Αφηρημένο

Immunosignaturing δείχνει υπόσχεση ως μια γενική προσέγγιση για τη διάγνωση. Έχει αποδειχθεί για την ανίχνευση ανοσολογικά σημάδια της λοίμωξης νωρίς κατά την πορεία της νόσου και να γίνει διάκριση της νόσου του Alzheimer από υγιή δείγματα αναφοράς. Εδώ έχουμε δοκιμάσει αν immunosignatures αντιστοιχούν σε κλινικές ταξινομήσεις της νόσου χρησιμοποιώντας δείγματα από ανθρώπους με όγκους του εγκεφάλου. Τα δείγματα αίματος από ασθενείς που υποβάλλονται κρανιοτομές για θεραπευτικά αφελείς όγκους του εγκεφάλου με διαγνώσεις αστροκυτώματος (23 δείγματα),

πολύμορφο γλοιοβλάστωμα

(22 δείγματα), μικτή ολιγοδενδρογλοίωμα /αστροκύτωμα (16 δείγματα), ολιγοδενδρογλοίωμα (18 δείγματα), και 34 αλλιώς υγιείς μάρτυρες εξετάστηκαν με immunosignature. Επειδή τα δείγματα ελήφθησαν πριν από την επικουρική θεραπεία, είναι απίθανο να διαταράσσονται από μη σχετίζεται με καρκίνο επηρεάζει. Η πλατφόρμα immunosignaturing διακρίνεται όχι μόνο ο καρκίνος του εγκεφάλου από τους ελέγχους, αλλά και παθολογικά σημαντικά χαρακτηριστικά για τον όγκο συμπεριλαμβανομένου του τύπου, ο βαθμός, και η παρουσία ή απουσία του O

6-μεθυλο-γουανίνη-προαγωγέα DNA μεθυλοτρανσφεράση μεθυλίωσης (MGMT), ένα σημαντικό βιοδεικτών που προβλέπει ανταπόκριση στην τεμοζολομίδη σε

γλοιοβλάστωμα multiformae

ασθενείς

Παράθεση:. Hughes AK, Cichacz Ζ, Scheck Α, Coons ΝΔ, Johnston Α.Ε., Stafford P (2012) Immunosignaturing μπορεί να ανιχνεύσει Προϊόντα από μοριακούς δείκτες στο καρκίνο του εγκεφάλου. PLoS ONE 7 (7): e40201. doi: 10.1371 /journal.pone.0040201

Επιμέλεια: Ernesto Τ Marques, Πανεπιστήμιο του Pittsburgh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Φεβρουαρίου 2012? Αποδεκτές: 6 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιούλη, 2012

Copyright: © 2012 Hughes et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ταμεία έρχονται από την εκκίνηση έως SAJ από το κράτος της Αριζόνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ταυτοποίηση βιοδεικτών για προσυμπτωματική ανίχνευση της νόσου και την ταξινόμηση των υφισταμένων καταστάσεων ασθένειας θα μπορούσε να προσφέρει μια γρήγορη και φθηνή συμπλήρωμα της βασικής παθολογική διάγνωση. Οι ερευνητές συνεχίζουν την αναζήτηση για το αίμα της πρωτεΐνης βιοδεικτών (ες) για την ανίχνευση του καρκίνου, αλλά η ευαισθησία παραμένει πεισματικά χαμηλό [1], [2]. Ανοσοποιητικού επιτήρηση, ωστόσο, λαμβάνει χώρα συνεχώς και είναι αρκετά ευαίσθητη στις αλλαγές αντιγόνο προφίλ [3], [4], [5], [6], [7]. Έχει αποδειχθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα προκαλούν μια ανιχνεύσιμη χυμική ανοσολογική απόκριση [6], [7]. Αντισώματα κάνουν εξαιρετική βιοδείκτες επειδή είναι σταθερά σε ορό, έχουν υψηλή ειδικότητα και συγγένεια για συγγενές αντιγόνο τους, είναι άφθονα, και θα επιτρέψει αναδρομικές μελέτες. Ένα ενεργοποιημένο Β κύτταρο μπορεί να παράγει αντισώματα 5000-20,000 ανά λεπτό [8], [9], ενώ αναπαράγει κάθε ~ 70 ώρες [10], με διάρκεια ζωής έως 4½ μήνες [11], [12], που οδηγεί σε & gt? 10

11 ενίσχυση ενός ειδικού σήματος ανά εβδομάδα. βιοδείκτες βασίζονται σε αντίσωμα αποφευχθεί το πρόβλημα αραίωσης δει με πρωτεομική βιοδείκτες [13], [14] και δεν είναι μόνο εξαιρετικά πλούσια, αλλά μπορεί να συλληφθεί σωματικά σε νανο- και picomolar συγγένειες. Περαιτέρω, μη καθαρισμένο αντισώματα είναι σταθερές, επιτρέποντας αρχειακό δείγματα που χρησιμοποιούνται για τη δοκιμή όπου RNA ή πρωτεΐνες μπορεί να έχουν αποικοδομηθεί [15]. Το μεγαλύτερο εμπόδιο στη χρήση αντισωμάτων ως βιοδεικτών ήταν αδυναμία μας να deconvolve την πυκνή πληροφορίες που περιέχονται σε αντισώματα που υπάρχουν σε ένα συγκρότημα περιβάλλον [16]. Υπάρχουν & gt? 10

9 ξεχωριστές ιδιαιτερότητες στο αίμα ενός μέσου ενήλικα, περισσότερο από ό, τι μπορεί να εξεταστεί ξεχωριστά. Δακτυλικών αποτυπωμάτων του καρκίνου αντισωμάτων έχει εργαστεί στο παρελθόν [17], [18], αλλά αυτό ήταν ένα βαρύ καθήκον. Εισαγάγαμε immunosignaturing ως μια απλή και πολύ φθηνή προσέγγιση για τη διάγνωση. Εδώ απευθυνόμαστε αν οι immunosignatures συσχετίζονται με βιολογικές ή κλινικές ταξινομήσεις.

Τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να προκαλέσει την παραγωγή αντισωμάτων έναντι αυτο-αντιγόνων ή έναντι νέο-αντιγόνων [3], [18], [19], [20 ], [21], [22], [23], [24]. Δεν έχουμε καμία

a priori

τρόπος να καθοριστεί τι ακριβώς προφίλ των αντιγόνων θα παρουσιαστεί από ένα καρκινικό κύτταρο (αν και ανάλυση των βιβλιοθηκών EST μπορεί να προτείνει υποψηφίους). Έτσι, δημιουργώντας έναν επίτοπο ή πρωτεΐνη microarray ικανό να ανιχνεύσει τον καρκίνο ειδικά αντιγόνα θα ήταν δύσκολη. Αν και εμφάνιση φάγου έχει δειχθεί για την ανίχνευση αντισωμάτων ειδικών για τον καρκίνο [17], [18], [25], για μια σειρά τεχνικών και πρακτικούς λόγους panning δεν είναι επιδεκτική ως διαγνωστικό εργαλείο. Δημιουργήσαμε μια μικροσυστοιχία μίας χρήσης που αποτελείται από 10.000 διαφορετικά πεπτίδια τυχαία ακολουθία. Χρησιμοποιούμε 20μερών πεπτιδίων που ενσωματώνουν όλα τα πιθανά αμινοξέα, εκτός από την κυστεΐνη το οποίο χρησιμοποιούμε ως συνδετικό. Αυτά τα 20μερή μπορεί να περιέχει τουλάχιστον 7 τυπικό μεγέθους επιτόπια. έκθεσης φάγου και επιτόπου μικροσυστοιχίες έχουν την τάση να χρησιμοποιούν μικρότερα πεπτίδια για την πρόληψη cross-talk και να διατηρήσει την ειδικότητα? στην περίπτωσή μας, είναι πλέον πεπτίδια μας επιτρέπουν να επεκτείνει την πολυπλοκότητα των μικροσυστοιχιών μας, η οποία έχει σχετικά λίγα χαρακτηριστικά. Επίσης, οι συστοιχίες παρουσιάζουν εξαιρετικά υψηλή επαναληψιμότητα έτσι ώστε ακόμη και μικρές διαφορές στην πρόσδεση μεταξύ του αντισώματος και το πεπτίδιο μπορεί να είναι σημαντική. Τα πεπτίδια είναι τυπωμένα σε πολύ υψηλή πυκνότητα, μια σημαντική θεώρηση όταν χρησιμοποιούν τυχαία πεπτίδια για την ανίχνευση αντισωμάτων τα οποία δεσμεύουν σε μικρομοριακές ή ακόμη και millimolar συγγένειες [26]. Η πυκνότητα αυτών των πεπτιδίων τυχαίας αλληλουχίας στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας δημιουργεί μια απληστία που μοιάζει να επηρεάσει όπου η εκτός ρυθμού επιβραδύνεται με πολλές τάξεις μεγέθους, ενισχύοντας τα αδύναμα αλλά αναπαραγώγιμη αλληλεπιδράσεις μεταξύ αντισώματος και του πεπτιδίου. Μοτίβα γίνει ανιχνεύσιμη, και έτσι να αναπαραχθούν ότι υπο-ταξινόμηση των ασθενειών είναι εφικτή. Παρά το γεγονός ότι η συστοιχία έχει ένα αποτελεσματικό πολλά-προς-πολλά μεταξύ αντισώματος και του πεπτιδίου, τα μοτίβα που παράγονται δεν είναι καθόλου μονότονη? στην πραγματικότητα είναι αρκετά διακρίνονται από ασθένεια σε ασθένεια. Έτσι, η «immunosignature» ορίζεται ως η κοινή μορφή δεσμεύσεως που μοιράζεται από τους ασθενείς με μία δεδομένη νόσο αλλά όχι με άλλο ασθένεια ή με υγιείς μάρτυρες [27], [28], [29], [30].

Ρωτήσαμε αν αντισώματα που δημιουργούνται ενάντια στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να σχετίζονται με, ή να χρησιμεύσει ως υποκατάστατο για, κλινικά χρήσιμη βιοδείκτες της νόσου. Για να απαντηθεί το ερώτημα, επικεντρωθήκαμε σε κακοήθεις όγκους του εγκεφάλου. Παρά το γεγονός ότι η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του εγκεφάλου είναι σχετικά χαμηλό σε σύγκριση με άλλες μορφές καρκίνου, όπως του μαστού και του πνεύμονα,

γλοιοβλάστωμα multiformae

(GBM) είναι ένα από τα πιο θανατηφόρα και επιθετικούς όγκους με κορυφές της επίπτωσης στις δύο νεότερους και ηλικιωμένους πληθυσμούς [31 ], [32]. Οι πιο συχνές κακοήθεις όγκους του εγκεφάλου είναι τα αστροκυτώματα, που αποτελείται από βαθμού II, κατηγορίας III (αναπλαστικό) και βαθμού IV (GBM). Οι κακοήθεις όγκοι μπορεί επίσης να προκύψουν από τα ολιγοδενδροκύτταρα και θεωρούνται χαμηλές ολιγοδενδρογλοιώματος βαθμού (βαθμός ΙΙ) και αναπλαστικό ολιγοδενδρογλοίωμα (βαθμού ΙΙΙ). Υπάρχουν επίσης μικτά oligoastrocytomas (χαμηλού βαθμού και αναπλαστικό). Menigiomas προκύπτουν από τα αραχνοειδή κύτταρα που καλύπτουν τον εγκέφαλο και είναι συνήθως καλοήθεις, αλλά μπορεί να επαναληφθεί. Ένα μικρό ποσοστό από αυτές μπορεί να εξελιχθούν σε υψηλότερους βαθμούς που είναι πιο επεμβατική. Στην πραγματικότητα, οι ασθενείς με οποιονδήποτε από τους τύπους όγκων που αναφέρθηκαν μπορεί να παρουσιάσει με βαθμό όγκου υψηλή αρχικά, ή μπορεί να εξελιχθεί συν τω χρόνω. Ενώ η διάγνωση ορισμένων από αυτούς τους όγκους μπορεί να είναι σχετικά απλή, όπως δεν είναι πάντα η περίπτωση [33], [34]. Οι Neuropathologists αντιμέτωποι με την πρόκληση της λήψης κλήσεων συνεπής – μη-υποκειμενική πάνελ βιοδεικτών που μπορεί να διακρίνει μεταξύ αυτών των διαφορετικών τύπων και ποιοτήτων των όγκων του εγκεφάλου θα ήταν πολύ χρήσιμο για την εξάλειψη εργαστήριο-σε-lab διακύμανσης. Σε αυτή την εργασία παρουσιάζουμε τα δεδομένα που απεικονίζει την απόδοση της πλατφόρμας immunosignaturing μας για την αναγνώριση ενός ποικιλία τύπων όγκου στον εγκέφαλο και τους υποτύπους.

Αποτελέσματα

Immunosignaturing μπορούν να διακρίνουν GBMs από άλλες ασθένειες

Προηγουμένως δημοσιευμένα αποτελέσματα από το εργαστήριο μας [26], [28], [29], [30] έδειξαν υπογραφές για τη νόσο του Alzheimer, μολυσματική ασθένεια, μονόκλωνα και πολύκλωνα αντισώματα. Πρώτον, ελέγξαμε την υπόθεση ότι λαμβάνει χώρα μια αυτοάνοση απόκριση σε ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του εγκεφάλου. Για να το κάνετε αυτό, θα εκτεθεί ορού από 5 τυχαία επιλεγμένους ασθενείς GBM από ομάδα μας ασθενή και 3 τυχαία επιλεγμένα υγιή, ηλικίας μάρτυρες να ProtoArray® Life Technologies ». Μετά τον έλεγχο για το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη, καμία σημαντική αντιδραστικότητα σε οποιαδήποτε πρωτεΐνη στο ProtoArray παρατηρήθηκε, είτε για τις υγιείς ελέγχους ή τους ασθενείς με καρκίνο. Με δεδομένο αυτό, ζητήσαμε από το αν ο καρκίνος ήταν ανιχνεύσιμη σε όλα τα σχετικά πεπτίδιο μικροσυστοιχιών μας, και κατά πόσον διαφορετικοί τύποι καρκίνου που παράγονται διαφορετικά πρότυπα της δέσμευσης. Στην πραγματικότητα, ο καρκίνος και μολυσματική ασθένεια αμφότεροι παράγουν αναπαραγώγιμη μοτίβο? Το Σχήμα 1 δείχνει τις 100 πιο σημαντικές πεπτίδια επιλέγονται με τη χρήση ANOVA 1 δρόμου με ρ & lt? 1,06 × 10

-13 σε 28 ασθενείς με καρκίνο του μαστού, 19 υγιείς μάρτυρες, 10 ασθενείς GBM, και 9 ασθενείς με διάχυτη

Coccidiodes immitis

(Valley Fever). Οι κατηγορίες της νόσου ήταν ταυτόχρονα αισθητή με ένα 0% αφήσει έξω σφάλμα διασταυρωμένης επικύρωσης χρησιμοποιώντας τόσο γραμμική διακριτική ανάλυση και Support Vector Machine κατά την ταξινόμηση αυτών των ασθενών. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι GBM δείγματα καρκίνου του εγκεφάλου έχουν μοτίβα immunosignature διακρίνονται από άλλες ασθένειες.

Ο θερμικός χάρτης που παρουσιάζεται εδώ διακρίνει 4 διαφορετικές ασθένειες με τη χρήση 70 πεπτιδίων που προσδιορίζονται ως η πιο σημαντική χρησιμοποιώντας ANOVA 1 δρόμου σε όλες τις ασθενείς με καρκίνο του μαστού 27 , 19 υγιείς μάρτυρες, 10

γλοιοβλαστώματος multiformae

ασθενείς, και 9 ασθενείς Valley Fever. ακρίβεια ταξινόμησης ήταν 100% χρησιμοποιώντας τόσο γραμμική διακριτική ανάλυση και Support Vector Machines και να αφήσει ένα έξω διασταυρούμενης επικύρωσης.

Η

Immunosignature ήταν αναπαραγώγιμη στα διαφορετικά σύνολα δειγμάτων και την πάροδο του χρόνου

Το 2007, δείγματα από 13 ασθενείς GBM και 45 υγιείς εθελοντές ελέγχου λειτουργεί ως απόδειξη του κύριου πειράματος. Το 2010, 14 διαφορετικούς ασθενείς GBM και 13 διαφορετικές υγιείς μάρτυρες έτρεξαν στο πεπτίδιο immunosignature μικροσυστοιχιών. Σε μεσολάβησαν 3 χρόνια, πολλές αλλαγές στην εκτύπωση και την επιφάνεια ολίσθησης χημεία υλοποιήθηκαν, έτσι πεπτίδιο-to-πεπτίδιο αναπαραγωγιμότητα βελτιώθηκε από ένα μέσο όρο Συντελεστής Μεταβλητότητας ανά συστοιχία & gt? 50% σε & lt? 15%. Προηγουμένως χρησιμοποιήσαμε in-house επικαλυμμένα με διαφάνειες αμινοσιλανίου και Nanoprint 60 με καρφίτσες SMP2 Telechem να επικοινωνήσετε με πεπτίδια εκτύπωσης σε 1-up σχεδιασμό. Επί του παρόντος, Εφαρμοσμένη μικροσυστοιχίες (Tempe, AZ) πιεζοηλεκτρικό εκτυπώσεις πεπτίδια πάνω Schott (Ιένα, Γερμανία) Nexterion A + αμινοσιλανίου επικαλυμμένο με διαφάνειες χρησιμοποιώντας εναπόθεση πιεζοηλεκτρικό για να εκτυπώσετε 10.000 πεπτίδια σε 2-up σχέδιο [26]. Ωστόσο, ακόμη και με αυτές τις σημαντικές αλλαγές και τη χρήση νέων δειγμάτων, πολλά από τα πεπτίδια που από το 2007 είχε παρόμοια απόδοση ταξινόμησης

Βρήκαμε 55 πεπτίδια με τιμή p & lt t-test?. 1 × 10

– 6 μεταξύ 45 ελέγχων και 13 ασθενείς GBM (Εικόνα 2, αριστερά). Επαναλάβαμε το πείραμα με τους ασθενείς 14 GBM και 13 ελέγχου 3 χρόνια αργότερα με τις ίδιες αλληλουχίες πεπτιδίων (Σχήμα 2 δεξιά) και βρήκε τα νέα δείγματα είχαν 0% σφάλμα κατάταξης, χρησιμοποιώντας τόσο LDA και SVM. Μια ομαδοποίηση κ-μέσων εκτελέσθηκε επί των πεπτιδίων με k = 3 και διαπίστωσε ότι τα πεπτίδια που αποτέλεσε τη συστάδα κυανού (υψηλής δέσμευσης σε GBM, χαμηλά σε ελέγχους) ήταν οι ίδιες τόσο για τα δείγματα 2007 και 2010.

Ο θερμικός χάρτης στα αριστερά δείχνει 50 πεπτίδια που διαφοροποιούνται οι ασθενείς γλοιοβλάστωμα από υγιή άτομα που προέρχονται από 4 διαφορετικές γεωγραφικές τοποθεσίες σε όλη την ΗΠΑ (Fred Hutchison Ινστιτούτο του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον, το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Irvine, κρατικό πανεπιστήμιο της Αριζόνα). Αυτά τα πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να ταξινομήσει διαφορετικά δείγματα που αποτελείται από τυφλωθεί ασθενούς και υγιούς ορούς που ελήφθησαν από το Institute Barrow Νευρολογικών 3 χρόνια αργότερα. Οι έγχρωμες γραμμές στα δεξιά υποδεικνύουν συστάδες που καθορίζουν τις ομάδες των πεπτιδίων. Αν και υπάρχουν διαφορές μεταξύ των τιμών που λαμβάνονται κατά το 2007 και το 2010, τα περισσότερα από τα high-δεσμευτική πεπτίδια είναι πολύ παρόμοια.

Η

Immunosignaturing μπορούν να διακρίνουν διαφορετικές παθολογίες Brain Tumor και Μοριακής υπότυποι

Τέλος, , ρωτήσαμε αν παθολογία του όγκου του εγκεφάλου παράγεται ένα διακριτό immunosignature. Αναλύσαμε αίματος από ασθενείς που παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Η μεθυλίωση του υποκινητή μεθυλοτρανσφεράση O-6-μεθυλγουανίνη-DNA έχει δειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός stratifier για GBM. Οι ασθενείς με αυτό το μοριακό υπότυπο έχουν βελτιώσει την επιβίωση, ιδιαίτερα όταν η θεραπεία περιλαμβάνει την τεμοζολομίδη [38], [39], [40]. Η τρέχουσα σκέψη είναι ότι η βελτιωμένη επιβίωση δεν οφείλεται αποκλειστικά σε αυτό το γονίδιο, αλλά ότι η μεθυλίωση του υποκινητή αυτού του γονιδίου μπορεί να είναι ένας δείκτης για μια πιο πλειοτροπικές φαινότυπο μεθυλίωσης.

Τα δείγματα ασθενών αναλύθηκαν εις διπλούν στα δίκυκλα μας μέχρι micoarrays. Μια τεχνική επανάληψη είχε τρέξει στην κορυφή σειρά από μία διαφάνεια και το κάτω μέρος του άλλου για να εξασφαλίσει τη μη πάνω /κάτω προκατάληψη. Οι συστοιχίες immunosignaturing παρέχεται ένα ελάχιστο όριο ανίχνευσης 1,25 φορές στο 95

ο εκατοστημόριο σε 2 τεχνικές επαναλήψεις κατά μέσο όρο. Συστοιχίες επέδειξε της Pearson συντελεστής συσχέτισης & gt? 0,97 σε όλη την τεχνική αντίγραφα από διαφάνειες μέσα στην ίδια παρτίδα εκτύπωσης, και & gt? 0,91 σε όλη παρτίδες εκτύπωσης. Ανάλυσης που χρησιμοποιούνται τα μεσαία μη φόντο αφαιρούνται τα σήματα που λαμβάνονται απευθείας από την (έκθεση GenePix) αρχείο GPR. Υπόβαθρο αφαίρεση δεν χρησιμοποιείται λόγω της ακόμη και πολύ χαμηλό υπόβαθρο. ισχύς ταξινόμηση πεπτίδιο υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την τυπική ανάλυση δύναμη στην Ε [41] (εντολή ‘power.t.test »). Για τους σκοπούς της δοκιμής-κατάρτισης, χωρίσαμε δείγματα 50:50 τυχαία, 1000 φορές και υπολογίζεται η προκύπτουσα ακρίβεια. Για την επιλογή χαρακτηριστικό που χρησιμοποιούμε είτε t-test ή ANOVA με κατάλληλη διόρθωση πολλαπλές δοκιμές. 100 πεπτίδια των οποίων οι τιμές p κυμάνθηκαν από 10

-27 έως 10

-18 χρησιμοποιήθηκαν στην heatmap φαίνεται στο Σχήμα 3.

Top: έξι διαφορετικές κατηγορίες ασθενών όγκου στον εγκέφαλο ελέγχθηκαν για immunosignature τους . Εξετάσαμε

γλοιοβλάστωμα multiformae

(MGMT- είναι καφέ, MGMT + είναι μωβ), αστροκύτωμα βαθμού ΙΙ (κόκκινο), ολιγοδενδρογλοίωμα (κυανό) και μικτές ολιγο /Astro (μπλε) κατά τα άλλα υγιείς μάρτυρες (κίτρινο). Χρησιμοποιήσαμε ένα 1-τρόπος ANOVA για να επιλέξετε το 100 πιο σημαντικές πεπτίδια, σ & lt? 10

-18. Υψηλή (κόκκινο) και χαμηλής (μπλε) σήματα αντιστοιχούν σε αντισώματα ασθενή ανιχνεύθηκε με ένα με φθορισμό σημασμένο αντι-ανθρώπινο δευτερεύοντα. Τα δεδομένα ομαδοποιούνται χρησιμοποιώντας ιεραρχική συσταδοποίηση στα δύο πεπτίδια (Υ-άξονας) και ασθενών (Χ-άξονας). Κάτω δεξιά: κύρια στοιχεία της οθόνης του διαχωρισμού μεταξύ των δειγμάτων. Χ και Υ άξονες αντιπροσωπεύουν τα πρώτα δύο κύριες συνιστώσες που αποτελούν το 64% της συνολικής διακύμανσης μεταξύ των δειγμάτων. Πληροφορίες για τον ασθενή βρίσκεται στον πίνακα 1.

Η

Όπως είναι προφανές στο σχήμα 3α, κάθε μια από τις κλινικές ταξινομήσεις του καρκίνου του εγκεφάλου παρήγαγε ένα διακριτό μοτίβο, περιλαμβανομένων των δειγμάτων MGMT + και MGMT-. Μια κύρια συστατικά διάγραμμα (Σχήμα 3β) δείχνει τις σχετικές διαφορές μεταξύ των επιμέρους δειγμάτων, και η ανάλυση γραμμικής διακρίνουσας με άδεια-one-out cross-επικύρωσης (Πίνακας 1), προβλέπει την απόδοση ταξινόμησης και λάθους. Μόνο οι έλεγχοι αστροκύτωμα εναντίον παράγεται κακή κατάταξη στα δείγματα που εξετάστηκαν. Πραγματοποιήσαμε δοκιμή-κατάρτισης με τη χρήση LDA και να αφήσει ένα από διασταυρωμένης επικύρωσης από ομοιόμορφα διαχωρισμό των δειγμάτων καρκίνου και τον έλεγχο σε ομάδες δοκιμής-κατάρτισης. Το κάναμε αυτό 1000 φορές και έλαβε 0% σφάλματος για όλα τα ζεύγη συγκρίσεις εκτός αστροκύτωμα έναντι του ελέγχου, όπου πήραμε ένα μέσο ποσοστό σφάλματος 4,7%. Έχουμε αναφερθεί ένα σφάλμα του 7% στον Πίνακα 1, η οποία αντιστοιχεί σε ένα μόνο τυχαία επιλεγμένη επανάληψη test-κατάρτισης. Είχαμε 0% σφάλμα κατάταξης μεταξύ GBM MGMT + εναντίον ελέγχους και MGMT- εναντίον τους ελέγχους? είχαμε επίσης ένα 0% σφάλμα κατάταξης μεταξύ των ασθενών MGMT + και MGMT- GBM. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι immunosignatures των κλινικών ταξινομήσεις είναι διαφορετικά.

Συζήτηση

Θα αποδειχθεί, αφενός, ότι η immunosignature της GBM ήταν διαφορετική από εκείνη του καρκίνου του μαστού και η μόλυνση Πυρετός της κοιλάδας. Δείξαμε επίσης ότι η υπογραφή GBM ήταν σχετικά σταθερή, ακόμη και πάνω από αρκετές επαναλήψεις της πλατφόρμας μικροσυστοιχίας. Τέλος εξετάσαμε ένα μεγάλο αριθμό ασθενών με τις πιο κοινές παθολογίες καρκίνο του εγκεφάλου και βρήκαν εντυπωσιακές διαφορές immunosignature μεταξύ τους. Παραδόξως, οι ασθενείς ακόμα και GBM με διαφορές σε O

6-μεθυλο-γουανίνη-DNA κατάσταση μεθυλοτρανσφεράση μεθυλίωσης (MGMT) έδειξε ένα μετρήσιμο και κοινή ανοσοποιητικό υπογραφή, αρκετά για να ταξινομήσει MGMT καθεστώς με 0% σφάλμα επικύρωσης σταυρό.

μια αρχική ανησυχία για τη χρησιμότητα της immunosignaturing ήταν ότι η φλεγμονώδης απόκριση σε οποιαδήποτε ασθένεια που θα περιόριζε την ειδικότητα για μια ασθένεια. Όπως φαίνεται στην σύγκριση μεταξύ μας GBM, καρκίνο του μαστού και Πυρετός της κοιλάδας, ασθένεια ειδικές υπογραφές είναι εμφανείς. Ένα τεχνικό πρόβλημα είναι η σταθερότητα της πλατφόρμας μικροσυστοιχίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, GMB-διακριτικό πεπτίδια ήταν εμφανής ακόμη και σε συστοιχίες τυπωμένο 3 χρόνια διαφορά με τη γήρανση (και πιθανώς εξευτελιστικής) διαλυτοποιημένο αποθέματα πεπτίδιο. Ωστόσο, βελτιώσαμε την πλατφόρμα στα χρόνια που μεσολάβησαν από τη θέσπιση τεχνικές εκτύπωσης χωρίς επαφή (Applied μικροσυστοιχίες, Tempe, AZ), μεγαλύτερες παρτίδες εκτύπωσης (136 διαφάνειες ανά παρτίδα), και την αυτοματοποίηση της επεξεργασίας του δείγματος (ΕΣ 4800 υβριδισμός Station Pro, Tecan, Männedorf, Ελβετία).

Δείχνουμε για πρώτη φορά ότι μια παθολογική κατάσταση, που καθορίζει την κυτταρική προέλευση ή την ανάπτυξη του όγκου, μπορεί να αντανακλάται στην immunosignature (Σχήμα 3α, 3β και Πίνακας 1). Για να MGMT κατάσταση μεθυλίωσης υποστηρικτής έκπληξή μας, ένα μόνο μοριακού δείκτη, έχει μια τέτοια βαθιά επίδραση στο ανοσοποιητικό σύστημα που η immunosignature είναι ξεχωριστή. Φυσικά, η μεθυλίωση υποστηρικτής MGMT μπορεί να είναι αρκετά πλειότροπο και θα μπορούσε να σηματοδοτήσει πρόσθετες αλλαγές στο κύτταρο προκαλεί πολλαπλούς στόχους να παρουσιαστούν στο ανοσοποιητικό σύστημα. Εμείς δεν έκπτωση το ενδεχόμενο ότι οι διαφορές που βλέπουμε στο ανοσοποιητικό υπογραφές οφείλονται σε αυτές τις πολλαπλές πρωτεΐνες που ενεργοποιείται με ένα μόνο υποκινητή. Δεδομένου ότι η κατάσταση MGMT είναι σχετική με αποτέλεσμα και temazolamide απόκριση, immunosignatures θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα χρήσιμο μη επεμβατικές διαγνωστικές για τον καρκίνο του εγκεφάλου.

Περιληπτικά, έχουμε δείξει ότι immunosignaturing του καρκίνου του εγκεφάλου αντανακλά παθολογικές διακρίσεις. Ακόμα κι αν ο εγκέφαλος είναι ανοσολογικά προνομιούχα, οι καρκίνοι μπορούν προφανώς παραβιάζει το φράγμα αίματος-εγκεφάλου και διεγείρει μια ευρεία χυμική απόκριση. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα πεπτίδια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μικροσυστοιχίες είναι εντελώς τυχαία. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση της κάθε ασθένειας σε οποιοδήποτε είδος? είναι

δεν

ειδικά για τον καρκίνο του εγκεφάλου και ήταν

δεν

προεπιλεγεί με οποιονδήποτε τρόπο. Είτε immunosignaturing θα έχει διαγνωστική ή προγνωστική χρήσεις για τον καρκίνο του εγκεφάλου δεν έχει απαντηθεί από αυτή τη μελέτη, αλλά η τεχνολογία είναι ελκυστική στην απλότητά του και το χαμηλό κόστος και έχει υψηλή ευαισθησία σε μεταβολές κυκλοφορούντα αντισώματα. καρκίνο του εγκεφάλου έχει επιβάλει τεράστια εμπόδια που παρεμποδίζουν την ανίχνευση, την παρακολούθηση και θεραπεία. Αισθανόμαστε η τεχνολογία αυτή παρέχει μια νέα μέθοδο για να ξεπεραστούν πολλά από αυτά τα εμπόδια.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα

Το αίμα συλλέχθηκε από ασθενείς που υποβάλλονται σε κρανιοτομή για την εκτομή του πρωτογενούς, θεραπεία-αφελή όγκους του εγκεφάλου υπό IRB # 10BN171 στο Νευρολογικό Ινστιτούτο Barrow, Phoenix, AZ. Τα δείγματα καταψύχθηκαν στους -20 ° C, από 1 μέχρι 7 ετών πριν από τη χρήση. Το αίμα φυγοκεντρήθηκε 100.000 χ g για 30 λεπτά για να κατακρημνιστούν τα κυτταρικά υπολείμματα και αιμόλυση το πλάσμα μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα και καταψύχθηκαν στους -20 ° C. Υγιείς εθελοντές της ίδιας περίπου ηλικίας και αρσενικό-θηλυκό σύνθεση όπως κοόρτη καρκίνος αιμοδοσίας που καταψύχθηκε με παρόμοιο τρόπο. Λάβαμε επίσης δείγματα από ασθενείς διαγνώστηκαν με καρκίνο του μαστού και Πυρετός της κοιλάδας. Ο Πίνακας 1 δείχνει τον αριθμό και τον τύπο των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται σε αυτή την ανάλυση. MGMT ανάλυση μεθυλίωσης υποκινητή του ιστού του όγκου GBM διεξήχθη με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάλυση (PCR) όξινου θειώδους-τροποποιημένου DNA όπως περιγράφεται [42]

Protoarray Πλατφόρμα:. Παρουσία αυτοαντισωμάτων

Έχουμε επιλέξει 5

γλοιοβλάστωμα multiformae

ασθενείς και 3 υγιείς ίδιας ηλικίας μάρτυρες από ομάδα μας των δειγμάτων ορού. Ακολουθήσαμε το πρωτόκολλο Life Technologies »για την ανίχνευση των αυτοαντισωμάτων ακριβώς όπως είναι γραμμένο. Χρησιμοποιήσαμε Novagen Biologicals (San Diego, CA) βιοτινυλιωμένο αντι-ανθρώπινο δευτερεύουσα στην προτεινόμενη συγκέντρωση και Life Technologies »AlexaFluor 647-στρεπταβιδίνη ως ανίχνευση τριτογενή. Διαφάνειες σαρώθηκαν με σαρωτή ενός Agilent «C», 100% της ισχύος λέιζερ, το 80% PMT σε 10um ανάλυση. Διαφάνειες ευθυγραμμίστηκαν με το αρχείο appropriate.gal, και μετατρέπονται σε τιμές χρησιμοποιώντας Molecular Devices »(Santa Clara, CA) GenePix Pro 6.0. Όλοι οι έλεγχοι που παρέχονται με τις συστοιχίες λειτούργησε όπως αναμενόταν? δεδομένα αναλύθηκαν σε της Agilent (Palo Alto, CA) GeneSpring 7.3.1 χρησιμοποιώντας FWER = 5%. Δεν πρωτεΐνες στις συστοιχίες πληρούσαν τα κριτήρια ψευδείς ανακάλυψη για σημαντικότητα μεταξύ υγιών εναντίον τους ασθενείς με καρκίνο.

Immunosignature πλατφόρμα

Η τεχνολογία immunosignaturing έχει περιγραφεί αλλού [26], [27], [28 ], [29], [30], [35], [36], [37], [43]. Εν συντομία, μια αραίωση πλάσματος 1:500 προστέθηκε σε ρυθμιστικό επώασης που αποτελείται από 5% BSA, 0,1% Tween 20 σε 1Χ PBS ρΗ 7,2. Το μίγμα αυτό επωάστηκε επί των μικροσυστοιχίες immunosignaturing (που λαμβάνεται από www.peptidemicroarraycore.com) στους 37 ° C για 1 ώρα με ανάδευση σε 4800 Station Tecan Pro Hybridization (Tecan, Salzburg, Austria), ξηραίνεται υπό βαθμός άζωτο μοριακών, και σαρώνεται επί σαρωτή ενός Agilent «C» σε 70% της ισχύος λέιζερ, το 20% PMT σε 10um ανάλυση, ενιαία λειτουργία χρώματος. εικόνες μικροσυστοιχιών 16-bit μετατράπηκαν σε τιμές χρησιμοποιώντας GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Santa Clara, CA) για να παραχθεί ένα αρχείο GPR. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με GeneSpring 7.3.1 (Agilent, Santa Clara, CA). Συντελεστής συσχέτισης του Pearson σε ολόκληρη αυτών των δειγμάτων κατά μέσο όρο & gt? 0,92. Δείγματα με συντελεστές συσχέτισης για τεχνικά αντίγραφα & lt?. 0.85 είχαν επαναληφθεί

Πληροφορικής Ανάλυση

Η προεπεξεργασία των δεδομένων των μικροσυστοιχιών αποτελούνταν από διάμεση εξομάλυνση ανά διαφάνεια και συνδεθείτε

10 μετασχηματισμού. Τ-τεστ Ουαλίας διορθωμένη και προσαρμόζεται για πολλαπλές μεροληψία δοκιμή με τη χρήση ενός FWER (Οικογένεια-σοφός Error Rate) 5%? ANOVA ίδιο. Τα πεπτίδια αναλύθηκαν με τη δοκιμή την υπόθεση ότι υπήρχαν διαφορές στην ένταση σε ολόκληρη την καρκίνο του εγκεφάλου ή άλλες ομάδες ασθένεια και οι ασθενείς ελέγχου ως αποτέλεσμα της κατάστασης της νόσου. Πεπτίδια που πληρούν τα κριτήρια αυτά ήταν τα «χαρακτηριστικά» χρησιμοποιήθηκαν για την ταξινόμηση. Ταξινόμησης που χρησιμοποιείται γραμμική διακριτική ανάλυση (LDA) με άδεια-one-out cross-επικύρωσης. Support Vector Machines (SVM) με ένα πολυώνυμο τάξης γινόμενο των 1 και 0 διαγώνια συντελεστή κλίμακας χρησιμοποιήθηκε με τα αρχικά χαρακτηριστικά για να διασφαλίσει ότι οι επιδόσεις ταξινόμησης δεν οφείλεται σε ταξινομητή. SVM παράγεται σφάλματα ταξινόμησης κατά 3% του LDA. Ένα χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη Receiver Operator δημιουργήθηκε και η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUROC) υπολογίστηκε (Πίνακας 1).

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Adrienne Scheck και το Νευρολογικό Ινστιτούτο Barrow των Νοσοκομείο Αγίου Ιωσήφ για τα δείγματα ορού.