Αφηρημένο

Οι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών (OC) μπορεί να αντιμετωπιστεί με χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και /ή ακτινοθεραπεία, αν και καμία από αυτές τις στρατηγικές είναι πολύ αποτελεσματική. Αρκετές φυτικής προέλευσης φυσικών προϊόντων /συμπληρωμάτων διατροφής, συμπεριλαμβανομένων των αποσπασμάτων από

Emblica

officinalis

(Amla), έδειξαν ισχυρή αντι-νεοπλασματικές ιδιότητες. Σε αυτή τη μελέτη διαπιστώσαμε ότι εξάγει Amla (ΑΕ) έχει αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις στα κύτταρα OC στο πλαίσιο τόσο

in vitro

και

in vivo

συνθήκες. Έχουμε καθορίζεται επίσης το αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις ένα από τα συστατικά της ΑΕ, quercetin, σε κύτταρα OC κάτω από το

in vitro

συνθήκες. ΑΕ δεν προκάλεσε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, αλλά αύξησε σημαντικά την έκφραση των πρωτεϊνών αυτοφαγικά beclin1 και LC3B-ΙΙ υπό

in vitro

συνθήκες. Κερσετίνη αύξησε επίσης την έκφραση των πρωτεϊνών αυτοφαγικά beclin1 και LC3B-ΙΙ κάτω από το

in vitro

συνθήκες. ΑΕ επίσης μείωσε σημαντικά την έκφραση αρκετών γονιδίων αγγειογόνου, συμπεριλαμβανομένων υποξία παράγοντας 1α (HIF-1α) σε κύτταρα OVCAR3. ΑΕ ενήργησε συνεργικά με σισπλατίνη για τη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και να αυξήσει την έκφραση των πρωτεϊνών αυτοφαγικά beclin1 και LC3B-ΙΙ κάτω από το

in vitro

συνθήκες. AE είχε επίσης αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα και προκαλούμενη από την έκφραση των πρωτεϊνών αυτοφαγικά beclin1 και LC3B-ΙΙ σε όγκους ξενομοσχεύματος ποντικού. Επιπλέον, AE μειωμένη αντιγόνου ενδοθηλιακού κυττάρου – CD31 θετικά αιμοφόρα αγγεία και η έκφραση του HIF-1α σε όγκους ξενομοσχεύματος ποντικού. Μαζί, αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η ΑΕ αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του οργανωμένου εγκλήματος και

in vitro

και

in vivo

πιθανώς μέσω αναστολής της αγγειογένεσης και ενεργοποίηση των αυτοφαγία σε OC. Έτσι ΑΕ μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη ως εναλλακτική ή συμπληρωματική θεραπευτική προσέγγιση στην προσπάθεια για την καταπολέμηση του οργανωμένου εγκλήματος

Παράθεση:. De Α, De Α, Papasian C, Hentges S, Banerjee S, Haque I, et al. (2013)

Emblica

officinalis

Απόσπασμα Προκαλεί Autophagy και αναστέλλει την ανθρώπινη καρκίνο των ωοθηκών κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αγγειογένεση, την ανάπτυξη των Mouse Ξενομοσχεύματος Όγκων. PLoS ONE 8 (8): e72748. doi: 10.1371 /journal.pone.0072748

Επιμέλεια: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 του Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 12, Ιούλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Αυγ του 2013

Copyright: © 2013 De et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια τειχών ταμείο UMKC και ένα βραβείο Merit VA Grant (SKB, SB). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή τη συμμετοχή του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών (OC) είναι η δεύτερη πιο κοινή γυναικολογικό καρκίνο και είναι η κύρια αιτία της. θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Κάθε χρόνο περίπου 22.000 γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες διαγνωστεί με OC, και 15.000 θάνατοι οφείλονταν σε OC το 2011 και μόνο [1]. OC είναι δύσκολο να εντοπιστεί σε πρώιμο στάδιο (Ι /ΙΙ), και συχνά δεν είναι κλινικά ύποπτα μέχρι να εξαπλώνεται και προκαταβολές σε μεταγενέστερα στάδια (III /IV). Κατά συνέπεια, OC έχει κακή πρόγνωση, με ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για όλα τα στάδια του ~ 47% [2]. Επί του παρόντος, OC μπορεί να αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοβολία, με ανεπαρκή αποτελέσματα, όπως υποδεικνύεται από το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης που προαναφέρθηκε. Η ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων, ή συνδυασμούς φαρμάκων για OC δεν έχουν παράσχει σημαντικές λόγο να είμαστε αισιόδοξοι. Δεδομένου ότι τα συμβατικά αντικαρκινικά φάρμακα μπορεί να είναι εξαιρετικά τοξικά, τα φυτικής προέλευσης βιοδραστικών ενώσεων που ερευνώνται πιο εντατικά ως εναλλακτική ή συμπληρωματική θεραπεία για διάφορες μορφές καρκίνου [3]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι τα φυτικά εκχυλίσματα έχουν αντι-όγκου /αντικαρκινικές /αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί καλλιεργημένων ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών όγκου [4-7] και επίσης έχουν αντιαγγειογενετική επίδραση επί καρκινικών κυτταρικών γραμμών [8].

Amla (

Emblica

officinalis

) είναι ένα μικρόκαρπα φυτό που έχει αναγνωριστεί για τις θεραπευτικές του ιδιότητες και έχει χρησιμοποιηθεί από την αρχαιότητα στην ινδική παραδοσιακή σύστημα ιατρικής «Ayurveda» για τη θεραπεία πολλών ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [9-11]. Ο καρπός του φυτού Amla περιέχει 11 γνωστές ιατρικώς σχετικός συστατικά όπως γαλλικό οξύ, ελλαγικό οξύ, 1-Ο-galloyl-βητα-D-γλυκόζη, 3,6-δι-O-galloyl-D-γλυκόζη, chebulinic οξύ, quercetin , chebulagic οξύ, corilagin, 1,6-δι-O-gallolyl γλυκόζη βήτα D, 3-ethylgallic οξύ, isostrictiniin και ασκορβικό οξύ [9]. Τα κλαδιά του φυτού περιέχει επτά βιοδραστικών ενώσεων – geraniin, phyllanemblinins C και Ε, prodelphinidin Β1, (2) -epigallocatechin 3-O-γαλλικό, (S) -eriodictyol 7- [6-Ο- (Ε) -ρ-coumaroyl ] -β-D-γλυκοζίδιο [12]. Μεταξύ αυτής της συλλογής ενώσεων, γαλλικό οξύ, ελλαγικό οξύ, 1-Ο-galloyl-βητα-D-γλυκόζη, chebulinic οξύ, quercetin, chebulagic οξύ, corilagin, ασκορβικό οξύ, και geraniin απέδειξαν ισχυρή αντι-καρκινογόνες ιδιότητες μεμονωμένα, και αυτά μπορεί να βοηθήσει να εξηγήσει τις αντικαρκινικές ιδιότητες ολόκληρου του εκχυλίσματος Amla (ΑΕ) [9,13]. ΑΕ έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό μιας ποικιλίας καρκινικών κυττάρων

in vitro

, συμπεριλαμβανομένων κυττάρων OC, και επίσης έχει αποδείξει αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα

in vivo

[9-11]. Πρόσφατα Triphala, ένα φυτικό φάρμακο που περιέχει AE, έχει επίσης αποδειχθεί αντι-αγγειογένεσης ιδιότητες [8].

Λόγω της δυνητικής αξίας της ΑΕ ως αντικαρκινική θεραπεία, ιδιαίτερα για OC, ερευνήσαμε την αντι- πολλαπλασιαστική και αντι-ογκογόνο επιδράσεις των ΑΕ σε κυτταρικές γραμμές ωοθήκης

in vitro

και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Έχουμε επίσης ερεύνησαν την επίδραση της ΑΕ στην αγγειογένεση όγκου σε καλλιεργημένα κύτταρα και ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Έχουμε παρατηρήσει ότι ΑΕ δεν προκάλεσε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, αλλά αύξησε σημαντικά την έκφραση της πρωτεΐνης αυτοφαγικά σε ιστοκαλλιέργεια και μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Έχουμε επίσης παρατηρήσει ότι ΑΕ ενήργησε συνεργιστικά με σισπλατίνη για μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και αυξάνουν την έκφραση των beclin1 και LC3B-ΙΙ υπό

in vitro

συνθήκες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις τυποποιημένες κατευθυντήριες γραμμές της αμερικανικής Ένωσης για την Διαπίστευση του Εργαστηρίου φροντίδα των ζώων. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Θεσμικό

Animal Care και Χρήση Επιτροπής του Kansas City VA Medical Center (Kansas City, MO).

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

OVCAR3, SW626 και φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα πλακούντα (HS 799 pl) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection. Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) και τρυψίνη τα προμηθευτήκαμε από την Sigma, St. Louis, ΜΟ. OVCAR3 και SW626 κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone Laboratories, Logan, UT) και αντιβιοτικά στους 37

OC σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 περιβάλλον. Όλα τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν εντός 10 περάσματα από την παραλαβή ή την ανάκτηση (~ 2 και 1/2 μήνες της καλλιέργειας). ΑΕ για θεραπεία παρασκευάζεται από εμπορικώς διαθέσιμα δισκία (Himalaya, ΗΠΑ, Houston, ΤΧ, που περιέχει 250 mg του Amla φρούτα και 350 mg του Amla βλαστικών σκόνη). Ένα απόθεμα διαλύματος Α.Ε. παρασκευάσθηκε ζυγίζοντας τα δισκία Amla, άλεση τους, και τη διάλυση της σκόνης σε ενδοτοξίνη ελεύθερο αποστειρωμένο νερό σε 10 mg /ml. Το διάλυμα διηθείται μέσω μεμβράνης οξικής κυτταρίνης 0,02 μm και χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της καλλιέργειας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.

Θεραπεία

10.000 OVCAR3 ή SW626 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ατομικά φρεάτια πλακών 24 φρεατίων σε 1 ml μέσου που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και επωάστηκε στους 37

OC για 24 ώρες πριν από την έναρξη των πειραμάτων. Μετά την αρχική επένδυση, το μέσο αντικαταστάθηκε με 1 ml DMEM που περιείχε ορό (10%) και ΑΕ (0-400 μg /ml? Εις τριπλούν) για διάφορα χρονικά σημεία (6-96 ώρες) στους 37

OC. Η

in vitro

ελέγχου (0 μg /ml του ΑΕ) έλαβε φορέα (νερό) σε όγκο ίσο με την υψηλότερη συγκέντρωση των ΑΕ που χρησιμοποιείται. Μπορούμε επίσης επεξεργασμένα κύτταρα OVCAR3 με διαφορετικές δόσεις της κερκετίνης (5-100 μg /ml? Εις τετραπλούν) για διάφορα χρονικά σημεία (6 έως 96 ώρες) στους 37

OC. Οι

in vitro

ελέγχου (0 μg /ml του quercetin) έλαβε φορέα (DMSO? 4 μ.λίτρα, το οποίο είναι ισοδύναμο με τον όγκο για 100 μg /ml του quercetin)

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου)] (ΜΤΤ) δοκιμασίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14] με τροποποιήσεις [15]. OVCAR3 και SW626 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων που περιέχουν DMEM και 10% FBS. Μετά τη θεραπεία, ΜΤΤ (0,1 mg /φρεάτιο) προστέθηκε σε κύτταρα που ακολουθείται από επώαση για 4 ώρες στους 37

OC. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης που σχηματίζονται διαλυτοποιήθηκαν με επώαση των κυττάρων με 1 ml ισοπροπυλικής αλκοόλης που διαλύθηκε το μπλε προϊόν φορμαζόνης που συνέβησαν κατά τη διάρκεια της επώασης με ΜΤΤ. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 560 nm σε ένα φασματοφωτόμετρο. Ο αριθμός των λειτουργικά ενεργά κύτταρα (δηλαδή, τιμές οπτικής πυκνότητας) υπολογίστηκε για συγκρίσεις μεταξύ ομάδων ελέγχου και θεραπείας.

DNA κατακερματισμό

DNA παρασκευάστηκε από επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένες καλλιέργειες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16 ]. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία τα κύτταρα λύθηκαν σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (100 mM Tris, ρΗ 8.0, 20 mM EDTA, 0,5% SDS) που έλαβαν θεραπεία με 50 μg /ml άνευ ϋΝάσης RNase στους 37

OC για 30 λεπτά και 100 μg /ml πρωτεϊνάσης Κ για 2 ώρες σε 50

OC. Το DNA στη συνέχεια εκχυλίσθηκε με φαινόλη-χλωροφόρμιο και χλωροφόρμιο και καθιζάνει σε 3 όγκους αιθανόλης. Το DNA (1 μg /λωρίδα) ηλεκτροφορήθηκε επί πηκτών αγαρόζης 1%. Τα πρότυπα μοριακά βάρη κινούνται ταυτόχρονα. Τα πηκτώματα χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Chemidox (BioRad, Hercules, CA).

RNA Extraction

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα OVCAR3 χρησιμοποιώντας μέθοδο εκχύλισης ΤπζοΙ. ποσότητα και την ποιότητα του mRNA προσδιορίστηκαν με μέτρηση της απορρόφησης του στο Genesys 6 Σάρωση UV /VIS σάρωσης Φασματοφωτόμετρο, αλλά και με τη χρήση τσιπ experion RNA (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Gene Array

Διαφορική έκφραση της αγγειογένεσης ρυθμιστικών γονιδίων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Oligo GEArray παρέχονται από τον κατασκευαστή (SA Bioscience Corporation, Frederick, MD, USA). Εν συντομία, 3 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα σε βιοτίνη-16-dUTP-επισημασμένου cDNA διερευνητές με τη μέθοδο TrueLabeling-AMP χρησιμοποιώντας 16 μΙ 2,5Χ RNA πολυμεράση, 2 μΐ 10 mM βιοτινυλιωμένου UTP, η RNA πολυμεράση 2 μΐ. Οι μεμβράνες SuperArray (ΥΑΕ-026) προ-υβριδοποιήθηκαν σε 60

OC για 2 ώρες. Ο υβριδισμός των επισημασμένων με βιοτίνη ανιχνευτές cDNA στις μεμβράνες διεξήχθη σε 60

OC όλη τη νύχτα με αργή ανάδευση. Οι υβριδοποιήθηκαν μεμβράνες πλύθηκαν σε ρυθμιστικό αλατούχο κιτρικό νάτριο (μια φορά σε 2 χ SSC, 1% SCS και μία φορά σε 0,1 χ SSC, 0,5% SDS). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση στρεπταβιδίνη, και στη συνέχεια με το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας CDP-Star. Εικόνες από τις μεμβράνες αποκτήθηκαν με τη χρήση του συστήματος Chemidoc XRS (BioRad) και τα σύνολα δεδομένων εξήχθησαν στην GEArray Αναλυτή, το λογισμικό που αναπτύχθηκε από την SA Βιοεπιστήμης και αναλύονται. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης του κάθε γονιδίου προσδιορίστηκε με σύγκριση της έντασης του σήματος του κάθε γονιδίου της συστοιχίας μετά τη διόρθωση για υπόβαθρο και την κανονικοποίηση.

In vivo μελέτες όγκων

Οκτώ εβδομάδων γυμνά ποντίκια (nu /nu γονότυπο, Harlan Laboratories (Madison, WI) διατηρήθηκαν με νερό και τροφή

κατά βούληση

σε ένα παθογόνο περιβάλλον ελεύθερο με ένα σκοτεινό κύκλο 12 ώρες φως και 12 ώρες σε μια μονάδα φροντίδας ζώων στο Κάνσας Σίτι VA Medical Center. φροντίδα των ζώων και πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις εγκεκριμένες κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής ζώων φροντίδα και Χρήση των Kansas City VA Medical Center. OVCAR3 κύτταρα (5X10

4) με Matrigel εγχύθηκαν υποδορίως στη δεξιά πίσω πλευρά της κάθε ποντικό (4-5 ποντίκια ανά ομάδα). η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε μετά το 2

ος ημέρα της ένεσης και συνεχίστηκε μέχρι και 24 ημέρες. μήκος και το πλάτος του όγκου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο :. όγκος του όγκου = μήκος χ πλάτος χ 0.5 πλάτος

Έξι ημέρες μετά την ένεση, τα ποντίκια τροφοδοτήθηκαν από του στόματος με 10% σακχαρόζη (έλεγχος) ή 10% σακχαρόζη με ΑΕ ημερησίως (100 mg /kg σωματικού βάρους.). Η δόση των 100 mg /kg σωματικού βάρους επιλέχθηκε με βάση μια προκαταρκτική μελέτη, όπου η δόση αυτή έδειξε βέλτιστη επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Μετά από 18 ημέρες θεραπείας ΑΕ, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλδεΰδη για περαιτέρω μελέτη.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε 4% φορμαλίνη ορισμένου εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές ιστών σύμφωνα με τις προηγούμενες μεθόδους μας [17,18]. Εν συντομία, τομές ιστών μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλδεΰδη και αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε φθίνουσα συγκεντρώσεις αλκοόλης, πλύθηκαν με PBS και αποκλείστηκαν με κλείδωμα ορού (Immpress-Vector Laboratories, Burlingame, CA) για 20 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν με beclin1, LC3B-ΙΙ (Cell Signaling, Boston, ΜΑ), CD31, Ki67 (Abcam, Cambridge, ΜΑ) ή HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton CO) αντίσωμα (1: 500 για όλα τα αντισώματα) για μια νύχτα σε υγρό θάλαμο σε 4

OC. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα σε στρεπταβιδίνη (Immpress-Vector Laboratories) και οι τομές με αιματοξυλίνη. Οι τομές απεικονίστηκαν με ένα ψηφιακό φωτομικροσκόπιο Leica. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μικροαγγείων, τομές ιστών αναλύθηκαν σε 50Χ μεγέθυνση και μετρήθηκαν CD31-θετικών αγγείων. αναλύθηκαν τέσσερις τομείς από κάθε ένα από 3 τμήματα ανά όγκο.

κύτταρα OVCAR3 μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλδεΰδη και πλένονται με PBS. Μετά από αποκλεισμό στην παρεμπόδιση ορού, τα κύτταρα επωάστηκαν με beclin1, LC3B-ΙΙ ή HIF-1α (1: 200) αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4

OC. Τα κύτταρα πλύθηκαν και ανιχνεύθηκε ανοσοαντιδραστικότητα όπως περιγράφεται ανωτέρω. Ο αριθμός των κυττάρων σε ανοσοχρώση και ολικά κύτταρα μετρήθηκαν και το ποσοστό των κυττάρων με ανοσοσήμανση υπολογίστηκε.

κηλίδες Western κηλίδος Western

διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε είτε από OVCAR3, SW626 κύτταρα ή από όγκους και η συγκέντρωση της πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη μέθοδο προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (Pierce, Rockford, IL). Κάθε δείγμα (50 μα), επί δωδεκυλ SDS-θειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου. Η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη επωάστηκε με το κλείδωμα του ορού (Thermoscientific, Pittsburgh, ΡΑ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από ολονύκτια επώαση στους 4

OC με αντίσωμα προς Βαχ, Bcl2, κασπάσης 3, διασπασμένη κασπάση 3, κασπάση 7, beclin1 ή LC3B -II (1: 1000, Cell Signaling) ή HIF-1α (1: 1000, Abcam). Μετά από πλύση με Tris-NaCl-tween ρυθμιστικό διάλυμα 20, η μεμβράνη επωάστηκε με δευτερογενή αντισώματα (1: 10.000, Abcam) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Thermoscientic).

Στατιστική ανάλυση

Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές. Όλα τα γραφικά δεδομένα εμφανίζονται ως μέσες + S.E.M. Η σημαντικότητα ελέγχθηκε με τη χρήση t-tests unpaired, δύο-ουρά του Student με άνιση διακύμανση (Microsoft Excel, Redmond, WA).

σ

& lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Α.Ε. αναστέλλει OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 πολλαπλασιασμό

Για να προσδιοριστεί εάν AE μπορεί να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ελέγξαμε την επίδρασή της σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές : 1) ένα κύτταρο ωοθηκών (OVCAR3), 2) ένα κύριο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου μετάσταση σε ωοθήκη (SW626), 3) ένα φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα πλακούντα (HS 799). Κανονική πλακούντα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί εάν ΑΕ έχει οποιαδήποτε επίδραση σε μη νεοπλασματικά κύτταρα. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε SW626 κύτταρα για να καθοριστεί εάν AE είναι ικανή να αναστέλλει όγκους που είχαν υποστεί μετάσταση από άλλους δικτυακούς τόπους στην ωοθήκη και να καθορίσει εάν τα αποτελέσματα της Α.Ε. επί OVCAR3 θα επικαλύπτονταν με άλλα καρκινικά κύτταρα. κύτταρα OVCAR3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του ΑΕ (0-1000 μg /ml) για 24 ώρα και του σχετικού αριθμού των κυττάρων συναχθεί χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Χαμηλές συγκεντρώσεις (10-200 μg /ml) του ΑΕ δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων? Ωστόσο, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανεστάλη σημαντικά σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από ΑΕ 300-1000 μg /ml (Σχήμα 1Α). Εμείς αντιμετωπίζεται φυσιολογικά κύτταρα του πλακούντα (HS 799 pl) με διαφορετικές δόσεις (100-500 μg /ml) του ΑΕ για 48 ώρα για να καθορίσει εάν ΑΕ ήταν γενικά κυτταροτοξικά, και προσδιορίστηκε ότι ΑΕ βασικά δεν είχε επίδραση επί της επιβίωσης των κυττάρων σε οποιαδήποτε από τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (Εικόνα 1Β). Εμείς αγωγή τόσο τα κύτταρα SW626 OVCAR3 και σε καλλιέργεια με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΕ για διάφορους χρόνους πριν από την εκτέλεση δοκιμασιών ΜΤΤ. Η ταχεία απώλεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού συνέβη με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΕ τόσο OVCAR3 και SW626 κύτταρα (Σχήμα 1Α, 1C, 1D). Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από AE εξαρτιόταν τόσο από τη συγκέντρωση και χρόνο επώασης (Σχήμα 1 C, 1ϋ). Η χαμηλότερη συγκέντρωση του ΑΕ που δοκιμάστηκε (100 μg /ml) προκάλεσε σημαντική αναστολή (ρ = & lt? 0.001) των κυττάρων OVCAR3 με 72 ωρών, και η υψηλότερη δόση (400 μg /ml) αναστέλλεται ισχυρά (ρ = & lt? 0.007) αύξηση του κύτταρα OVCAR3 με 12 ωρών (Σχήμα 1 C). Σε κύτταρα SW626, ΑΕ στα 100 μg /ml προκάλεσε σημαντική αναστολή κατά 48 ωρών (ρ = 0.001), και στην υψηλότερη δόση αύξηση ανεστάλη (p = & lt? 0.001) με 6 ωρών (Σχήμα 1 D)

Α. Δόση εξαρτώμενη επίδραση της ΑΕ επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων OVCAR3. Β Δόση εξαρτώμενη επίδραση της ΑΕ επί του κυτταρικού θανάτου σε φυσιολογικά κύτταρα του πλακούντα (HS-799 pl). CD. εξαρτώνται από το χρόνο και τη δόση επιδράσεις της ΑΕ στον πολλαπλασιασμό OVCAR3 (C) και τα κύτταρα SW626 (D). Ε Δόση εξαρτώμενη επίδραση του quercetin στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων OVCAR3. OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 καλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν για 2 ημέρες σε ϋΜΕΜ σε παρουσία 10% ορού, όπως περιγράφεται υπό Υλικά και Μέθοδοι. Μετά την περίοδο αυτή, οι καλλιέργειες τροφοδοτήθηκαν με μέσο που περιέχει 10% ορό και διάφορες δόσεις AE για 24 ώρες, εκτός του χρόνου της μελέτης εξαρτάται. Τα δεδομένα είναι η μέση + S.E.M. από 6 ανεξάρτητες παρατηρήσεις. *, P & lt?. 0.05, σημαντικά διαφορετικό από την ομάδα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα

Η

Κερσετίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα OVCAR3

Μετά τον προσδιορισμό ότι Α.Ε. δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα OVCAR3, ελέγξαμε εάν η θεραπεία της OC κυττάρων με διάφορες δόσεις (0-100 μg /ml) του quercetin – ένα από τα συστατικά του AE– θα μπορούσε να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα OVCAR3. Η χαμηλότερη συγκέντρωση του quercetin δοκιμάστηκαν (5 μg /ml) προκάλεσε σημαντική αναστολή (ρ = & lt? 0.01) των κυττάρων OVCAR3 από 48 ώρες, και στην υψηλότερη δόση (100 μg /ml) αναστέλλει (p = & lt? 0.005) αύξηση του OVCAR3 κύτταρα με 24 ώρες (Εικόνα 1 Ε).

ΑΕ αλλάζει τη μορφολογία του OVCAR3 και κυττάρων SW626

Αναστολή του πολλαπλασιασμού μπορεί να αλλάξει το μέγεθος και τη μορφολογία των μεμονωμένων κυττάρων [20]. Ως εκ τούτου, παρατηρήσαμε προσεκτικά τη μορφολογία του OVCAR3 και κυττάρων SW626 μετά από θεραπεία με 0-300 μg /ml ΑΕ. Η μορφολογία των κυττάρων OVCAR3 επεξεργασία με 100 και 200 ​​μg /ml ΑΕ δεν διέφερε από μη επεξεργασμένα κύτταρα μετά από 24 ώρες (Εικόνα 2 A-C), ενώ η αγωγή με 300 μg /ml γιά 24 ώρες προκάλεσε η πλειονότητα των κυττάρων για να γίνει γύρο ( Σχήμα 2D). ΑΕ επάγεται επίσης δοσοεξαρτώμενη μεταβολές στην μορφολογία των κυττάρων SW626 μετά από 24 ώρες (Σχήμα 2Ε-Η). Η στενότερη εξέταση αποκάλυψε ότι η θεραπεία με 300 μg /ml του ΑΕ για 24 ώρες επαγόμενη κυτταροπλασματικά κενοτόπια τόσο OVCAR3 και SW626 κύτταρα (Σχήματα 2J, 2Ν, 2L, 2P). Αυτές οι μορφολογικές μεταβολές υποδηλώνουν ότι ο κυτταρικός θάνατος μπορεί να συμβαίνει επειδή ο κυτταρικός θάνατος είναι μερικές φορές συνοδευόμενη από σχηματισμό κενοτοπίων [21]. Περαιτέρω πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 300 μg /ml συγκέντρωση του ΑΕ.

Α-D. εξαρτώμενη από τη δόση επίδραση της ΑΕ στη μορφολογία και η κυτταρική πυκνότητα των OVCAR3: Α = έλεγχος, Β = 100 μg /ml AE, C = 200 μg /ml ΑΕ, D = 300 μg /ml ΑΕ. E-H. Δόση εξαρτώμενη επίδραση της ΑΕ στη μορφολογία και την πυκνότητα των κυττάρων των κυττάρων SW626. Ε = Ελέγχου, F = 100 μg /ml ΑΕ, G = 200 μg /ml AE, Η = 300 μg /ml ΑΕ. I-J, M-N. ΑΕ αυξήθηκε κυτταροπλασματικά κενοτόπια στο OVCAR3. Ι και το Μ = Ελέγχου, J και Ν = 300 μg /ml ΑΕ. K-L και O-P. ΑΕ αυξήθηκε κυτταροπλασματικά κενοτόπια στο SW626. Κ και Ο = έλεγχος, L και Ρ = 300 μg /ml ΑΕ. OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 καλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν για 2 ημέρες σε ϋΜΕΜ σε παρουσία 10% ορού, όπως περιγράφεται υπό Υλικά και Μέθοδοι. Μετά την περίοδο αυτή, οι καλλιέργειες τροφοδοτήθηκαν με μέσο χωρίς ορό 10% και διαφορετικές δόσεις του ΑΕ για 24 ώρες. Μερικά από τα χυμοτόπια υποδεικνύονται με βέλη (N και P). Bar = 50 μm.

Η

AE δεν προκαλούν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε OVCAR3 και τα κύτταρα SW626

Με βάση τις μορφολογικές αλλαγές που περιγράφονται παραπάνω, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία της OC κυτταρικές σειρές με 300 μg /ml του ΑΕ θανάτου που επάγεται κύτταρο, θέλαμε να προσδιοριστεί αν η θεραπεία ΑΕ επαγόμενη απόπτωση αυτών των κυτταρικών γραμμών. Χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές προσεγγίσεις για να εξερευνήσετε αυτή τη δυνατότητα: 1) Από την εξέταση του DNA για τον κατακερματισμό ενδοπυρηνοσωμικού, ένα σήμα κατατεθέν της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, και? 2) κηλίδωση Western για ειδικές πρωτεΐνες (π.χ. bax, bcl

2, κασπάσης 3, διασπασμένη κασπάση 3 και caspase 7) που συμμετέχουν στην αποπτωτική παθολογική οδό. Για να προσδιοριστεί εάν ΑΕ προκαλείται κατάτμηση ενδοπυρηνοσωματική DNA, DNA παρασκευάζεται από τον έλεγχο και την AE-επεξεργασμένες καλλιέργειες κλασματώθηκε επί πηκτών αγαρόζης 1% 24 και 96 ώρες μετά την προσθήκη του ΑΕ (300 μg /ml). Αν και αποικοδόμηση του DNA παρατηρήθηκε σε αυτά τα παρασκευάσματα, δεν υπήρχε εμφανής κατακερματισμού του DNA ακόμη και μετά από 96 ώρες αγωγής (Σχήμα 3Α-Β), υποδηλώνοντας ότι ο κυτταρικός θάνατος δεν έλαβε χώρα μέσω απόπτωσης. Για να διερευνηθεί περαιτέρω το δυναμικό ρόλο των αποπτωτικών οδών σε θάνατο των ΑΕ επεξεργασμένων κυττάρων, κηλίδες Western για bax, bcl

2, κασπάσης 3, διασπασμένη κασπάση 3 και caspase 7 διεξήχθησαν. Σε κύτταρα OVCAR3, θεραπεία ΑΕ μειώνεται η έκφραση του bax, bcl

2 και διασπασμένη κασπάση 3 (Σχήμα 3C, 3Ε και 3θ), και δεν άλλαξε την έκφραση της κασπάσης 3 ή caspase 7 πρωτεΐνες (Σχήμα 3G και 3K). Σε κύτταρα SW626, θεραπεία ΑΕ δεν άλλαξε την έκφραση του bax, bcl

2, caspase3, ή caspase7 (Σχήματα 3D, 3F, 3Η και 3L) και μείωσε την έκφραση διασπασμένης κασπάσης 3 (Σχήμα 3J). Συλλογικά, τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι apopotic μονοπάτια δεν ενεργοποιούνται σε ΑΕ κυτταρικές σειρές OC αντιμετωπίζονται.

Α-Β. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες του κατακερματισμού του DNA σε κύτταρα OVCAR3 (Α) και τα κύτταρα SW626 (Β). OVCAR3 και SW626 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 μg /ml ΑΕ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Μετά την επεξεργασία, το DNA εκχυλίζεται και ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1%. Το μέγεθος σε ζεύγη βάσεων των δεικτών μοριακού βάρους (λωρίδα) υποδεικνύεται παράλληλα με την γέλη. Ο αριθμός στην δεξιά πλευρά δείχνει το μήκος σε νουκλεοτίδια για αρκετές από τις ζώνες. C24 = Έλεγχος 24 ώρες, C96 = Έλεγχος 96 ωρών, Τ24 = AE 24 θεραπεία ώρας, T96 = AE 96 θεραπεία ώρα, + C = Θετικός μάρτυρας, S = τυπικό μέγεθος του DNA. C-L. Εκφράσεις των αποπτωτικών πρωτεϊνών μετά τη θεραπεία ΑΕ (300 μg /ml) σε OVCAR3 και τα κύτταρα SW626. Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες των Western blot του Βαχ (C, D), Bcl

2 (E, F), κασπάσης 3 (G, H), που διασπάται κασπάσης 3 (i, j), Κασπάση 7 (K, L) σε OVCAR3 (C, E, G, I, K) και SW626 (D, F, η, J, L) κυττάρων μετά κατεργασία ΑΕ εμφανίζονται στην κορυφή. β-ακτίνη ανιχνεύθηκε ως έλεγχος για κάθε κηλίδα. Το ιστόγραμμα που αντιστοιχεί σε κάθε φωτογραφία αντιπροσωπεύει την αναλογία του πυκνομετρική ανάλυση της κάθε ζώνης με το αντίστοιχο β-ακτίνης μπάντα. Η καλλιέργεια υπέστη κατεργασία με 0 ή 300 μg /ml ΑΕ για 24 ώρα. Μετά τη θεραπεία, πρωτεΐνη από OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 εκχυλίζεται και 30 μg πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE. Η πρωτεΐνη στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοστυπώθηκαν έναντι αντισώματα σχετίζονται με την απόπτωση – Bax, Bcl

2, κασπάσης 3, διασπασμένη κασπάση 3 ή Caspase 7. Οι τιμές είναι μέσοι + S.E.M. 4 ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

AE προκαλεί αυτοφαγία στην OVCAR3 και SW626 κύτταρα

Πρόσφατα

in vivo

και

in vitro.

στοιχεία δείχνουν ότι ένας αριθμός των αντικαρκινικών φαρμάκων ασκούν τη δράση τους, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω των επιπτώσεών τους στην αυτοφαγία [22,23]. Οι μελέτες παραπάνω πρότεινε ότι apopotic οδοί δεν ενεργοποιήθηκαν από τη θεραπεία ΑΕ, γι ‘αυτό επέλεξε να καθορίσει αν αυτοφαγία ενεργοποιήθηκε στην ΑΕ αντιμετωπίζονται OC κύτταρα. Συγκεκριμένα, αντιμετωπίζονται OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 με ΑΕ να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα επί της εκφράσεως του αυτοφαγικά Πρωτεΐνες beclin1 και LC3B-II χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία και ανοσοστύπωση τεχνικές. Ανοσοαντιδραστικότητα για τις δύο beclin1 και LC3B-ΙΙ ήταν παρούσα σε μη επεξεργασμένα OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 (σχήμα 4 Α, Β, Ε, F). Η ένταση της ανοσοχρώσης και τον αριθμό των ανοσοθετικών κυττάρων, ωστόσο, αυξήθηκαν με αγωγή ΑΕ [Εικόνα 4 Α-Η]. Η ανάλυση στυπώματος Western ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα των ανοσοχρώση, αποδεικνύοντας ότι η αγωγή ΑΕ αύξησε την έκφραση του beclin1 και LC3B-ΙΙ τόσο OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 (σχήμα 4 Ι-Ρ). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αυτοφαγία δραστηριοποιείται στην ΑΕ επεξεργασμένα κύτταρα. Μελετήσαμε επίσης την έκφραση των πρωτεϊνών αυτοφαγικά beclin1 και LC3B-ΙΙ μετά τη θεραπεία κερκετίνη (5 μg /ml για 48 ώρα) σε κύτταρα OVCAR3 χρησιμοποιώντας ανοσοστύπωση. Έκφραση των beclin1 και LC3B-ΙΙ ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα επεξεργασμένα quercetin από μάρτυρα (Σχήμα 4 Q-T).

Ανοσοβαφή beclin1 και LC3B-ΙΙ OVCAR3 και κύτταρα ελέγχου SW626 και μετά από επεξεργασία με 300 μg /ml ΑΕ (Α, Β, Ε και F). Τα ιστογράμματα δείχνουν το ποσοστό των beclin1 (Γ και Δ) και LC3B-ΙΙ (G και Η) ανοσοθετικών κυττάρων ως ποσοστό των συνολικών κυττάρων. OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 καλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν για 2 ημέρες σε ϋΜΕΜ με την παρουσία 10% ορού, όπως περιγράφεται υπό Υλικά και Μέθοδοι. Μετά την περίοδο αυτή, οι καλλιέργειες τροφοδοτήθηκαν με μέσο που περιέχει 10% ορό και ΑΕ για 24 ώρες. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε 400 χ μεγέθυνση. Έκφραση beclin1 σε ολική πρωτεΐνη του OVCAR3 (Ι) και τα κύτταρα και έκφραση LC3B-ΙΙ σε ολική πρωτεΐνη των κυττάρων OVCAR3 (Μ) και SW626 (N) SW626 (J) μετά από επεξεργασία με ΑΕ (300 μg /ml) για 24 ώρες. Εκπρόσωπος φωτογραφία Western Blot για beclin1 και LC3B-II εμφανίζονται στην κορυφή. β-ακτίνη ανιχνεύθηκε ως έλεγχος για κάθε κηλίδα. Σημαίνει + S.E.M. Οι τιμές του πυκνομετρική αναλογία beclin1 (Κ και L) και LC3B-ΙΙ (Ο και Ρ) με β-ακτίνη εμφανίζεται στο κάτω μέρος του κάθε αντίστοιχου γέλης. Q-T: θεραπεία Quercetin (5 μg /ml για 48 ώρα) επάγει έκφραση του beclin1 (Q, R) και LC3B-ΙΙ (S, T) σε κύτταρα OVCAR3. Μετά τη θεραπεία, πρωτεΐνη από OVCAR3 και τα κύτταρα SW626 εκχυλίστηκε και 50 μg πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE. Η πρωτεΐνη στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοστυπώθηκαν έναντι beclin1 και LC3B-ΙΙ αντισώματα. Μετά ανοσοανίχνευση, beclin1 και LC3B-ΙΙ θετικών ζωνών μετρήθηκαν πυκνομετρικά και κανονικοποιήθηκαν με τιμές β-ακτίνης. Οι τιμές είναι μέσα + S.E.M. 6 ανεξάρτητα πειράματα. *, Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Bar = 50 μm.

Η

Α.Ε. αναστέλλει γονίδια που σχετίζονται με την αγγειογένεση σε κύτταρα OVCAR3

Εν όψει του γεγονότος ότι ένας αυξανόμενος μάζα όγκου πρέπει να καθιερώσει μια αγγειακή παροχή, και τις πρόσφατες αναφορές ότι η αγγειογένεση θα μπορούσε να ανασταλεί από βότανα που περιλαμβάνονται ΑΕ [8], θελήσαμε να καθοριστεί αν AE θα μπορούσε να αναστείλει την αγγειογένεση

in vitro

. Συγκεκριμένα, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της αγωγής ΑΕ για την έκφραση των γονιδίων σε αγγειογόνου AE-αγωγή (300 μg /ml) και μη κατεργασμένα κύτταρα OVCAR3 χρησιμοποιώντας την Array Ανθρωπίνων Αγγειογονικοί OligoGE οποία ανιχνεύει 112 γονίδια που εμπλέκονται συγκεκριμένα στην αγγειογένεση (SA Bioscience Corporation). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τρεις ανεξάρτητες μελέτες και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 5 Α-ϋ. Πολλά γονίδια (πράσινο

*) εκφράστηκαν σε μειωμένα επίπεδα στα AE-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένους μάρτυρες (Σχήμα 5Β). Ένα clustergram απεικονίζει τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε έλεγχο και AE-επεξεργασμένες καλλιέργειες φαίνεται στο Σχήμα 5C. Η έκφραση του COL4A3, CXCL6, ECGF1, EFNB2, FGF2, IL-1β, PDGFB, TNFRSF12A και HIF-1α μειώθηκαν σε λιγότερο από το 40% των επιπέδων ελέγχου (Σχήμα 5D), με HIF-1α αναστέλλεται σε μεγαλύτερο βαθμό.

Α. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των πολύ μικρών πίνακα από τον έλεγχο και την AE-επεξεργασία του πολιτισμού. Η καλλιέργεια υπέστη κατεργασία με 0 ή 300 μg /ml ΑΕ για 24 ώρες. Μετά τη θεραπεία, RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ μέθοδο εκχύλισης. Οι SuperArray μεμβράνες υβριδοποιήθηκαν με βιοτίνη επισημασμένο cDNA, επωάστηκαν με συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση στρεπταβιδίνη, η έκφραση του γονιδίου ανιχνεύθηκε με το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας CDP-Star. Β Εκπρόσωπος σκέδασης του AE-αγωγή εναντίον καλλιέργειες κυττάρων ελέγχου. Πολλά γονίδια (πράσινο

*) είναι υπό εκφράζεται στην ομάδα AE-θεραπεία. Γ Αριστερός πίνακας: χάρτης θερμότητας (clustergram) του ελέγχου και της ΑΕ-επεξεργασμένες καλλιέργειες. Εννέα γονίδια τα οποία μειώνονται κατά περισσότερο από 70% που υποδεικνύεται από αιχμές βελών στη δεξιά πλευρά του χάρτη θερμότητας. Μεσαίο πάνελ: Μια διευρυμένη χάρτη θερμότητας που δείχνουν μειωμένη έκφραση του HIF-1α στην ομάδα AE-θεραπεία. Δεξιό πλαίσιο: Το μέγεθος της γονιδιακής έκφρασης. Δ Γραφική αναπαράσταση της σχετικής γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας παγκόσμιο υπόβαθρο και GAPDH ως γονίδιο αναφοράς και να μετατραπεί σε πολλαπλή μεταβολή τιμές (ΑΕ έναντι του ελέγχου).

Η

ΑΕ αναστέλλει την έκφραση του HIF-1α in vitro

στα παραπάνω πειράματα, αποδείξαμε ότι η θεραπεία ΑΕ κατασταλεί έκφραση πολλών γονιδίων που σχετίζονται με την αγγειογένεση. Για να καθοριστεί εάν μειωμένη έκφραση του γονιδίου αντιστοιχούσε σε μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης, εξετάσαμε ειδικά το αποτέλεσμα της αγωγής επί της παραγωγής ΑΕ του HIF-1α πρωτεΐνης σε κύτταρα OVCAR3 χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία και κηλίδες Western. Τόσο ανοσοκυτταροχημεία και τα αποτελέσματα κηλίδος Western έδειξαν σημαντικά μειωμένη έκφραση του HIF-1α σε καλλιέργειες OVCAR3 κυττάρων (Σχήμα 6 Α-Β), υποστηρίζοντας περαιτέρω την ιδέα ότι θεραπεία ΑΕ καταστέλλει την αγγειογένεση.

A. Μικροφωτογραφία δείχνοντας μειωμένη έκφραση του HIF-1α immunostatining σε κύτταρα OVCAR3 μετά τη θεραπεία ΑΕ. Το ιστόγραμμα δείχνει το ποσοστό των ανοσοθετικών κυττάρων HIF-1α σχέση με το σύνολο των κυττάρων. κύτταρα OVCAR3 καλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν και κατεργάστηκαν με 0 ή 300 μg /ml του ΑΕ για 24 ώρες. Τα κύτταρα ανοσοχρώση με το αντίσωμα HIF-1α και φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 400Χ. Bar = 50 μm. Οι τιμές είναι μέσα + S.E.M. 4 ανεξάρτητα πειράματα. *, Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. B. Ένα αντιπροσωπευτικό φωτογραφία στυπώματος Western για HIF-1α δείχνεται στην κορυφή. β-ακτίνη ανιχνεύθηκε ως έλεγχος για κάθε κηλίδα. Σημαίνει + S.E.M. Οι τιμές του πυκνομετρική αναλογία του HIF-1α και β-ακτίνης εμφανίζεται στο κάτω μέρος της γέλης. Μετά ανοσοανίχνευση, ο όγκος του HIF-1α θετικών ζωνών μετρήθηκε πυκνομετρικά και ομαλοποιήθηκε με τιμές β-ακτίνης. Οι τιμές είναι μέσα + S.E.M. 4 ανεξάρτητα πειράματα. *, Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. C. Το ιστόγραμμα δείχνει την συνεργιστική δράση των ΑΕ σε παρουσία διαφορετικών δόσεων cisplatin επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα OVCAR3.