Αφηρημένο

Ιστορικό

Παρά τη χαμηλή συχνότητα, ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη συχνότερη αιτία των θανάτων από καρκίνο και έχει το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας από όλους τους γυναικολογικούς κακοηθειών μεταξύ των αμερικανικών γυναικών. Το ποσοστό θνησιμότητας θα μειωθεί με ένα δείκτη πρώιμης ανίχνευσης. Η άλφα υποδοχέα φολικού (FRα) είναι μία λογική επιλογή για ένα βιοδείκτη εξαιτίας διαδεδομένη υπερέκφραση του στον καρκίνο των ωοθηκών και αποκλειστική έκφραση του σε λίγες μόνο φυσιολογικούς ιστούς. Στην προηγούμενη εργασία, παρατηρήθηκε ότι οι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών είχαν αυξημένα επίπεδα μιας πρωτεΐνης η οποία δεσμεύεται σε ένα FRα-ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος σε σχέση με τα υγιή άτομα ορού. Ωστόσο, δεν αποδείχθηκε ότι η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε ήταν άθικτο λειτουργική FRα. Στην παρούσα μελέτη, ο στόχος ήταν να προσδιοριστεί εάν ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών (n = 30) είχαν αυξημένα επίπεδα στον ορό ενός πλήρως λειτουργικού ανέπαφο FRα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (n = 30).

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση επίπεδα

FRα στον ορό αναλύθηκαν με δύο μεθόδους, ανάλυση ανοσοκηλίδωσης και ραδιοσημασμένο δοκιμασία σύνδεσης φολικού οξέος που βασίζεται μικροδιήθηση. Χρησιμοποιώντας την ανοσοδοκιμασία, παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα του FRα ήταν υψηλότερα σε ορό ασθενών καρκίνου των ωοθηκών σε σύγκριση με τους ελέγχους. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης με τη χρήση της δοκιμασίας σύνδεσης μικροδιήθησης, η οποία έδειξε ότι η κυκλοφορούσα FRα είναι λειτουργική. Είναι σημαντικό, βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα της FRα ήταν συγκρίσιμα μεταξύ νωρίς και ασθενείς με προχωρημένο στάδιο.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών έχουν αυξημένα επίπεδα λειτουργικών ανέπαφη FRα. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την πιθανή χρήση των κυκλοφορούντων FRα ως βιοδείκτη του πρώιμου καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Βασικοκυτταρικό E, Eghbali-Fatourechi GZ, Καλλή KR, Hartmann LC, Goodman KM, Goode EL, et al. (2009) Λειτουργική Φυλλικό οξύ άλφα υποδοχέα είναι αυξημένη στο αίμα του καρκίνου των ωοθηκών ασθενείς. PLoS ONE 4 (7): e6292. doi: 10.1371 /journal.pone.0006292

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 του Απριλίου 2009? Αποδεκτές: 11, Ιουνίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 20 του Ιούλη, 2009

Copyright: © 2009 Basal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η επιχορήγηση υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, K01-CA100764 και R03-CA121386. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο και έχει το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας όλων των γυναικολογικών κακοηθειών μεταξύ των γυναικών στις ΗΠΑ με περίπου 21.650 νέες περιπτώσεις και την αναμενόμενη & gt? 15.500 θανάτους το 2008 [1]. Η πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών παρόν με προχωρημένη νόσο (στάδιο III-IV) και έχουν μια 5-ετή επιβίωση των τυπικά & lt? 30%. Το γεγονός ότι η επιβίωση των ασθενών με νόσο σταδίων Ι-ΙΙ κυμαίνεται από 60% -90%, ανάλογα με το βαθμό του όγκου [1], [2] προτείνει τη δυνατότητα για ένα υψηλό ποσοστό θεραπείας με έγκαιρη ανίχνευση της νόσου. Από σωματικά συμπτώματα είναι απόντα στα πρώτα στάδια του καρκίνου των ωοθηκών, γίνονται προσπάθειες για την ανάπτυξη αναλύσεις αίματος ή ιστού βιοδείκτες.

Αν και το CA-125 ορού, η επιφάνεια των ωοθηκών κυττάρου γλυκοπρωτεΐνη (δηλαδή βλεννίνη) άγνωστης βιολογική σημασία, είναι αυξημένη σε & gt? 80% των ασθενών με προχωρημένο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, ο δείκτης αυτός έχει θετική προγνωστική αξία & lt? 10% στη νόσο πρώιμο στάδιο [3]. Επιπλέον, CA-125 συνδέεται επίσης με διάφορες μη κακοήθεις συνθήκες, όπως η εγκυμοσύνη, ενδομητρίωση, η αδενομύωση, ινομυώματα της μήτρας, φλεγμονώδης νόσος της πυέλου, εμμηνόρροια, και καλοήθεις κύστεις των ωοθηκών. CA-125 συνδέεται επίσης με άλλες κακοήθεις καταστάσεις όπως του παγκρέατος, του μαστού, του πνεύμονα, γαστρικό και του κόλου καρκίνους [4]. Αν και το CA-125 είναι χρήσιμη για την παρακολούθηση της χημειοθεραπείας του ασθενούς και στην ανίχνευση της πρώιμης υποτροπής σε ασθενείς με ήδη γνωστούς καρκίνους των ωοθηκών, δεν είναι χρήσιμο για τον έγκαιρο εντοπισμό στάδιο της νόσου [5].

Το φυλλικό οξύ α υποδοχέα (FRα), ένα μόριο 38-40 kDa, είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο μέλος της οικογένειας του υποδοχέα φολικού (FR) με υψηλή συγγένεια για φολικά. FRα αγκυρώνεται σε κυτταρικές μεμβράνες μέσω μιας χαρακτηριστικής ομάδας γλυκοσυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης και μεταφέρει φολικά μέσω μιας ενδοκυτταρικής διαδικασίας [6]. FRα εμφανίζει περιορισμένη κανονική κατανομή ιστού, με μετρήσιμους έκφραση περιορίζεται στην κορυφαία επιφάνεια των λίγων επιθηλίων, κυρίως στον πνεύμονα, νεφρό, και χοριοειδές πλέγμα, αλλά υπερεκφράζεται σε ένα φάσμα στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα , ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του νεφρού και σε υψηλής ποιότητας οστεοσάρκωμα [7] – [10]. Αυτή η υπερ-έκφραση της υψηλής συγγένειας FRα σε μερικούς καρκίνους μπορεί να έχουν προκύψει για την κάλυψη κυψελοειδούς απαιτήσεις για τη σύνθεση του DNA και την ανάπτυξη [11].

Εκτός εντοπισμό επιφανείας κυττάρου της, FRα μπορεί επίσης να ρίξει στο αίμα. Ρίχνοντας αρχικά προσδιορίζονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του δοκιμασίες οι οποίες χρησιμοποιούνται καθαρισμένα άνευ κυττάρων FR ως δεσμευτική πρωτεΐνη σύνδεσης ραδιοσυνδετήρα φολικού. Σε αυτές τις μελέτες διαπιστώθηκε ότι υπήρχε συχνά μια μεγάλη διαφορά στην εκτίμηση του συνολικού φολικού οξέος στον ορό, όταν προσδιορίστηκαν μετά από εκχύλιση θερμότητας σε σύγκριση με το φυσικό ορό [12]. Όταν υπόστεγο, FRα θα δεσμεύουν κυκλοφορούν φυλλικό οξύ, δεδομένου ότι η συγγένεια είναι μέσα στο εύρος ηΜ. Τώρα είναι καλά κατανοητό ότι απόπτωση περιπλέκει την ερμηνεία των δοκιμασιών φολικού στον ορό και πιθανώς μάσκες η παρουσία λειτουργικού υποδοχέα εκτός από επεξεργασία με οξύ χρησιμοποιείται για να απελευθερώσει το ενδογενές φολικό οξύ και επιτρέπουν FRα κορεσμό με το ραδιοεπισημασμένο φολικό οξύ. Αυτή η διαφορά στα επίπεδα φολικού οξέος μεταξύ φυσικής και θερμότητα που εξάγεται ορού οδήγησε στην ταυτοποίηση των κυκλοφορούντων FRα σε ορισμένα δείγματα του αίματος ομφάλιου λώρου και σε ορισμένες από μητρικό ορό [13]. Είναι σημαντικό ότι, FRα απελευθερώνονται από φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα δεν θα πρέπει να συμβάλει σε επίπεδα FRα στον ορό, δεδομένου ότι ο υποδοχέας πάντοτε εντοπίζεται στην κορυφαία επιφάνεια ενός πολωμένου επιθηλίου όπου αποβολή του θα παραδώσει την ελεύθερη υποδοχέα σε έναν αυλό που στραγγίζει φυσικά από τον οργανισμό μέσω δική του στομίου του.

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι FRα μπορεί επίσης να ρίξει στο αίμα από όγκους, το οποίο προσφέρει την ευκαιρία να έχουν πρόσβαση και να μετρήσει ως καρκινικός δείκτης του καρκίνου πρώιμο στάδιο. Η επικρατούσα έκφραση του FRα στον καρκίνο των ωοθηκών, μεταξύ όλων των σταδίων, έχει διεγείρει το ενδιαφέρον για την εφαρμογή της ως θεραπευτικό στόχο και βιοδείκτης [14]. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν ανέπαφη λειτουργική FRα έχει ρίξει στην κυκλοφορία και να αξιολογήσει τις δυνατότητές της ως κυκλοφορούν βιοδείκτη. Αυτός ο στόχος υποστηρίζεται από προηγούμενη εργασία η οποία έδειξε ότι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών έχουν αυξημένα επίπεδα μιας πρωτεΐνης ορού που αντιδρούν με αντισώματα αντι-FRα [15]. Τι έμενε να απαντηθεί ήταν αν τα αντισώματα που ανιχνεύονται ολόκληρη FRα και αν η ανιχνεύθηκε πρωτεΐνη ήταν ένα λειτουργικό υποδοχέα φολικού (FR). Έτσι, στην παρούσα μελέτη, τα επίπεδα των κυκλοφορούντων FRα στο αίμα των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών εξετάσθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία μικροδιήθησης

3Η-FA-based το οποίο αναπτύχθηκε για την ανίχνευση λειτουργικών FRα. Επιπλέον, ένας προσδιορισμός ανοσοστυπώματος χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του ειδικού ολόκληρη πρωτεΐνη FRα. Όπως θα αποδειχθεί, ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών επιδεικνύουν αυξημένα επίπεδα FRα στην κυκλοφορία στήριξη της δυνητικής χρήσης της ως βιοδείκτη ασθένεια.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η Mayo κλινική IRB ενέκρινε τη μελέτη και την γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα μαθήματα.

θέματα

Κάθε περίπτωση καρκίνου των ωοθηκών για πρώτη φορά συνδυάζεται με ένα θηλυκό ελέγχου κλήρωση του αίματος μέσα σε 6 μήνες (όλες οι 30 περιπτώσεις ταιριάζουν με επιτυχία), και στη συνέχεια ηλικία μέσα σε 5 χρόνια. Είκοσι-εννέα περιπτώσεις με επιτυχία ταιριάζουν. Η 30η υπόθεση συμφωνημένα στην κλήρωση του αίματος μέσα σε 6 μήνες και την ηλικία μέσα σε 9 χρόνια σε ένα επιλέξιμο έλεγχο. Επιλέξιμες περιπτώσεις ήταν ασθενείς, ηλικίας άνω των 20, με ιστολογικά επιβεβαιωμένο πρωτογενές επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Ένα δείγμα αίματος των 40 mL (προ-εγχειρητική) συλλέχθηκε, επεξεργάστηκε, κλασματοποιήθηκε και αποθηκεύθηκε στους -80 ° C ως ορού. Η μέση ηλικία (± SEM) των ίδιας ηλικίας υγιείς γυναίκες δότες και ασθενείς ήταν 61 ± 3 και 60.63 ± 3 έτη αντίστοιχα. Άλλα χαρακτηριστικά των ασθενών και των όγκων που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Προμήθειες και αντιδραστήρια

Το φυλλικό οξύ ελήφθη από την Alexis Biochemicals. φίλτρα φυγοκέντρηση (10,000 dalton αποκοπή) αγοράστηκαν από την Millipore (Burlington, ΜΑ). Τριτιωμένα φολικό οξύ [3,5,7,9-

3Η] άλας νατρίου, (

3Η-FA, 1 mCi /ml) αγοράστηκε από την American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, Missouri), και έτοιμου ασφαλές κοκτέιλ υγρού σπινθηρισμού ήταν από την Beckman Coulter. Αντι-FRα αντισώματα, MOv18 /ZEL και F5753 ήταν από την Alexis Biochemicals (San Diego, CA) και των ΗΠΑ Βιολογική (Swampscott, ΜΑ), αντίστοιχα.

Προετοιμασία του όγκου κυτταρολύματα και υπερκείμενα καλλιέργειας κυττάρων ως πηγές FRα

ΚΒ κύτταρα είναι ανθρώπινα ρινοφαρυγγικά επιδερμοειδούς καρκινώματος κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του FRα [16] – [18]. ΚΒ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα που αποτελούνται από φολικού χωρίς RPMI 1640, συμπληρωμένο με 55 μΜ 2-μερκαπτοαιθανόλη, 2 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, ρυθμιστικό 10 mM HEPES, 100 IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα υπερκείμενα παρασκευάσθηκαν με φυγοκέντρηση των ρυθμισμένων μέσων στους 4 ° C για την απομάκρυνση μη αγκυροβολημένα κύτταρα. Δείγματα των υπερκειμένων 4 ημερών φυλάχθηκαν στους -80 ° C για να χρησιμοποιηθεί ως πηγή συνδέεται μη-κυττάρου FRα. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από συρρέουσες μονοστοιβάδες ΚΒ με επαναλαμβανόμενους κύκλους ψύξης-απόψυξης ακολουθούμενα από φυγοκέντρηση για την απομάκρυνση υπολειμμάτων. Και για τα δύο υπερκείμενα και προϊόντα κυτταρικής λύσης, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με οπτική πυκνότητα. MCF-7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού χρησιμοποιήθηκαν ως FRα-αρνητικό έλεγχο και παρασκευάστηκαν παρομοίως με κύτταρα ΚΒ. Προϊόντα λύσης (5-10 μg προϊόντων λύσης) και υπερκείμενα (10-20 μL) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη ποσοτικού προσδιορισμού και ως μάρτυρες.

3Η-φολικό οξύ δεσμευτική δοκιμασία

Μέτρηση του φυλλικού οξέος υποδοχείς σε περιπτώσεις και τους ελέγχους ήταν μια παραλλαγή ενός προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [19]. Δείγματα (10 μΐ) φορτώθηκαν μέσα στον ανώτερο θάλαμο ενός ζεύγους σωλήνων διήθησης και αραιώθηκαν σε συνολικό 50 μΙ με διάλυμα διαλυτοποίησης (50 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 25 mM

n

οκτυλο -β-D-γλυκοπυρανοσίδη, 5 mM EDTA, και 0,02% αζίδιο του νατρίου). Οι σωλήνες διήθησης φυγοκεντρήθηκαν και τα φίλτρα σε επεξεργασία με 30 mM οξικό διάλυμα (ρΗ 3.0) για την απομάκρυνση ενδογενούς FA που ακολουθείται από φυγοκέντρηση και δύο πλύσεις με το διάλυμα διαλυτοποίησης. Στη συνέχεια, τα ζεύγη των σωλήνων διήθηση επωάστηκαν είτε με μια 1000Χ κρύο FA σε ένα διάλυμα δεσμεύσεως (10 mM Να

2P

4, 1,8 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, 500 mM NaCl, 2.7 mM ΚΟΙ, ρΗ 7.4, και 25 mM

η-

οκτυλ-β-D-γλυκοπυρανοσίδη) ή με το διάλυμα πρόσδεσης και μόνο, και τα δείγματα επωάστηκαν 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε. διάλυμα που περιέχει Δεσμευτική

3Η-FA προστέθηκε στη συνέχεια σε όλα τα δείγματα ακολουθούμενα από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C με ήπια ανάδευση. Τα φίλτρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση και πλύθηκαν με PBS που περιείχε 50 mM

ν

οκτυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδη για την απομάκρυνση του μη δεσμευμένου

3Η-FA. Bound

3Η-FA που κατακρατήθηκε πάνω στα φίλτρα απομακρύνθηκε με 100 μΙ PBS που περιέχει 4% Triton Χ-100 και μεταφέρεται σε ένα φιαλίδιο με κοκτέιλ υγρού σπινθηρισμού, και η δραστικότητα μετρήθηκε σε μία Beckman LS6000IC Scintillation Counter. Η ειδική σύνδεση προσδιορίστηκε με αφαίρεση της δραστικότητας παρουσία περίσσειας ψυχρού FA από τη δραστηριότητα του ίδιου δείγματος χωρίς ανταγωνισμό FA.

Ανοσοκαταβύθιση και ανάλυση ανοσοστυπώματος των FRα

FRα στον ορό άμεσα μετράται χρησιμοποιώντας ανάλυση ανοσοκηλίδος του ανοσοκαταβύθισης. Δείγματα ορού (100 μl), λύματα (25 μα ΚΒ ή MCF-7) ή ΚΒ υπερκείμενα προ-καθαρίζεται δύο φορές με Πρωτεΐνη G Sepharose και 5 μg κάθε ένα από τα μονοκλωνικά αντισώματα, MOv18 /ZEL και F5753, προστέθηκαν σε κάθε δείγμα και επωάζονται για 1 ώρα στους 4 ° C. Protein G Sepharose συν σφαιρίδια στη συνέχεια προστέθηκαν και το μίγμα αφέθηκε να περιστρέφεται όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν με 600 μΙ ρυθμιστικού λύσης (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Να

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, και αναστολείς πρωτεάσης). Τα σφαιρίδια αποχύθηκαν και ζέση σε ρυθμιστικό Laemmli. Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE υπό μη αναγωγικές συνθήκες που ακολουθείται από κηλίδωση. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα MOv18 /ZEL (5 μg /ml σε 2% άπαχο ξηρό γάλα, 0,1% Tween 20 σε TBS) που ακολουθείται από δευτερογενή αντι-ποντικού IgG υπεροξειδάση κοχλιαρίας (HRP) συζευγμένο αντίσωμα (1:5000 σε 2% μη άπαχο ξηρό γάλα σε 0,1% Tween 20), και αναπτύχθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια με Super Signal West Pico χημειοφωταύγειας υποστρώματος για 5 λεπτά (Pierce, Rockford, IL, USA). Οι κηλίδες στη συνέχεια εξετέθησαν σε φιλμ και η μπάντα θέσεις ακτίνων Χ και πυκνότητες μπάντα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μηχανογραφημένο σύστημα ανάλυσης εικόνας (συστήματα UVP Biochem Imaging, ορεινές, CA).

Στατιστική Ανάλυση

Η μέσα επίπεδα των κυκλοφορούντων FRα, ανιχνεύεται είτε με δέσμευσης συνδέτη δοκιμασία ή ανάλυση ανοσοκηλίδωσης, μεταξύ των περιπτώσεων και άτομα ελέγχου συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το Wilcoxon συμφωνημένα δοκιμή ζεύγη. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί για στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις. Αναλογίες δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Σε όλες τις περιπτώσεις, μια δίπλευρη δοκιμή χρησιμοποιήθηκε και την αξία ΑΡ μικρότερη από ή ίση με 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Ανίχνευση FRα χρησιμοποιώντας δέσμευσης μικροδιήθησης προσδιορισμούς και ανοσοκηλίδωση

σε αρχικές προσπάθειες για τη μέτρηση των επιπέδων των κυκλοφορούντων FRα από μελέτες σύνδεσης

3Η-FA, προκαταρκτικές μελέτες είχαν γίνει για να καθορίσει τα χαρακτηριστικά του προσδιορισμού διήθησης μικροφυγόκεντρο. ΚΒ κύτταρα υπερκείμενο δείγματα επωάστηκαν με αυξανόμενες ποσότητες

3Η-FA απουσία και παρουσία περίσσειας ψυχρού FA και στη συνέχεια μέτρησαν την ανάκτηση των δεσμευμένων

3Η-FA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, μεταξύ 10 και 120 nmol /L

3Η-FA, η συνολική σύνδεση αυξήθηκε γραμμικά. Όταν προστέθηκε περίσσεια ψυχρό FA, το ποσό δεσμεύεται μειώθηκε σε επίπεδα υποβάθρου. Οι υπολογιζόμενες συγκεντρώσεις FA πάνω από αυτό το εύρος (10-120 nmol /L) ήταν συνεπή και καμία από τις τιμές ήταν σημαντικά διαφορετικές (δεν φαίνεται). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δοκιμασία είναι σε θέση να μετρήσει FRα σε μία ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων FA

Πίνακας Α:. Δέκα μΐ υποπολλαπλάσια του υπερκείμενου καλλιέργειας KB αραιώθηκε στα 50 μL με ρυθμιστικό που περιείχε αυξανόμενες συγκεντρώσεις

3Η-FA παλλόμενα, χωρίς (Σύνολο όριο) ή με 1000X κρύο FA. Μετά την επώαση, το μη δεσμευμένο FA απομακρύνθηκε με μικροδιήθηση. Που παρουσιάζονται είναι η CPM φυλάσσεται από τον μικροφίλτρο. Επίσης δείχνεται Ιστορικό οποία είναι δεσμευτική απουσία KB υπερκείμενα και χωρίς υπερβολή το κρύο FA. * P & lt? 0,05. Κάθε σημείο δεδομένων είναι η μέση τιμή (± SE) 3 επαναλήψεις. Η γραμμή ένθετο διακεκομμένη είναι η γραμμική γραμμή παλινδρόμησης του συνολικού δεσμεύεται παρουσιάζονται με τα αντίστοιχα ρ και r αξίες. Πάνελ Β δείχνει ότι η ποσότητα της ειδικής σύνδεσης εξαρτάται από τα επίπεδα εισόδου. Στην περίπτωση αυτή, αυξανόμενες ποσότητες ορού που περιέχει μια πρωτεΐνη ακίδα KB εξετάστηκαν. Αυτό το πείραμα είναι αντιπροσωπευτικό 2 διαφορετικά πειράματα. Πίνακας Γ δείχνει τη συγκέντρωση FA που δεσμεύονται είτε KB υπερκείμενα ή ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα ορού από μια υπόθεση και τον έλεγχο, συγκρίνοντας το 30 KD και 10 Μικροδιηθητικές αποκοπής. Πείραμα είναι αντιπροσωπευτικό δύο πειραμάτων. Πίνακας Α παρουσιάζει ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα της ανάλυσης με ανοσοαποτύπωμα των FRα. Arrow = M

r πρωτεΐνη 38000? KD = kilodalton? IP = ανοσοκατακρήμνιση. Λωρίδα 1, IP w χωρίς ορό? λωρίδα 2, ΠΕ KB λύμα? λωρίδα 3, ΠΕ προκαταρκτική διαύγαση ορού με KB λύμα ακίδα? λωρίδα 4. IP του ορού και μόνο, λωρίδα 5, KB λύματος δεν IP? λωρίδα 6, IP της KB λύμα δεν ορού.

Η

Για να καθοριστεί το ελάχιστο ποσό που απαιτείται ορού, ένα δείγμα φυσιολογικό ορό μάρτυρα (100 μl) εμπλουτίστηκε με κυτταρικό λύμα KB (5 μg) και διαφορετικών όγκων (0-40 μλ) ελέγχθηκαν ως προς τη δέσμευση

3Η-FA. Όπως εμφανίζεται σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παράδειγμα στο Σχήμα 1 Β, ο προσδιορισμός θα μπορούσε να ανιχνεύσει μικροφίλτρο δεσμευτικός FA σε έναν όγκο μόλις 10 μΐ. Ωστόσο, πάνω από 20 μl ορού, διαπιστώθηκε ότι οι Μικροδιηθητικές δεν είναι πάντα εύκολα τα στραγγίζετε. Έτσι, ένα πρότυπο όγκου 10-20 μl χρησιμοποιήθηκε για τις περιπτώσεις και τους ελέγχους.

Παρά το γεγονός ότι πριν από την εργασία είχε χρησιμοποιήσει 30 φίλτρα αποκοπής KD για τη μέτρηση FRα σε δείγματα ιστών [19], υπήρχε μια ανησυχία ότι κάποια απώλεια μπορεί έχουν προκύψει ως συνέπεια της μεταβολής του μεγέθους των πόρων, με αποτέλεσμα την παρουσία κάποιων πόρους του φίλτρου που θα επιτρέπει τη διέλευση του 38 KDa FRα. Ως εκ τούτου, οι δοκιμές έγιναν συγκρίνοντας 30 KD και 10 KD φίλτρα αποκοπής. Σε γενικές γραμμές, υπήρχαν μόνο μικρές διαφορές. Για παράδειγμα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, δεν υπήρχε αξιοσημείωτη διαφορά στο δεσμευμένο FA όταν χρησιμοποιούν κυτταρολύματα ΚΒ ΚΒ υπερκείμενα. Αντίθετα, μικρές αυξήσεις παρατηρήθηκαν με συνέπεια σε δείγματα ορού κατά τη χρήση των 10 KD φίλτρα αποκοπής. Έτσι, το 10 KD αποκοπής χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση FRα στους ορούς των περιπτώσεων και ελέγχων.

Σε μια προσπάθεια να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα μικροδιήθησης, μια μέθοδος ανοσοκαθίζηση και ανοσοστύπωμα καθιερώθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, FRα μπορεί να ανοσοκαταβυθίζεται από ορούς (100 μΙ) και ανοσοστυπώθηκαν με αποτέλεσμα ανίχνευση του 38 KD FRα. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δοκιμασία μικροδιήθησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση FRα σε μικρά δείγματα ορών. Περαιτέρω, ανοσοαποτύπωση ανάλυση αποκαλύπτει την παρουσία ανέπαφης πλήρους μήκους FRα.

Οι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών χωρίς θεραπεία έχουν αυξημένα μέσα επίπεδα κυκλοφορούντων FRα σε σύγκριση με μάρτυρες

Ο ασθενής (δηλαδή περιπτώσεις) χαρακτηριστικά είναι λεπτομερώς στον πίνακα 1. δοκιμασίες πρόσδεσης μικροφίλτρο και ανοσοκηλίδωση έδειξε ότι οι οροί που λαμβάνονται από τις περιπτώσεις που περιείχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα μέσης του FRα σχέση με τους μάρτυρες (Σχήμα 2Α-C). ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης του συνόλου των μετρήσεων και από τις δύο περιπτώσεις και έλεγχοι έδειξαν ότι υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων των προσδιορισμών μικροδιήθησης και immunoblot (Σχήμα 2D). Για να εκτιμηθεί η οποία δοκιμασία μπορεί δυνητικά να είναι πιο δεκτικά στην ανάπτυξη ως μια δοκιμή βιοδείκτη, αποκοπές ιδρύθηκαν από τις τιμές της ομάδας ελέγχου και για τις δύο δοκιμασίες, χρησιμοποιώντας την μέση και δύο τυπικές αποκλίσεις. Με αυτή τη στρατηγική, περισσότερο από 95% των τιμών ελέγχου έπεσαν κάτω από την αποκοπή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, χρησιμοποιώντας αυτή τη στρατηγική, 13% και 27% των περιπτώσεων θεωρήθηκαν ότι έχουν αυξημένα επίπεδα FRα στις δοκιμασίες μικροδιήθησης και ανοσοαποτύπωση, αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher έδειξε ότι το κλάσμα των περιπτώσεων με αυξημένα επίπεδα FRα, όπως ανιχνεύεται με την δοκιμασία ανοσοστύπωσης, ήταν σημαντικά διαφορετική από το κλάσμα των ελέγχων θεωρείται θετική. Αντιθέτως, το κλάσμα των περιπτώσεων που εντοπίστηκαν με τη δοκιμασία μικροδιήθηση δεν ήταν σημαντική, γεγονός που υποδηλώνει ότι η δοκιμασία ανοσοστύπωσης μπορεί δυνητικά να έχει μια καλύτερη θετική προγνωστική αξία.

Πίνακας Α δείχνει τον αριθμό των κυκλοφορούντων υποδοχέα φολικού (FRs) παρέκταση από η δοκιμασία μικροδιήθησης υποθέτοντας μία μοριακή αναλογία FA:FR και στις δύο περιπτώσεις και μάρτυρες πάνελ Β 1:01 δείχνει την πυκνομετρική σήμα που λαμβάνεται με τη χρήση ανοσοκηλιδώσεως. Οι τιμές Ρ σε πίνακες Α και Β υπολογίζεται χρησιμοποιώντας συμφωνημένα δοκιμή ζεύγη του Wilcoxon και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± s.e.m. Πίνακας C: Λωρίδα 1, ανοσοκαθίζηση αρνητικός έλεγχος? διαδρομή 2, αρνητικός έλεγχος (MCF-7) λύμα? λωρίδα 3, θετικός έλεγχος (KB) λύμα)? λωρίδα 4, έλεγχος δειγμάτων ορού? λωρίδα 5, σε συνδυασμό δείγματος ορού καρκίνου των ωοθηκών? λωρίδα 6, έλεγχο δείγματος ορού? λωρίδα 7 συμφωνημένα δείγμα ορού καρκίνου των ωοθηκών. Arrow = M

r πρωτεΐνη 38000? KD = kilodalton. Πάνελ D δείχνει την ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης συσχέτιση της δέσμευσης μικροδιήθησης δεδομένα προσδιορισμού και τα δεδομένα ανοσοκηλίδωση. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό άτομο. Ανοίξτε τα σύμβολα αντιπροσωπεύουν τις υγιείς ελέγχους και κλειστά σύμβολα είναι ασθενείς.

Η

Πίνακας Α και Β δείχνουν το ποσοστό των περιπτώσεων και ελέγχων που θεωρήθηκαν θετικά μέσω μικροδιήθησης ή ανοσοστύπωση προσδιορισμού, αντίστοιχα, με αποκοπές καθιερωθεί ως η μέση συν δύο τυπικές αποκλίσεις των τιμών ελέγχου. Η π-αξία υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher.

Η

Τα επίπεδα των κυκλοφορούντων FRα είναι συγκρίσιμα μεταξύ πρώιμη και προχωρημένη νόσο

Δοκιμάσαμε αν υπήρχε κάποια συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των κυκλοφορούντων FRα και μια ποικιλία από κλινικά χαρακτηριστικά, όπως επίσης και την έκφραση FRα εντός του όγκου. Βρήκαμε ότι τα κυκλοφορούντα επίπεδα FRα (όπως εκτιμάται ανοσοαποτύπωση) ήταν συγκρίσιμα μεταξύ νωρίς (στάδια Ι /ΙΙ, n = 15, 16 ± 2 ΑΕ) και προχωρημένο στάδιο (στάδια ΙΙΙ /IV, n = 15, 12 ± 2 au, p = 0,24) των ασθενών, όπως φαίνεται στα Σχήματα 4Α. Οι διαφορές στα κυκλοφορούντα FRα μεταξύ πρώιμο και ασθενείς με προχωρημένο στάδιο, όπως εκτιμάται από δοκιμασίες πρόσδεσης δεν ήταν επίσης σημαντική (1,4 ± 0,3 έναντι 1,0 ± 0,2 ρ & lt?. 0.2, Σχήμα 4Β). Είναι σημαντικό, τα επίπεδα της FRα σε ασθενείς με πρώιμο στάδιο ήταν σημαντικά υψηλότερο από όλους τους ελέγχους (n = 30, 7 ± 0,9 AU, ανοσοαποτύπωση, σ & lt? 0,0001 και 0,6 ± 0,1 ηιτιοΐδ δεσμευτικές /l, p = 0.02).

Πάνελ Α και Β δείχνει τη σύγκριση μεταξύ πρώιμο και όψιμο σήματα στάδιο πυκνομετρικής και δοκιμασία μικροδιήθηση, αντίστοιχα. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό άτομο και η οριζόντια γραμμή αντιπροσωπεύει τη μέση. σ τιμές που παρουσιάζονται υπολογίστηκαν με τη χρήση της δοκιμής Τ του Student.

Η

Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των κυκλοφορούντων FRα και είτε την ηλικία, το βαθμό, την κατάσταση υποτροπή ή έκταση της debulking (βέλτιστη έναντι υπο-βέλτιστη) (p & gt ? 0,05). Όγκοι από 27 από τους 30 ασθενείς είχαν υψηλή έκφραση FRα, συνεπές με προηγούμενες εργασίες, και ως εκ τούτου, το μέγεθος του δείγματος μας δεν ήταν αρκετά μεγάλη για να καθοριστεί εάν η έκφραση του όγκου FRα συσχετίστηκε με τα επίπεδα του FRα στο αίμα. Ωστόσο, από τις τρεις όγκους (1 ορώδες οριακά και 2 βλεννώδες οριακά) με χαμηλό όγκο που σχετίζεται FRα, μόνο 1 βλεννώδες οριακά κατέδειξε χαμηλά επίπεδα κυκλοφορούντων FRα. Αυτό υποδηλώνει ότι κυκλοφορούν FRα δεν μπορεί να συσχετίζονται καλά με τα επίπεδα του όγκου. Πράγματι, σε προγενέστερες μελέτες μας, παρατηρήσαμε κάποιες διαφορές σε FRα χρώση διαφορετικές εστίες όγκου (επαναλαμβανόμενες και μεταστατικών βλαβών) [14].

Συζήτηση

Ο καρκίνος των ωοθηκών διαφεύγει συχνά ανίχνευσης λόγω της έλλειψης οριστική πρώιμα συμπτώματα. Ως εκ τούτου, ο καρκίνος των ωοθηκών παρουσιάζει στο προχωρημένο στάδιο ~ 70% των ασθενών. Οι βιοδείκτες που χρησιμοποιούνται σήμερα δεν είναι επαρκής για την ανίχνευση του καρκίνου πρώιμο στάδιο. Ως εκ τούτου, δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πρώτη αιτία θανάτου μεταξύ όλων των γυναικολογικών κακοηθειών τα τελευταία χρόνια. Επί του παρόντος διατίθενται δείκτες CA-125 και πρωτεομική προφίλ έλλειψη ευαισθησίας, ειδικότητας ή /και επαναληψιμότητα. Υπάρχει σαφής ανάγκη για διαγνωστικούς δείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών σε πρώιμο στάδιο. Ένα μόριο που εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά σε παθογόνους ιστού θα έκανε ένα ιδανικό βιοδείκτη και ένα τέτοιο υποσχόμενος υποψήφιος είναι το φυλλικό οξύ υποδοχέα (FR-α). FR-α είναι ιδιαίτερα υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των καρκίνων των ωοθηκών αλλά εμφανίζει περιορισμένη έκφραση σε ιστούς που είναι υπεύθυνοι για συνολική σωματική κατακράτηση φολικών (π.χ., πλακούντα, χοριοειδούς πλέγματος και των νεφρών). Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε αν ήταν εφικτό για την ανίχνευση κυκλοφορούντων FRα σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και αν το κυκλοφορούν FRα ήταν πλήρους μήκους και λειτουργικά.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών έχουν αυξημένα επίπεδα FRα σε σχέση με τους υγιείς ελέγχους. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι κυκλοφορούν FRα θα μπορούσε ενδεχομένως να αναπτυχθεί ως ένα βιοδείκτη. Τα αυξημένα επίπεδα του FRα στη νόσο πρώιμο στάδιο δείχνει ότι προς τα πάνω ρύθμιση του FRα μπορεί να συμβεί νωρίς στην ωοθηκική καρκινογένεση σε ορισμένους ασθενείς. Πράγματι, Toffoli και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι σχεδόν το 79% των ασθενών με πρώιμο στάδιο (Ι και ΙΙ), ο καρκίνος των ωοθηκών υπερεκφράζεται FRα, το οποίο ήταν ουσιαστικά ταυτόσημο με το ποσοστό των ασθενών προχωρημένου σταδίου που είχαν FRα έκφραση [9]. Εμείς που παρατηρήθηκαν σε μελέτες μας ότι τα επίπεδα των κυκλοφορούντων FRα σε ασθενείς πρώιμο στάδιο, δεν ήταν διαφορετική από ό, τι οι ασθενείς σε προχωρημένο στάδιο. Ωστόσο, Toffoli και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι ενώ η αναλογία ήταν παρόμοια, τα επίπεδα της FRα επί του όγκου ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με προχωρημένο στάδιο. Η έλλειψη συσχέτισης μπορεί να υποδεικνύει ότι υπάρχουν και άλλοι παράγοντες που ρυθμίζουν τα επίπεδα στον ορό. Για παράδειγμα, Mantovani και οι συνεργάτες του βρήκαν ότι κανονικά ανθρώπινα δείγματα ούρων ήταν έντονα θετικά για FRα ανοσο-αντιδραστικότητα, γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχει ένας μηχανισμός για την ταχεία κάθαρση νεφρών του [15]. Δεδομένου ότι τα εγγύς σωληνάρια του νεφρού εκφράζουν έντονα την πρωτεΐνη, θα μπορούσε κανείς να συμπεράνει ότι ο νεφρός έχει μια καλά αναπτυγμένη στρατηγική για την εξάλειψη FRα για να το αποτρέψει από τη συσσώρευση του αίματος και την πρόληψη της πρόσληψης FA στους ιστούς [19]. Αυτό υποστηρίζεται σε κινητικές μελέτες μοντελοποίησης ποντικού που έχουν δείξει ότι καθώς ο όγκος εξελίσσεται, αυξάνεται σε επίπεδα ούρα FRα προηγούνται επίπεδα ορών σημαντικά [15].

άθικτη FRα είναι μια πρωτεΐνη 38 kDa και στην ανοσολογική ανάλυση μας, αντι-MOv18 αντισώματος /ZEL ανίχνευσαν μια πρωτεΐνη στο ίδιο μοριακό βάρος. Επιπλέον, δείξαμε ότι η δοκιμασία μικροδιήθησης ανιχνεύεται λειτουργική πρωτεΐνη, η οποία λαμβάνεται μαζί υποδηλώνει ότι FRα αποβληθούν από τον καρκίνο των ωοθηκών είναι άθικτο και λειτουργικό. Η παρουσία του FRα στην κυκλοφορία των ασθενών έχει θεραπευτική σημασία ως έχει αναπτυχθεί ένας αριθμός θεραπειών που επιφανείας κυττάρου στόχου FRα σε ασθενείς με καρκίνο [20]. Αυτά κυκλοφορούν FRs μπορεί να δεσμεύσει και να παρεμβαίνει με την κλινική αποτελεσματικότητα. Αυτό μπορεί να εξηγήσει τα υψηλά ποσοστά αποτυχίας που παρατηρείται σε ορισμένες FRα κατευθυνόμενη ανοσοθεραπείες σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Για παράδειγμα, Kershaw και συνεργάτες ανέπτυξαν μια προσέγγιση στην οποία αυτόλογα Τ κύτταρα από ασθενείς γονίδιο-τροποποιημένα με ένα χιμαιρικό υποδοχέα ο οποίος περιείχε ένα FRα-ειδικό αντίσωμα απλής αλύσου συζευγμένο με την αλυσίδα γάμμα υποδοχέα Fc [21]. Ενώ τα κύτταρα εκκρίνεται ΙΡΝ-γ σε απόκριση FRα, απέτυχαν να εντοπίζεται σε θέση όγκου, μια αποτυχία που μπορεί να εξηγηθεί με την κυκλοφορία FRα οποία κορεσμένα τους χιμαιρικούς υποδοχείς. Ως εκ τούτου, η ανάλυση των κυκλοφορούντων FRα σε ασθενείς με καρκίνο θα μπορούσε να βοηθήσει στον καθορισμό των επιπέδων των αντι-FRα στοχοθετημένη χιμαιρικών υποδοχέων που απαιτούνται για την επιτυχή θεραπεία. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι αυξημένα κυκλοφορούντα FRα ήταν λειτουργική, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή παρεμβολή με έναν αριθμό θεραπειών φολικού οξέος-συζευγμένο φάρμακο που έχουν αναπτυχθεί που απαιτούν μια λειτουργική θέση σύνδεσης [20], Μία από τις δυσκολίες, ωστόσο, κατά τη μέτρηση του ορού επίπεδα FRα είναι η έλλειψη ενός προσδιορισμού της ποιότητας. Ενώ δοκιμασίες πρόσδεσης μας ήταν σε θέση να ανιχνεύσει μια διαφορά μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται δείχνουν ότι δοκιμασία ανοσοστύπωσης δυνητικά μπορεί να είναι περισσότερο χρήσιμα για την ανίχνευση αυξημένων επιπέδων. Ωστόσο, όπως και με κάθε δοκιμασία λέκιασμα, το βοηθητικό πρόγραμμα περιορίζεται από την τεχνική πολυπλοκότητά του (δηλαδή ανοσοκατακρήμνιση ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση) και τα αποτελέσματα με τον προσδιορισμό αυτό είναι μόνο ημι-ποσοτική.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο καρκίνος των ωοθηκών ασθενείς, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με πρώιμη νόσο, έχουν αυξημένα επίπεδα λειτουργικού ανέπαφη FRα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. Με την περαιτέρω ανάπτυξη, περιλαμβανομένων των μεγαλύτερων πρώιμο στάδιο μεγέθη δειγμάτων καρκίνου των ωοθηκών και βελτιωμένη απόδοση της ανάλυσης, η χρήση των FRα ως βιοδείκτη για τον καρκίνο των ωοθηκών μπορεί να είναι εφικτό.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω Ο Δρ Λίντα Ε Κελεμεν για την πολύτιμη συζητήσεις της με το χειρόγραφο.