Αφηρημένο

εντός του όγκου ετερογένεια (ITH) οδηγεί σε υποεκτίμηση της μετάλλαξης τοπίο απεικονίζεται από μία μόνο βιοψία βελόνα και, κατά συνέπεια, επηρεάζει την ακρίβεια της θεραπείας. Η έκταση του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) γενετικό ΙΤΗ δεν είναι καλά κατανοητός στην Κινέζους ασθενείς. Έτσι, πραγματοποιήσαμε βαθιά αλληλουχίας με τη χρήση του OncoGxOne

™ πίνακα Plus, στοχεύοντας 333 ειδική για τον καρκίνο γονίδια σε multi-περιοχή βιοψίες των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων του ήπατος από τρία CRC ασθενείς κινέζικα. Διαπιστώσαμε ότι η έκταση της ΙΘ διέφερε μεταξύ των τριών υποθέσεων. Κατά μέσο όρο, το 65% του συνόλου των μεταλλάξεων που ανιχνεύθηκαν ήταν κοινό στο πλαίσιο των επιμέρους όγκων.

KMT2C

εκτροπές και το

NCOR1

μετάλλαξη ήταν οι μόνοι πανταχού παρούσα γεγονότα. Μεταγενέστερες φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι οι όγκοι εξελίχθηκαν σε μία διακλαδωμένη τρόπο. Σύγκριση των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων αποκάλυψε ότι

PPP2R1A

(E370X),

SETD2

(I1608V),

Smad4

(G382T), και

AR

μεταλλάξεις ιστοσελίδα μάτισμα μπορεί να είναι ειδικά για τον καρκίνο του ήπατος μεταστατικού. Αυτές οι μεταλλάξεις θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην έναρξη και την εξέλιξη των μακρινών μεταστάσεων. Συλλογικά, η ανάλυσή μας εντόπισε σημαντικό επίπεδο γενετικής ITH στην CRC, η οποία θα πρέπει να ληφθούν υπόψη για εξατομικευμένες θεραπευτικές στρατηγικές

Παράθεση:. Lu YW, Zhang HF, Liang R, Xie ZR, Luo ΗΥ, Zeng YJ, et al. (2016) ορθοκολικό καρκίνο γενετική ετερογένεια που οριοθετείται από Multi-Περιφέρεια αλληλουχίας. PLoS ONE 11 (3): e0152673. doi: 10.1371 /journal.pone.0152673

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 23 Νοέμ 2015? Αποδεκτές: 17 Μαρτίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 29 Μαρτίου, 2016

Copyright: © 2016 Lu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Δεδομένα αλληλουχίας είναι διαθέσιμα από την Ακολουθία Ανάκτηση Αρχείο (SRA) βάση δεδομένων (αριθμός πρόσβασης SRP065361)

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Ιατρικής Leading ταλέντο της επαρχίας Γιουνάν (Νο L-201,205) KHW, Ίδρυμα της Γιουνάν Ινστιτούτο Digestive Disease (Αρ 2014NS122) KHW, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Γιουνάν, Κουνμίνγκ Ιατρικό Πανεπιστήμιο (NO. 2015FB100) HFZ, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81.460.007) XYK. https://www.nsfc.gov.cn/. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου παγκοσμίως, αντιπροσωπεύοντας περίπου 1,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις και 600.000 θανάτους κάθε χρόνο [1]. CRC είναι ο τρίτος συχνότερος καρκίνος και η πέμπτη συχνότερη αιτία των θανάτων από καρκίνο στην Κίνα. Η συχνότητα εμφάνισης της CRC έχει επίσης αυξηθεί στην κινεζική πληθυσμού τα τελευταία χρόνια [2]. Παρά τη σημαντική πρόοδο που έχει σημειωθεί όσον αφορά τη θεραπεία CRC, συμπεριλαμβανομένων στοχευμένη θεραπεία, η πενταετής σχετική επιβίωση των ασθενών με απομακρυσμένες μεταστάσεις είναι μόνο το 12,5% [3]. Ως εκ τούτου, ένα εκτεταμένο κατανόηση της μοριακής βιολογίας του CRC είναι πολύ επιθυμητή. Αυτές οι νέες ιδέες θα βελτιωθεί στη συνέχεια τη θεραπεία της CRC.

εντός του όγκου ετερογένεια (ITH) οδηγεί σε υποεκτίμηση της μετάλλαξης τοπίο απεικονίζεται από μία μόνο βιοψία βελόνα και, κατά συνέπεια, επηρεάζει την ακρίβεια της θεραπείας. Με την ανάπτυξη της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS), ΙΤΗ έχει πρόσφατα διευκρινισθεί σε ουσιαστική λεπτομέρεια σε διάφορους τύπους καρκίνου [4-7], συμπεριλαμβανομένων CRC [8, 9]. Kim et al. [8] διεξάγεται βιοψίες multi-περιοχή του πρωτογενούς και του ήπατος μεταστατικού περιοχές από πέντε CRCs μέσω αλληλούχισης ολόκληρους exome και παρατήρησε ότι μόνο το 19,8% -53,9% των μεταλλάξεων σε ένα δεδομένο δείγμα ήταν καθολική. Επίσης, εντοπίστηκαν

APC

,

KRAS

, και

TP53

μεταλλάξεις σε όλες τις περιφερειακές βιοψίες. Η κάλυψη αλληλουχίας των σπουδών τους είναι σχετικά χαμηλό, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε παραβλέψουμε το χαμηλό μετάλλαξη συχνότητας. Ενώ στη μελέτη Kogita, [9], που απευθύνονται μόνο 50 γονίδια του καρκίνου, και ως εκ τούτου η προσδιόρισε την έκταση της CRC γενετικής ITH ήταν περιορισμένη. Επιπλέον, η έκταση της CRC γενετικής ITH δεν έχει τεκμηριωθεί σε Κινέζους ασθενείς.

Διενεργήσαμε βαθιά αλληλουχίας κάλυψης με τη χρήση του SureSelect Target Εμπλουτισμός Kit και OncoGxOne

™ Plus πάνελ του DNA από multi-περιοχή βιοψίες πρωτοβάθμια και ήπατος μεταστατικούς όγκους των τριών κινεζικών ασθενείς CRC να χαρακτηρίσει CRC ITH σε Κινέζους ασθενείς. Έχουμε καθορίζεται το τοπίο μετάλλαξη και προσδιόρισε το ουσιαστικό επίπεδο γενετικής ITH στο CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Τρεις ασθενείς με πολυ-περιφερειακή καρκίνωμα του παχέος εντέρου πρωτοβάθμια χειρουργικά εκτομή στο νοσοκομείο οι πρώτοι άνθρωποι της επαρχίας Yunnan μεταξύ Οκτωβρίου 2013 και Απρίλιος 2014 εγγράφηκαν στη μελέτη. Παθολογική σταδιοποίηση όγκου διεξήχθη σύμφωνα με την ταξινόμηση ΤΝΜ (Πίνακας 1). Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του νοσοκομείου Το πρώτο της Λαϊκής επαρχία Γιουνάν (2014YXLH029). Όλοι οι ασθενείς στη μελέτη υπό τον όρο έγγραφη συγκατάθεση για τη χρήση των εκτομή ιστού.

Η

DNA απομόνωση

Οι, παραφίνη-ενσωματωμένες δείγματα φορμόλη-σταθερό (FFPE) υποβλήθηκαν σε ιστολογική επισκόπηση , επιλέχθηκαν μόνο εκείνα που περιέχουν επαρκή κύτταρα όγκου (κύτταρα κατά τουλάχιστον 70% του όγκου), όπως προσδιορίζεται με χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης, και συμφωνημένα κανονικούς ιστούς για απομόνωση DNA. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε με τη χρήση του QIAamp

® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή με ελαφρές τροποποιήσεις. Γονιδιωματικό DNA δείγματα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο NanoDrop 2000 (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Το απομονωμένο DNA αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση.

δοκιμές Μικροδορυφορικοί

Η αστάθεια μικροδορυφορικού (MSI) κατάσταση προσδιορίστηκε για κάθε περίπτωση με τη χρήση πέντε μονονουκλεοτίδης ή δινουκλεοτίδιο μικροδορυφόρων δείκτες (BAT25, BAT26, D17S250, D2S123 και D5S346) [10]. Αστάρια ήταν 5′-σημασμένο με HEX, FAM ή ΤΕΤ (Sangon Biotech Co., Ltd, Shanghai, Κίνα). Όλα μικροδορυφορικών τόπων ενισχύθηκαν από συμφωνημένα φυσιολογικών και καρκινικών DNA μέσω φθορισμού multiplex αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Στη συνέχεια, τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας για την ΑΒΙ αυτοματοποιημένο αλληλουχητή 3730XL χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό ανάλυσης θραύσμα (Gene Σάρωση, Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ, USA). Μικροδορυφορικού σταθερότητα δείκτη αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό GeneMapper. Η κατάσταση MSI είχε χαρακτηριστεί ως MSI-υψηλή, αν ≥30% των δεικτών ήταν ασταθής, MSI-χαμηλή αν & lt?. 30% των δεικτών ήταν ασταθής, και όχι βάρδιες ή πρόσθετες αιχμές για μικροδορυφορικού σταθερή (MSS) καρκίνο του παχέος εντέρου

στόχος του εμπλουτισμού και της αλληλουχίας

προετοιμασία εμπλουτισμό ακολουθία των δειγμάτων και της βιβλιοθήκης διεξήχθη με τη χρήση του SureSelect Target εμπλουτισμός Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) και OncoGxOne

™ πίνακα καρκίνο Plus (GENEWIZ, Inc ., South Plainfield, NJ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. OncoGxOne Plus, μια στοχευμένη πίνακα ογκολογίας, περιέχει 333 καρκίνου συγκεκριμένα γονίδια (συμπεριλαμβανομένων όλων των γνωστών γονιδίων του οδηγού του καρκίνου και 64 στοχευμένες και σχετικές χημειοθεραπεία γονίδια). Εν συντομία, 200 ng γενωμικού DNA από κάθε δείγμα διαμελισμένο από ακουστική διάτμηση σε ένα όργανο Covaris. Κλάσματα των 150-200 bp προσδέθηκαν στο SureSelect μενου Ολίγο και ενισχύθηκαν με PCR για 10 κύκλους. Για τον εμπλουτισμό του στόχου, η ολόκληρη η βιβλιοθήκη υβριδοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το SureSelect Oligo Kit Capture για 16 ή 24 ώρες στους 65 ° C. Βιοτινυλιωμένα υβρίδια συνελήφθησαν, και τα εμπλουτισμένα βιβλιοθήκες ολοκληρώθηκαν κάτω των 16 κύκλους PCR. Τα προκύπτοντα καθαρισμένα βιβλιοθήκες συνενώθηκαν και αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας το Illumina

® MiSeq

™ μέσο NGS για 2 χ 150 ζεύγη-άκρο αλληλούχιση διαβάζει (Illumina, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τα γονίδια στο OncoGxOne

™ πίνακα καρκίνο Plus που απαριθμούνται στο S1 πίνακα.

Βιοπληροφορική ανάλυση

δεδομένα αλληλουχίας έχουν πρόσβαση μέσω του Reporter MiSeq. την ποιότητα των δεδομένων ελέγχθηκε με τη χρήση FastQC (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) και, στη συνέχεια, ευθυγραμμισμένο με το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (hg19) χρησιμοποιώντας το εργαλείο ευθυγράμμισης Burrows-Wheeler για να δημιουργήσει ένα μπαμ αρχείο [11]. Παραλλαγή καλώντας διεξήχθη με τη χρήση του Γονιδιώματος Analysis Toolkit, από προεπιλογή [12]. Πρώτες παραλλαγή κλήσεις φιλτράρονται χρησιμοποιώντας συχνότητες αλληλόμορφο & gt? 5% και μεταβάλλεται διαβάζει & gt? 7X. Στη συνέχεια, οι προκύπτουσες παραλλαγές σχολιασμένη από τον Illumina Παραλλαγή Studio έκδοση 2.2.3 (Illumina, San Diego, CA, USA) και ANNOVAR [13]. Γνωστή πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας παραλλαγές inthedbSNP 137 (hg19) [14] και SNPs που παρουσιάζονται στα δεδομένα 1000 γονιδιώματα. Οι πιθανές βλαστικών μεταλλάξεις αλληλουχία σε συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς.

Η φυλογενετική ανάλυση

συναχθεί προγονικές σχέσεις μεταξύ πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων του ασθενούς 3 από προφίλ μετάλλαξη. δέντρα Neighbor κατασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τους Kim et al. [8], με κάποιες τροποποιήσεις. Χρησιμοποιήσαμε phytools [15] για τον υπολογισμό των αποστάσεων γείτονα και αλγόριθμο γείτονα υλοποιείται στο πακέτο ΡΗΥίΙΡ [16] το λογισμικό για να συναχθεί το φυλογενετικό δέντρο.

Αποτελέσματα

Επισκόπηση των δεδομένων NGS

Τρεις CRC ασθενείς (Ρ1, Ρ2, και Ρ3) συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Στη συνέχεια, 10 δείγματα από 3 ασθενείς υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό αλληλουχίας, με μια διάμεση κάλυψη του 250 διαβάζει. Ταυτοποιήσαμε ~ 8000 σωματικών παραλλαγές μονής νουκλεοτιδίου (SNVs) (4444 έως 8348) και ~ 850 (457 έως 1154) σωματικών εισαγωγές και διαγραφές (indels) των δειγμάτων 10 βιοψίας από τις περιπτώσεις 3 CRC (Πίνακας 2).

ασθενής 1

Ένα 62-year-old αρσενικό διαγνώστηκε με καρκίνο του παχέος εντέρου MSS, με 3,5 εκατοστά Χ 3 cm × 1,2 εκατοστά όγκου. Δύο περιοχές (Ρ1-1 και Ρ1-2) του πρωτογενούς όγκου εμφάνισαν μέτρια διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, και η παθολογική στάδιο του όγκου ήταν T2N1M0. Ο ασθενής δεν έλαβε καμία προηγούμενη επεξεργασία.

Οι nonsynonymous μεταλλάξεις σωματικών σημείο και indels που οδηγούν σε πρωτεΐνη αλλαγές συνοψίζονται στον Πίνακα S2. κατανομές τους σε διάφορες περιοχές σε όλη την όγκου χαρτογραφήθηκαν (Σχήμα 1Α). Με τη σύγκριση των φασμάτων μετάλλαξης μεταξύ πρωτοβάθμιας περιοχές, διαπιστώσαμε ότι το 24% (11/45) των μεταλλάξεων ήταν ειδικά για Ρ1-1, ενώ το 13% (6/45) των μεταλλάξεων ήταν ειδικά για Ρ1-2. Το υπόλοιπο 63% των μεταλλάξεων μοιράστηκαν από τις δύο περιοχές. Με τη σύγκριση αποτέλεσμα μας με τα 127 σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια που προσδιορίζονται από Kandoth et al. [17], διαπιστώσαμε ότι Ρ1-1 και Ρ1-2 περιέχονται

APC

(428_429del),

KIT

(A755T),

KMT2C

(R909K, C391X, G315S D348N, P309S και .Y816_I817delinsX),

NCOR1

(S63L),

NRAS

(G12D), και

PIK3CG

(K344Q) μεταλλάξεις. Ρ1-1 περιείχε επτά επιπλέον μεταλλάξεις, δηλαδή,

APC

(Q706X),

KMT2D

(3860_3861del),

KMT2C

(S338L, K306fs, και μια μετάλλαξη ιστοσελίδα splicing)

BRCA2

(T3030fs), και

ΕΛΒ4

μετάλλαξη ιστοσελίδα μάτισμα. Ρ1-2 περιείχε ένα άλλο

AR

(57_58del) μετάλλαξη.

Μια Γενετική ITH σε Ασθενή 1. Η περιφερειακή κατανομή των 45 σωματικών παραλλαγές σε 3 πρωτογενείς περιοχές του όγκου (Ρ1-1 και Ρ1-2 )? Β Γενετική ITH σε Ασθενή 2. Η περιφερειακή κατανομή των 33 σωματικών παραλλαγές σε 3 πρωτογενείς περιοχές του όγκου (Ρ2-1, Ρ2-2, και P2-3)? Γ Γενετική ITH στο 3. Ασθενής Η περιφερειακή κατανομή των 58 σωματικών παραλλαγές σε 3 κύρια και 2 μεταστατικό περιοχές. Ο χάρτης θερμότητα υποδεικνύει την παρουσία (γκρι) ή απουσία (σκούρο μπλε) μιας μετάλλαξης σε κάθε περιοχή. Οι έγχρωμες γραμμές πάνω από το χάρτη θερμότητας προσδιορίζει τις κατηγορίες των μεταλλάξεων.

Η

Ασθενής 2

Ένα 60-year-old γυναίκα είχε διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου MSS, με 3,8 cm × 3,5 cm × 1,2 εκατοστά όγκου. Τρεις περιοχές (Ρ2-1, Ρ2-2, και P2-3) του πρωτογενούς όγκου εμφάνισαν μέτρια διαφοροποιημένο ιστολογία και δεξιά ηπατική μετάσταση λοβού. Πολλαπλές μεταστάσεις λεμφαδένα (ρΝ2) ανιχνεύθηκαν, και η παθολογική στάδιο του όγκου ήταν T2N4M0. Ο ασθενής δεν έλαβε καμία προηγούμενη επεξεργασία.

Για Ασθενής 2, στοχευμένη επανεύρεση της αλληλουχίας του DNA από τις τρεις περιοχές του πρωτογενούς όγκου διεξήχθη. Αυτή η διαδικασία αποκάλυψε 25 nonsynonymous σημειακές μεταλλάξεις και 8 indels (S2 Πίνακας). κατανομές τους σε διαφορετικές περιοχές κατά μήκος του όγκου χαρτογραφήθηκαν (Σχήμα 1Β) όπως περιγράφεται από Gerlinger et al. [5]. Εμείς διακρίνονται τα 33 μεταλλάξεις σε 23 πανταχού μεταλλάξεις (αυτές που παρουσιάζονται σε όλες τις περιοχές σε κάθε CRC), 6 ιδιωτικό μεταλλάξεις (αυτές που παρουσιάζονται σε μία μόνο περιοχή), και το υπόλοιπο που ονομάζεται κοινόχρηστη μεταλλάξεις. Κατά μέσο όρο, ένα ενιαίο βιοψία εμφάνισαν 28 σωματικές μεταλλάξεις, αντιπροσωπεύοντας το 85% του συνόλου των μεταλλάξεων που παρατηρούνται σε αυτό τον όγκο. Τα τοπία μετάλλαξη των διαφόρων περιοχών ήταν πολύ παρόμοιο με ένα άλλο.

Εντοπίσαμε πολλά σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των

ATRX

(P571A),

CHEK2

(P358S),

KDM6A

(A1038T),

NCOR1

(N208K, S63L),

KMT2C

(A746S, G892R, P309S, R909K, D348N, και Y816_I817delinsX), και

AR

(57_59del), που ήταν πανταχού παρούσα μεταλλάξεις. Η

TGFBR2

(E125fs) ήταν ειδικά για Ρ2-1,

SETD2

(I1608V) μετάλλαξη ήταν ειδικά για Ρ2-2,

TP53

(T218P),

KMT2C

(K339N) ήταν ειδικά για P2-3.

APC

(L693fs) και ΤΡ53 (R89W) και υιοθετήθηκε από Ρ2-2 και P2-3.

NCOR1

(K85N) και υιοθετήθηκε από Ρ2-2 και Ρ2-1.

KMT2C

(Q755X) μοιράζεται από Ρ2-1 και P2-3.

Ασθενής 3

Ένα 71-year-old γυναίκα διαγνώστηκε με MSS-υψηλή και μέτρια διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου, με 9 cm × 5 cm × 3 cm πρωτογενούς όγκου και 1,5 cm × 1 cm × 0,5 cm δεξιά ηπατική μετάσταση λοβού. Τρεις περιοχές (Ρ3-1, Ρ3-2, Ρ3-3 και) του πρωτογενούς καρκίνου και δύο μεταστατικές περιοχές αποκόπηκαν, και η παθολογική στάδιο του όγκου ήταν T3N2M2. Ο ασθενής δεν έλαβε καμία προηγούμενη επεξεργασία. Για αυτόν τον ασθενή, στοχευμένη επανεύρεση της αλληλουχίας διεξήχθη με DNA από τις τρεις περιοχές (Ρ3-1, Ρ3-2, Ρ3-3 και) του πρωτογενούς όγκου και δύο μεταστατικές περιοχές. Η διαδικασία αποκάλυψε 47 nonsynonymous σημειακές μεταλλάξεις και 11 indels (S2 Πίνακας). κατανομές τους σε διαφορετικές περιοχές κατά μήκος του όγκου χαρτογραφήθηκαν (Σχήμα 1 C).

Κατασκευάσαμε ένα φυλογενετικό δέντρο (Σχήμα 2), η οποία έδειξε μία διακλαδισμένη, αντί για ένα γραμμικό, εξέλιξη του όγκου, να αντιπροσωπεύει την εξελικτική ιστορία το CRC. φάσματα μετάλλαξη Ρ3-2 ήταν περισσότερο παρόμοια με L1 και L2, που δείχνει ότι η προέλευση των απομακρυσμένων μεταστάσεων θα μπορούσε να αποδοθεί σε ένα από τα κύρια αξιοθέατα.

μήκη υποκατάστημα στο δέντρο είναι ανάλογη με τον αριθμό των nonsynonymous μεταλλάξεις σε αντίστοιχους κλάδους.

η

σε γενικές γραμμές, αλληλουχίας στόχου που έχουν εντοπισθεί 45 σωματικές μεταλλάξεις ανά βιοψία, αντιπροσωπεύοντας το 78% του συνόλου των μεταλλάξεων που παρατηρούνται σε αυτόν τον όγκο. 60% του συνόλου των μεταλλάξεων ανιχνεύεται με αλληλούχιση πολλαπλών περιοχή στο δείγμα κολεκτομή ήταν πανταχού παρούσα μεταλλάξεις που υπάρχουν σε όλες τις περιοχές. Όταν αναλύσαμε την πρωτοπαθή καρκίνο, ένας μέσος όρος 45 σωματικών μεταλλάξεων ανιχνεύτηκαν ανά βιοψία, η οποία αντιπροσώπευε το 87% του συνόλου των μεταλλάξεων που προσδιορίζονται στην παρούσα όγκου. Για τις μεταστατικές θέσεις, μία βιοψία αποκάλυψε 92% του συνόλου των μεταλλάξεων ανιχνεύονται σε αυτόν τον όγκο.

Στα σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια, αποφασίσαμε ότι

KRAS

(G13D),

PIK3CA

(E545),

TP53

μια μετάλλαξη περιοχή ματίσματος,

APC

(E854fs),

KMT2C

(E141G, K339N, P309S και Y816_I817delinsX),

SETBP1

(Q1558L), και

NCOR1

(S63L) ήταν πανταχού παρούσα μεταλλάξεις, ενώ

CDKN2A

(D74A),

Smad4

(W168X),

NCOR1

(N208K),

KMT2C

(G315C και K306fs) και

INHBA

(V58I) ήταν ειδικά για την πρωτοπαθή καρκίνο.

PPP2R1A

(E370X),

SETD2

(I1608V),

Smad4

(G382T), και

AR

μεταλλάξεις ιστοσελίδα μάτισμα ήταν ειδικά για το ήπαρ μεταστατικό καρκίνο . Ωστόσο, αυτές οι μεταλλάξεις ήταν απούσες στα πρωτογενή περιοχές καρκίνου. Η

KRAS

,

TP53

, και

PIK3CA

μεταλλάξεις, οι οποίες συχνά έχουν χρησιμοποιηθεί ως μοριακοί βιοδείκτες στην CRC, παρουσίασε επίσης σε όλες τις περιοχές.

οι μεταστατικοί όγκοι-ειδικών μεταλλάξεων

με τη σύγκριση του τοπίου μετάλλαξη μεταξύ πρωτογενών και μεταστατικών περιοχές, διαπιστώσαμε ότι πολλές μεταλλάξεις ήταν ειδικά για τις μεταστατικές περιοχές. Smad4 είναι ένα βασικό αισθητήριο του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα-β σηματοδότηση υπεροικογένεια, η οποία ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [18]. Η απώλεια της Smad4 σχετίζεται με CRC μετάσταση [19-21]. Εν τω μεταξύ, AR ανήκει σε μια οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων που δρουν ως παράγοντες μεταγραφής. AR έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση με την καταστολή της πυρηνικό παράγοντα κάππα Β /μήτρα μεταλλοπεπτιδάση 9 μονοπάτι και περαιτέρω αναστολή της μετάστασης στο ήπαρ καρκίνωμα [22, 23]. παραλλαγές ματίσματος AR είναι γνωστές για την προώθηση μετάσταση όγκου [24]. Η

PPP2R1A

γονίδιο κωδικοποιεί τη δομική υπομονάδα του ενζύμου ΡΡ2Α, η οποία είναι μια πολύ συντηρημένη φωσφατάση σερίνης /θρεονίνης που εξυπηρετεί ένα ευρύ φάσμα βιολογικών ρόλων, συμπεριλαμβανομένης της αρνητικής ρύθμισης της μεταγωγής σήματος, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [25] , και γονιδιακής έκφρασης. PPP2R1A διευκολύνει όγκου των κυττάρων-λεμφικό αλληλεπιδράσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τη διάρκεια των κυττάρων μελανώματος μετάσταση [26].

Συζήτηση

Η ανάλυση μετάλλαξη τοπίο πολυ-περιοχή των τριών όγκων CRC παρέχεται ουσιαστική απόδειξη της ΙΘ, με το έκταση της ΙΘ διαφορετικές μεταξύ των τριών υποθέσεων. Σε ασθενής 1, έχουμε την αλληλουχία δύο χωρικά διαχωρισμένο θέσεις πρωτογενούς καρκίνου. μετάλλαξης φάσματα τους παρουσίασαν μια επικάλυψη 63%. Σε ασθενής 2, μία μόνο βιοψία εμφάνισαν 28 σωματικές μεταλλάξεις κατά μέσο όρο, αντιπροσωπεύοντας το 85% του συνόλου των μεταλλάξεων που παρατηρούνται σε αυτή του όγκου. Αντίθετα, στην Ασθενής 3, 78% του συνόλου των μεταλλάξεων παρατηρήθηκαν σε αυτό τον όγκο. Από όλες τις σωματικές μεταλλάξεις αποκαλύφθηκαν με αλληλούχιση πολλαπλών περιοχή, το 30% έως 40% ήταν ετερογενής και ως εκ τούτου δεν μπορεί να ανιχνευθεί σε κάθε αλληλουχία περιοχής. Kim et al. [8] προσδιορίστηκε ότι το 46% -80% των μεταλλάξεων ήταν μη ανιχνεύσιμα σε όλες τις περιφερειακές βιοψίες σε ομάδα τους. Το επίπεδο της γενετικής ITH σε δείγματα τους ήταν μεγαλύτερη από ότι στην δική μας. Τα αποτελέσματα αλληλούχισης των πρωτογενών καρκίνων του ασθενείς 1 και 2 ήταν περισσότερο όμοια μεταξύ τους από εκείνες των δειγμάτων από την προαναφερθείσα μελέτη. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι μόνο βιοψίες των όγκων δεν μπορεί να αντιπροσωπεύει με ακρίβεια γονιδιωματικής μετάλλαξης τοπίο ενός όγκου, το οποίο επηρεάζει σημαντικά την στοχευμένη θεραπεία.

Εμείς κατασκευάσαμε ένα φυλογενετικό δέντρο χρησιμοποιώντας τα δεδομένα από Ασθενή 3. Το δέντρο αναφέρεται ότι CRC εξελίχθηκε σε μια διακλαδισμένη , παρά μια γραμμική, τρόπο. Το διακλαδισμένο μοντέλο εξέλιξη έχει επικυρωθεί σε πολλούς τύπους καρκίνων [27], συμπεριλαμβανομένων CRC [8]. Παραδοσιακά, CRC θεωρείται να εξελιχθεί σε ένα γραμμικό τρόπο [28]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι υπάρχουν δύο μοντέλα εξέλιξη CRC [29].

διακλαδισμένης εξέλιξη του όγκου υπογραμμίζει την ανάγκη να στοχεύσετε μεταλλάξεις βρίσκονται στο κεντρικό κορμό του φυλογενετικό δέντρο. Διαπιστώσαμε ότι

KMT2C

και

NCOR1

(S63L) μεταλλάχθηκαν σε όλες τις περιοχές σε σύγκριση με τα σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια που αναφέρθηκαν από Kandoth et al. [17]. KMT2C είναι ένα μέλος της οικογένειας λευχαιμίας ανθρώπινου trithorax /μικτή καταγωγή [30] και συμμετέχει στην τροποποίηση των ιστονών.

KMT2C

συχνά μεταβάλλεται σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του ήπατος [31], δερματικό καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο [32], και του οισοφάγου καρκίνο πλακωδών κυττάρων [33]. Στην έρευνά μας, διαπιστώσαμε ότι κάθε ασθενής έχει τουλάχιστον επτά μεταλλάξεις στο

KMT2C

, η κλινική σημασία της οποίας μένει να επικυρωθεί. Παρατηρήσαμε επίσης μια

NCOR1

παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη. NCOR1 είναι ένα συν-καταστολέα πυρηνικός υποδοχέας 270 k [34] η οποία συμμετέχει στην εξαρτώμενη από συνδετήρα μεταγραφική καταστολή από τον υποδοχέα-α οιστρογόνου [35].

KMT2C

και

NCOR1

μπορεί να αντιπροσωπεύουν δύο πιθανές δυνατότητα στόχευσης γονιδίων στη ρύθμιση της ετερογένειας.

KRAS

,

TP53

, και

PIK3CA

είναι τα πιο σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια στο CRC [36]. Ωστόσο, μόνο ασθενής 3 είχε αυτές τις μεταλλάξεις σε ομάδα μας. Αυτές οι μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν σε όλες τις περιοχές που λαμβάνονται από τον ασθενή και επεδείκνυε υψηλή αντιστοιχία μεταξύ συμφωνημένα πρωτογενών και μεταστατικών CRC. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με εκείνο του Brannon et al. [37]. Η κύρια φάσματα μετάλλαξη του καρκίνου αντιπροσωπεύει με ακρίβεια αυτά των μεταστατικών αλλοιώσεων σε σχέση με τις διαθέσιμες προβλέψει βιοδείκτες CRC.

PPP2R1A

(E370X),

SETD2

(I1608V),

Smad4

(G382T), και

AR

μεταλλάξεις ιστοσελίδα ματίσματος προσδιορίστηκαν να είναι δυναμικό μεταστατικό όγκο συγκεκριμένες μεταλλάξεις. Υποθέτουμε ότι αυτές οι μεταλλάξεις θα μπορούσαν να οδηγήσουν CRC μετάσταση. Δεδομένου του περιορισμένου μεγέθους του δείγματος, η συχνότητα αυτών των μεταλλάξεων στο CRC μεταστάσεις πρέπει να αξιολογείται σε μια μεγαλύτερη ομάδα. Περαιτέρω λειτουργικές μελέτες είναι απαραίτητες για την αντιμετώπιση τους ρόλους τους σε CRC μετάσταση.

Γονιδιωματική ανάλυση από ενιαίο βιοψίες βελόνα ενδέχεται να υποτιμούν τη μεταλλάξεων τοπίο ετερογενών όγκων. ΙΘ μπορεί να εξηγήσει εν μέρει την κακή επικύρωση CRC βιοδεικτών οφείλεται σε σφάλμα δειγματοληψίας. Ανακατασκευή του κλωνική δομή του όγκου και τον εντοπισμό των πανταχού παρούσα μεταβολές που βρίσκονται στο πορτ-μπαγκάζ του φυλογενετικό δέντρο μπορεί να συμβάλει στην ανακάλυψη πιο αποτελεσματικών βιοδείκτες και θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Εν κατακλείδι, εντοπίσαμε τη σημαντική έκταση των ITH στο CRC. Στο πλαίσιο αυτού του φαινομένου, διαπιστώσαμε ότι CRC εξελίχθηκε σε μία διακλαδισμένη τρόπο και αρκετές μοριακών γεγονότων μπορεί να συμβάλει στην εξέλιξη CRC. Ερευνήσαμε μόνο σε τρεις περιπτώσεις λόγω των οικονομικών περιορισμών. Περαιτέρω μελέτες με μεγάλα μεγέθη δείγματος θα πρέπει να επιβεβαιωθούν αυτά τα ευρήματα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. OncoGxOneTMPlus λίστα γονίδιο του καρκίνου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152673.s001

(PDF)

S2 πίνακα. Γενετικές αλλοιώσεις ανά ασθενή

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152673.s002

(XLSX)