Αφηρημένο

Ιστορικό

Πολλές θεραπείες σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνου (NSCLC) αποτελούν ιστολογία-εξαρτώμενη, και η ανάγκη για δείκτες ιστολογία σχετίζονται αυξάνεται. Τα microRNAs (miRNAs) είναι πολλά υποσχόμενη μοριακών δεικτών σε πολλούς καρκίνους και τις διαφορές δείχνουν στην έκφραση ανάλογα με την ιστολογική υπότυπο. Η οικογένεια miRNA miR-200 έχει συσχετισθεί με τη ρύθμιση του επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) /μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ). EMT περιλαμβάνει βαθιές φαινοτυπικές αλλαγές που περιλαμβάνουν την απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, την απώλεια της κυτταρικής πολικότητας, και την απόκτηση των μεταναστευτικών και επεμβατική ιδιότητες που διευκολύνει τη μετάσταση. Διττό ρόλο για την οικογένεια miR-200 στην πρόγνωση αρκετών όγκων έχει συσχετιστεί με κύτταρο όγκου προέλευσης. Ωστόσο, ο προγνωστικός ρόλος και η λειτουργία των miR-200 οικογένεια σε NSCLC αδενοκαρκίνωμα σε πρώιμο στάδιο και το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) δεν έχουν καθιερωθεί.

Μέθοδοι

έκφραση των miRNAs προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας TaqMan αναλύσεις σε 155 όγκους από εκτομή των ασθενών με NSCLC. Λειτουργικές μελέτες διεξήχθησαν σε τρεις κυτταρικές σειρές NSCLC:. H23, A-549 και HCC-44

Αποτελέσματα

Υψηλή miR-200c έκφραση σχετίστηκε με μικρότερη συνολική επιβίωση (OS) σε ολόκληρο το ομάδα (p = 0,024). Υψηλή miR-200c (p = 0,0004) και miR-141 (p = 0,009), η έκφραση συσχετίζεται με μικρότερο λειτουργικό σύστημα στο αδενοκαρκίνωμα – αλλά όχι σε SCC. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, ένα σκορ κινδύνου βάσει miR-141 και η έκφραση του miR-200c αναδειχθεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για OS σε ολόκληρη την ομάδα (OR, 2.787? P = 0,033) και σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα (Ή, 10.649? P = 0,002). Λειτουργικές αναλύσεις έδειξαν ότι το miR-200c, συνδεόταν με μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) και επηρεάζονται τα επίπεδα κυτταρικής μετανάστευσης και E-cadherin, ενώ η υπερέκφραση του miR-141 μείωσε

KLF6

επίπεδα πρωτεΐνης και παράγεται μια αύξηση της έκκρισης του

VEGFA in vitro

(H23, ρ = 0,04? Α-549, p = 0,03? HCC-44, p = 0.02) και συνδέθηκε με υψηλότερη πυκνότητα του αίματος των μικροαγγείων σε δείγματα όγκων των ασθενών (p & lt? 0.001) .

Συμπέρασμα

Υψηλή miR-141 και την έκφραση του miR-200c συνδέονται με μικρότερη OS σε ασθενείς με NSCLC με αδενοκαρκίνωμα μέσω ΚΟΑ και την αγγειογένεση

Παράθεση:. Tejero R, Ναβάρο Α, Campayo Μ, Viñolas Ν, Marrades RM, Cordeiro A, et al. (2014) miR-141 και miR-200c ως δείκτες της συνολικής επιβίωσης σε πρώιμα στάδια μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα. PLoS ONE 9 (7): e101899. doi: 10.1371 /journal.pone.0101899

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 του Φεβ 2014? Αποδεκτές: 12, Ιούν, 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Tejero et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI0900547), SDCSD του Πανεπιστημίου της Βαρκελώνης και AECC-Catalunya 2013. αποτελμάτωση Tejero, Άννα Cordeiro, Marc Ruiz-Martinez είναι APIF υπότροφοι του Πανεπιστημίου της Βαρκελώνης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο, με περισσότερα από 226.000 νέα κρούσματα στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2012 [1]. Ογδόντα τοις εκατό των καρκίνων του πνεύμονα είναι καρκίνος μη-μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC) [2], η οποία έχει μια 5-ετή επιβίωση μόνο 10% συνολικά και 60-70% σε ασθενείς σταδίου Ι, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για νέες διαγνωστικές και θεραπευτικές στρατηγικές. Χειρουργική εκτομή, όταν είναι δυνατόν, παραμένει η μόνη θεραπευτική αγωγή για πρώιμο στάδιο NSCLC. Ωστόσο, σχεδόν το 50% των εκτομή ασθενείς εμφανίζουν υποτροπή και να έχουν μια θλιβερή πρόγνωση [2]. Αρκετές νέες θεραπείες σε NSCLC είναι ιστολογία εξαρτώμενη, και πλακώδες καρκίνωμα (SCC) ανταποκρίνεται κάπως διαφορετικά από αδενοκαρκίνωμα σε ορισμένες θεραπευτικές αγωγές [3], [4] [5]. Ωστόσο, λίγες ιστολογίας-εξαρτώμενη προγνωστικούς βιοδείκτες είναι διαθέσιμα για χρήση ρουτίνας στην κλινική πρακτική, ειδικά σε χειρουργήσιμη ασθενείς.

Τα τελευταία χρόνια, microRNAs (miRNAs) έχουν αναδειχθεί ως πολλά υποσχόμενη μοριακών δεικτών σε πολλές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του NSCLC [6 ]. Ειδικές miRNAs έχουν περιγραφεί ως ιστολογία ειδικά προγνωστικοί δείκτες για την SCC (miR-146b και miR-155) [7] ή αδενοκαρκίνωμα (miR-21) [8].

Η οικογένεια miR-200 αποτελείται από πέντε μέλη που βρίσκονται σε δύο διαφορετικές ομάδες: miR-200a, miR-200b και miR-429 περιλαμβάνει συστάδα 1 (χρωμόσωμα 1), και miR-200c και miR-141 περιλαμβάνει συστάδα 2 (χρωμόσωμα 12). Όλες οι πέντε miRNAs έχουν συσχετιστεί με τη ρύθμιση του επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) /μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ) [9]. EMT περιλαμβάνει βαθιές φαινοτυπικές αλλαγές που περιλαμβάνουν την απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, την απώλεια της κυτταρικής πολικότητας, και την απόκτηση των μεταναστευτικών και επεμβατική ιδιότητες [10]. Αυτή η διαδικασία είναι θεμελιώδης για την εμβρυϊκή ανάπτυξη και συμμετέχει επίσης στην εισβολή και μετάσταση όγκου [11]. Η οικογένεια πράξη miR-200 με τους στόχους ZEB1 τους και ZEB2 [9] και TGF-β2 [12]. Τα miRNAs είναι έτσι σε θέση να εκτελέσει την επιθηλιακά φαινότυπο μέσω μετα-μεταγραφική καταστολή των γονιδίων αυτών, που επιτρέπει την έκφραση της Ε-καδερίνης και των παραγόντων πολικότητας αναγκαία για το σχηματισμό του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις. Η οικογένεια miR-200 φαίνεται να έχουν διττό ρόλο στην πρόγνωση των ασθενών. Η υπερέκφραση της οικογένειας miR-200 δρα ως δείκτης της καλύτερης έκβασης σε γαστρικό και των ωοθηκών [13], [14], [15]. Στον καρκίνο του μαστού [16] και NSCLC [17] σε αντίθεση, υψηλή έκφραση της οικογένειας miR-200 συνδέεται με βραχύτερη επιβίωση. Στον καρκίνο του μαστού, η οικογένεια miR-200 προάγει μετάσταση μέσω ενός μηχανισμού μη-Ε-καδερίνης που σχετίζονται με στόχευση

SEC23A

, η οποία μεσολαβεί την έκκριση της μετάστασης καταστολής πρωτεΐνες [16]. Ωστόσο, ο ρόλος της υψηλής miR-200 επίπεδα σε NSCLC δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί.

Στην παρούσα εργασία, έχουμε αναλύσει το ρόλο των μελών της οικογένειας miR-200 σε όγκους από εκτομή των ασθενών με NSCLC και συσχετίζονται ευρήματά μας με τη συνολική επιβίωση (OS) μετά από χειρουργική επέμβαση, τόσο σε ολόκληρη την ομάδα και σύμφωνα με ιστολογική υποτύπους. Επιπλέον, μελετήσαμε τις λειτουργικές επιπτώσεις των προγνωστικών δεικτών σε κυτταρικές σειρές NSCLC.

Αποτελέσματα

Ασθενείς

Ο Πίνακας 1 παρουσιάζει τα κύρια κλινικά χαρακτηριστικά για όλους τους 155 ασθενείς. Η διάμεση ηλικία ήταν 65 έτη (εύρος, 35-85) και το 87% ήταν άνδρες. Είκοσι μία (13,6%) ασθενείς είχαν κατάσταση Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) (PS) 0 και 132 (85,2%) είχαν PS 1. Ενενήντα τέσσερις (60,6%) ασθενείς είχαν μπορώ στάδιο της νόσου. Εβδομήντα τρία (47,1%) ασθενείς είχαν αδενοκαρκίνωμα και 70 (45,1%) SCC. Εκατόν τριάντα οκτώ (89%) ασθενείς ήταν νυν ή πρώην καπνιστές. Είκοσι (12,9%) ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ανοσοενισχυτικό (16 για το στάδιο ΙΙ ή ΙΙΙ της νόσου και τέσσερα για το στάδιο Ι της νόσου με την T & gt? 4 cm). Η μέση παρακολούθηση ήταν 43 μήνες (εύρος, 2-160). Μετά από παρακολούθηση των 160 μηνών, 70 (45,2%) ασθενείς είχαν υποτροπιάσει.

Η

miR-200 οικογένεια έκφρασης και κλινικά χαρακτηριστικά

δείγματα Αξιόπιστες όγκου και φυσιολογικό ιστό ελήφθησαν από 155 ασθενείς με ΜΜΚΠ. Τα πέντε μέλη του miR-200 που βρέθηκαν σε δύο ομάδες: miR-200a /b, και miR-429 (cluster 1) και miR-200c και miR-141 (cluster 2). Όλα τα μέλη της οικογένειας miR-200, με εξαίρεση miR-141, ήταν μειωτικά στον όγκο σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό (miR-200a, p = 0,043? MiR-200b, σ & lt? 0,001? MiR-429, p = 0,003? MiR-200c , p & lt?. 0.001) (Σχήμα S1)

Οι ασθενείς με PS 1-2 έδειξαν υψηλότερα επίπεδα miR-429 (p = 0,039) από εκείνες με PS 0. Οι καπνιστές είχαν χαμηλότερα επίπεδα του miR-200a ( p = 0,027) και miR-429 (p = 0,032) σε σχέση με τους μη καπνιστές ή πρώην καπνιστές.

miR-141 και miR-200c ως δείκτες του OS

Χρησιμοποιώντας τις αποκοπές που ορίζονται από το Maxstat δέσμη R, ταξινομήσαμε τους ασθενείς ως έχουν υψηλά ή χαμηλά επίπεδα έκφρασης των πέντε miRNAs. Μεταξύ των 155 ασθενών σε ολόκληρη την ομάδα, εκείνοι με υψηλά επίπεδα miR-200c έδειξε μικρότερη OS (ρ = 0,024? Σχήμα 1Α). Μεταξύ των 94 ασθενών με νόσο του σταδίου Ι, τα υψηλά επίπεδα του miR-200c (ρ = 0,019? Εικόνα 1Β) και miR-141 (ρ = 0,03? Σχήμα 1C) και οι δύο συνδέονται με μικρότερη OS. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο OS προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τα επίπεδα έκφρασης των υπόλοιπων miRNAs

OS σύμφωνα με το (Α) τα επίπεδα έκφρασης του miR-200c σε ολόκληρη την ομάδα (Ν = 155).? (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-200c στο στάδιο Ι ασθενείς (Ν = 94)? και (Γ) miR-141 επίπεδα έκφρασης στο στάδιο Ι ασθενείς (Ν = 94).

Η

miR-141 και miR-200c σε αδενοκαρκίνωμα

Δεν υπάρχουν διαφορές στο OS παρατηρήθηκαν κατά με τα επίπεδα έκφρασης είτε miR-141 ή miR-200c σε ασθενείς με SCC (Σχήμα 2Α και 2Β). Ωστόσο, μεταξύ των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα, τα miRNAs εντοπίστηκαν δύο καλά διαφοροποιημένες ομάδες. Η μέση OS για τους ασθενείς αδενοκαρκίνωμα με υψηλή έκφραση του miR-200c ήταν 61,2 μήνες (95% CI = 42,9 – 79,5), ενώ ήταν 145,5 μήνες (95% CI = 134,4 – 156,6) για τα άτομα με χαμηλά επίπεδα (P & lt? 0.001? Σχήμα 2C ). Η μέση OS για τους ασθενείς αδενοκαρκίνωμα με υψηλή έκφραση του miR-141 ήταν 71,7 μήνες (95% CI = 44,9 – 81,6), ενώ ήταν 136,9 μήνες (95% CI = 110,9 έως 1162,9) για τα άτομα με χαμηλά επίπεδα (p = 0,009? Σχήμα 2D )

Η συνολική επιβίωση, σύμφωνα με (Α) τα επίπεδα έκφρασης του miR-200c σε ασθενείς με SCC (Ν = 70).? (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-141 σε ασθενείς με SCC (Ν = 70)? (C) Τα επίπεδα έκφρασης miR-200c σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα (Ν = 73)? και τα επίπεδα miR-141 έκφρασης σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα (Ν = 73) (D).

Η

Στη συνέχεια, ανέλυσε την συνδυαστική επίδραση του miR-141 και miR-200c δημιουργώντας ένα σκορ κινδύνου με βάση την έκφραση τα επίπεδα και των δύο miRNAs. Οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα και των δύο miRNAs ταξινομήθηκαν ως υψηλού κινδύνου, άτομα με χαμηλά επίπεδα των δύο miRNAs ως χαμηλού κινδύνου, και εκείνοι με άλλους συνδυασμούς ως ενδιάμεσου κινδύνου. Πενταετές OS ήταν 49,4% για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου, 66,7% για τους ασθενείς ενδιάμεσου κινδύνου, και 100% για τους ασθενείς χαμηλού κινδύνου (p = 0,002? Σχήμα 3).

Η

miR-200c έχει μεγαλύτερο αντίκτυπο στη μετανάστευση των κυττάρων από το miR-141

η μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε με

in vitro

δοκιμασία μηδέν μετά από επιμόλυνση με προ-miR-200c, προ-miR-141 ή προ-miRNA αρνητικό έλεγχος. Υψηλά επίπεδα miR-200c μειώνεται κυτταρική μετανάστευση σε σύγκριση με τον έλεγχο στην κυτταρική σειρά Η23 (p = 0,005), Α-549 (p = 0,0085) και HCC-44 (ρ = 0,013) (Σχήμα 4Α). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές για miR-141, εκτός από το Α-549 (p = 0,043). Μετά την επιμόλυνση, τα επίπεδα Ε-καδερίνης αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (Σχήμα 4Β) και παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα σε κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-200c.

(Α) Μετά από 36 ή 48 ώρες από την επιμόλυνση με προ-miRNAs σε οι κυτταρικές σειρές NSCLC, κυτταρική μετανάστευση μετρήθηκε με

in vitro δοκιμασία

μηδέν. Υψηλά επίπεδα miR-200c μειώνεται κυτταρική μετανάστευση σε σύγκριση με τον έλεγχο σε όλες τις κυτταρικές σειρές (H23, ρ = 0.005? Α-549, ρ = 0,0085? HCC-44, ρ = 0,013), ενώ η υψηλή επίπεδα miR-141 μειώνεται κύτταρο μετανάστευση μόνο στο Α-549 (p = 0.04). (Β) Τα επίπεδα Ε-καδερίνης αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία και παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα σε κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-200c σε σύγκριση με εκείνα επιμολυσμένα με προ-miR-141 ή προ-miR-ελέγχου σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές.

miR-141 ρυθμίζει αρνητικά KLF6, οδηγώντας σε αυξημένα επίπεδα VEGFA

in vitro

, και σχετίζεται με την υψηλότερη πυκνότητα των μικροαγγείων σε δείγματα ασθενών

Από το miR-141 υπερέκφραση είχε προηγουμένως που σχετίζονται με το σχηματισμό υψηλότερη αιμοφόρων αγγείων σε όγκους των ωοθηκών μοντέλα ποντικών [18], εξετάσαμε τις πιθανές επιπτώσεις αυτού του μηχανισμού για την προγνωστική ρόλο του miR-141 στο NSCLC. Χρησιμοποιώντας TargetScan 6.2, εντοπίσαμε KLF6 ως υποτιθέμενο στόχο του miR-141, αλλά δεν του miR-200c. Ανοσοκηλίδωση των KLF6 σε Η23 κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-141or προ-miR-200c έδειξε ότι μόνο miR-141 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης KLF6 στις 24 ώρες (Σχήμα 5Α). Από KLF6 ρυθμίζει την έκφραση και την έκκριση του VEGFA, ένας κρίσιμος αγγειογόνος παράγοντας [19], εξετάσαμε την επίδραση της αύξησης miR-141 επίπεδα έκφρασης στο

VEGFA

επίπεδα. Εμείς υπερεκφράζεται κυτταρικές σειρές και miR-141 και miR-200c στο H23, A-549 και HCC-44 NSCLC και θεραπεία των κυττάρων με το DFX για να παράγουν υποξία. Μετά από 48 ώρες, αναλύσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης του VEGFA στο υπερκείμενο αυτών των κυττάρων. Η υπερέκφραση του miR-141 παρήγαγε μια μέση αύξηση της τάξης του 28% στην απελευθέρωση της VEGFA (H23, ρ = 0,04? Α-549, p = 0.03, HCC-44, p = 0.02), ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές για ΜΙΚ 200c, εκτός από την κυτταρική γραμμή HCC-44 (ρ = 0,04) (Σχήμα 5Β).

(Α) Ανοσοκηλίδωση των KLF6 σε κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-αρνητικού ελέγχου ή προ-miR-141 /200c . miR-141 μείωσε σημαντικά το επίπεδο της πρωτεΐνης KLF6 στις τρεις κυτταρικές σειρές. (Β) Μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση με προ-miRNAs σε υποξικές συνθήκες, η συγκέντρωση VEGFA στο υπερκείμενο καλλιέργειας μετρήθηκε με ELISA. Όλα τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν την μέση ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) Ένα σύνολο τομών ιστού όγκου 29 αδενοκαρκινώματος αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία με CD34 + ως δείκτη σκάφος? Οι δύο αντιπροσωπευτικές περιπτώσεις με υψηλά /χαμηλά επίπεδα miR-141 που φαίνεται. (D) παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην πυκνότητα μικροαγγείων αίματος μεταξύ αδενοκαρκινώματα με υψηλά επίπεδα miR-141 και τα άτομα με χαμηλά επίπεδα miR-141 (ρ & lt? 0.001).

Η

Στη συνέχεια προσπάθησε να καθορίσει εάν υπάρχει μια σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης miR-141 και του αριθμού των αιμοφόρων αγγείων σε δείγματα ασθενών. Μετά τον προσδιορισμό του αριθμού των αιμοφόρων αγγείων σε δείγματα όγκων από 29 ασθενείς με ανοσοϊστοχημεία, με χρήση ενός αντισώματος έναντι CD34 +, το οποίο είναι ένας δείκτης του ενδοθηλίου των αγγείων (Σχήμα 5C), ταξινομήσαμε τα δείγματα του όγκου σε δύο ομάδες: υψηλά ή χαμηλά επίπεδα του miR-141. Ο μέσος αριθμός των αιμοφόρων αγγείων σε όγκους με υψηλά επίπεδα ήταν 22% υψηλότερη από τη μέση σε όγκους με χαμηλά επίπεδα (P & lt? 0.001? Σχήμα 5D)

πολυπαραγοντικές αναλύσεις

Στην πολυπαραγοντική ανάλυση. σε ολόκληρη την ομάδα, συμπεριλάβαμε όλες τις κλινικές και βιολογικών παραγόντων με μονοπαραγοντική P≤0.1 και το σκορ κινδύνου βάσει miR-141 και η έκφραση του miR-200c. Το miR-141 /miR-200c βαθμολόγηση κινδύνου (υψηλού κινδύνου εναντίον άλλων) αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της μικρότερης OS (Ή, 2.787? 95% CI = 1,087 – 7,148? P = 0,033), σε συνδυασμό με το στάδιο & gt? Ι και της ηλικίας & gt?. 65 (Πίνακας 2)

Η

Στην πολυπαραγοντική ανάλυση περιλαμβάνει μόνο τους ασθενείς αδενοκαρκίνωμα, το miR-141 βαθμολόγηση κινδύνου /miR-200c ήταν επίσης ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για το OS (OR, 10.649? 95% CI = 2,433 έως 46,608? p = 0,002), σε συνδυασμό με την ηλικία & gt?. 65 (Πίνακας 2)

Συζήτηση

στην παρούσα εργασία, έχουμε διαπιστώσει ότι η υψηλή ΜΙΚ 141 και έκφραση miR-200c συνδέονται με βραχύτερη επιβίωση σε ασθενείς εκτομή αδενοκαρκίνωμα NSCLC, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με πρώιμο στάδιο της νόσου. Επιπλέον, η συνδυαστική επίδραση των δύο miRNAs ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για το OS. Οι διάφοροι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην επίδραση αυτών των miRNAs? ενώ miR-141 φαίνεται να δρα μέσω της αγγειογένεσης με την αναστολή

KLF6

και την αύξηση

VEGFA

επίπεδα, miR-200c παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της ΚΟΑ.

Πρόσφατα, ένας φαινοτυπική πλαστικότητα έχει υποτεθεί για παροδική διεργασίες ΕΜΤ-ΜΕΤ [20]. Επαγωγή της MET από υπερέκφραση των μελών της οικογένειας miR-200 είναι σημαντική σε μεταγενέστερο στάδιο της διαδικασίας μετάσταση. Ενώ EMT επιτρέπει στο κύτταρο να μεταναστεύουν από τον πρωτοπαθή όγκο, ΚΟΑ επιτρέπει να αποικίσουν και να παράγει μεταστάσεις σε απομακρυσμένα όργανα [10], [11]. Έτσι, τόσο ρύθμιση προς τα κάτω και η υπερέκφραση των μελών της οικογένειας miR-200 έχουν συσχετιστεί με χειρότερη πρόγνωση. Προκειμένου να διερευνηθεί εάν η ρύθμιση της MET από miR-141 και miR-200c ήταν ιστολογία-εξαρτώμενη, εξετάσαμε προγνωστική αξία τους στις δύο μεγάλες ιστολογικών υποτύπων και βρήκε τόσο miR-141 και miR-200c σχετίζονταν με λειτουργικό σύστημα μόνο σε αδενοκαρκίνωμα ασθενείς. Έχει παρατηρηθεί ότι το αδενοκαρκίνωμα NSCLC είναι ένα πιο μεσεγχυματικά-όπως τον τύπο του όγκου, αφού έχει παρατηρηθεί ότι βιμεντίνη, ένας δείκτης των μεσεγχυματικών κυττάρων, υπερεκφράστηκε σε καλά διαφοροποιημένα αδενοκαρκινώματα και στο H23, Α-549 και κυτταρικές σειρές HCC-44 , αλλά δεν ανιχνεύονται σε SCC ιστούς [21], [22]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, miR-200c υπερέκφραση ως ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης προηγουμένως αναφέρθηκε σε μία ομάδα από 70 ασθενείς με ΜΜΚΠ που αποτελείται από δύο αδενοκαρκινώματος και ιστολογίες SCC [17], αλλά προγνωστική αξία του δεν εξετάστηκε στην υποομάδα των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα. Σε άλλα μοντέλα όγκων, όπως ο καρκίνος του μαστού, η υπερέκφραση των μελών της οικογένειας miR-200 οδήγησε σε αυξημένη μετάσταση [23] και σχετίζεται με κακή πρόγνωση [16]. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα του miR-141 στον ορό έχουν συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου [24] και τα υψηλά επίπεδα του miR-200c με κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο [25]. Σε αντίθεση, ένα έργο χρησιμοποιώντας δεδομένα από μια ηλεκτρονική βάση δεδομένων TCGA ανέφεραν ότι τα χαμηλά επίπεδα του miR-200b *, miR-200a και miR-429 σχετίζονταν με μικρότερο λειτουργικό σύστημα σε μια ετερογενή ομάδα ασθενών με NSCLC που περιλαμβάνονται εκείνοι με μεταστατική νόσο [26] .

από miRNAs ρυθμίζουν τα επίπεδα των πολλαπλών πρωτεϊνών στόχων ανάλογα με αλληλουχία τους, η επίδρασή τους εξαρτάται από τις πρωτεΐνες που εκφράζονται σε κάθε κυτταρικό τύπο [27]. Τόσο miR-141 και miR-200c βρίσκονται στην ίδια χρωμοσωμική περιοχή (12p13.31) και να μοιραστούν την ίδια θέση έναρξης της μεταγραφής [28], αλλά αν είμαστε ομάδα τα miRNAs της οικογένειας miR-200 σύμφωνα με την ομοιότητα των σπόρων τους ακολουθία, μπορούμε να εντοπίσουμε δύο διαφορετικές ομάδες – miR-200BC /429 και miR-200a /141 – οι οποίες διαφοροποιούνται από μια απλή αλλαγή νουκλεοτιδίου [29]. Αν και miR-141 και miR-200c είναι μεταγραφικώς ρυθμίζονται κατά τον ίδιο τρόπο, διαφέρουν ως προς τους στόχους τους. Όταν αναλύσαμε το ρόλο του miR-141 και miR-200c σε EMT /ΚΟΑ στην H23, A-549 και HCC-44 κυτταρικές σειρές, μόνο miR-200c επηρεάζεται EMT και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Η υπερέκφραση του miR-200c αύξησε τα επίπεδα της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης και μείωσε την ικανότητα μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, όπως δείχθηκε προηγουμένως με Ceppi

κ.ά.

σε ένα διαφορετικό πίνακα των κυτταρικών γραμμών NSCLC. Ceppi

et al

διερευνήθηκε η έκφραση του miR-200c

in vitro

και

in vivo

και μια ισχυρή αντίστροφη συσχέτιση με την εισβολή ανιχνεύθηκε. Επαναφορά του miR-200c σε πολύ επεμβατικές /επιθετικά κύτταρα NSCLC που προκαλείται από την απώλεια του φαινοτύπου μεσεγχυματικών με την αποκατάσταση E-cadherin και η μείωση της έκφρασης Ν-cadherin, και ανέστειλε

in vitro

εισβολή των κυττάρων, καθώς και

στο vivo

μετάσταση σχηματισμό [30]. Επιπλέον, Pacurari et al. διαπίστωσε ότι το miR-200c προς τα κάτω ρύθμιση σε δείγματα όγκων του πνεύμονα SCC συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα DCL1, ATRX και HFE -. βιοδεικτών που σχετίζονται με την EMT [31]

Αν και miR-141 είναι ένα μέλος της οικογένειας mir-200, το δεν συμμετείχε στη EMT /ΚΟΑ. Η

in vitro

υπερέκφραση του miR-141 σχετιζόταν με μείωση του

KLF6

επίπεδα πρωτεΐνης, παράγοντας μία αύξηση στην έκκριση του

VEGFA

. Επιπλέον, οι όγκοι με υψηλά επίπεδα miR-141 είχε ένα μεγαλύτερο αριθμό αιμοφόρων αγγείων. Έχει αποδειχθεί ότι ο καρκίνος που σχετίζεται με ινοβλάστες (CAFS) που απομονώνεται από αδενοκαρκινώματα πνεύμονα ποντικού που εκκρίνεται άφθονη VEGFA και αυξημένη εισβολή των καρκινικών κυττάρων σε μελέτες συγκαλλιέργεια [32]. Όταν αναλύσαμε την έκφραση του miR-141 στον όγκο και αντιστοιχισμένο φυσιολογικό ιστό, δεν παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης, οδηγώντας μας να υποθέσουμε ότι ο προγνωστικός ρόλος του miR-141 μπορεί να σχετίζεται με την έκφρασή του σε κύτταρα CAF και όχι σε κύτταρα όγκου. Η υπερέκφραση του miR-141, θα οδηγήσει σε υπερπαραγωγή VEGFA και την αύξηση της νεοαγγειογένεσης, τα οποία έχουν προηγουμένως σχετίζονται με την πρόγνωση σε NSCLC [33].

Υλικά και Μέθοδοι

Πληθυσμός μελέτης και την ηθική δήλωση

εκατόν πενήντα πέντε ενήλικες ασθενείς διαγνώστηκαν με ΜΜΚΠ οι οποίοι υποβλήθηκαν σε πλήρη χειρουργική εκτομή σε Hospital Clinic στη Βαρκελώνη, Ισπανία, μεταξύ Μαρτίου 1996 και Δεκεμβρίου 2009 συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Έγκριση για τη μελέτη λήφθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του κέντρου, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε συμμετέχοντα, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

εκχύλιση RNA και miRNA ανάλυση

Το συνολικό RNA και ανίχνευση miRNA εκτελέστηκε από τους ιστούς όγκων FFPE όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. ανίχνευση miRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας εμπορικές δοκιμασίες (δοκιμασίες microRNA TaqMan, Appplied Biosystems)

Western Blot ανάλυση

ανάλυση Western Blot πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35] χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα:. KLF6 sc -7158 (Santa Cruz Biotechonology) και α-τουμπουλίνης (Sigma).

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση, πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36] χρησιμοποιώντας ένα Flex Μονοκλωνικό ποντικού κατά ανθρώπινης CD34 Class II κλώνο QBend 10 Έτοιμο προς χρήση (Dako) και μονοκλωνικά Mouse Anti-Human

αιμοφόρων αγγείων ποσοτικοποίηση

επιλέχθηκαν E-καδχερίνη κλώνος NCH-38 (Dako). Τέσσερις ανεξάρτητες περιοχές που βρίσκονται υπό ένα πεδίο 40X, και ένα πεδίο 200Χ (0,785 χιλιοστά

2 ανά τομέα) και χρησιμοποιείται για να μετρήσει CD34-θετικά σκάφη σε κάθε μία από αυτές τις περιοχές. Δύο ανεξάρτητες παθολόγους εξέτασε τις διαφάνειες, και ο μέσος όρος των τεσσάρων 200X μετράει τομέα των CD34-θετικών σκάφη καταγράφηκε.

Οι κυτταρικές σειρές, miRNA επιμόλυνση και VEGF ποσοτικοποίηση

H23 (American Type Culture Collection) και τα κύτταρα HCC-44 (DSMZ) καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen). Α-549 κύτταρα (DSMZ) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου.

Μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, 7 χ 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με 100ηΜ προ-miR-141 /200c ή προ-miR-αρνητικού ελέγχου # 2 χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 400 μΜ δεσφερριοξαμίνης να επάγει υποξικές συνθήκες. Μετά από 24 ώρες επώασης, η συγκέντρωση VEGF στα υπερκείμενα μετρήθηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το VEGF Ανθρώπινα Elisa Kit (ab100662, Abcam).

Η κυτταρική μετανάστευση ανάλυση

μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε με

in vitro

δοκιμασία μηδέν [37]. 5 * 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια 12 φρεατίων πλάκα μία ημέρα πριν την επιμόλυνση με προ-miRNAs. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, η κυτταρική μονοστιβάδα αποξέστηκε σε μια ευθεία γραμμή για να δημιουργήσει ένα «μηδέν» με ένα άκρο ρ100 πιπέτας. Η απόσταση της μετανάστευσης (μm) εκτιμήθηκε σε 36 ώρες (HCC-44) ή σε 48 ώρες (H23 και Α-549) μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας cellSense Έναρξη 1.7 του λογισμικού (Όλυμπος).

Στατιστικές αναλύσεις

OS υπολογίστηκε από το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης για την ημερομηνία θανάτου ή την τελευταία παρακολούθηση. Kaplan-Meier καμπύλες για το OS, με διαστήματα εμπιστοσύνης 95% τους (ΠΙ), συντάχθηκαν και σε σύγκριση με τη βοήθεια ενός δοκιμασία log-rank. Όλοι οι παράγοντες με τιμή p & lt? 0.1 στην μονοπαραγοντική ανάλυση συμπεριλήφθηκαν στην πολυμεταβλητή παλινδρόμηση Cox αναλύσεις για το OS

Paired t-test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs μεταξύ του ιστού του όγκου και σε συνδυασμό φυσιολογικό ιστό.. Μη paired t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων. Βέλτιστη αποκοπές των δεδομένων έκφρασης των miRNAs για το OS αξιολογήθηκαν μέσω μέγιστο επιλεγμένων στατιστικών στοιχείων log-rank με τη χρήση του πακέτου Maxstat (πακέτο R). Η εφαρμογή αυτών των αποκοπές επιβεβαιώθηκε από τη δοκιμή Kaplan-Meier. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση PASW Στατιστικά V18 (SPSS) και R v2.8.1. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο ≤0.05.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

επίπεδα έκφρασης των μελών της οικογένειας miR-200 που λαμβάνεται από 155 NSCLC όγκου και σε συνδυασμό φυσιολογικό ιστό. (Α) Ομάδα 1: miR-200a, miR-200b, και miR-429. (Β) Cluster 2:. MiR-141 και miR-200c

doi: 10.1371 /journal.pone.0101899.s001

(ΔΕΘ)