Αφηρημένο

Ιστορικό

Πολλά ανάλογα βιταμίνης D εμφάνισαν χαμηλά ποσοστά ανταπόκρισης, υψηλή συστημική τοξικότητα και υπερασβεστιαιμία σε δοκιμές σε ανθρώπους για τη θεραπεία του καρκίνου. Ταυτοποιήσαμε το πρώτο μη-υπερασβεσταιμικό αντικαρκινική βιταμίνη D αναλογικό MT19c με μεταβολή της Α-δακτυλίου του ergocalciferol. Η μελέτη αυτή περιγράφει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα και το μηχανισμό δράσης των MT19c τόσο

in vitro

και

in vivo

μοντέλα.

Μεθοδολογία /Principal εύρεση

Αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του MT19c αξιολογήθηκε σε καρκινικές κυτταρικές ωοθηκών (SKOV-3) ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια και ένα μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών συγγενή αρουραίου. Μετρήθηκαν επίπεδα ασβεστίου στον ορό του MT19c ή ζώα που έλαβαν καλσιτριόλη. In-silico προσομοίωση μοριακής σύνδεσης και μια δοκιμασία ρεπόρτερ VDR βασίζεται κυττάρων αποκάλυψε την αλληλεπίδραση MT19c-VDR. ανάλυση Genomewide mRNA των όγκων αντιμετωπίζονται MT19c προσδιορίζονται οι στόχοι των ναρκωτικών που είχαν ελεγχθεί από ανοσοαποτύπωση και μικροσκοπία. Ποσοτικοποίηση των κυτταρικών CoA μηλονυλο διεξήχθη με HPLC-MS. Μια μελέτη δέσμευσης με τον υποδοχέα PPAR-Υ εκτελέστηκε. MT19c μειωμένη ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών σε ξενομόσχευμα και συγγενικά ζωικά μοντέλα, χωρίς να προκαλεί υπερασβεστιαιμία ή οξείας τοξικότητας. MT19c είναι ένας ασθενής υποδοχέας βιταμίνης D (VDR) ανταγωνιστή που αναστάτωσε την αλληλεπίδραση μεταξύ VDR και συνενεργοποιητή SRC2-3. Ανάλυση mRNA γονιδίωμα-ευρεία και Western Blot και μικροσκοπία των όγκων ξενομοσχεύματος αντιμετωπίζονται MT19c έδειξαν αναστολή της συνθάσης των λιπαρών οξέων (FASN) δραστηριότητα. MT19c μειωμένη κυτταρικά επίπεδα του μηλονυλο CoA σε SKOV-3 κύτταρα και ανέστειλαν EGFR /φωσφοϊνοσιτόλης-3kinase (ΡΙ-3Κ) δραστηριότητα ανεξάρτητα από πρωτεΐνη PPAR-γάμμα.

Η σημαντικότητα

Αντικαρκινική αποτελέσματα των μη υπερασβεστιαιμικών MT19c πράκτορας παρέχει μια νέα προσέγγιση στο σχεδιασμό της βιταμίνης-D που βασίζεται αντικαρκινικά μόρια και μια λογική για την ανάπτυξη MT19c ως ένας θεραπευτικός παράγοντας για κακοήθεις όγκους των ωοθηκών με τη στόχευση ογκογόνο

de novo

λιπογένεσης.

Παράθεση: Moore RG, Lange TS, Robinson Κ, Kim ΚΚ, Uzun Α, Horan TC, et al. (2012) Η αποτελεσματικότητα ενός μη-Υπερασβεσταιμική Βιταμίνη D2 Προέρχεται Αντικαρκινικό Agent (MT19c) και Αναστολή των λιπαρών οξέων Σύνθεση σε καρκίνο των ωοθηκών μοντέλο ξενομοσχεύματος. PLoS ONE 7 (4): e34443. doi: 10.1371 /journal.pone.0034443

Επιμέλεια: Olivier Gires, Πανεπιστήμιο Ludwig-Maximilians, Γερμανία

Ελήφθη: 6 Ιουλίου, 2011? Δεκτές: 2, Μάρτη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 3, Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Moore et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. RKS και LB αναφέρονται ως συν-εφευρέτες σε εκκρεμότητα αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας. Heterocycles και παράγωγα αυτών και μεθόδους παρασκευής και θεραπευτική χρήση των ΗΠΑ 2009/0221529 Α1. Το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έχει ανατεθεί σε γυναίκες και βρέφη Νοσοκομείο RI, το παρόν εργοδότη του συγγραφέα RKS, TSL, KKK, RGM, ΝΚ, TCH, KR, JFP, MDP, SC, και ΝΗ. Κανένα άλλο συμβουλών, προϊόντα για την ανάπτυξη που σχετίζονται με αυτόν τον παράγοντα υπάρχουν. Κανένα από τα γεγονότα που αναφέρονται παραπάνω μεταβάλλουν adherance των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία των δεδομένων και των υλικών.

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικές κακοήθειες. καρκίνων σε πρώιμα στάδια είναι ως επί το πλείστον ασυμπτωματικές, και οι περισσότερες από τις διαγνώσεις σε παρουσίαση ανιχνεύουν ιδρύθηκε περιφερειακές ή απομακρυσμένες μεταστάσεις [1]. Η πλειονότητα των ασθενών που θα βιώσουν υποτροπιάζουσα νόσο, καθώς και αντίσταση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης του καρκίνου των ωοθηκών σε προχωρημένο στάδιο έχει γίνει έγκαιρη διάγνωση, την κατανόηση της αιτιολογίας της νόσου και τη στόχευση των συγκεκριμένων χαρακτηριστικών γνωρισμάτων, όπως τις κορυφαίες προτεραιότητες στην έρευνα για τον καρκίνο [1].

Αυξημένη

de novo

λιπαρών οξέων σύνθεση είναι το σήμα κατατεθέν του καρκίνου [2], [3]. Otto Warburg παρατηρήθηκε για πρώτη φορά ενισχυμένη αναερόβια γλυκόλυση στα καρκινικά κύτταρα [4]. Φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς χρήση διατροφικών λιπών για τη σύνθεση της νέας διαρθρωτικής λιπιδίων, ενώ διαρκώς πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα για άγνωστους λόγους αποφεύγουν τη χρήση των διατροφικών λιπών και πραγματοποιεί ανεξάρτητες

de novo

σύνθεση των λιπαρών οξέων για την παροχή συνεχώς για την παραγωγή μεμβρανών, την παραγωγή ενέργειας και το λιπίδιο τροποποίηση πρωτεϊνών [4].

De novo

λιπαρών οξέων σύνθεση περιλαμβάνει δύο βασικά ένζυμα? ακετυλο Co-Α καρβοξυλάσης (ACC) και λιπαρών οξέων συνθάσης (FASN). ACC-καρβοξυλικά ακετυλο-CoA να σχηματίσουν μηλονυλο CoA. Το προϊόν μηλονυλο-ΟοΑ μετατρέπεται περαιτέρω με FASN σε λιπαρά οξέα μακράς αλυσίδας. Τα πρόσφατα συντίθενται λιπαρά οξέα αποθηκεύονται από λιπολυτική PPAR-γ να αποφευχθεί η τοξικότητα των λιπαρών οξέων. Ως εκ τούτου, απορρυθμισμένη λειτουργίες lipogenic ενζύμων FASN και ACC που εμπλέκονται στην

de novo

λιπαρών οξέων σύνθεση σε συνδυασμό με λιπολυτική PPAR-γ παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην προώθηση της επιβίωσης των κυττάρων του όγκου σε πολλαπλά επίπεδα.

Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει υπερέκφραση του FASN σε επιθηλιακού καρκίνου των ανθρωπίνων ωοθηκών (EOC) [5] – [8] και καρκίνους του μαστού [9], του προστάτη [10], του παχέος εντέρου [11], του πνεύμονα [12], του ενδομητρίου [13] και θηλώδες θυρεοειδούς [14]. Ένα ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχίες αποτελείται από περισσότερα από 6.000 ανθρώπινα γονίδια που ταυτοποιούνται συνθάσης λιπαρού οξέος (FASN) ως δυνητικό θεραπευτικό ή μοριακό στόχο σε EOC [15]. Στη συνέχεια, μια φαρμακολογική στόχευση FASN από το φυσικό κερουλενίνη προϊόν και ένα συνθετικό μόριο C75 κατέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών και του μαστού σε μοντέλα ζώων [16] – [17]

Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι MT19c είναι μια νέα κατηγορία αντικαρκινικών παράγοντα που στοχεύει τα κρίσιμα συστατικά του

de novo

μηχανήματα σύνθεσης λιπαρού οξέος σε όγκους των ωοθηκών καρκίνο ξενομοσχεύματος και τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. MT19c είναι μια νέα βιταμίνη D2-προερχόμενο παράγοντα που ασκείται κανένα υπερασβεστιαιμική επιδράσεις και εμφανίζεται πολύ υψηλούς δείκτες ασφαλείας σε γυμνούς ποντικούς. MT19c είναι ένας ασθενής ανταγωνιστής VDR που διαταράσσουν τις αλληλεπιδράσεις VDR-συνενεργοποιητή και δεν παρουσιάζουν κλασσική αλληλεπιδράσεις καλσιτριόλη-VDR [18]. Σε χαμηλές δόσεις MT19c, των ωοθηκών ξενομοσχεύματος όγκους ή συγγενικά αρουραίους έδειξαν μερική έως πλήρης απόκριση και παρέτεινε την επιβίωση σημαντικά σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου. Αυτή η μελέτη περιγράφει μια νέα προσέγγιση για το σχεδιασμό ασφαλών και αποτελεσματικών τάξη αντικαρκινικών παραγόντων της βιταμίνης Α που στερούνται υπερασβεστιαιμία καθώς και κλασικές τοξικότητες τύπος βιταμίνης-D. Επιπλέον, τα δεδομένα που παρέχονται στο παρόν επαληθεύεται ότι η τρέχουσα έμφαση στη στόχευση

de novo

μηχανήματα ένζυμο σύνθεσης λιπαρών οξέων για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών είναι μια βιώσιμη προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου στον άνθρωπο των ωοθηκών, και με βάση αυτή τη μελέτη MT19c έχει αναγνωριστεί ως μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για την κλινική αξιολόγηση σε ασθενείς με ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

μελέτες αποτελεσματικότητας των MT19c σε μοντέλα ζώων ΕΓΚ

Η αποτελεσματικότητα κατά των όγκων των MT19c (Εικ. 1Α) ήταν μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινο κύτταρο EOC προέρχονται ξενομοσχεύματα σε γυμνούς (/NU NU) ποντικούς, καθώς και τον καρκίνο των ωοθηκών αρουραίο με βάση το μοντέλο συγγενή αρουραίου Fisher-344 αρουραίους. Για την πρώτη μελέτη κυττάρων SKOV-3 αιωρήθηκε σε matrigel εμβολιάσθηκαν υποδορίως σε μία πλευρά κάθε ζώου. Τα ζώα αποδόθηκαν σε μία θεραπεία (n = 20) ή μια ομάδα ελέγχου (n = 10). Όχημα ή MT19c (5 mg /kg σωματικού βάρους) χορηγήθηκε ΙΡ κάθε δεύτερη ημέρα για 60 ημέρες σε ποντικούς που φέρουν SKOV-3 που προέρχεται όγκους. Τα ζώα ζυγίστηκαν (Σχήμα 1Β, κάτω πλαίσιο) και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε (Σχήμα 1Β, άνω πάνελ) κάθε 5 ημέρες. Κανονική αύξηση του σωματικού βάρους και για τους δύο οχημάτων και τα ποντίκια που πήραν φάρμακο παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Το μέγεθος του όγκου αυξήθηκε στα ζώα ελέγχου με ένα μέσο όρο αύξηση κατά 2-φορές του όγκου κατά την διάρκεια διαμέτρου τη δοκιμαστική περίοδο. Στην ομάδα θεραπείας, το μέγεθος του όγκου μειώθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια των τελευταίων 15 ημερών θεραπείας με 5 από 8 ζώα που εμφανίζουν πλήρη ανταπόκριση (Σχ. 1 Β, άνω πίνακας). τα ποσοστά επιβίωσης των ζώων ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου (p = 0,0001, σχ. 1C) με βάση την ανάλυση Kaplan-Meier. Κατά τη διάρκεια της περιόδου αξιολόγησης, τα ποντίκια έλαβαν όχημα φτάσει στο τελικό σημείο (διάμετρος όγκου 10 mm) εντός 20 ημερών θεραπείας, ενώ ένα μέρος των υπό θεραπεία ζώων MT19c επιβίωσαν μέχρι το τέλος της μελέτης.

(Α) χημική δομή της MT19c. (Β) αντικαρκινική δράση του MT19c σε ένα μοντέλο EOC σε ποντικούς. Γυμνά ποντίκια (20 αγωγή και 10 έλεγχοι) που φέρει SKOV-3 που προέρχεται ξενομοσχευμάτων όγκου δοσολογήθηκαν (ΙΡ) είτε με τον έλεγχο του οχήματος ή MT19c (5 mg /kg σωματικού βάρους) σε εναλλασσόμενες ημέρες για 60 ημέρες. Το μέγεθος του όγκου υπολογίσθηκε (άνω πάνελ) χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο κάθε 5 ημέρες και το βάρος καταγράφεται (κάτω πίνακας). ανάλυση επιβίωσης (C) Kaplan-Meier. ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier για MT19c και ποντίκια υπό αγωγή με όχημα πραγματοποιήθηκε με τη χρήση STATA 9 (StataCorp, College Station, TX) και SAS 9.1 λογισμικό (SAS Institute, Cary, NC). (Δ) Η αποτελεσματικότητα του MT19c σε ένα συνγονιδιακό μοντέλο EOC σε αρουραίους. Fisher 344 αρουραίοι (3 ζώα /ομάδα αγωγής) έλαβαν ένεση ΙΡ με EOC κύτταρα αρουραίου Nuţu-19. Μετά από 3 εβδομάδες, είτε MT19c (100 ή 500 μg /kg σωματικού βάρους) ή όχημα εγχύθηκαν ΙΡ ημερησίως για 12 ημέρες. ιστοί όγκου συλλέχθηκαν και επιπλοϊκά βάρος (D-1), ο όγκος ασκητικό (D-2) και το σωματικό βάρος (D-3) που καταγράφονται. Mean επιπλοϊκά βάρους και όγκου συγκρίθηκαν με έλεγχος τ με άνισες διακυμάνσεις. Το κατώτερο πάνελ απεικονίζει την απόκριση δείκτη (D-4).

Η

ως ανεξάρτητη προσέγγιση για τον προσδιορισμό της αντικαρκινική δράση του MT19c

in vivo

χρησιμοποιήσαμε ένα καλά καθορισμένο συγγενικό αρουραίο μοντέλο EOC [19] Fisher 344 αρουραίοι χωρίστηκαν σε δύο ομάδες αγωγής των 3 ζώων εκάστη και μία ομάδα ελέγχου. Nuţu-19 κύτταρα ΕΓΚ αρουραίων ενέθηκαν IP. Μετά από 3 εβδομάδες, είτε 0.1 ή 0.5 mg MT19c /kg σωματικού βάρους ή όχημα ενέθηκαν ΙΡ καθημερινά. Ένας μέσος όρος 22 ml του ασκιτικού υγρού συλλέχθηκε σε ζώα ελέγχου στο τελικό σημείο της μελέτης (Εικ. 1 D, όγκος ασκίτη). Πολλαπλές μικρούς όγκους (0,1-1,5 cm σε διάμετρο) παρατηρήθηκαν στο επίπλουν, έντερο, το διάφραγμα, περιτοναϊκό τοίχωμα, και η επιφάνεια όλων των άλλων κοιλιακά όργανα. θεραπεία MT19c δοσοεξαρτώμενο μειωμένο μέσο σχηματισμού ασκίτη στα 0,5 mg kg σωματικού βάρους /και κατέστειλε το σχηματισμό οζιδίων του όγκου. Ομοίως, η θεραπεία MT19c δοσοεξαρτώμενο μείωσε το μέσο επιπλοϊκά βάρους (Σχ. 1D). Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε ένα πολύ χαμηλή δόση MT19c σε σύγκριση με τη μελέτη της οξείας τοξικότητας (400 mg /kg σωματικού βάρους) ή την ανωτέρω μοντέλο ποντικών ξενομοσχεύματος και μελέτη μακροπρόθεσμης τοξικότητας (5 mg /kg σωματικού βάρους? 10 × μεγαλύτερο). Αξίζει να σημειωθεί ότι, στη δόση των 0,5 mg MT19c /kg σωματικού βάρους κάθε 3 ζώα που υπέστησαν αγωγή παρουσίασαν υποχώρηση του όγκου (Σχ. 1 D, δείκτης απόκρισης). Ένα ζώο έδειξε μία πλήρη απόκριση. βάρη των ζώων στις δύο ομάδες ελέγχου και θεραπείας αυξήθηκαν κατά τη διάρκεια αυτού του πειράματος (Σχ. 1D).

επιπτώσεις MT19c στα επίπεδα του ασβεστίου στον ορό και τοξικολογικές μελέτες σε ζωικά μοντέλα

Σήμερα είναι γνωστό καλσιτριόλη /βιταμίνη D3-αναλόγων προκαλέσει υπερασβεστιαιμία. Ως εκ τούτου, διερευνάται εάν MT19c μπορεί να προκαλέσει υπερασβεστιαιμία σε ζώα παρά αλλαγμένη διαμόρφωση Α-δακτυλίου. Στα ζώα, MT19c δεν προκάλεσε υπερασβεστιαιμία κατά τη διάρκεια 35 ημερών της δίκης των ζώων. Calcitriol έδειξαν επίπεδα ασβεστίου σημαντικά υψηλότερη ορού (15,5 mg /dL) κατά το τέλος της θεραπείας από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή MT19c (~ 10 mg /dL), η οποία ήταν πιο κοντά στα επίπεδα του ασβεστίου στην ομάδα ελέγχου (ρ & lt? 0,05) (Εικ. 2Α).

(Α) επίπεδα ασβεστίου στον ορό σε ποντίκια μετά από αγωγή MT19c. 8 ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με MT19c (5 mg /kg σωματικού βάρους) ή καλσιτριόλη (10 μg /kg σωματικού βάρους) ή όχημα (EtOH) για 35 ημέρες, το αίμα συλλέγεται και ασβεστίου στον ορό αναλύθηκαν σε ημέρα 35. Μεταβολή της μέσης ασβεστίου ορού ήταν σημαντική ( P & lt? 0,05) σε σύγκριση μεταξύ των ομάδων από την T-test του Student με άνισες διακυμάνσεις (Β) μελέτη οξείας τοξικότητας των MT19c. MT19c ή όχημα χορηγήθηκε σε γυμνούς ποντικούς και τα ζώα παρακολουθήθηκαν για οποιαδήποτε παρατηρήσιμη τοξικότητα. (Γ) MT19c σε ένα VDR-αγωνιστή ή ανταγωνιστή διαλογής. VDR-υπερεκφράζουν VDR-UAS-bla κύτταρα ΗΕΚ 293Τ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 5 ώρες με καλσιτριόλη /βιταμίνη-D3 (0.1 ΡΜ-1 ηΜ? Αριστερό πάνελ) ή MT19c (1 ηΜ-1 μΜ? Μεσαίο πλαίσιο) και VDR-ενεργοποίηση αναλύθηκε. Για να αναλυθεί ανταγωνιστικές δράσεις η δοκιμασία διεξήχθη (SelectScreen® κυττάρων βασίζεται πυρηνικού υποδοχέα Profiling Υπηρεσίες: https://www.invitrogen.com) μετά από κυτταρική διέγερση με καλσιτριόλη /βιταμίνη-D3 (120 ρΜ) και θεραπεία με MT19c (1 ηΜ -1 μΜ? δεξί πάνελ?) για 5 ώρες. (D) Σύνοψη των βασικών χαρακτηριστικών του MT19c και συναφών ενώσεων. Σύγκριση των MT19c με με καλσιτριόλη και άλλες κλινικά σημαντικές βιταμίνες δ παράγωγα.

Η

Μια μελέτη οξείας τοξικότητας για τον προσδιορισμό της ασφάλειας των MT19c διεξήχθη από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) σε αθυμικά γυμνά ποντίκια. MT19c χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά (ΙΡ) σε δόσεις των 400, 200, παρακολουθήθηκαν 100 mg /kg σωματικού βάρους (ένα ζώο /δόση) και τα ζώα για μια περίοδο 13 ημερών (Εικ. 2Β) για την εγγραφή των παρατηρήσιμη τοξικότητα (βλέπε Υποστηρικτικά Πληροφορίες S1) . MT19c δεν παρουσίασαν καμία τοξικότητα σε οποιαδήποτε από τις τρεις δόσεις που δοκιμάστηκαν. Οξεία τοξικότητα μέτρα της συγκέντρωσης που θα επηρεάσει αρνητικά την υγεία του ζώου, και φονικότητα είναι η πιο κοινή τελικό σημείο.

MT19c δεν επηρεάζει VDR μεταγραφή σε κύτταρα

MT19c έδειξε ένα ασθενές ανταγωνιστική δράση σε φθορισμό δοκιμασία πόλωσης χρησιμοποιώντας το πεδίο σύνδεσης VDR συνδέτης και ένα φθορίζον επισημασμένο πεπτίδιο συνενεργοποιητή [20]. Για τον προσδιορισμό μεταγραφική ρύθμιση του VDR στα κύτταρα κατά την αγωγή MT19c χρησιμοποιήσαμε μια λειτουργική δοκιμασία-VDR-ρεπόρτερ με βάση τα κύτταρα (GeneBLAzer® Technology, www.invitrogen.com) χρησιμοποιώντας μετασχηματισμένα ΗΕΚ293 κύτταρα (βλέπε Υποστηρικτικά Πληροφορίες S1). Αυτά τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ εκφράζουν μια πρωτεΐνη σύντηξης του VDR-LBD-GAL4 δέσμευσης DNA τομέα, η οποία ενεργοποιείται από καλσιτριόλη και επάγει τη μεταγραφή ενός γονιδίου αναφοράς β-λακταμάσης. Η μεταγραφική ενεργοποίηση του VDR παρουσία MT19c προσδιορίσθηκε μετά από 5 ώρες προ-αγωγή με την καλσιτριόλη ελέγχου (0.1 ΡΜ-1 ηΜ) (Σχ 2C?. Αριστερός πίνακας). Ή MT19c (1 ηΜ-1 μΜ) (Σχ 2C ? μεσαίο πλαίσιο). Καλσιτριόλη προκάλεσε VDR-ενεργοποίηση σε 22:00 (IC

50~30 μ.μ.). MT19c δεν έδειξε αγωνιστική δραστηριότητα στις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν. Για την ανάλυση ανταγωνιστικές δράσεις, τα κύτταρα διεγείρονται με καλσιτριόλη (120 ρΜ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MT19c (1 ηΜ-50 μΜ) (Εικόνα 2C?. Δεξί πάνελ) για 5 ώρες. MT19c ανέστειλε καλσιτριόλη επαγόμενη VDR-ενεργοποίηση μόνο σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις (IC

50~30 μΜ). Έτσι MT19c αναδειχθεί ως ένα εξαιρετικά αδύναμο ανταγωνιστή VDR δεν φθάνει βιολογική σημασία. MT19c είναι περίπου 1000 φορές λιγότερο ισχυρός ανταγωνιστής VDR από ΤΕΙ-9647 ή ZK159222 [21].

Μοριακή Docking Προσομοίωση (MDS) του VDR και MT19c αλληλεπίδραση

Τα περισσότερα από τα σήμερα γνωστά καλσιτριόλη /βιταμίνη -θ3 ανάλογα είναι VDR αγωνιστές. Για μοριακή εικόνα για την πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ MT19c με το VDR χρησιμοποιήσαμε μια MDS βασίζεται στη δομή των MT19c και το VDR liganded σε καλσιτριόλη (ΠΠ ID: 1DB1) [22] χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ΑυΤΌϋΟΟΚ 4.0 [23]. επιλέγεται Πιθανές σύμπλοκα πρωτεΐνης-συνδετήρα βασίστηκαν στην πρόσδεση ελεύθερης ενέργειας και της διάπλασης με τη χαμηλότερη ενέργεια αγκυροβολημένο επιλέχθηκε ως πιθανό υποψήφιο για αλληλεπίδραση /VDR MT19c. Σύκο. 3Α απεικονίζει το MDS για VDR και καλσιτριόλη (αριστερό πάνελ) ή MT19c (δεξί πάνελ). Στο θύλακα σύνδεσης του VDR, τα υπολείμματα που βρίσκονται σε επαφή με καλσιτριόλη χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορά (Εικ. 3Β) και για MT19c τα ίδια υπολείμματα επιλέχθηκαν για τον χαρακτηρισμό αλληλεπιδράσεων. Παρατηρήσαμε ότι MT19c απέκτησε ένα ανεστραμμένο διαμονή στο πεδίο σύνδεσης συνδετήρα VDR σε σύγκριση με καλσιτριόλη. MT19c είναι η πρώτη τάξη βιταμίνης D του μορίου να αποδείξει αυτή τη μοναδική αλληλεπίδραση VDR-LBD. Μέχρι την πλευρά διαμονή των MT19c στο VDR-LBD ήταν άκρως αποθετική ότι άτομα με ειδικές ανάγκες η κλασική καλσιτριόλη-VDR, όπως αλληλεπιδράσεις που καθορίζουν τις γονιδιωματικής λειτουργίες της βιταμίνης-D. Περαιτέρω, το κλειδί χώρος μεταξύ των ελίκων 11 και 12 στο VDR σύνδεσης συνδετήρα τομέα όπου καλσιτριόλη ή ο ανταγωνιστής ZK168281 πλευρική αλυσίδα (C-25) συνδέονται (Σχ. 3D, αριστερό πάνελ) καταλαμβάνεται από τον Α-δακτύλιο του MT19c (Εικ . 3D, δεξί πάνελ). Είναι ενδιαφέρον, MT19c αποκάλυψε μια στενότερη δέσμευση μεταξύ καρβονυλίου του Α-δακτυλίου με υπόλειμμα VDR H397 (2.05 Α) (Σχ. 3Ε, δεξί πάνελ) σε σύγκριση με το 25-υδροξυ ομάδα του καλσιτριόλη (2,8 Α) (Εικ υδρογόνο. 3Ε , αριστερό πάνελ). Πολλαπλές επιδράσεις που περιγράφεται παραπάνω, συμπεριλαμβανομένης της διευρυμένης μεταβάλλεται δομή Α-δακτυλίου του MT19c που διαταράσσεται η φυσική διαμόρφωση του ελίκων 11,12 και 13 μετά την ανεστραμμένη είσοδος στον VDR-LBD, βιολογικά άσχετο αλληλεπιδράσεις με 15 βασικά υπολείμματα αμινοξέων του VDR-LBD, και στρέβλωση στην έλικες 11, 12 και 13 που επιτρέπει την αλληλεπίδραση VDR-συνενεργοποιητή μπορεί να εξηγήσει γιατί MT19c είναι μη υπερασβεσταιμικό σε ζώα [21].

(Α) 3D δομές του VDR /καλσιτριόλη και συμπλέγματα /MT19c VDR.

Αριστερό πλαίσιο:

συγκρότημα /καλσιτριόλη VDR (καλσιτριόλη στο κέντρο, έλικα 11 = λευκό χρώμα).

δεξί πίνακα:

VDR συγκρότημα /MT19c (MT19c στο κέντρο, 11 = πράσινο φως). MDS διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ΑυΤΌϋΟΟΚ 4,0 με τη δομή της MT19 και της καλσιτριόλης-liganded VDR που παρέχεται από την Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεΐνης. Εικόνες δομές δημιουργήθηκαν με τη χρήση UCSF Χίμαιρα. (Β) Ακολουθία θέση σύνδεσης συνδετήρα VDR. Κίτρινο κωδικό χρώμα αντιπροσωπεύει έλικες στην δομή. Πράσινη κωδικό χρώμα αντιπροσωπεύει τα αμινοξέα με άμεση αλληλεπίδραση με τον συνδετήρα (καλσιτριόλη). (Γ) Σύγκριση αλληλεπίδρασης.

Αριστερό πλαίσιο:

αλληλεπίδραση μεταξύ Leu227 και καλσιτριόλη.

Δεξιά Panel:

αλληλεπίδραση μεταξύ Leu227 και MT19c. (D) Σύγκριση έλικας 12 και έλικα 11 αλληλεπιδράσεις με προσδέματα.

Αριστερό πλαίσιο:

αλληλεπίδραση μεταξύ έλικα 11 (μωβ), έλικα 12 (κίτρινο), και καλσιτριόλη.

Δεξιά Panel:

αλληλεπίδραση μεταξύ έλικα 11 (λευκό), έλικα 12 (κίτρινο) και MT19c. Και στις δύο πλάκες αλληλεπίδραση μεταξύ His397 επί έλικα 11 και συνδέτη απεικονίζεται. (Ε) αποστάσεις μεταξύ 397 και συνδετήρων Του.

Αριστερό πλαίσιο:

αλληλεπίδραση μεταξύ His397 και καλσιτριόλη.

Δεξιά Panel:.

Αλληλεπίδραση μεταξύ His397 και MT19c

Η

MT19c αναστέλλει EGFR σηματοδότησης τόσο in vitro και in vivo, αλλά δεν επηρεάζει την έκφραση του PPAR-γ

Για την αναγνώριση οι μοριακοί στόχοι των MT19c σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, μια ανάλυση Gene Set Εμπλουτισμός Analysis (GSEA) της ευρείας mRNA γονιδίωμα του οχήματος αγωγή (έλεγχος) και MT19c αγωγή όγκων κατά την ημέρα-8, ημέρα-16 και την ημέρα-30 διεξήχθη εις τριπλούν χρησιμοποιώντας Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Τα δεδομένα έκφρασης έχει κατατεθεί στη διεύθυνση www.ncbi.nlm.nih.gov (ACC = GSE23616). ξενομοσχεύματος όγκοι αντιμετωπίζονται MT19C έδειξε σταθερά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης για τα γονίδια που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της ενέργειας (p & lt? 0,00000000055). Με βάση τα επίπεδα έκφρασης με υψηλότερη στατιστική σημαντικότητα (p = 0,00000005? Σημείο αποκοπής), έχουμε συγκεντρωμένα τα βασικά μεταβολικά γονίδια που επλήγησαν από την ανάλυση Ingenuity Pathway (IPA). Η διαφορική έκφραση του EGFR, ΡΙ3Κ, PRKAA2, THRSP, SREBF1, μηλονυλο Οο-Α καρβοξυλάση, ακετυλο CoA καρβοξυλάση και συνθάση λιπαρών οξέων στον έλεγχο και την ομάδα θεραπείας κατά την ημέρα-8, ημέρα-16 και την ημέρα-30 φαίνεται στο Σχ. 4Α.

(Α) Γονιδιωματική ανάλυση αφελείς ή MT19c αντιμετωπίζονται ξενομοσχεύματος όγκους. SKOV-3 ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή MT19c (5 mg kg σωματικού βάρους /) και όγκου ιστών συλλέχθηκαν την ημέρα-8, 16 και 30. Το mRNA από όγκους αναλύθηκε με Affymetrix microarray τσιπ εις τριπλούν και έκφραση γονιδίων σε σύμπλεγμα με ανάλυση GSEA. Η διαφορά στην έκφραση των γονιδίων από όγκους αγωγή MT19c εκφράστηκε ως% του ελέγχου (±). (Β) Έκφραση των πυρηνικών EGFR (nEGFR) σε SKOV-3 ιστοί ξενομοσχεύματος αγωγή με φορέα ή MT19c. SKOV-3 ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MT19c ή όχημα. Παραφίνη παραφίνη ιστούς υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και χρωματίστηκαν με Alexafluor-συζευγμένο φωσφόρου EGFR αντίσωμα και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικό και Μέθοδος. EGFR εμφανίζεται στο πράσινο μαζί με DAPI πυρηνική χρώση. Μεγέθυνση: 40 × 2 (Γ) Ανάλυση Western blot της φωσφο-EGFR και φωσφο-ΡΙ-3Κ και έκφραση της πυρηνικής EGFR (nEGFR) σε SKOV-3 κύτταρα. (Αριστερό πάνελ): SKOV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 250 ηΜ MT19c. PAGE και ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης κυττάρου διεξήχθη. Ενεργοποιημένος φωσφο-EGFR και φωσφο-ΡΙ-3Κ έγινε ορατή με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα που αναγνωρίζουν διασπασμένων θραυσμάτων. Ως εσωτερικό πρότυπο για ίση φόρτωση (50 μg ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης /λωρίδα) στυπώματα ανιχνεύθηκαν με ένα (α-τουμπουλίνης αντίσωμα (δεξιός πίνακας):. Έκφραση της πυρηνικής EGFR (nEGFR) σε όχημα (άνω πάνελ), καλσιτριόλη (2 υΜ, μεσαίο πλαίσιο) και MT19c (250 nm, κάτω πίνακας) κατεργάζεται SKOV-3 κύτταρα με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού EGFR φαίνεται σε πράσινο και δεξιά στήλες δείχνει DNA (μπλε) Μεγέθυνση:.. 40. (D) MT19c κατασταλεί δραστικότητα κινάσης ΡΙ-3Κ σε SKOV-3 κύτταρα. SKOV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με MT19c (0, 250 ηΜ) για υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα ειδικό για φωσφο-τυροσίνης και ΡΙ3Κ δράση προσδιορίστηκε με ίη vitro δοκιμασία κινάσης λιπιδίων. σωληνώσεις . 3 (φωσφοϊνοσιτιδίου 3-φωσφορική), η φωσφορυλιωμένη τελικό προϊόν δείχνεται το ραβδόγραμμα δείχνει τα αποτελέσματα πυκνομετρική σάρωση ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος (Ε):.. Αναγνώριση της αλληλεπίδρασης μεταξύ MT19c και PPARγ χρησιμοποιώντας πόλωσης φθορισμού η διακοπή της δέσμευσης μεταξύ ΡΡΑΚγ LBD και φθορίζοντα DRIP2 πεπτιδίου με MT19c ερευνήθηκε στο ▪ παρουσία και • απουσία αγωνιστή GW929. Οι έλεγχοι ήταν οχήματος DMSO (▴ με αγωνιστή, ○ χωρίς αγωνιστή), ▾ μη σημασμένο πεπτίδιο DRIP2 (θετικός μάρτυρας) και ♦ φθορίζον πεπτίδιο DRIP2 από μόνη της (θετικός μάρτυρας).

Η

Τα καρκινικά κύτταρα οργανώνουν την απαίτηση ενέργειας από αναπροσανατολισμό lipogenic /λιπολυτική μεταβολική ισορροπία για να προβλέπουν και να στηρίξει την ανάπτυξη του καρκίνου μέσω του επαναπροσδιορισμού λειτουργίες του EGFR, PPAR-γ, και τη σύνθεση λιπαρών οξέων και μηχανήματα γλυκόλυση [24]. Στόχευση EGFR και άλλα συστατικά του μεταβολισμού έχει, ως εκ τούτου, υποτίθεται για τη βελτίωση των ωοθηκών έκβαση της θεραπείας του καρκίνου [6], [25]. Για να κατανοήσουμε την επίδραση του MT19c επί EGFR και κατάντη καταρράκτη σηματοδότησης του στον καρκίνο των ωοθηκών, διερευνήσαμε την επίδραση της MT19c επί EGFR και ΡΙ-3kinase δραστικότητα σε SKOV-3 κύτταρα με ανάλυση western blot, μικροσκοπία και ένα

in vitro

PI-3kinase δοκιμασία δραστηριότητας.

η γονιδιακή έκφραση (GSEA) έδειξε ότι MT19c καταστολή της έκφρασης EGFR σε όγκους αντιμετωπίζονται κατά την ημέρα-8. Επιπλέον, οι όγκοι αντιμετωπίζονται μέχρι την ημέρα-30 έδειξαν σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του EGFR ενώ ελάσσονα ενεργοποίηση του EGFR σε όγκους αγωγή μέχρι την ημέρα-16 υποδεικνύοντας εξουδετέρωση προσπάθεια ενάντια στη δράση του φαρμάκου παρατηρήθηκε (Εικ. 5Α). Στη συνέχεια, θα επικυρώνονται τα δεδομένα μικροσυστοιχιών για EGFR με ανοσοϊστοχημική ανάλυση των επεξεργασμένων SKOV-3 ξενομοσχεύματα σε επεξεργασία με όχημα ή MT19c (5 mg /kg σωματικού βάρους). Τα πλακίδια του snap κατεψυγμένα συγκομίζονται όγκων από το όχημα ή τα ζώα που πήραν φάρμακο στο Σχ. 1Β ανοσο-χρώση με ένα FITC-EGFR αντίσωμα (R &? Συστήματα D, ΜΝ, USA) και αντι-βάφτηκαν με ϋΑΡΙ διαλύθηκε σε Vecta-ασπίδα μέσα στερέωσης (Vector Labs, CA). Ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο των χρωματισμένων όγκων ελέγχου φωσφο-EGFR έδειξε ισχυρή του κυτταροπλάσματος χρώση και πυκνά πυρήνες, ενώ οι όγκοι αντιμετωπίζονται MT19c έδειξαν μειωμένη σημαντικά ποσοτικά χρώση ή έκφραση σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 4Β).

(AC) Δυτική κηλίδα ανάλυση lipogenetic πρωτεϊνών σε SKOV-3 κύτταρα. SKOV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 250 ηΜ MT19c ή όχημα για 24 ώρες. Ανάλυση της έκφρασης των πρωτεϊνών με κηλίδωση Western προϊόντων λύσης με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον της συνθάσης λιπαρού οξέος (FASN), ακετυλο συν-A καρβοξυλάσης (ACC), φωσφορυλιωμένη ACC και ΑΜΡΑ διεξήχθη (Υλικά και Μέθοδοι). Τα αντιπροσωπευτικά πειράματα φαίνονται. Ως εσωτερικό πρότυπο για ίση φόρτωση (50 μg ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης /λωρίδα) στυπώματα ανιχνεύθηκαν με ένα αντι – (-. Τουμπουλίνης αντίσωμα (Β) Μιτοχονδριακή διαμεμβράνης εκπόλωση-δυναμικό (ΔΨm) ανάλυση μετά από θεραπεία MT19c SKOV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν. για 3 ή 24 ώρες με 1 μΜ MT19c σταθεροποιήθηκαν και χρωματίσθηκαν με DiOC

18 (3), και ανάλυση FACS διενεργείται. το διάγραμμα μπάρα απεικονίζει τον αριθμό των μη-φθορίζοντα κύτταρα (%) με απώλεια ΔΨm. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται . (C) Επίδραση των υποστρωμάτων συνθάσης λιπαρού οξέος επί κυτταροτοξικότητα των MT19c. SKOV-3 κύτταρα, προεπωάστηκαν με κιτρικό (1 mM), ακετυλο συν-Α (200 μΜ) για 1 ώρα και κυμαινόμενη συγκέντρωση των MT19c (0, 1 μΜ) προστέθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία MTS. (D) απελευθέρωση LDH σε SKOV-3 κύτταρα. SKOV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις του MT19c (0, 1 μΜ) προστέθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες και την απελευθέρωση LDH εκτιμάται χρησιμοποιώντας το κιτ Cytotox (Promega). (Ε) έκφραση των πρωτεϊνών σύνθεσης λιπαρού οξέος σε αφελή και MT19c αντιμετωπίζονται ξενομοσχεύματος όγκους. Η έκφραση της συνθάσης λιπαρού οξέος (FASN) και φωσφο-ακετυλο CoA καρβοξυλάσης (ACC) σε όχημα (αριστερό πάνελ) και MT19c (5 mg /kg σωματικού βάρους, δεξί πάνελ) κατεργάζεται SKOV-3 ξενομοσχεύματα προσδιορίσθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. FASN εμφανίζεται με πράσινο χρώμα και φωσφο-ACC εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα. DNA δείχνεται στο μπλε. Μεγέθυνση: 40 × 2. (F) HPLC-MS ποσοτικοποίηση των μηλονυλο-συν-ένα περιεχόμενο σε MT19c αγωγή SKOV-3 κύτταρα. SKOV-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή MT19c (500 ηΜ) σε μέσο ελεύθερο ορού DMEM. Acid διαλυτά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με HPLC-MS. Ο χρόνος ολοκληρώματα περιοχή και συγκράτηση του CoA μηλονυλ στην ομάδα ελέγχου και θεραπείας σε σύγκριση με το πρότυπο αναφοράς (Sigma-Aldrich). (Αριστερό πάνελ): χρόνος κατακράτησης του προτύπου αναφοράς (Sigma Alrich, USA)? (Μεσαίο πάνελ): χρόνος κατακράτησης του μηλονυλο CoA στο όχημα αγωγή SKOV-3 κύτταρα? (Δεξιός πίνακας): χρόνος κατακράτησης του μηλονυλο CoA στο MT19c (500 ηΜ) κατεργάζεται SKOV-3 κύτταρα

Η

Για να μελετηθεί η επίδραση της λειτουργικής MT19c επί της έκφρασης του υποδοχέα EGF σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών εξετάσαμε EGFR. εντοπισμό σε SKOV-3 κύτταρα

in vitro

κατά την κατεργασία με MT19c. SKOV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με MT19c (100 ηΜ) ή καλσιτριόλη (2 μΜ) για 12 ώρες σε συνθήκες ελεύθερες ορού. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Υλικό και Μέθοδος τμήμα. Μια μικροσκοπική εξέταση των κυττάρων που κατεργάστηκαν όχημα έδειξαν σαφή και άθικτο κυτταρική μορφολογία με χρώση διαμεμβρανικές EGFR σε εταιρεία με λίγους πυρήνες πυκνά χρωματισμένη (Σχ. 4C, το άνω αριστερό πλαίσιο). Μία χρώση ϋΑΡΙ έδειξε επίσης ανέπαφη δομική ακεραιότητα του DNA και χρωματίνης (σχ. 4C, άνω δεξιά πάνελ). Σε αντίθεση με όχημα, τα κύτταρα έλαβαν καλσιτριόλη έδειξε ιδιαίτερα έντονη και ειδική πυρηνική χρώση που οφείλεται σε πυρηνική translocalization και επέδειξε έλλειψη χρώσης μεμβράνης (Σχ. 4C, μεσαίο πάνελ). Από την άλλη πλευρά, σε αντίθεση με καλσιτριόλη, η θεραπεία MT19c δεν προωθούν EGFR πυρηνική translocalization και μια ισχυρή χρώση διαμεμβρανική EGFR μεταξύ κυτταρικού πληθυσμού που είναι παρόμοια με τα κύτταρα που έλαβαν φορέα παρατηρήθηκαν (Εικ. 4C, κάτω πάνελ). Λίγοι πυρήνες με πυκνή πυρηνική χρώση σε κυτταρικό πληθυσμό αντιμετωπίζονται MT19c, στην πραγματικότητα, ήταν θυμίζει απόπτωσης από πυρηνική μετατόπιση. Σημειώθηκε ότι ξενομοσχεύματος όγκοι έδειξαν ισχυρότερη κυτοσολικό χρώση από διαμεμβρανική χρώση που παρατηρείται για καλλιεργημένα SKOV-3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, πιθανώς υποδεικνύει την απόκλιση του όγκου μικρο-περιβάλλον του δύο τύπων κυττάρων (Σχ. 4Β και 4C). Μια ανάλυση western blot του φαρμάκου σε επεξεργασία SKOV-3 κύτταρα έδειξαν ότι MT19c κατέστειλε την ενεργοποίηση του EGFR εντός 12 ωρών από τη θεραπεία (Εικ. 4C, αριστερό πάνελ).

Από EGFR ρυθμίζει άμεσα πολλές κρίσιμες λειτουργίες του ΡΙ-3kinase [ ,,,0],5], για να αναλύσει PI-3kinase δραστηριότητα SKOV-3 κύτταρα κατόπιν αιτήσεως του MT19c (250 nM) πραγματοποιήσαμε μια PI-3kinase δραστηριότητα [26]. Η ΡΙ3-κινάσης (ΡΙ3Κ) μονοπατιού ρυθμίζει πολλές κυτταρικές διεργασίες, όπως ο μεταβολισμός των κυττάρων, την κυτταρική επιβίωση, και απόπτωση σε καρκινικά και phosphotidylionositol-3,4,5-τριφωσφορική (ΡΙΡ-3) είναι ο μεσολαβητής κλειδί της μεταγωγής σήματος ΡΙ-3kinse [ ,,,0],27]. PIP-3 συντίθεται από phosphotidylionositol-4,5-διφωσφορική (ΡΙΡ-2) [28]. Με βάση την δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης μας, παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία MT19c (250 ηΜ) μειωτικά PIP-3 παραγωγή σημαντικά εντός 12 ωρών σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 4D). Η μέτρηση της πυκνότητας pixel του τόπου φόρτωσης αντιπροσωπεύουν PIP-3 ποσό του λύματος ελέγχου εκλούεται μέσω χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC) ήταν 14.480 μονάδες, ενώ το δείγμα κατεργάζεται MT19c έδειξε 9 φορές λιγότερο ποσοτική σύνθεση του ΡΙΡ-3 (πυκνότητα εικονοστοιχείων 1304) (Σχ. 4D, κάτω πάνελ). Παραδόξως, PIP-3 παραγωγή έντονα ρυθμίζεται αυξητικά 2-φορές μέσα στις πρώτες 3 ώρες από την αγωγή υποδεικνύοντας πίεσης προ-επιβίωσης μετά την εφαρμογή του φαρμάκου. Για να κατανοηθεί περαιτέρω η επίδραση της MT19c στην έκφραση του ΡΙ-3kinase, μια κηλίδα Western διεξήχθη. MT19c (250 ηΜ) θεραπεία έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση της φωσφορυλίωσης ΡΙ-3kinase σε SKOV-3 κύτταρα μέσα σε 12 ώρες, (Σχ. 4C, αριστερό πλαίσιο).

MT19c δεν επηρεάζει συστατικό PPAR-γάμμα του μεταβολισμού των λιπιδίων σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

EGFR υπερέκφραση ενεργοποιεί λειτουργία PPAR-gamma σε καρκινικά κύτταρα για να τους προστατεύσει από παλμιτικό τοξικότητα [24]. PPAR-γάμμα είναι ένας πιθανός στόχος για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου [29]. Εξετάσαμε την αλληλεπίδραση του MT19c με πυρηνικού υποδοχέα PPAR-γάμμα διεξάγοντας μία δοκιμασία πόλωσης φθορισμού. Σε περίπτωση απουσίας του PPARγ αγωνιστής (GW949) δεν είχαμε παρατηρείται μία αλληλεπίδραση μεταξύ PPARγ και πρωτεΐνης συνενεργοποιητή DRIP2. Ομοίως, με την παρουσία του αγωνιστή GW949 δεν παρατηρήθηκε διακοπή της αλληλεπίδρασης μεταξύ VDR και DRIP2.

MT19c κατασταλεί Λιπαρά έκφραση οξύ συνθάσης σε όγκους ξενομοσχεύματος

EGFR /ΡΙ-3Kinase ενισχύει λιπογένεση στον καρκίνο κύτταρα με την ενεργοποίηση lipogenic συνθάσης λιπαρού οξέος (FASN) μηχανήματα σε συνδυασμό με PPAR γ [5]. Η υπερέκφραση του FASN σε επιθηλιακού καρκίνου των ανθρωπίνων ωοθηκών (EOC) έχει δειχθεί [7] – [10]. Μια οθόνη μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων συνθάσης προσδιορίζονται λιπαρού οξέος (FASN) ως πιθανών μοριακός στόχος σε EOC [17]. Γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση του mRNA των αφελείς και MT19c αντιμετωπίζονται οι όγκοι ξενομοσχεύματος προσδιορίζονται σαφώς δράσης MT19c στην έκφραση FASN στο MT19c θεραπεία των ωοθηκών ξενομόσχευμα καρκίνου (p = 0,00000000055) (Εικ. 4Α) [30].

Παρατηρήσαμε μέσω ανοσοστύπωσης ότι η θεραπεία MT19c κατέστειλε την έκφραση του FASN και ακετυλο Οο-Α καρβοξυλάσης (ACC) σε SKOV-3 κύτταρα (Σχ. 5Α) χρόνος εξαρτώμενο. Εξετάσαμε αν MT19c ρυθμίζει FASN και ACC στη θεραπεία ξενομοσχεύματος όγκους. Συγκομιδής ξενομοσχευμάτων των αφελείς και MT19c ομάδες θεραπείας ανοσο-χρώση με FASN αντισώματος και αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού για να διακρίνει τη χρώση FASN στην ομάδα ελέγχου έναντι της ομάδας θεραπείας. Ενώ οι όγκοι αντιμετωπίζονται οχημάτων παρουσίασαν έντονη και ομοιογενή χρώση γύρω από τα σταγονίδια λιπιδίων ενσωματωμένα στους ιστούς (Εικ. 5D, αριστερό άνω πάνελ), όγκοι αντιμετωπίζονται MT19c έδειξαν σημαντική έλλειψη χρώσης ή μερική /υπολειμματική χρώση (Εικ. 5Ε, δεξιά άνω πάνελ). Παρατηρήσαμε την παρουσία 2 πεδία οξέων στο σύνολο του τμήματος του ιστού που πυκνά χρωματίστηκαν στον έλεγχο. Ομοίως μόνο δύο λιπαρά πεδία ανιχνεύθηκαν στην ενότητα ξενομόσχευμα έλαβαν φάρμακο και η χρώση FASN γύρω τους ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι όχημα αγωγή ιστών ελέγχου. Πραγματοποιήσαμε μετρήσεις της έντασης φθορισμού των τμημάτων ολόκληρη ιστού τόσο του ελέγχου και των ιστών που πήραν φάρμακο και υπολογίζεται η μέση τιμή και την ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD). Όπως φαίνεται στο Σχ. Σύκο.