Αφηρημένο

Σωματικά μεταλλαξιγένεσης τρανσποζονίου σε ποντίκια είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για τη διερεύνηση των γενετικών μηχανισμών ογκογένεσης. Η ταυτοποίηση των όγκων οδήγησης ενθέσεις μεταθετονίου απαιτεί παραδοσιακά τη γενιά των μεγάλων όγκων ομάδες να λάβουν πληροφορίες σχετικά με τις κοινές θέσεις εισαγωγής. Tumor οδήγηση ενθέσεις χαρακτηρίζονται επίσης από κλωνική διαστολή τους στον ιστό του όγκου, ένα φαινόμενο που διευκολύνεται από την αργή και εξελισσόμενη διαδικασία μετασχηματισμού του μεταθετονίου μεταλλαξογένεσης. Περιγράφουμε εδώ ένα βελτιωμένο προσέγγιση για την ανίχνευση παρεμβολών όγκου οδήγησης που αξιολογεί την κλωνική επέκταση των παρεμβολών με την ποσοτικοποίηση της σχετικής αναλογίας αλληλουχίας αναγνώσεις που λαμβάνονται σε επιμέρους όγκους. Για το σκοπό αυτό, έχουμε αναπτύξει ένα πρωτόκολλο για προσδιορισμό αλληλουχίας θέση εισαγωγής που χρησιμοποιεί ακουστική διάτμηση του DNA του όγκου και αλληλούχιση Illumina. Αναλύσαμε διάφορους συμπαγείς όγκους που δημιουργούνται από PiggyBac μεταλλαξιγένεση και για κάθε όγκο & gt? 10

6 διαβάζει αντιστοιχούν σε & gt? 10

4 θέσεις εισαγωγής ελήφθησαν. Σε κάθε όγκο, 9-25 ενθέσεις ξεχώρισε από εμπλουτισμένο σειρά τους διαβάζουν συχνότητες σε σύγκριση με τις συχνότητες που λαμβάνονται από τους ελέγχους ουρά DNA. Αυτά τα εμπλουτισμένα ενθέσεις είναι πιθανά κλωνικά ενθέσεις οδήγηση του όγκου, και έτσι τον προσδιορισμό υποψήφια γονίδια του καρκίνου. Τα υποψήφια γονίδια του καρκίνου της μελέτης μας αποτελείται πολλούς καταξιωμένους γονίδια του καρκίνου, αλλά και τα νέα υποψήφια γονίδια, όπως Εγκέφαλος-like1 (

Mamld1

) και Diacylglycerolkinase δέλτα (

Dgkd

). Δείχνουμε ότι κλωνική ανάλυση επέκτασης αλληλουχίας υψηλής απόδοσης είναι μια ισχυρή προσέγγιση για την ταυτοποίηση των υποψήφιων γονιδίων του καρκίνου σε παρεμβατικής οθόνες μεταλλαξιγένεση σε επίπεδο μεμονωμένων όγκων

Παράθεση:. Friedel RH, Friedel CC, Bonfert Τ, Shi R, Rad R, Soriano P (2013) κλωνική επέκταση Ανάλυση τρανσποζονίου Εισαγωγές από High-Throughput αλληλουχίας Εντοπίζει γονίδια του καρκίνου του υποψηφίου σε μια οθόνη PiggyBac μεταλλαξιγένεση. PLoS ONE 8 (8): e72338. doi: 10.1371 /journal.pone.0072338

Συντάκτης: Andrew C. Wilber, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 του Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 8 Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Friedel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από HD24875 επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας του Παιδιού και Ανθρώπινης ανάπτυξης σε PS, από αναπτυξιακών κονδυλίων από το Ινστιτούτο Tisch Καρκίνου, Mount Sinai School of Medicine, σε RF και P.S., και από DFG FR2938 επιχορήγηση /1-1 έως C.F. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σωματικά μεταλλαξιγένεση από τρανσποζόνια DNA σε ποντίκια ερευνά τις υποκείμενες γενετική της ογκογένεσης. Τρανσποζόνια φιλοξενούν ενεργοποίησης γονιδίου ή κασέτες γονιδίων-παγίδευση μπορούν να ενεργοποιήσουν ογκογονίδια ή να διαταράξει καταστολείς των όγκων, οδηγώντας με αυτόν τον τρόπο την ανάπτυξη του όγκου [1]. Εκτός από το ρόλο τους στην ανακάλυψη νέων γονιδίων του καρκίνου, τρανσποζονίου μεταλλαξογένεση διευκολύνει επίσης πιο λεπτομερείς μελέτες για τις γενετικές και κυτταρικοί μηχανισμοί της ογκογένεσης αξιοποιώντας ευαισθητοποιητικό μεταλλάξεις φόντο και ενεργοποίηση transposon ειδικού τύπου κυττάρου [2]. Δύο συστήματα μεταθετό στοιχείο έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε οθόνες καρκίνο στο ποντίκι: Ωραία Κοιμωμένη [2-4] και PiggyBac [5,6]. Οι θέσεις προσθήκης του transposon προσδιορίζονται από θραύσματα διασταύρωση αλληλούχιση του πέρατα του μεταθετονίου και πλευρικές γονιδιωματικό DNA. Οι όγκου οδήγηση υποψήφια γονίδια του καρκίνου, στη συνέχεια προσδιορίζονται με κοινή θέση εισαγωγής ανάλυση (CIS), μια διαδικασία ενθέσεις χαρτογράφηση των πολλαπλών όγκων και ανάλυση των γονιδίων που συνήθως χτύπησε στο ανεξάρτητα δείγματα. ανάλυση CIS έχει αποδειχθεί ότι είναι μια επιτυχημένη προσέγγιση για την ταυτοποίηση των υποψήφιων γονιδίων, ωστόσο, απαιτεί ένα σημαντικό αριθμό δειγμάτων του όγκου (50-100 στις περισσότερες μελέτες), και θα παρέχει πολύ λίγες πληροφορίες σχετικά με τα μοτίβα μετάλλαξης σε επιμέρους όγκους.

Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του μετασχηματισμού με τρανσποζόνια είναι η συνεχής κινητοποίηση μέσα και έξω από θέσεις εισαγωγής. Ο μηχανισμός αυτός διευκολύνει τη θετική επιλογή και κλωνική επέκταση των παρεμβολών όγκου οδήγηση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου πάνω από ουδέτερο ενθέσεις επιβατών. Κλωνική επέκταση των εισαγωγών τρανσποζονίου μπορεί να αξιολογηθεί με την ανάλυση των σχετικών αναλογιών αλληλουχία διαβάζει ελήφθη από ενθέσεις σε επιμέρους όγκους. Ωστόσο, προηγούμενες οθόνες τρανσποζόνιο όγκου δεν έχουν χρησιμοποιήσει ανάλυση κλωνική επέκταση, πιθανόν λόγω των περιορισμών στον αριθμό των ακολουθίας αναγνώσεις λαμβάνονται με την προσέγγιση 454 Pyrosequencing που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις μελέτες. Επιπλέον, τα τυπικά πρωτόκολλα για την παρασκευή του DNA του όγκου συνεπάγεται κατακερματισμού με πέψεις περιορισμού, η οποία εισάγει τις προκαταλήψεις για ενθέσεις που αντιπροσωπεύεται από μικρότερα θραύσματα περιορισμού που είναι περισσότερο αποτελεσματικά ενισχύονται με PCR [7]. Μια εναλλακτική προσέγγιση για τον κατακερματισμό του DNA, ακουστική κούρεμα, μπορεί να μειώσει σημαντικά τις προκαταλήψεις PCR, όπως κάθε θέση εισαγωγής αντιπροσωπεύεται από ένα σύνολο τεμαχίων με παρόμοιο εύρος μήκους [8].

Για να αποκτήσει μια βελτιωμένη ποσοτική αναπαράσταση της θέσεις εισαγωγής από την ακολουθία τους διαβάζουν τους αριθμούς, συνδυάσαμε δύο τεχνικές εξελίξεις των πρόσφατων εκθέσεων – αλληλουχίας Illumina για την απόκτηση & gt? 10

6 διαβάζει ανά δείγμα [7], και ακουστική διάτμηση να μειώσει τις προκαταλήψεις PCR [7,8] – και να αναπτυχθεί ένα πρωτόκολλο για την αποτελεσματική αλληλούχιση υψηλής απόδοσης των εισαγωγών τρανσποζονίου. Εφαρμόσαμε το πρωτόκολλο μας για την ανάλυση των έντεκα διάφορους συμπαγείς όγκους που είχαμε δημιουργούνται από μεταλλαξογένεση με την PiggyBac συστοιχία τρανσποζόνιο ATP1-S2 [5]. Για κάθε εισαγωγή σε κάθε όγκο, υπολογίσαμε μια σχετική συχνότητα ανάγνωσης, η οποία μας επέτρεψε να εντοπιστούν μεταξύ 9-25 ενθέσεις ανά όγκο που εκπροσωπούν κλωνικά επεκταθεί ενθέσεις οδήγησης όγκου. Μεταξύ των γονιδίων μεταλλαχθεί με κλωνικά επεκταθεί ενθέσεις ήταν πολυάριθμα εγκατεστημένος γονίδια του καρκίνου, καθώς επίσης και διάφορα νέα γονίδια υποψήφια καρκίνου.

Έχουμε αποδείξει ότι εδώ αλληλούχιση υψηλής διεκπεραιωτικότητας βιβλιοθηκών θέσης εισαγωγής προσδιορίζει κλωνικά επεκταθεί μεταλλάξεις σε μεμονωμένους όγκους. Η προσέγγιση αυτή θα βελτιώσει σημαντικά την ποιότητα του υποψηφίου γονιδίου καρκίνου προβλέψεις παρεμβατικής οθόνες μεταλλαξιγένεση, και θα διευκολύνει τον εντοπισμό των δικτύων συνεργαζόμενων μεταλλάξεις σε μεμονωμένους όγκους.

Αποτελέσματα

PiggyBac transposon μεταλλαξιγένεση

μια οθόνη τρανσποζονίου μεταλλαξιγένεση πραγματοποιήθηκε σε ποντίκια που φέρουν εκφράζεται παντού τρανσποσάσης PiggyBac (Rosa 26-PBase) και ένα διαγονιδιακό σειρά PiggyBac transposon (ATP1-S2) [5]. Η συστοιχία ATP1-S2 περιέχει 20 αντίγραφα της ATP1 τρανσποζόνης, το οποίο είναι εξοπλισμένο με δέκτες ματίσματος για την παγίδευση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και έναν υποκινητή CAG για την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων. Αυτά τα στοιχεία επιτρέπουν ATP1 να προκαλέσει συμπαγείς όγκους κατά τη μετάθεση [5]. Εμείς εκτραφεί μια δοκιμή ομάδα των 27 ποντίκια που έφεραν Rosa 26-PBase και ATP1-S2, και μια ομάδα ελέγχου 27 ποντικών μόνο με ATP1-S2. Ομάδες ήταν ηλικίας, και ενώ δεν παρατηρήθηκαν όγκοι στην ομάδα ελέγχου, παρατηρήθηκε 11 μακροσκοπική όγκων μεταξύ 8 ποντίκια μέσα στην ομάδα δοκιμής μεταξύ 59 – 85 εβδομάδες (Εικόνα 1Α). Τρία ζώα πραγματοποιείται όγκους σε δύο ανεξάρτητους χώρους, και σε μία περίπτωση, η γενετική ανάλυση των θέσεων εισαγωγής έδειξε ότι και οι δύο όγκοι έχουν κοινή προέλευση (βλέπε παρακάτω), ενώ όλοι οι άλλοι όγκοι προφανώς προέκυψαν ανεξάρτητα. τύπους όγκων που αποτελείται πλακωδών κυττάρων καρκινώματα του δέρματος, συμπαγείς όγκους του πνεύμονα και του εντέρου, και οζώδες λέμφωμα του σπλήνα. Η περιεκτικότητα των κυττάρων του όγκου στα αποκόπηκαν δείγματα κυμαίνονταν από 30-100%, όπως εκτιμήθηκε με ιστοπαθολογική ανάλυση αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήματα (Σχήμα S1). Απομονώσαμε DNA για ανάλυση των θέσεις εισαγωγής τρανσποζονίου από όλες τις 11 όγκους. Για τον έλεγχο για τυχαίες ενθέσεις PiggyBac σε μη καρκινικό ιστό, απομονώσαμε επίσης DNA από 6 άκρες της ουράς των ποντικών που φέρουν όγκο.

Α) οικόπεδο επιβίωσης Kaplan-Meier ομάδες μεταφέρουν είτε συστοιχία PiggyBac μόνο (ATP1-S2 ) ή PiggyBac συστοιχία και συστατική τρανσποζάσης (ATP1-S2? R26-PBase). Κόκκινα βέλη δείχνουν εμφάνιση όγκων. Σημειώστε τα σήματα υποδηλώνουν λογοκρίνονται τα ζώα (δεν όγκου που παρατηρείται κατά τη στιγμή της θυσίας).

Β) Ευθυγραμμίσεις της γονιδιωματικής αλληλουχίας Illumina διαβάζει τερματίσει στις θέσεις που δημιουργούνται από ακουστική διάτμηση. PB3 /PB5, PiggyBac 3 ‘/5’ τερματική επανάληψη? Α.Ε., συγκολλήσεις δέκτη? P, υποστηρικτής CAG.

Γ) Παράδειγμα χαρτογραφηθεί ακολουθία διαβάζει για τις PB3 και PB5 πλευρές μιας εισαγωγής PiggyBac, είδαν στο πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα UCSC. Σημειώστε ότι ακουστική διάτμηση προκαλεί τυχαία σημεία θραύσης DNA στο οποίο προσδένονται Splinkerette προσαρμογείς, η οποία οδηγεί σε ένα σκαλί-σαν μοτίβο ευθυγραμμίσεις αλληλουχιών. Η συνεχής τέλος ευθυγραμμίσεις προς τα δεξιά και αριστερά προκαλούνται από την αμετάβλητη ακολουθία διαβάσει το μήκος του συστήματος Illumina.

Δ) Ποσοτική επισκόπηση της ακολουθίας διαβάζει, διαβάζει χαρτογραφηθεί, και μοναδικές θέσεις εισαγωγής από την ουρά και όγκου δείγματα.

Η

αλληλουχίας υψηλής απόδοσης των εισαγωγών τρανσποζονίου

Αξιοποιήσαμε Illumina αλληλουχίας υψηλής απόδοσης για την επίτευξη συνολικής κάλυψης ανάγνωσης των εισαγωγών τρανσποζονίου σε επιμέρους δείγματα όγκων. Στις περισσότερες προηγούμενες οθόνες τρανσποζονίου μεταλλαξογένεση, όγκος ΟΝΑ χωνεύθηκε με ένζυμα περιορισμού, οι οποίες παράγουν θραύσματα ενός σταθερού μεγέθους για μεμονωμένες προσθήκες. Όπως PCR ενισχύει βραχύτερα θραύσματα πιο αποτελεσματικά από μακρύτερα θραύσματα, μια προκατάληψη εισάγεται κατά την επακόλουθη ενίσχυση PCR για ενθέσεις που αντιπροσωπεύονται από σύντομη θραυσμάτων περιορισμού [7,8]. Για να επιτευχθεί μια πιο αναλογική εκπροσώπηση των εισαγωγών, που κατακερματισμένο DNA του όγκου με ακουστική διάτμηση σε τεμάχια των 200-400 μεγέθους bp (βλέπε Μέθοδοι S1 για ένα λεπτομερές πρωτόκολλο). Με αυτόν τον τρόπο, οι εισαγωγές αντιπροσωπεύονται από το θραύσμα πισίνες με παρόμοιο εύρος μεγέθους. Κουρά ακολούθησε τέλος επιδιόρθωση του DNA, A-ουράς 3′-άκρα, και η σύνδεση με Splinkerette προσαρμογείς με 3′-T-προεξοχή (Εικόνα S2). Σε ξεχωριστές αντιδράσεις, θραύσματα διασταύρωση για την 3 ‘και 5’ άκρα του τρανσποζονίου PiggyBac (PB3 και PB5) στη συνέχεια ενισχύθηκαν σε δύο διαδοχικές PCR γύρους για να δημιουργήσει PB3 και PB5 βιβλιοθήκες για κάθε δείγμα. Οι PCR εκκινητές περιείχαν τερματικές αλληλουχίες προσαρμογέα για ενίσχυση στερεάς φάσης Illumina και αλληλούχιση και ένα 6-βάσης bar code να διακρίνει δείγματα σε multiplex αλληλούχιση. Έχουμε ετοιμάσει δύο πισίνες του PB3 και PB5 βιβλιοθήκες, και κάθε πισίνα ήταν αλληλουχία σε μία μόνο λωρίδα μιας συσκευής Illumina HiSeq2000 με 100 βάσεις διαβάσει μήκους. Ακολουθία διαβάζει είχαν αποδιαυλώνονται σύμφωνα με bar τους κώδικα και χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα του ποντικού χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο παπιγιόν [9].

Ευθυγράμμιση της ακολουθίας διαβάζει στο πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα UCSC επιβεβαίωσε την αμερόληπτη χαρακτήρα της κατάτμησης DNA με ακουστική διάτμηση. Η τυχαία κατανομή των σημείων θραύσης DNA που προκαλείται αλληλουχία διαβάζει από προσθήκεε τρανσποζονίων να ευθυγραμμιστεί σε μια σκάλα που μοιάζει με μοτίβο γύρω από την κεντρική αλληλουχία ΤΤΑΑ του PiggyBac εισαγωγής (Σχήμα 1Β, C). Για κάθε δείγμα, λάβαμε κατά μέσο όρο ~ 5×10

6 bar-κωδικοποιημένες διαβάζει, με παρόμοιους αριθμούς για τους όγκους και τους ελέγχους ουρά (Σχήμα 1D? Πίνακας S1).

Περίπου το 19,3% των διαβάζει από δείγματα όγκου θα μπορούσε να να χαρτογραφηθεί στο γονιδίωμα του ποντικού. Για τα δείγματα της ουράς, το 15,3% των διαβάζει θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί. Αυτά διαβάζει αντιπροσωπεύουν νέες ενθέσεις του μεταθετού ATP1 εκτός του πίνακα των χορηγών της. Αυτό το μέτριο ποσοστό δυνατότητα αντιστοίχισης διαβάζει οφείλεται κυρίως στο υψηλό ποσοστό του αναφέρει ότι περιείχαν πλασμίδιο σειρά συνοδευτικών ακινητοποιημένα τρανσποζόνια στη σειρά των χορηγών και, ως εκ τούτου, δεν θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί. Για τον προσδιορισμό του κλάσματος του ATP1 transposons που παραμένουν στη συστοιχία δότη ATP1-S2, πραγματοποιήθηκε ανάλυση κατά Southern ουρές των Rosa 26-PBase? ATP1-S2 ποντίκια και διαπίστωσαν ότι περίπου το 40% του ATP1-S2 τρανσποζόνια δεν κινητοποιήθηκαν από τη συστοιχία (Εικόνα S3). Αυτή η ατελής κινητοποίηση ATP1 μπορεί να προκληθεί από την ειδική in vivo κατάσταση χρωματίνη της συστοιχίας ATP1-S2. Όπως μεθυλίωσης του DNA σε θέσεις CpG μπορεί να είναι ανασταλτική για PiggyBac μεταφοράς [10], αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του ATP1-S2 με κηλίδα Southern με ένα ευαίσθητο μεθυλίωση πέψη περιορισμού. CpG μεθυλίωση του πίνακα ATP1-S2 ανιχνεύθηκε, παρέχοντας μια πιθανή εξήγηση για το μέτριο ρυθμό μεταφοράς (Σχήμα S3). Ένας επιπλέον παράγοντας που μειώνει νέες εισαγωγές τρανσποζονίου είναι η απώλεια της transposons κατά τη διάρκεια της μεταφοράς (δηλαδή, εκτομή χωρίς να ακολουθήσει την επανένταξη), και μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι περίπου το ήμισυ όλων των αντιγράφων ATP1 transposon χάνονται κατά τη διάρκεια της δραστηριότητας μεταφοράς [5]. Παρά τη μέτρια κλάσμα δυνατότητα αντιστοίχισης ακολουθία διαβάζει, το πρωτόκολλο αλληλουχίας υψηλής απόδοσης μας, μας επέτρεψε να ανακτήσει σημαντικό αριθμό διαβάζει για τους σκοπούς της μελέτης μας με ~ 1×10

6 διαβάζει χαρτογραφηθεί κατά μέσο όρο για τα δείγματα όγκων και ~ 0.7×10

6 διαβάζει για τους ελέγχους ουρά (Σχήμα 1D).

μονόπλευρη και αμφίπλευρη κάλυψη ανάγνωσης των παρεμβολών

Συνολικά, βρήκαμε 4.210 νέες θέσεις εισαγωγής σε δείγματα όγκων και την ουρά συνδυασμό που υποστηρίζονται από αντιστοιχίσεις ανάγνωσης και στις δύο πλευρές της εισαγωγής PiggyBac transposon (PB3 και PB5). Πιο ενθέσεις, ωστόσο, ταυτοποιήθηκαν με χαρτογραφήθηκαν διαβάζει μόνο στη μία πλευρά του μεταθετονίου (314.970 ενθέσεις με διαβάζει μόνο PB3 ή πλευρά PB5). Είναι ενδιαφέρον ότι η συντριπτική πλειοψηφία των ενθέσεων στη μελέτη μας, ιδίως εκείνων με διαβάζει χαρτογραφείται σε μία μόνο πλευρά του τρανσποζονίου, αντιπροσωπεύθηκαν από μικρά Διαβάστε αριθμούς (Σχήμα S4). Μια παρόμοια παρατήρηση σχετικά με το υψηλό ποσοστό των σπάνιες προσθήκες έχει γίνει σε μια μελέτη Sleeping Beauty [7]. Είναι κατανοητό ότι αυτές οι σπάνιες ενθέσεις διαφύγουν την ανίχνευση και στις δύο πλευρές του transposon λόγω της χαμηλής αφθονίας τους, με αποτέλεσμα την υψηλή αναλογία ενθέσεις καλύπτονται μόνο στη μία πλευρά. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης αρκετά ενθέσεις με υψηλή ανάγνωσης αριθμών που καλύφθηκαν μόνο στη μια πλευρά (σχήμα S4). Πιθανοί λόγοι για την κάλυψη μονόπλευρη ανάγνωση σε αυτές τις περιπτώσεις περιλαμβάνουν πλευρικές επαναλαμβανόμενες ή χαμηλές εκτάσεις πολυπλοκότητα του DNA που εμποδίζουν τη χαρτογράφηση, ή μικρές αναδιατάξεις DNA (διαγραφές, αναστροφές) που προκαλείται από την εισαγωγή του μεταθετονίου. Για την ολοκληρωμένη ανάλυση, συμπεριλάβαμε στη μελέτη μας, όλες τις θέσεις εισαγωγής, που συνδυάζει θέσεις εισαγωγής με μονόπλευρη και με δύο όψεων ακολουθία διαβάσετε κάλυψης, η οποία οδήγησε σε ~ 2×10

4 μοναδικές ενθέσεις μεταθετονίου κατά μέσο όρο ανά δείγμα (Σχήμα 1D).

PiggyBac μεταλλάσσεται το γονιδίωμα

ομοιόμορφα

τα στοιχεία σχετικά με το χρωμοσωμικό κατανομή των παρεμβολών ATP1 αποκάλυψε ότι το μεταθετό στοιχείο ATP1 PiggyBac μεταλλάσσεται χρωμοσώματα ομοιόμορφα κατ ‘αναλογία προς το περιεχόμενό ΤΤΑΑ τους, τόσο σε όγκους και ουρές (Εικόνα 2Α) . Αυτό το σχέδιο είναι σε συμφωνία με τα προηγούμενα στοιχεία που αναφέρονται για το σχέδιο εισαγωγής του σχετικού ATP2 transposon [5]. Η εξαίρεση στον αναλογική κατανομή ενθέσεις ήταν το εγγύς άκρο του χρωμοσώματος 10, που φιλοξενεί τη συστοιχία δότη ATP1-S2. Εδώ, παρατηρήσαμε μια εμπλουτισμό ενθέσεις στην περιοχή από ~ 2 Mb στο εγγύς άκρο του χρωμοσώματος 10 (Σχήμα 2Β). Αυτή η προκατάληψη είναι πιθανό να προκαλείται από μια τοπική επίδραση hopping του τρανσποζονίου PiggyBac στη γειτονία της συστοιχίας δότη, και ως εκ τούτου παρεμβολές στον τομέα αυτό εξαιρέθηκαν από περαιτέρω ανάλυση.

Α) σχετική κατανομή των θέσεων εισαγωγής PiggyBac πάνω χρωμοσώματα , σε σύγκριση με ποσοστό των τόπων ΤΤΑΑ στα χρωμοσώματα. Σημειώστε την υπερεκπροσώπηση του χρωμοσώματος 10, το οποίο μεταφέρει τη συστοιχία μεταθετό στοιχείο δότη. Χρωμόσωμα Υ, το οποίο αποτελείται κυρίως από υψηλά επαναλαμβανόμενα στοιχεία, εμφάνισε μια ελαφρά προτίμηση για ενθέσεις PiggyBac.

Β) Τοπική επίδραση hopping στο χρωμόσωμα 10. Ιστόγραμμα της πυκνότητας εισαγωγής στο χρωμόσωμα 10 αποκαλύπτει μια θετική προκατάληψη για παρεμβολές στο εγγύς άκρο (βέλη), όπου βρίσκεται η συστοιχία δότη ATP1-S2

Γ) Κατανομή ενθέσεις PiggyBac σε περιοχές του γονιδιώματος:. Διοργανωτή (10 kb ανάντη της TSS), εξώνια, εσώνια, και διαγονιδιακές περιοχές

.

σύγκριση, επίσης, την κατανομή των θέσεων εισαγωγής σε περιοχές του γονιδίου (προαγωγός, εξόνιο, ιντρόνιο) και διαγονιδιακές περιοχές. Συνολικά, τα δύο δείγματα ουράς και όγκων έδειξαν μία κατανομή των παρεμβολών που έμοιαζε με το μέσο ποσοστό των γονιδιακών περιοχών στο γονιδίωμα του ποντικού, αν και παρατηρήθηκαν ενθέσεις PiggyBac σε κάπως υψηλότερη από την αναμενόμενη αριθμούς σε διαγονιδιακές περιοχές (Σχήμα 2C).

κλωνική επέκταση των εισαγωγών τρανσποζονίου

Η ανάλυσή μας των εισαγωγών τρανσποζονίου αποδειχθεί κανένα ουσιαστικές διαφορές στα πρότυπα ένθεση PiggyBac τρανσποζονίων σε δείγματα όγκων και την ουρά από την άποψη της κατανομής των χρωμοσωμάτων και γονιδιακές περιοχές. Είμαστε δίπλα αναλύονται οι ποσοτικές διαφορές της ακολουθίας διαβάζει τους αριθμούς για προσθήκες σε επιμέρους δείγματα. Η βασική υπόθεση είναι ότι κλωνικά επεκταθεί ενθέσεις είναι παρούσες στην πλειονότητα των κυττάρων ενός δείγματος και θα πρέπει να αντιπροσωπεύεται από υψηλότερους αριθμούς ανάγνωσης από την ουδέτερη ενθέσεις που είναι παρόντες μόνο σε ένα μικρότερο κλάσμα του δείγματος.

Για προσαρμογή για παραλλαγές στην ακολουθία διαβάζεται κάλυψης των διαφόρων δειγμάτων, δημιουργήσαμε πρώτο σχετικές συχνότητες ανάγνωσης με κανονικοποίηση PB3 και PB5 πλευρά διαβάσει τους αριθμούς για το συνολικό αριθμό των διαβάζει από την αντίστοιχη βιβλιοθήκη δείγμα. Όπως PB3 και PB5 διαβάσει συχνότητες προήλθαν από ανεξάρτητα παρασκευαστούν βιβλιοθήκες PCR, ένας τέλειος συσχετισμός μεταξύ της PB3 και PB5 διαβάσει δεν θα μπορούσε να αναμένεται συχνότητες. Παρ ‘όλα αυτά, παρατηρήσαμε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ PB3 και PB5 διαβάσει συχνοτήτων για ενθέσεις PiggyBac (Σχήμα S5). Για να συνδυάσετε τις πληροφορίες των συχνοτήτων ανάγνωσης των PB3 και PB5 πλευρές του κάθε εισαγωγή, μπορούμε στη συνέχεια υπολογίζεται για κάθε εισαγωγή η μέση συχνότητα ανάγνωσης από PB3 και PB5 της να διαβάσετε τις συχνότητες. Για εισαγωγές που εκπροσωπήθηκαν από τον διαβάζει μόνο στη μία πλευρά, η μέση συχνότητα ίση με 0,5 της αντίστοιχης συχνότητας μονόπλευρη.

Για μια συγκριτική ανάλυση των κατανομών συχνότητας ανάγνωσης σε δείγματα όγκων και την ουρά, θα καταγράφεται η μέση ανάγνωσης συχνοτήτων όλων των θέσεις εισαγωγής σε ένα διάγραμμα Θηκόγραμμα (Σχήμα 3). Αυτό το διάγραμμα αποκάλυψε ότι περισσότερο από το 99% των παρεμβολών σε όγκους και ουρές εκπροσωπήθηκαν από ένα μικρό κλάσμα του διαβάζει με συχνότητες ανάγνωσης κάτω του 0,1%. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, όταν θα επικεντρωθεί στην κορυφή ακραίες τιμές του κάθε δείγματος, παρατηρήσαμε ότι τα δείγματα όγκων περιείχε ένα μικρό αριθμό των ακραίων τιμών με εμπλουτισμένο συχνότητες ανάγνωσης που ήταν σαφώς υψηλότερες από τις ισχυρότερες ακραίες τιμές των δειγμάτων ουρά. Αυτές οι ενθέσεις υψηλής συχνότητας είναι πιθανό να είναι κλωνικά επεκταθεί ενθέσεις που έχουν θετικώς επιλεγεί για τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου.

Κουτί οικόπεδο μέσης συχνότητας ανάγνωσης των εισαγωγών τρανσποζονίου σε όγκους και τους ελέγχους ουρά. Τελείες δείχνουν τις top 1% προσθήκες του κάθε δείγματος, ανάλογα με τη μέση συχνότητα ανάγνωσης. Κάθετη γραμμή υποδηλώνει κατανομή του εκατοστημόριο ομάδα 2-25%, και κουτιά υποδεικνύουν διανομή του κατώτερου 75% των παρεμβολών. Ένα όριο για ακραίες τιμές (διακεκομμένη οριζόντια γραμμή) υπολογίστηκε με το μέσο όρο των συχνοτήτων ανάγνωση των Top 10 ενθέσεις από κάθε δείγμα ουρά.

Η

Σε έλλειψη αποτελεσματικής στατιστικής μεθόδου να διακρίνει αλήθεια ακραίες τιμές από τυχαία εμπλουτίζεται παρεμβολές , αποφασίσαμε να καθορίσει κλωνική επέκταση με μία μέθοδο κατωφλίου. Αξιοποιήσαμε ελέγχους ουρά ως σημείο αναφοράς για την κατανομή των συχνοτήτων ανάγνωσης σε μη καρκινικό ιστό, και υπολογίζεται το όριο για την ακραία τιμή ανίχνευσης από το μέσο όρο των 60 υψηλότερες συχνότητες των δειγμάτων ελέγχου ουράς (οι 10 πρώτες συχνότητες του κάθε δείγματος ουρά). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα το όριο του 0,37% για το σύνολο δεδομένων μας. Εντοπίσαμε μεταξύ 9-25 ενθέσεις για κάθε δείγμα όγκου πάνω από το όριο, αλλά μόνο 2-6 προσθήκες σε δείγματα ουρά (Πίνακας S2).

Εμείς ανακρίθηκε περαιτέρω την επαναληψιμότητα της κατάταξης θέσεις εισαγωγής από τη συχνότητα ανάγνωσης σε μια σειρά από πειράματα ελέγχου. Ρωτήσαμε πρώτη περίπτωση επέκτασης θέση εισαγωγής θα ποικίλλουν μεταξύ των διαφόρων τμημάτων μιας ενιαίας μάζας του όγκου (Σχήμα S6). Με τη σύγκριση ανάγνωσης συχνότητες μικροτομή δείγματα από μόνο μάζες όγκου, παρατηρήσαμε μια πλήρη επικάλυψη των πιο υψηλά εμπλουτισμένου παρεμβολές μεταξύ των δειγμάτων και έναν αγώνα περισσότερο από το 50% των παρεμβολών πάνω από το όριο συνολικά.

Στη συνέχεια, διερευνάται εάν επεκταθεί ενθέσεις σε όγκους θα μπορούσε ήδη να είναι παρόντες, όπως διευρύνθηκε ενθέσεις στην προ-καρκινικό ιστό από τον οποίο προκύπτει ο όγκος. Για το σκοπό αυτό, συγκρίναμε προσθήκεε τρανσποζονίων σε γονίδια από ένα όγκου πνεύμονα με τις ενθέσεις του παρακείμενο φυσιολογικό ιστό πνεύμονα (Σχήμα S7). Οι πιο εμπλουτισμένο παρεμβολές όγκος δεν ήταν παρούσα στο φυσιολογικό ιστό, επιβεβαιώνοντας την εγκυρότητα της προσέγγισής μας για τον εντοπισμό γονιδίων υποψήφιος καρκίνο. Ωστόσο, 2 από 6 επεκτάθηκε ενθέσεις γονιδίου του όγκου ανιχνεύθηκαν επίσης σε παρόμοια επίπεδα κατά τη συνήθη ιστό πνεύμονα, υποδεικνύοντας ότι ορισμένες κλωνικά επεκταθεί ενθέσεις σε όγκους μπορεί να προέρχεται από προ-καρκινικές κλωνικής ενθέσεις.

Τέλος, ρωτήσαμε αν τα όργανα θα φέρουν υψηλότερο ποσοστό φόντο επεκταθεί εισαγωγές προ-καρκίνου από την ουρά των ιστών, όπως όργανα έχουν συνήθως μια πιο ομοιογενή σύνθεση των κυτταρικών τύπων από την ετερογενή ουρά (Σχήμα S7). Πράγματι, βρήκαμε ότι το DNA από τα όργανα μπορεί σε ορισμένες περιπτώσεις να περιέχει περισσότερο διευρυμένη εισαγωγές από την ουρά του ιστού. Ο αριθμός των επεκτάθηκε ενθέσεις κυμαίνονταν από 3 έως 23 σε όργανα, με μέσο όρο 11 επεκτάθηκε ενθέσεις ανά δείγμα. Καθώς τα δείγματα όγκων του κοόρτης μας πραγματοποιούνται κατά μέσο όρο 16,4 επεκτάθηκε ενθέσεις, εκτιμούμε ότι κατά μέσο όρο 66% (11 /16.4) του διογκωμένου ενθέσεις σε όγκους μπορεί να αντανακλά επεκταθεί ενθέσεις προ-καρκίνου. Με βάση αυτά τα πειράματα ελέγχου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ανάλυση κλωνική επέκταση είναι μια κατάλληλη μέθοδος για τον εντοπισμό υποψήφια γονίδια του καρκίνου σε άτομο όγκους. Ωστόσο, ένα σημαντικός περιοριστικός παράγοντας είναι η παρουσία του διογκωμένου ενθέσεις προ-καρκίνου σε ιστό όγκου, και το ποσοστό του εν λόγω προσθήκες μπορεί να ποικίλει ευρέως μεταξύ των δειγμάτων ανάλογα με τον τύπο του όγκου και των ιστών του ξενιστή.

Μεταξύ κλωνικά επεκταθεί ενθέσεις σε όγκους, 56,9% βρέθηκαν στο γονίδιο περιοχές (υποκινητές, εξώνια, και εσώνια), -Α σημαντικά υψηλότερο ποσοστό από ό, τι για όλα τα ενθέσεις PiggyBac σε όγκους (33,4%? βλέπε σχήμα 2C) -, και 43,1% βρέθηκαν σε διαγονιδιακές περιοχές. Κλωνικά επεκταθεί παρεμβολές στις διαγονιδιακές περιοχές μπορεί να ασκήσει μεγάλου βεληνεκούς cis-επιπτώσεων σε γειτονικά γονίδια. Ωστόσο, καθώς οι τρέχουσες βάσεις δεδομένων δεν περιέχουν πληροφορίες σχετικά με την ογκογόνο ρόλο των διαγονιδιακών περιοχών, θα περιοριστεί περαιτέρω ανάλυση μας για ενθέσεις μεταθετονίου στις περιοχές του γονιδίου.

Κλονική επεκτάσεις εντοπίσει τον καρκίνο γονίδια υποψήφια

Η κλωνική επέκταση ανάλυση των εισαγωγών τρανσποζονίου σε περιοχές γονίδιο που ταυτοποιείται 88 μοναδικά γονίδια που αντιπροσωπεύουν εν δυνάμει γονίδια υποψήφια καρκίνου (Σχήμα 4Α). Σε συμφωνία με αυτή την πρόβλεψη, παρατηρήσαμε διάφορα γονίδια μεταξύ των υποψήφιων γονιδίων μας που εμπλέκονται στον καρκίνο. Για παράδειγμα, εννέα υποψήφια γονίδια του καρκίνου μας επίσης περιλαμβάνονται στον κατάλογο Cancer Gene Απογραφής, η οποία αποτελείται από 487 γονίδια, που συνδέεται με τον καρκίνο [11], που αντιπροσωπεύει ένα πολύ σημαντικό εμπλουτισμό (

Abl2

,

Braf

,

Fbxw7

,

Foxp1

,

Ipo11

,

Mllt3

,

Fas

,

PTEN

και

NF1

? p & lt?. 0.0002, ακριβές τεστ του Fisher)

Α) κλωνική επεκτάθηκε ενθέσεις γονιδίων σε δείγματα όγκων, κατατάσσονται σύμφωνα με τη μέση συχνότητα ανάγνωσης τους (

στ

) . Τρία ποντίκια harbored δύο όγκους το καθένα (όγκος 01 και 08, του όγκου 05 και 09, και του όγκου 04 και 10, αντίστοιχα). Ένα μπλε αστερίσκος υποδηλώνει γονίδια που υπάρχουν στη λίστα Cancer Gene απογραφής, ένας κατάλογος των 487 γονιδίων που εμπλέκεται αιτιωδώς σε καρκίνο.

Mamdl1

και

Dgkd

χτυπήθηκαν σε ανεξάρτητα δείγματα όγκου και επισημαίνονται με κόκκινο και ροζ, αντίστοιχα.

Β) Κυτταρική διεργασίες επηρεάζονται από κλωνική επεκταθεί ενθέσεις γονιδίου. Κατηγορίες διαδικασία συντάχθηκαν από λειτουργικές πληροφορίες γονίδιο σε www.omim.org και www.informatics.jax.org.

Η

Στη μελέτη μας, τα τρία ζώα της κλάσης πραγματοποιούνται δύο όγκους το καθένα (Σχήμα S1). Είναι ενδιαφέρον ότι, δύο ζεύγη των όγκων έδειξε καμία επικάλυψη των γονιδίων υποψήφιος καρκίνου (όγκοι 01 και 08? Όγκους 04 και 10), υποδεικνύοντας ανεξάρτητους προέλευση των όγκων. Αντίθετα, οι όγκοι 05 (μάζα συμπαγούς όγκου στο ήπαρ) και 09 (οζώδες λέμφωμα) μοιράστηκε 5 γονίδια υποψήφια καρκίνο, υποδεικνύοντας μία κοινή προέλευση. Δεδομένου ότι το ήπαρ είναι μία κοινή τοποθεσία εισβολής για λεμφοκυτταρική λευχαιμία [12], είναι πιθανό ότι το ήπαρ του όγκου 09 είναι μία μεταστατική μάζα όγκου που προέρχεται από την σπληνική λεμφοκυτταρικής όγκου 05. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο 5 κοινόχρηστο υποψήφια γονίδια του καρκίνου των όγκων 05 και 09 (

PTEN, Fas, ESR1, Abl2, Lrp1b

) έχουν ανεξάρτητα λαμβάνονται σε δύο όγκους με παρόμοιο μέσο ανάγνωσης συχνότητες, επιβεβαιώνοντας την ανθεκτικότητα της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας μας για τον εντοπισμό κλωνική επέκταση των παρεμβολών.

Κατά την ανάλυση των υποψήφιων γονιδίων για σημαντικά τον εμπλουτισμό των λειτουργικών κατηγοριών με τη χρήση του πόρου DAVID βιοπληροφορική (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [13], βρήκαμε ένα σημαντικό εμπλουτισμό των κατηγοριών και τις οδούς που σχετίζονται με πρωτεϊνική κινάση (π.χ., KEGG : ΜΑΡΚ μονοπάτι σηματοδότησης, σ & lt? 0,016? Interpro: πρωτεϊνικής κινάσης, πυρήνα, σ & lt? 0,016? Benjamini-Hochberg διορθωμένη τιμή Ρ? πίνακα S3). Παρομοίως, όταν το χέρι ομαδοποιούνται υποψήφια γονίδια με γνωστές κυτταρική διαδικασία τους, διαπιστώσαμε ότι τα γονίδια που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος που αναπαρίσταται με τη μεγαλύτερη ομάδα γονιδίων (Σχήμα 4Β). Άλλα εξέχοντα κυτταρικές διεργασίες των υποψήφιων γονιδίων ήταν απόπτωση, χρωματίνης αναδιαμόρφωση, μεταγραφή, και πρωτεΐνη μεταφοράς /διαλογής (Σχήμα 4Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, κατά την εξέταση κυτταρικών διαδικασιών στο επίπεδο των μεμονωμένων όγκων, βρήκαμε ότι κάθε όγκος είχε μία ή περισσότερες μεταλλάξεις σε γονίδια σήμανσης, και ένα μείγμα από ενθέσεις που επηρεάζουν τουλάχιστον δύο άλλες κυτταρικές διεργασίες. Αυτό το πρότυπο πολλαπλών μεταλλαγμένου διεργασίες για κάθε όγκο είναι σε συμφωνία με την έννοια ότι πολλαπλές γενετικές μεταβολές σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες οδηγούν την ανάπτυξη του όγκου [14].

Μεταξύ των γονιδίων υποψήφιες καρκίνος ορίζεται από κλωνική επέκταση, δύο γονίδια χτυπήθηκαν ανεξάρτητα σε διαφορετικές τοποθεσίες ΤΤΑΑ σε πολλαπλούς όγκους (με εξαίρεση τα γονίδια που μοιράζονται όγκου 05 και 09, τα οποία μοιράζονται μια κοινή προέλευση): εγκέφαλος-τομέα, όπως 1 (

Mamld1

) και Diacylglycerolkinase δέλτα (

Dgkd

). Έτσι, αυτά τα γονίδια είναι ιδιαίτερα ισχυρή υποψήφια γονίδια του καρκίνου, όπως αυτές ορίζονται διπλά τόσο από κλωνική επέκταση των παρεμβολών σε επιμέρους όγκους και ανεξάρτητη εμφάνιση ως θέσεις κοινή εισαγωγή σε πολλαπλά δείγματα όγκων. Η

Mamld1

γονίδιο έχει μεταλλαχθεί από παρεμβολές στα επιθηλιακά όγκοι του δέρματος (όγκου 01, 02, και 03).

Mamld1

έχει προταθεί να είναι ένα συν-ενεργοποιητής της μη κανονικής σηματοδότηση Notch [15]. Σε ανθρώπινο δέρμα, τα συστατικά σηματοδότηση Notch είναι άφθονα εκφράζονται, και απο-ρύθμιση της σηματοδότησης Notch οδηγεί σε διάφορα είδη καρκίνων του δέρματος [16]. Έτσι,

Mamld1

είναι ένα νέο γονίδιο υποψήφιος καρκίνου ως ρυθμιστής της σηματοδότησης Notch για επιθηλιακών όγκων. Η

Dgkd

γονίδιο έχει βρεθεί μεταλλαχθεί σε συμπαγείς όγκους 05 (λεμφοκυτταρική μετάσταση στο ήπαρ) και 07 (του πνεύμονα).

Dgkd

μεταβολίζει 1,2, διακυλογλυκερόλη (DAG) με φωσφατιδικό οξύ (ΡΑ). Τόσο Δ.Σ.Ε. και PA να παίξει σημαντικό ρόλο ως δεύτεροι αγγελιοφόροι για μιτογόνα σήματα, και διαμόρφωση των επιπέδων τους από το

DGK

πρωτεϊνών έχει προταθεί να είναι ένας πιθανός μηχανισμός για τον καρκίνο [17].

Συζήτηση

Έχουμε αποδείξει εδώ ότι η ανάλυση αλληλούχισης υψηλής απόδοσης του διατμημένου DNA από όγκους τρανσποζόνιο που δημιουργείται παρέχει μέσα για την ταυτοποίηση γονιδίων υποψήφιος καρκίνου με ανάλυση κλωνική επέκταση. Η προσέγγιση αυτή αντιπροσωπεύει μια βελτιωμένη στρατηγική για την ταυτοποίηση των γονιδίων υποψήφιος καρκίνου σε οθόνες τρανσποζονίου, και επιτρέπει για πρώτη φορά την ταυτοποίηση των γονιδίων υποψήφιος καρκίνο σε επίπεδο μεμονωμένων όγκων.

Ποσοτικοποίηση των κλωνική επέκταση

η τρέχουσα πρωτόκολλα χρησιμοποιούν τον περιορισμό χωνεύει να κατακερματίσουν το DNA του όγκου, με αποτέλεσμα μια προκατάληψη προς παρεμβολές που αντιπροσωπεύονται από μικρά τμήματα [7] και μειώνοντας έτσι την ποσοτική πτυχή των διαβάσετε ανάλυσης αριθμού. Εφαρμόσαμε ακουστική διάτμηση για κατάτμηση DNA για να ελαχιστοποιηθούν οι διαφορές μεγέθους των θραυσμάτων θέση εισαγωγής. Αυτή η βελτίωση, σε συνδυασμό με Illumina αλληλούχιση υψηλής διεκπεραιωτικότητας, μας επέτρεψε να ληφθεί ένα ημι-ποσοτική εκτίμηση της αναλογικής αντιπροσώπευσης του ενθέσεις. Αρκετές παρατηρήσεις δείχνουν ότι η μέθοδος μας φτάσει σε ένα επίπεδο ποσοτικής ακρίβειας επαρκεί για τον προσδιορισμό κλωνικά επεκταθεί προσθήκες που καθορίζουν υποψήφια γονίδια του καρκίνου. Πρώτον, η σύγκριση των δειγμάτων όγκου και ελέγχου αποκάλυψε μία διακριτή εμπλουτισμό της εισαγωγής διαβάζει σε δείγματα όγκων. Δεύτερον, η ανάλυση των σχετικών όγκων 05 και 09 έδειξαν ισχυρή συσχέτιση των συχνοτήτων ανάγνωσης του κλωνικά επεκταθεί προσθήκες. Τέλος, τα γονίδια μεταλλαχθεί με κλωνικά επεκταθεί ενθέσεις αποτελείται πολλά καλά καθορισμένα καρκινικά γονίδια.

Ωστόσο, ένας σημαντικός περιοριστικός παράγοντας της ανάλυσης κλωνική επέκταση είναι ότι τα όργανα μπορεί να μεταφέρει έναν αριθμό ενθέσεων προ-καρκίνου που έχουν κλωνική επεκτάθηκε κατά τύχη. Όπως πειράματα ελέγχου μας δείχνουν, αυτές οι παρεμβολές μπορεί να περιλαμβάνει κατά μέσο όρο τα δύο τρίτα των κλωνικά επεκταθεί παρεμβολές. Έτσι, αν και η μέθοδος μας είναι σαφώς αποτελεσματική στον εντοπισμό υποψήφια γονίδια καρκίνου σε άτομο όγκους, η κινητήρια λειτουργία καρκίνος του κάθε γονιδίου πρέπει να ενισχύεται περαιτέρω με εναλλακτική μεθόδων, όπως η ανάλυση CIS ή λειτουργικές δοκιμασίες.

Ένας παράγοντας που μπορεί να επηρεάσει την κλωνική ρυθμό διαστολής του ενθέσεις είναι η δραστηριότητα της τρανσποζάσης PiggyBac. Εάν η δραστηριότητα της μεταφοράς PiggyBac θα έπαυε κατά τη διάρκεια ζωής του ποντικιού, αυτό θα καθορίσει ορισμένες προσθήκες, οι οποίες θα εμφανίζονται ως κλωνική επεκτάσεις στην ανάλυσή μας. Εμείς θα αντιμετωπίσει την συνεχή δραστηριότητα της τρανσποζάσης PiggyBac σε ενήλικες ιστό ποντικού σε μελλοντικές μελέτες με ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις.

Πολλές προκαταλήψεις στη σειρά διαβάσετε εκπροσώπηση στην ανάλυσή μας κλωνική επέκταση παραμένουν, για παράδειγμα εκείνες που θεσπίστηκε με διαφορετικό περιεχόμενο GC θραυσμάτων κατά την διάρκεια ενίσχυσης PCR. Ένας άλλος παράγοντας που μειώνουν την ποσοτική δύναμη της μεθόδου μας είναι η πιθανή παρουσία μη στρωματικών όγκων του ιστού στα δείγματα, τα οποία αραιώνει τα κλωνικά ενθέσεις οδήγηση του όγκου. Επιπλέον, μια προειδοποίηση της μεθόδου μας είναι ότι η δέσμευση μη ειδική εκκινητή Splinkerette θα μπορούσε να οδηγήσει σε ορισμένες περιπτώσεις σε κυρίαρχο ενίσχυση του γενωμικού περιοχές που δεν είναι αληθινοί προσθήκεε τρανσποζονίων. Περαιτέρω τεχνικές βελτιώσεις θα πρέπει να φέρει την ανάλυση των κλωνική επέκταση στο απόλυτο ποσοτικό επίπεδο

αλληλουχίας υψηλής απόδοσης των εισαγωγών τρανσποζονίου

προσέγγισης αλληλουχίας μας απέδωσε & gt?. 10

6 χαρτογραφηθεί διαβάζει ανά δείγμα όγκου. Μια σειρά από 10

5 διαβάζει ανά δείγμα είχε προταθεί να είναι αρκετή για να αποκαλύψει όλες τις εισαγωγές της Ωραίας Κοιμωμένης δημιουργούνται όγκοι [7].