερα υπερεκφράζεται σε PCa, προτείνει ένα μεγαλύτερο ρόλο για φυσική ERG σε ανάπτυξη PCa. Αυτό υποστηρίζεται από την παρατήρηση ότι η ενδογενής ποντίκι

Erg

μεταγραφές υπερεκφράζονται σε όγκους από προστάτη υπό όρους

PTEN

– /-?

Trp53

– /- ποντίκια, σε σύγκριση με το

PTEN

– /-?

Trp53

+ /+ ποντίκια [7]. Είναι σημαντικό ότι, ενώ τα τελευταία αποτελέσματα του μοντέλου σε μια νωχελική μορφή προστάτη, ο πρώην παράγει ένα επιθετικό φαινότυπο [7].

Η διαφορά ενεργοποίησης των τριών μητρική υποστηρικτές στα σύντηξης που μεταφέρουν τα δείγματα προστάτη υποδηλώνει ότι αυτή ανώμαλη έκφραση είναι μεταγραφικά ρυθμίζεται. Μια ενδιαφέρουσα δυνατότητα είναι ότι η ενεργοποίηση της φυσικής Ρ

προωθητής Β μπορεί να οδηγείται άμεσα ή έμμεσα από την ίδια ERG ως μέρος μιας θετικής ρυθμιστικής βρόχου. Για παράδειγμα, αρκετές υποθετικές στοιχεία απόκρισης c-Myc ταυτοποιήθηκαν αμέσως ανάντι του ERG P

B υποκινητή [18]. Επειδή ο-Μγο αποτελεί βασικό κατάντη στόχος της ERG [26], το ανδρογόνο-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του ERG από την σύντηξη, ή ένα ξεχωριστό ΡΤΕΝ-εξαρτώμενη ενεργοποίηση Myc [27] θα μπορούσε να προκαλέσει μια αυτοσυντηρούμενη ERG /Myc ογκογόνο βρόχου, η οποία θα μπορούσε τελικά να γίνει ανεξάρτητος από ανδρογόνο. Πράγματι, σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ένα μηχανισμό τροφοδοσίας προς τα εμπρός όπου η έκφραση του ενδογενούς ERG ελέγχεται από υπερέκφραση του προϊόντος σύντηξης έχει περιγραφεί προσφάτως [28]

ERG Έκφραση:. Εναλλακτική πολυαδενυλίωσης και μάτισμα

Ανάλογα με το τι κάναμε για να μελετήσει τη χρήση του υποψηφίου, τότε να διερευνηθεί ο ρόλος των εναλλακτικών πολυαδενυλίωσης και ματίσματος στην έκφραση των παραλλαγών ERG. Από τα τρία κύρια PAS περιγράφεται (Σχήμα 1), το 11L-ΡΑ απαιτείται για μια πλήρως λειτουργική πρωτεΐνη ERG, ενώ ο PAS στο ιντρόνιο 7b (7b-ΡΑ) και το εξόνιο 12 (12-ΡΑ) παράγουν Ο-τερματικά κολοβωμένη ισομορφές ERG έλλειψη του πεδίου Ets δέσμευσης DNA και τον τομέα διενεργοποίησης (TAD).

ο 11L-ρΑ PAS ήταν η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη σε φυσιολογικούς ιστούς (μέση, ΔΟ (t) = 10,8), περίπου 8-φορές πιο από 7β-ρΑ (ΔΟ (t) = 13,8) και 50-φορές περισσότερο από 12-ρΑ (ΔΟ (t) = 16,6) (Σχ. 2D). Ωστόσο, σε TMPRSS2: ERG εκφράζουν δείγματα προστάτη (ΔΟ (t) = 5.2), η χρήση του 7b-ΡΑ έντονα ενεργοποιημένο, και γίνεται περίπου τόσο κοινή όσο το 11L-ΡΑ (ΔΟ (t) = 5,8) (Σχήμα 2Ε) . Το ίδιο ισχύει και σε κυτταρικές σειρές προστάτη που εκφράζουν τη σύντηξη (Σχήμα 2F) υποδηλώνοντας ότι η μετάβαση σε αυτό το μοτίβο της έκφρασης μπορεί να συσχετιστεί με την εξέλιξη του όγκου. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι, ενώ αυτή η παραλλαγή δεν έχει το ΣΕΔΕ και τους τομείς TAD, διατηρεί τους καθοριστικούς παράγοντες διμερισμού, και ως εκ τούτου η έκφραση της μπορεί να επηρεάσει τη δραστηριότητα των άλλων παραλλαγών πλήρους μήκους παρόν. Ένα εγγύτερο PAS στο εξώνιο 11 (11S-ΡΑ) [15], [18] έμμεσα αξιολογήθηκε με σύγκριση qPCR των περιοχών εκατέρωθεν του (Ε11 και 11L-ΡΑ), και παρόμοια επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χρήση του 11S-pa είναι οριακή κάτω από τις περισσότερες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις (Εικόνα 2D-F και Σχήμα S1D-F)

από εναλλακτικό μάτισμα παραλλαγές μπορεί να επηρεάσει ERG ή TMPRSS2:. λειτουργίες σύντηξης ERG [24], αναλύσαμε τις περιφέρειες γύρω εξόνιο 7b και εξονίου 4 σε φυσιολογικούς ιστούς, τα δείγματα προστάτη και κυτταρικές γραμμές με ημι-ποσοτική PCR. Και οι δύο εναλλακτικές γεγονότα ματίσματος ήταν εύκολα ανιχνεύσιμη, με σαφή επικράτηση των παραλλαγών 7β ένταξη εξόνιο 4 και εξόνιο. Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε καμία σημαντική εμπλουτισμό στο σχετικό ποσό είτε παραλλαγές ματίσματος σε δείγματα προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διαμόρφωση αυτών των δύο συγκεκριμένων γεγονότων ματίσματος δεν μπορεί να παίξει καθοριστικό ρόλο στη ΣΕΣΣ.

Συνολικά, αυτά στοιχεία δείχνουν ότι τα προϊόντα πλήρους μήκους, που περιέχει 7β εξόνιο και το ΣΕΔΕ και οι τομείς του ΣΕΔ, είναι το πιο άφθονο ERG παραλλαγές ανεξάρτητα από την κατάσταση των ανάντη περιφερειών, τόσο σε φυσιολογικούς ιστούς και όγκους. Η ισχυρή αύξηση του ακρωτηριασμένου ΤΕ: 7bpA ισομορφή σε σχέση με την παραλλαγή πλήρους μήκους θα μπορούσε απλά να αντανακλούν τις αλλαγές στον μηχανισμό ματίσματος /πολυαδενυλίωσης των καρκινικών κυττάρων, αλλά θα μπορούσε επίσης να αναφέρει (ακόμη ανεξερεύνητες) το ρόλο της στην ERG βιολογία σε όγκους

Ν-τερματική ετερογένεια της ERG Ισομορφών

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον η ετερογένεια που περιγράφονται στην περιοχή 5 ‘επηρεάζουν την έκφραση και δραστηριότητα ERG, θα υπο-κλωνοποιηθεί η μητρική παραλλαγές ERG-1α, ERG-1β, ERG -1γ, ERG-1b.Δ4, ERG-1c.Δ4, και η κοινή σύντηξης παραλλαγή Τ1: Ε4, με πλήρη 5 ‘UTRs τους και με το εξόνιο 7β περιλαμβάνονται (Σχήμα 3Α.). Μετά από παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα HeLa, cDNA ERG-1γ εκφράζονται αποτελεσματικά το αναμενόμενο 54 KDa προϊόν (Σχ. 3Β, στήλη 4). Αντίθετα, η έκφραση των φυσικών παραλλαγών ERG-1a και ERG-1b ήταν αναποτελεσματική, με αποτέλεσμα τα πεπτίδια μικρότερα από το -55 KDa αναμένεται αν το πρώτο εντός πλαισίου ATG σε χρησιμοποιήθηκε εξόνιο 3 (Εικ. 3Β, λωρίδες 2-3 ). Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτό το πεπτίδιο συν-μετανάστευσε με εκείνη που παράγεται από την παροδική υπερέκφραση του Τ1: παραλλαγή σύντηξης Ε4, στο -50 kDa (διαδρομή 5). Πρόσθετες παραλλαγή στην Ν-τερματική περιοχή προέρχεται από εξώνιο 4 παράκαμψη, η οποία μεταβάλλει κύριο ORF ERG, έτσι ώστε οι προβλεπόμενες αρχίζοντας τα ATG στο εξόνιο 1 c ή εξόνιο 3 δεν θα είναι σε θέση να παράγει ένα ERG σχετίζονται πεπτίδιο (Σχήμα 3Α). Παροδική υπερέκφραση του ERG-1b.Δ4 ή ERG-1c.Δ4 τόσο σαν αποτέλεσμα ERG-συγγενή πεπτίδια που μεταναστεύει στα ~44 KDa, συνεπής με την χρήση ενός εντός πλαισίου ATG M5 στο εξόνιο 5 (Σχήμα 3Β, λωρίδες 7,9) . Αυτό είναι ιδιαίτερα εμφανές όταν χρησιμοποιούν το ERG αντισώματος C-17, το οποίο αναγνωρίζει εύκολα ανασυνδυασμένου ERG, αλλά δεν τις ενδογενείς πρωτεΐνες. Ένα διαφορετικό αντίσωμα ERG (C-20) αναγνωρίζει επιλεκτικά έναν ενδογενή ταινία που αντιστοιχεί σε μέγεθος με ERGΔ4 (λωρίδες 1-5), καθιστώντας το διακόπτη στη χρήση M5 πιο δύσκολο να ανιχνευθούν.

(Α) Ν-τερματικό ετερογένεια στην ανθρώπινη φυσική παραλλαγές ERG. Οι 5 ‘περιοχές για τις υποδεικνυόμενες παραλλαγές αναπαράγεται. Κουτιά αντιπροσωπεύουν εξόνια με το ORF σε μπλε χρώμα. Red τσιμπούρια κάτω τα εξώνια υποδεικνύουν τα ATG εντός πλαισίου στα εξόνια 1c και τα εξώνια 3 έως 5. Τα προϊόντα εκτός-πλαισίου που προκαλείται από το εξόνιο πηδώντας, από κατά τα άλλα σε ΑΤΟ πλαίσιο υποδεικνύονται με κόκκινο χρώμα. (Β) Western Blot (WB) του παροδική έκφραση των παραλλαγών σε κύτταρα HeLa. Το αντίσωμα C20 αναγνωρίζει εξωγενούς πρωτεΐνης και ένα ενδογενές ζώνη στα ~44 KDa που αντιστοιχεί σε μέγεθος με Δ4 παραλλαγές. Αντίσωμα C17 αναγνωρίζει κατά προτίμηση εξωγενείς ζώνες ERG. (Γ) Οι μεταλλάξεις που εξαλείφουν ανεξάρτητα τα 3 ΑΤΟ εντός πλαισίου στο εξόνιο 4 εισήχθησαν στο cDNA του Τ1: Ε4 και αναλύθηκαν όπως παραπάνω. (D), Ομοίως, οι μεταλλάξεις εισήχθησαν για να εξαλειφθούν οι ΑΤΟ στο εξόνιο 3 (ERG-1β) ή στο εξώνιο 1γ (ERG-1γ) από μόνα τους ή σε συνδυασμό με μεταλλάξεις στο πρώτο εντός πλαισίου ATG (M4a) στο εξόνιο 4 (ERG-1b και ERG-1γ)

η

από Τ1:. Ε4 στερείται τις προβλεπόμενες κωδικόνια έναρξης και από τις δύο TMPRSS2 και ERG μεταγραφές, μια εναλλακτική εσωτερική ATG μέσα από το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης ERG πρέπει να χρησιμοποιηθεί για να εκφράσει ένα ERG σχετίζονται προϊόντος από το mRNA της σύντηξης, πιθανόν από το εξώνιο 4. για να προσδιοριστεί η Τ1: κωδικόνιο έναρξης Ε4, μια σειρά από μεθειονίνη-προς-αλανίνη μεταλλάξεις σημείου δημιουργήθηκαν για τα τρία σε πλαίσιο ΑΤΟ κωδικόνια που υπάρχουν στο ERG εξόνιο 4 ( Σχ. 3Α). Η μετάλλαξη στα νουκλεοτίδια 79 (M4a), αλλά όχι 121 (M4B) και 184 (M4C) του εξονίου 4 καταργούνται T1: έκφραση Ε4 (Σχήμα 3C), υποδεικνύοντας ότι η μεταγραφή σύντηξης χρησιμοποιεί το πρώτο εντός πλαισίου ATG για έκφραση του πεπτιδίου ERG .

Για να χαρτογραφηθούν οι ξεκινώντας τα ATG από την φυσική ERG ισομορφών παρόμοιες μεταλλάξεις όπου εισήγαγε επίσης μόνα τους ή σε συνδυασμό στα πρώτα τα ATG εντός πλαισίου στο εξόνιο 3, 1γ και 4 (Σχήμα 3D). Μετάλλαξη του ATG στο εξόνιο 3 (Μ3) δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του ~ 50 KDa προϊόντος (Σχήμα 3d, λωρίδες 2 έναντι 4), ενώ η μετάλλαξη της επόμενης ATG στο εξόνιο 4 (M4a) αυτό καταργείται τόσο στο βάρος και Μ3 πλαίσιο (Σχήμα 3D, λωρίδες 3 και 5), υποδεικνύοντας ότι ERG-1b (και ERG-1α) δεν χρησιμοποιούν πρώτα εντός πλαισίου ATG τους, όπως θα μπορούσε να προβλεφθεί από μια 5’cap εξαρτώμενη σάρωση μοντέλο της έναρξης της μετάφρασης [29]. Αντ ‘αυτού, η χρήση της ακόλουθης ATG στο εξώνιο 4 δημιουργεί ένα πεπτίδιο πανομοιότυπο με εκείνο που κωδικοποιείται από το Τ1: Ε4 σύντηξης. Αντιθέτως, όταν το κωδικόνιο έναρξης στο εξώνιο 1γ είναι μεταλλαγμένο (M1c), η κινητικότητα ERG-1c μειώνεται από ~54 kDa έως περίπου 50 kDa (Σχήμα 3D, λωρίδες 6 έναντι 8), όπως και Τ1: Ε4 και ERG-1b (λωρίδα 1 και 2), σύμφωνα με ένα διακόπτη στο M4a ATG. Πράγματι, η μετάλλαξη αυτού του ATG ως αποτέλεσμα την κατάργηση του προϊόντος -50 ΚΕ υπέρ ενός ακόμα μικρότερου προϊόντος.

Βιολογική Χαρακτηρισμός της ERG Ισομορφών

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η διαρθρωτική Ν-τερματικό οι διαφορές μεταξύ της σχετιζόμενης με καρκίνο ERG-1b /T1: Ε4 και την κανονική ERG-1c επηρεάζουν εγγενώς βιολογική τους δραστικότητα, μπορούμε αρχικά εκφράζονται σταθερά αντίστοιχες cDNAs τους σε κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 (Σχήμα 4Α) και επιλέγονται κλώνοι με ισχυρή έκφραση. Σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις, παρατηρήσαμε την προώθηση της κυτταρικής εισβολής και της μετανάστευσης και από τις δύο παραλλαγές ERG, όπως προσδιορίστηκαν από τη μετανάστευση trans-καλά μέσω Matrigel (Εικόνα 4Β) και δοκιμασία μηδέν πληγή (Εικόνα 4C-D). Η έκταση του φαινομένου για τη μετανάστευση /την εισβολή ήταν συγκρίσιμη με ERG-1b και ERG-1γ δείχνουν ότι είναι εξίσου ενεργά, τουλάχιστον σε ορισμένες βασικές πτυχές της βιολογίας τους.

(Α) κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 σταθερά που εκφράζουν υψηλού επιπέδου του ERG-1b και 1c ERG-αναλύθηκαν όπως στο Σχ 3. (Β-Ο) Μετά την επιλογή του φαρμάκου, ERG υπερεκφράζουν κλώνοι (1β και 1γ), έλεγχος με κενό φορέα (pLPC) και μη επεξεργασμένων ΝΙΗ-3Τ3 κύτταρα (ΝΤ) αναλύθηκαν για δυναμικό εισβολή τους χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό Matrigel εισβολής (Β), και σε μια τυποποιημένη δοκιμασία γρατσουνιά πληγή για τη μέτρηση της κινητικότητας του (C). (D) Ποσοτικοποίηση (C), χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Μπάρες δείχνουν την τυπική απόκλιση. (Ε) καμπύλη ανάπτυξης του ΝΙΗ-3Τ3 σταθερών κλώνων. Μετά την επιλογή, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε διαστήματα 48 ωρών επί μία περίοδο 8 ημερών και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. (F) Μετά την επιλογή του φαρμάκου, ΝΙΗ-3Τ3 σταθεροί κλώνοι απλώθηκαν και στερήθηκαν ορού, και ο κυτταρικός θάνατος μετρήθηκε με trypan blue μέθοδο. (G) 5 ημέρες μετά την επιλογή του φαρμάκου ΝΙΗ-3Τ3 σταθεροί κλώνοι υπέστησαν βαφή για SA-β-γαλακτοσιδάσης. καμπύλη (H) Ανάπτυξη του IMR90 κυττάρων που εκφράζουν σταθερά υψηλού επιπέδου ERG1b /T1: Ε4 ή τον κενό φορέα. Μετά την επιλογή του φαρμάκου, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε διαστήματα 48 ωρών επί μία περίοδο 8 ημερών και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. (Ι) 5 ημέρες μετά την επιλογή του φαρμάκου IMR90 σταθεροί κλώνοι υπέστησαν βαφή για SA-β-γαλακτοσιδάσης. Red βέλη δείχνουν bi-εμπύρηνα κύτταρα. Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται στα Β, C, G και Ι

Η

Παραδόξως, η έκφραση της ERG παραλλαγών στο πλαίσιο αυτό οδήγησε σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Σχήμα 4Ε). Αυτό δεν συνδέονται με το κυτταρικό θάνατο. Αντιθέτως, η έκφραση του ERG-1b και ιδιαίτερα ERG-1γ οδήγησε σε προστασία από τον κυτταρικό θάνατο μετά ασιτία ορού (Σχήμα 4F). Αυτή η συμπεριφορά μπορεί να αντικατοπτρίζει την ενεργοποίηση ενός ογκογονιδίου που εξαρτάται από γηρασμό κατάσταση που μοιάζει με έκφραση ERG όπως περιγράφηκε προηγουμένως για άλλα ογκογονίδια [30]. Πράγματι, ERG-εκφράζοντα κύτταρα, αλλά όχι μάρτυρες, χρωματίστηκαν θετικά για γήρανση βιοδείκτη (beta) β-Γαλακτοσιδάσης (Εικόνα 4G). Intrigued από αυτά τα αποτελέσματα, στη συνέχεια σταθερώς υπερεκφράζεται το ERG-1b /T1: Ε4 ισομορφή και το αντίστοιχο κενό φορέα στην κανονική κυτταρική σειρά ινοβλαστών ανθρώπινης IMR90, ένα καλά χαρακτηρισμένο πρότυπο σύστημα κυττάρων για την κυτταρική γήρανση. Όπως και με τα κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3, υπερ-έκφραση του ERG-1b /T1: Ε4 ισομορφή είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και την κυτταρική εισβολή, (Εικόνα S2). Επιπλέον, IMR90 κύτταρα που υπερεκφράζουν την ERG-1b /T1: Ε4 ισομορφή έδειξε γηρασμό σαν φαινότυποι όπως μια αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 4Η), συσσώρευση bi-εμπύρηνων κυττάρων και αυξημένα δραστικότητα SA-β-gal, μια κλασική βιοδεικτών γήρανσης (σχήμα 4I).

Αυτό το αποτέλεσμα είναι ιδιαίτερα συναρπαστικό υπό το πρίσμα του γεγονότος ότι το πρόγραμμα γήρανση ενεργοποιείται μια φορά το κύτταρο έχει αισθανθεί ένα κρίσιμο επίπεδο της βλάβης ή δυσλειτουργίας, που δείχνουν προς ένα κρίσιμο ρόλο για την ERG 1β /T1: Ε4 υπερέκφραση ως αρχικό γεγονός που οδηγεί σε PCA. Επιπλέον, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η κυτταρική γήρανση μπορεί να ανιχνευθεί σε πρώιμο στάδιο ανθρώπινα δείγματα προστάτη και μπορεί να προκληθεί από οξεία απώλεια του ΡΤΕΝ σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο σε μοντέλα PCa ποντικού [31], υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση ERG θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια αρχική φαινότυπο γήρανσης που απαιτεί επακόλουθη περιβαλλοντική ή γενετικές αλλαγές να προχωρήσουν σε κακοήθεια.

ATG πλαίσιο και uORFs Επηρεάζουν ERG Μετάφραση Αποδοτικότητα και Λειτουργίες

Αποτελεσματική μεταφραστεί ευκαρυωτικά mRNAs απαιτούν μια βέλτιστη πλαίσιο γύρω από το κωδικόνιο έναρξης, για να βοηθήσουν στην αναγνώρισή του από το ριβόσωμα (η ακολουθία Kozak: GCCRCCATGG) [32]. Ωστόσο, αυτό δεν είναι πάντα επαρκής για να εξηγήσει την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης. Για παράδειγμα, αν και ERG-1a /b και Τ1: Ε4 την ίδια ATG στο εξόνιο 4 (M4a) για να αρχίσει η μετάφραση, τα επίπεδα έκφρασής τους είναι διαφορετικές (Σχήμα 3Β λωρίδες 2,3 και 5) υποδηλώνοντας ένα ρόλο για τα διαφορετικά τους 5 ‘ UTRs. Πράγματι, η υποκατάσταση των φυσικών 5 ‘UTRs με ένα που περιέχει συναίνεσης Kozak (Σχήμα 5Α-Β) οδήγησε σε ενεργοποίηση της έκφρασης από τον Μ3 ATG στην παραλλαγή ERG-1b, με τη σύνθεση της αρχικά προβλεπόμενης 55 KDa πεπτίδιο (Σχήμα 5C, λωρίδες 1-2). Αυτό επιβεβαιώνει ότι τα στοιχεία μέσα στο 5 ‘UTR του ERG-1b αναστολή της μετάφρασης της και αποκλείει ότι η χαμηλή ERG-1b (Μ3) αφθονία οφείλεται σε εγγενή αστάθεια του Ν-τερματικού τομέα του.

( Α) Η μητρική 5 ‘UTR του ERG-1b, ERG-1c και Τ1: Ε4 αντικαταστάθηκαν με ένα κοινό ένας από τον φορέα έκφρασης (με πορτοκαλί χρώμα), και μια βελτιστοποιημένη αλληλουχία Kozak. Οι αντικατασταθούν τα ATG είναι στο εξόνιο 3 (Μ3), 1γ (M1c) και 4 (M4a) (Β) Πλαίσιο πολλαπλών εντός πλαισίου ATG χρησιμοποιούνται ως κωδικόνια έναρξης σε διάφορες ERG και TMPRSS2: ERG παραλλαγές. Η αλληλουχία γύρω από το ATG έχει ευθυγραμμιστεί σε συναινετική αλληλουχία Kozak, με τα σημαντικά συντηρημένες θέσεις -3 (R) και 4 (G) επισημαίνεται με κόκκινο χρώμα (μετρώντας τον Α ως 1). Πλαίσιο αξιολογείται ως «ισχυρή» (S), αν και οι δύο θέσεις συντηρημένες, και «αδύναμο» (W) εάν δεν είναι. Η εκτεταμένη ανάλυση τα ATG στο 5’UTR περιοχή του ERG και TMPRSS2: ERG αναφέρεται στον Πίνακα S1. (Γ) WB ανάλυση των παραλλαγές και μεταλλάξεις που παριστάνεται στο (Α). Βελτίωση του πλαισίου Μ3 ευνοεί τη χρήση του στα έξοδα του M4a ATG. (D) uORFs που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη μετάφραση αποτελεσματικότητα της ERG παραλλαγών στα 5 ‘UTRs του ERG-1b και πολλά κοινά TMPRSS2: ERG παραλλαγές. Κόκκινο τσιμπούρια δείχνουν τα ATG, κουτιά κάτω δείχνουν το υποτιθέμενο uORF παράγεται και κατά προσέγγιση το μήκος τους (κατάρτιση όχι υπό κλίμακα). Κόκκινα κουτιά δείχνουν ισχυρή πλαίσια ATG και πράσινο αδύναμοι (όπως ορίζεται στο (Β)). Περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τις uORFs παρατίθενται στον Πίνακα S1. (Ε) Επίδραση ανεξάρτητα μετάλλαξη ATG uORFs »στο ERG-1b: μετάλλαξη του πρώτου ATG στο εξόνιο 2 κυκλοφορίες καταστολή των επιπέδων της μετάφρασης και τις αυξήσεις του ERG από το ATG στο εξόνιο 4. (F) Έκφραση του ERG και TMPRSS2: ERG παραλλαγές . cDNA πλήρους μήκους για τις παραλλαγές, συμπεριλαμβανομένων ολόκληρων 5 ‘UTRs τους, εκφράστηκαν και προϊόντα λύσης από παροδικά διαμολυσμένα κύτταρα HeLa αναλύθηκαν με στύπωμα Western.

Η

Upstream Open Reading Frames (uORFs) είναι τυπικώς σύντομες ORFs που ξεκινούν μέσα στο 5 ‘UTR, είναι out-of πλαισίου με την κύρια κατάντη κωδικοποιητική αλληλουχία και μπορεί να μειώσει την έκφραση του [33], [34]. Ενώ δεν uORFs υπάρχουν στο ERG-1c ή Τ1: Ε4, υπάρχουν τρεις uORFs στην ERG-1β 5’UTR (Σχήμα 5D, κορυφή), που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την αναγνώριση της προβλεπόμενης ATG του ERG-1b (Πίνακας S1) . Κατάργηση της uORF ξεκινώντας uM2a με μετάλλαξη του ΑΤΟ σε GCG οδήγησε σε αυξημένη έκφραση ERG-1β (Σχήμα 5Ε, λωρίδα 2), υποδεικνύοντας ότι η δέσμευση του ριβοσώματος σάρωσης από τον πρώτο αντιμετώπισε ATG, για να δημιουργήσει ένα σύντομο uM2a 29 aa πεπτίδιο, είναι ένας περιοριστικός παράγοντας στην έκφραση ERG-1β από το κατάντη ATG

Η παρουσία uORFs θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει ομοίως τα επίπεδα έκφρασης των διαφόρων ανδρογόνων με γνώμονα TMPRSS2:. πρωτεΐνες ERG σύντηξης, με την προγνωστική επίπτωση, αφού το 5 ‘ετερογένεια σε σύντηξη συνδέεται με διαφορετικές κλινικές εκβάσεις [19], [20]. Οι διαφορετικές παθολογικές προφίλ θα μπορούσε να οφείλεται σε αλλαγές στη βιολογική δραστηριότητα, ανάλογα με την πρωτοταγή αλληλουχία της πρωτεΐνης ή σε διαφορές στην αφθονία της,

μέσω

διαμόρφωση της μετάφρασης. Τέτοιες παραλλαγές θα μπορούσε να εξηγήσει το πώς, για παράδειγμα, το Τ2: σύντηξη Ε4 συνδέεται με μια πιο επιθετική φαινότυπο [19], [20]

Για να διερευνηθεί αν αποτελεσματικότητα μετάφρασης παίζει ένα ρόλο στη δραστηριότητα των παραλλαγών σύντηξης.