Αφηρημένο

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη τοπική εισβολή όγκου, μετάσταση και την πρώιμη συστηματική διάδοση. Η συντριπτική πλειοψηφία των παγκρεατικό καρκίνο (PaCa) οι ασθενείς έχουν ήδη μεταστατικό επιπλοκές κατά τη στιγμή της διάγνωσης, και το ποσοστό θανάτου αυτού θανατηφόρο τύπο καρκίνου έχει αυξηθεί τις τελευταίες δεκαετίες. Έτσι, οι προσπάθειες για τον εντοπισμό νέων μοριακά στοχευμένες θεραπείες αποτελούν προτεραιότητες. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι η σεροτονίνη (5-ΗΤ) συμβάλλει στην ανάπτυξη του όγκου σε μια ποικιλία καρκίνων συμπεριλαμβανομένου του προστάτη, του παχέος εντέρου, της κύστης και καρκίνου του ήπατος. Ωστόσο, υπάρχει έλλειψη στοιχείων σχετικά με τον αντίκτυπο των υποδοχέων 5-ΗΤ για την προώθηση του καρκίνου του παγκρέατος. Έχοντας εξετάσει ο ρόλος των 5-ΗΤ 1-υποδοχείς, ιδιαίτερα 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποτύπους 1Δ σε διάφορους τύπους κακοηθειών, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D στην ανάπτυξη PaCa και πρόοδο και να αναλύσει τις δυνατότητές τους ως κυτταροτοξικά στόχους. Βρήκαμε ότι knockdown του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D έκφραση υποδοχέων, χρησιμοποιώντας ειδικά μικρά RNA παρεμβολής (siRNA), προκαλούμενη σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού και της ικανότητας κλωνισμού των κυττάρων PaCa. Επίσης, κατέστειλε σημαντικά κύτταρα PaCa εισβολή και μείωσε τη δραστηριότητα της uPAR /ΜΜΡ-2 σηματοδότηση και Ιντεγκρίνης /σηματοδότηση Src /Fak μεσολάβηση, ως αναπόσπαστα οδούς των καρκινικών κυττάρων που σχετίζονται με την εισβολή, τη μετανάστευση, προσκόλληση, και πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, η στόχευση 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D ρυθμίζει προς τα κάτω ZEB1 δακτύλου ψευδαργύρου και πρωτεΐνες σαλιγκάρι, οι παράγοντες μεταγραφής σφραγίδες που ρυθμίζουν επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), ταυτόχρονα με αυξητική ρύθμιση του claudin- 1 και Ε-καδερίνη. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η 5-ΗΤ

1β- και 5-ΗΤ

1D μεσολάβηση σηματοδότηση παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και επεμβατική φαινότυπο του PACA. Υπογραμμίζει, επίσης, τις θεραπευτικές δυνατότητες στόχευσης των 5-ΗΤ

υποδοχείς 1B /1D στη θεραπεία του PACA και ανοίγει ένα νέο δρόμο για την ταυτοποίηση βιοδεικτών, και πολύτιμη νέους θεραπευτικούς στόχους για τη διαχείριση του καρκίνου του παγκρέατος.

Παράθεση: Gurbuz Ν, Ashour ΑΑ, Alpay SN, Ozpolat Β (2014) κάτω ρύθμιση των 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D υποδοχείς αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, κλωνογενοποιήσεως και εισβολή των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (8): e105245. doi: 10.1371 /journal.pone.0105245

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Μαρτίου 2014? Αποδεκτές: 21 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Αύγ, 2014

Copyright: © 2014 Gurbuz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Τέξας Κέντρο για τον Καρκίνο νανοϊατρική (TCCN), ένα Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI) Κέντρο για τη νανοτεχνολογία (454CA151668), και με siRNA έργο του Κέντρου, MD Anderson Cancer Κέντρο, UT, Χιούστον, Τέξας, ΗΠΑ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παγκρέατος (PaCa), η οποία έχει μια ισχυρή ικανότητα διεισδυτικής με συχνές μετάσταση και επανάληψης, είναι γνωστό ότι είναι μία από τις πιο θανατηφόρες ανθρώπινους καρκίνους με & lt? 5% ποσοστό επιβίωσης 5 ετών [1]. Παρόλο που κατατάσσεται μόλις δέκατο σε συχνότητα μεταξύ των πιο κοινών ανθρώπινων καρκίνων, PaCa είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες και το ποσοστό του θανάτου του δεν έχει μειωθεί κατά τις τελευταίες δεκαετίες [2], [3]. Συνολικά, PaCa έχει περίπου 100% θνησιμότητα, διότι ανιχνεύεται γενικά στα στάδια των προτέρων, δεδομένου ότι συνήθως δεν προκαλεί κανένα σύμπτωμα σε προηγούμενα [4] στάδια. PaCa είναι εγγενώς ανθεκτικά σε απόπτωση και κακώς ανταποκρίνεται στις υπάρχουσες θεραπευτικές ουσίες, συμπεριλαμβανομένων συνδυασμός χημειοθεραπευτικών σχημάτων [5]. Για να ξεπεραστεί αυτό το παγκόσμιο πρόβλημα υγείας, οι έρευνες επικεντρώθηκαν στην ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών.

Η μιτογόνος νευροδιαβιβαστή, της σεροτονίνης (5-ΗΤ) ήταν παλαιότερα γνωστό ότι δρα ως παράγοντας ανάπτυξης [ ,,,0],6] για διάφορους τύπους μη-καρκινικών κυττάρων (π.χ. αγγειακών μυϊκών κυττάρων λείων, ινοβλάστες πνεύμονα και νεφρικά μεσαγγειακά κύτταρα) [7], [8], και τα καρκινικά κύτταρα (π.χ. παγκρεατικά καρκινοειδές κύτταρα, κύτταρα καρκινώματος μικρών κυττάρων του πνεύμονα και καρκίνωμα παχέος) [9], [10], [11]. Πρόσφατα, 5-ΗΤ έχει αναδειχθεί ως σημαντικός ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου σε μια ποικιλία τύπων καρκίνου [12], [13], [14], [15]. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, υδροξυλάση της τυροσίνης, το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στην οδό βιοσύνθεσης της σεροτονίνης, συχνά επάνω ρυθμισμένη [16]. Σημαντικά, έχει διαφορετικούς υποδοχείς 5-ΗΤ έχουν αναγνωριστεί (5-ΗΤ-1-7) με βάση δομικές, λειτουργικές και φαρμακολογικά χαρακτηριστικά τους [17], [18]. Έξι από τις οικογένειες των υποδοχέων 5-ΗΤ είναι G-πρωτεΐνη, συμπεριλαμβανομένων Gi: 5-HT-1, Gs: 5-HT-4,6,7, και Gq /11: 5-HT-2,5. Μόνο 5-ΗΤ-3 είναι μοναδικά ένας συνδετήρας-περιορισμένου διαύλου κατιόντων, που σχετίζονται με τον νικοτινικό υποδοχέα ακετυλοχολίνης [16]. Οι υποδοχείς 5-ΗΤ χωρίζονται περαιτέρω σε διάφορους υποτύπους, π.χ. 5-ΗΤ-1 οικογένεια έχει πέντε υποτύπους [18], που περιλαμβάνει την 5-ΗΤ-1Α, 1Β, -1δ, -1Ε και -1στ υποδοχείς και τα ζευγάρια κατά προτίμηση προς Gi /o να αναστέλλουν το σχηματισμό cAMP [19], [20 ]. Ειδικότερα, το ανθρώπινο 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D είναι ιδιαίτερα παρόμοιες σε αλληλουχία παρά το γεγονός ότι κωδικοποιείται από δύο διαφορετικά γονίδια. Η ακριβής λειτουργία αυτών των υποδοχέων παραμένει απροσδιόριστη, και η πρόοδος προς την κατεύθυνση αυτή έχει παρεμποδιστεί από την έλλειψη εκλεκτικών συνδετών [21]. Είχε προηγουμένως έδειξαν ότι οι 5-ΗΤ-1 υποδοχείς είναι ευρέως εκφράζονται στο ανθρώπινο καρκίνο του μαστού [22], του καρκίνου του προστάτη [23] και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα [18], η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει τις μιτογόνες επιδράσεις των αγωνιστών αυτών των υποδοχέων σε τέτοιους καρκίνους. Παγκρέατος έρευνα του καρκίνου έχει ως επί το πλείστον επικεντρώθηκε στη μελέτη των μεταλλάξεων του γονιδίου και τις οδούς μεταγωγής σήματος σε αδενοκαρκινώματος παγκρεατικού πόρου κύτταρα (PDAC), ενώ ο πιθανός ρόλος των υποδοχέων νευροδιαβιβαστών στην ανάπτυξη και την πρόοδο αυτής της θανάσιμης νεοπλασματικής νόσου έχει αγνοηθεί σε μεγάλο βαθμό [4]. Λαμβάνοντας υπόψη την πιθανή εμπλοκή του 5-ΗΤ 1 υποδοχέων σηματοδότησης στον πολλαπλασιασμό διαφόρων τύπων καρκίνων, με άγνωστες συνέπειες αυτών των υποδοχέων για την εξέλιξη PaCa, ερευνήσαμε εδώ το ρόλο του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D υποδοχείς στον πολλαπλασιασμό και την επεμβατική φαινότυπο του PACA.

Τοπικές εισβολή μπορεί να θεωρηθεί ως ένα αρχικό και ουσιαστικό βήμα για την κακοήθεια των καρκινωμάτων, που οδηγεί στην παραγωγή του συνήθως θανατηφόρα μακρινή μετάσταση. Για τα καρκινικά κύτταρα να εισβάλουν μακρινό ιστούς, θα πρέπει να διεισδύσουν γύρω εξωκυτταρικές μήτρες. Τέτοιες αλληλεπιδράσεις των καρκινικών κυττάρων /ECM διευκολύνεται από την ιντεγκρίνη οικογένεια μορίων προσκόλλησης κυττάρου συμπεριλαμβανομένων τυροσίνη-φωσφορυλιωμένα υποστρώματα (η Src κινάσης τυροσίνης και κινάσης εστιακής προσκόλλησης) [24]. Οι ιντεγκρίνες είναι trans-μεμβρανώδη α /β ετεροδιμερείς υποδοχείς που μεσολαβούν στις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και προσκόλληση κυττάρου προς εξωκυτταρική μήτρα (ECM) [25], και χρησιμεύουν ως υποδοχείς για μερικές πρωτεΐνες ECM (π.χ., ινωδονεκτίνη βιτρονεκτίνη, λαμινίνη και το κολλαγόνο) [ ,,,0],26]. Αλλαγμένη δραστικότητα ιντεγκρίνης ή συγγένεια υπόστρωμα μπορεί να συμβάλει στην νεοπλασματικών φαινότυπο. Κανονικά, κυτταρική Src κρατιέται σε μια ανενεργή κατάσταση, αλλά σε αρκετούς τύπους καρκίνου, ανώμαλα γεγονότα οδηγούν σε αυξημένη δραστηριότητα κινάσης της πρωτεΐνης και να προκαλέσει πλειοτροπικές κυτταρικές αποκρίσεις που προκαλεί μετασχηματισμό και μετάσταση [27].

Όπως πρόοδο καρκινώματα, οι όγκοι μπορεί να χάσουν επιθηλιακή μορφολογία και να αποκτήσουν χαρακτηριστικά μεσεγχυματικών που συμβάλλουν στην μεταστατικό δυναμικό. Μια επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης (ΕΜΤ), μια κρίσιμη διαδικασία παρόμοια με τη διαδικασία της εμβρυϊκής ανάπτυξης, πιστεύεται ότι είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για την προώθηση της εισβολής του καρκίνου και μετάσταση [28]. Τα τελευταία χρόνια, η οικογένεια Zeb παραγόντων μεταγραφής δακτύλου ψευδαργύρου έχει τεκμηριωθεί ως βασικών παραγόντων της ΕΜΤ [29]. Η επιθηλιακή πρωτεΐνη προσκόλλησης, Ε-καδερίνης, είναι ένα ενεργό καταστολέας της εισβολής και ανάπτυξη πολλών επιθηλιακών καρκίνων, και ρύθμιση προς τα κάτω της θεωρείται ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του ΕΜΤ [30], [31]. E-cadherin είναι ένα σημαντικό γονίδιο στόχο της οικογένειας Zeb μεταγραφικοί καταστολείς. EMT-προκαλώντας μεσολαβητές, όπως TCF8, ενεργοποιούν τα επιθηλιακά αποδιαφοροποίηση αλλοιώνοντας την έκφραση /λειτουργία του E-cadherin [32]. Οι καταστολείς Ε-καδερίνης μπορεί να ρυθμίζει αναπτυξιακά προγράμματα μεταγραφική του ΕΜΤ σε κύτταρα όγκου τους προδιαθέτουν για εισβολή και μετάσταση [33]. Έτσι, μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν Zeb συνδέουν αυτούς τους παράγοντες σε κακοήθη πρόοδο του όγκου [29].

Η παρούσα μελέτη επικεντρώνεται στη διερεύνηση του ρόλου των 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D για PaCa πολλαπλασιασμό και την εισβολή. Τα δεδομένα μας δείχνει σημαντικές μειώσεις PaCa ανάπτυξη κυττάρων, εισβολή και συσχετίζεται κατάντη σηματοδότησης σε απόκριση προς τα κάτω ρύθμιση αυτών των υποδοχέων σεροτονίνης εκφράσεις, που υποδηλώνει την σημαντική συμμετοχή αυτών των υποδοχέων για την προώθηση του καρκίνου του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, τις συνθήκες καλλιέργειας και τα αντιδραστήρια

Οι ανθρώπινες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). PANC-1 και MIAPaCa-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα μέσα περιέχουν πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (100 μονάδες /ml). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2/95% αέρα, και χρησιμοποιήθηκαν μεταξύ των περασμάτων 4 και 15. Ανθρώπινα κύτταρα παγκρεατικών επιθηλιακών αγωγού (HPDE) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Kapil Mehta, Τμήμα πειραματική θεραπευτική, MD Anderson Κέντρο Καρκίνου, ως ένα γενναιόδωρο δώρο. κύτταρα HPDE διατηρήθηκαν σε κερατινοκυττάρων μέσο άνευ ορού (SFM κερατινοκύτταρα, 1Χ) που περιέχει L-γλουταμίνη, και συμπληρώθηκε με προεπιλεγέντες ανθρώπινο ανασυνδυασμένο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα 1-53 (EGF 1-53) και 25 mg /500 ml Εκχύλισμα υποφύσεως βοοειδών ( ΒΡΕ) (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA). ΝΡ-κΒ αναστολέας ενεργοποίησης II, JSH-23 (4-μεθυλο-Ν

1- (3-φαινυλοπροπυλο) βενζολο-1,2-διαμίνη) (EMD Millipore Billerica, ΜΑ), διαλύθηκε σε DMSO σε μια τελική απόθεμα συγκέντρωση 10 mM, και απευθείας προστέθηκε σε κυτταρικές καλλιέργειες σε 25 και 50 μΜ συγκεντρώσεις, οι οποίες αποκλείει εκλεκτικά πυρηνική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ ρ-65 και δραστικότητα της μεταγραφής του.

Οι επιμολύνσεις με siRNA

Εκθετικά αναπτυσσόμενα μη επεξεργασμένα κύτταρα PANC-1 και MIAPaCa-2 απλώθηκαν 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Plated κύτταρα επιμολύνθηκαν με δίκλωνο siRNA που στοχεύει το mRNA των σεροτονεργικών υποδοχέων (5-ΗΤ-1) υποτύπου -Β ή -D (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), ή επιμολυσμένα με τον έλεγχο (μη σίγηση) siRNA? (5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘) [34], [35] (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). siRNA που στοχεύει τρανσγλουταμινάσης ιστού (TG2) (Qiagen, Valencia, CA) χρησιμοποιήθηκαν επίσης [35]. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με siRNA, σε μια τελική συγκέντρωση 25-50 ηΜ για 72 ώρες, χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Επιμόλυνσης HiPerFect (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις των siRNAs επιλέχθηκαν με βάση τις μελέτες δόσης-απόκρισης. έλεγχος για μη σίγηση κύτταρα siRNA επιμολυσμένα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν /επεξεργασία για περαιτέρω ανάλυση και δοκιμασίες.

Κυτταρική βιωσιμότητα και δοκιμασίες πολλαπλασιασμού /ανάπτυξης

Η βιωσιμότητα και /ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία MTS (Promega, Madison, WI, USA), μετά την επεξεργασία των κυττάρων, για τη μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο και τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν με αποκλεισμό trypan blue. Τα βιώσιμα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (1,5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο), και επιμολυσμένα με ενδεικνυόμενη siRNAs. Μετά από 72 ώρες θεραπείας, ένα διάλυμα που περιέχει MTS (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυ-μεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο) και PMS ( φαιναζίνη) (20:01 ν /ν) προστέθηκε στα κύτταρα. Μετά από 2-3 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα βιώσιμα αναπτυσσόμενα κύτταρα εκτιμήθηκαν με παρακολούθηση της απορρόφησης του προϊόντος στα 490 nm, με βάση την παραγωγή φορμαζάνης μέσω ζωντανών κυττάρων. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως μέσος όρος απορρόφησης ± τυπική απόκλιση.

κλωνογονιδιακή επιβίωση

δοκιμασία

PaCa κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-πηγαδιών πλάκες (1.5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο), επιμολυσμένα με μη φίμωση ελέγχου siRNA, ή siRNA έναντι 5-ΗΤ

1Β ή 5-ΗΤ

1D (μία φορά /εβδομάδα), και αναπτύχθηκαν επί 2 εβδομάδες. Τα σχηματισθέντα-αποικίες κηλιδώθηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και οι περιοχές κατανομής αποικίες περιοχής μετρήθηκαν πυκνομετρικώς [36]. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως μέσος όρος απορρόφησης ± τυπική απόκλιση.

Matrigel εισβολή δοκιμασία

PaCa κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ υποδεικνύονται siRNAs, και 72 ώρες αργότερα, ίσο αριθμό των κατεργασμένων βιώσιμων κυττάρων (4 χ 10

4 κύτταρα), σπάρθηκαν πάνω σε επικαλυμμένα με Matrigel Transwells (με 8- φίλτρα μm μέγεθος πόρου) σε θαλάμους εισβολή Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν την κάτω πλευρά της μεμβράνης μετά από 24 ώρες προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων σε ένα ελάχιστο τεσσάρων τυχαία επιλεγμένων περιοχών. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως μέσος όρος των ποσοστών της εισβολής ± τυπική απόκλιση.

Μετανάστευση Δοκιμασία

In-vitro

χρησιμοποιήθηκε δοκιμασία επούλωσης τραύματος για την αξιολόγηση κυτταρικής κινητικότητας και την ικανότητα να μεταναστεύουν. κύτταρα PANC-1 επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (5 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει 10% FBS για να επιτευχθεί μια σχεδόν συρρέουσα μονοστοιβάδα κυττάρων. Μια γρατσουνιά έγινε στη συνέχεια προσεκτικά στο κυτταρικό στρώμα χρησιμοποιώντας μια 10 μι στείρου άκρο μικροπιπέττα, και κάθε κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνονται με πλύση με PBS για την απομάκρυνση επιπλέοντα κύτταρα. Οι τραυματίες μονοστιβάδες στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ υποδεικνύονται siRNAs. Αμέσως μετά τις αγωγές, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Nikon), για να καθοριστεί το πλάτος της πληγής σε χρόνο 0. Οι καλλιέργειες συνεχίστηκαν, και τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν πάλι μετά από 12 ώρες και μετά από 24 ώρες από τον τραυματισμό του κυττάρου στρώμα. Την επούλωση πληγών οπτικοποιήθηκε με σύγκριση φωτογραφίες που ελήφθησαν σε 0 h με αυτά που λαμβάνονται σε 12 ώρες και 24 ώρες αργότερα, και αναλύθηκαν για την απόσταση μετανάστευσαν από την προπορευόμενη ακμή του τραύματος σε κάθε χρονικό σημείο. Η απόσταση που διανύθηκε από τα κύτταρα προσδιορίστηκε με τη μέτρηση του πλάτους του τραύματος κατά το χρόνο 12 ώρες και 24 ώρες, και αφαιρώντας την από το πλάτος της πληγής σε χρόνο 0. Οι τιμές που λαμβάνονται στη συνέχεια εκφράστηκαν ως% μετανάστευση, τη ρύθμιση του πλάτους της σχισμής σε 0 h ως 100%. Τρία πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

Western blot ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 25 cm-

2 φιάλες καλλιέργειας (0.5 × 10

6 κύτταρα /φιάλη). Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές σε παγωμένο PBS και ολικού κυττάρου προϊόντα λύσης λήφθηκαν με αιώρηση των κυττάρων σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης στους 4 ° C. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 13,000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C, και το υπερκείμενο συλλέχθηκαν κλάσματα. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης για κάθε δείγμα προσδιορίστηκε με ένα συμβατό απορρυπαντικό κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης (Bio-Rad, Hercules, CA), και κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως 40 μg πρωτεΐνη /λωρίδα επί 4-15% SDS-PAGE πηκτή. Οι πρωτεΐνες ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και επωάστηκαν πρώτα με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα? ρ-Src (Tyr-416), Src, β1 ιντεγκρίνης, uPAR, ΜΜΡ-2, σαλιγκάρι, TCF8 /ZEB1, NF-κΒ (ρ-105 /ρ-50), και κλαουδίνης-1 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ)? p-ΡΑΚ (Tyr-397), ΡΑΚ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)? 5-ΗΤ

1Β (Sigma Chemical, St. Louis, ΜΟ)? TG2 και α-SMA (Abcam? Cambridge, ΜΑ)? Ινονεκτίνη και 5-ΗΤ

1D (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), και στη συνέχεια με υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη με αντι-κουνελιού ή δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). β-ακτίνης (Sigma Chemical, St. Louis, ΜΟ), ή α-β-τουμπουλίνη (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. Όλα τα αντισώματα αραιώθηκαν σε TBS-Tween 20 που περιείχε 5% ξηρό γάλα. Χημειοφωταύγειας ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με αντιδραστήρια ανίχνευσης Chemi-λάμψη (Άλφα Innotech, San Leandro, CA), και οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν με ένα απεικονιστή FluorChem 8900, και ποσοτικά με ένα πυκνόμετρο με τη χρήση του προγράμματος ανάλυσης εικόνας (ImageJ 1.48s λογισμικό επεξεργασίας, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Όλα τα πειράματα ανεξάρτητα επαναληφθεί τουλάχιστον δύο φορές.

συστοιχίες Αντίστροφη πρωτεΐνη φάση (RPPA)

Τα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα PANC-1 (0.5 × 10

6 κύτταρα /2 ml μέσου) σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων. Μετά από 72 ώρες επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και 150 μι του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης [1% Triton Χ-100, 50 mM Hepes (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA , 100 mM NaF, 10 mM Sod. πυροφωσφορικό, 1 mM Na

3νο

4 και 10% γλυκερίνη, που περιέχει πρωτεϊνάση και φωσφατάση αναστολείς (Roche Applied Science, Indianapolis)] προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και RPPA υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35].

απομόνωση RNA και ανάστροφη αλυσιδωτή αντίδραση τρανσκριπτάσης-πολυμεράσης (RT-PCR) ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από το συλλέγονται τα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA), και cDNA ελήφθη από 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Το cDNA για 5-ΗΤ

1Β, 5-ΗΤ

1D, β1 ιντεγκρίνη, TG2 και GAPDH ενισχύθηκαν με χρήση κιτ Platinum Taq DNA πολυμεράσης (Invitrogen /Life Technologies), με ειδικούς εκκινητές. Εν συντομία, 2 μΙ του συνολικού 20 μί μεταγραφεί αντίστροφα προϊόν χρησιμοποιήθηκαν για PCR σε 1 × ρυθμιστικό PCR που περιέχει 1.5 mM MgCl

2, 200 τριφωσφορικά μΜ δεοξυνουκλεοτιδίων (dNTPs), 1 μονάδα Platinum Taq πολυμεράσης και 0,2 μΜ κάθε ανέφερε εκκινητές (Integrated DNA Technologies, IDT), ή GAPDH-ειδικούς εκκινητές (Thermo Scientific). Οι αλληλουχίες της αίσθησης και αντι-νόημα 5-ΗΤ

1Β εκκινητές είναι 5′-TGCTGGTTATGCTATTGGCG-3 ‘? και 5’-GATGACACAGAGGTGCAGGATG-3 ‘, αντίστοιχα. Οι αλληλουχίες της αίσθησης και αντι-νόημα 5-ΗΤ

1D εκκινητές είναι 5′-TGCCGTGGTCCTTTCCGTC-3 ‘? και 5’-GGTGATGGTATAGGCGATGCTG-3 ‘, αντίστοιχα. Οι αλληλουχίες της αίσθησης και αντι-νόημα β1 ιντεγκρίνης εκκινητές είναι 5’-CCTACTTCTGCACGATGTGATG-3 ‘? και 5’-CCTTTGCTACGGTTGGTTACATT-3 ‘, αντίστοιχα. Οι αλληλουχίες των με νόημα και αντι-νόημα TG2 εκκινητές είναι 5’-TAAGAGATGCTGTGGAGGAG-3 ‘? και 5’-CGAGCCCTGGTAGATAAA-3 ‘, αντίστοιχα. Τα δείγματα cDNA επωάστηκαν στους 94 ° C (2-5 min.) Για να μετουσιωθεί το πρότυπο και την ενεργοποίηση του ενζύμου. Αυτό το στάδιο ακολουθήθηκε από 35 κύκλους ενίσχυσης PCR (όπως 94 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s και 72 ° C για 60 s με 5-ΗΤ

1Β εκκινητή? 94 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s και 72 ° C για 60 s με TG2 εκκινητή? 94 ° C για 30 s, 58 ° C για 45 s και 72 ° C για 60 s με 5-ΗΤ

1D και β1 ιντεγκρίνης εναύσματα, σε κάθε κύκλο). Η αντίδραση PCR τερματίσθηκε με ένα τελικό στάδιο επέκτασης 5 λεπτών. στους 72 ° C. Τα ενισχυμένα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,2% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο. Η σύνθεση cDNA επιβεβαιώθηκε με ανίχνευση της μεταγραφής GAPDH, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, και στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του μαθητή

t-test

, για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα. Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές και σημειώνονται με αστερίσκο.

Αποτελέσματα

5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

Οι υποδοχείς 1D υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα

Αυξημένη 5-υδροξυτρυπταμίνη βιοσυνθετικής ικανότητας καθώς και σοβαρή αλλαγές στα πρότυπα έκφρασης των υποδοχέων 5-ΗΤ, έχει προηγουμένως αναφερθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του μαστού [16]. Εδώ, αξιολογήσαμε την έκφραση της 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1Δ σε διαφορετικά κύτταρα PaCa καθώς επίσης και σε φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινων παγκρεατικών επιθηλιακών αγωγού (HPDE). Βρήκαμε ότι αυτοί οι υποδοχείς είναι επάνω-ρυθμίζονται σε όλα τα κύτταρα PaCa ελέγχθηκαν συγκρίνοντας με χαμηλή έκφραση του σε φυσιολογικό παγκρεατικό επιθήλιο (Εικ. 1Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι η δυσ-ρύθμιση αυτών των υποδοχέων μπορεί να προωθήσει σηματοδότησης εξέλιξη υπέρ των όγκων σε κύτταρα PaCa.

(Α) 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D είναι εντόνως εκφρασμένα σε αρκετές παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Κυτταρολύματα από αρκετές κυτταρικές σειρές PaCa και φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινων παγκρεατικών επιθηλιακών αγωγού (HPDE) υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western όπως υποδεικνύεται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β-Ο) 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D υποδοχέων επίπεδα έκφρασης σε PANC-1 (Β) και κύτταρα MIAPaCa-2 (C) μετά knockdown της έκφρασης υποδοχέων με αντίστοιχες siRNAs τους. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ υποδεικνύονται siRNAs, και 72 ώρες αργότερα, λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα ιστογράμματα δείχνουν τη σχετική ποσοτικοποίηση των επιπέδων των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. (D-E) έκφραση mRNA του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1Δ σε PANC-1 (D) και τα κύτταρα MIAPaCa-2 (Ε) μετά knockdown της έκφρασης υποδοχέων με αντίστοιχες siRNAs τους. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ υποδεικνύονται siRNAs, και 72 ώρες αργότερα, το συνολικό RNA εκχυλίζεται και τα επίπεδα μεταγραφής του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D προσδιορίστηκαν με πρότυπες RT-PCR, όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (F-G) siRNA μεσολάβηση 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D knockdown αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PaCa. PANC-1 (F) και κύτταρα MIAPaCa-2 (G) διαμολύνθηκαν με 50 ηΜ υποδεικνύονται siRNAs, και μετά από 72 ώρες, ο πολλαπλασιασμός ανιχνεύθηκε με μία δοκιμασία MTS. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt? Κύτταρα ελέγχου 0.05 vs.. Όλα τα πειράματα ανεξάρτητα εκτελείται τρεις φορές.

Η

Νοκ ντάουν της 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D έκφραση υποδοχέων αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό /βιωσιμότητα των κυττάρων PaCa

με στόχο να διερευνηθεί η εμπλοκή αυτών των υποδοχέων στον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη των κυττάρων PaCa. Προς το σκοπό αυτό, γκρέμισε την έκφραση του κάθε υπότυπο του υποδοχέα σε κύτταρα MIAPaCa-2 PANC-1 και, χρησιμοποιώντας ειδικά μικρά RNA παρεμβολής (siRNA). Παρά το γεγονός ότι κωδικοποιείται από δύο διακριτά γονίδια, το ανθρώπινο 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D είναι ιδιαίτερα παρόμοιες σε αλληλουχία [21]. Ως εκ τούτου, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β και C, 5-ΗΤ

θεραπείες 1Β siRNA οδήγησε σε σχετικά χαμηλότερη έκφραση του 5-ΗΤ επίπεδο

πρωτεΐνη 1D, με ένα παρόμοιο κατώτερο του 5-ΗΤ

επίπεδα πρωτεΐνης 1Β επαγόμενη από 5-ΗΤ

1D siRNA. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στο γεγονός ότι τόσο η 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D υποτύπους μοιράζονται μια ταυτότητα αλληλουχίας αμινοξέων υψηλή (~68% ομολογία αλληλουχίας αμινοξέων), έχουν παρόμοιες ιδιότητες σύνδεσης συνδετήρα και σχεδόν δυσδιάκριτες φαρμακολογικά [37]. θα μπορούσε να συμβεί τέτοια ομοιότητες επαγόμενη αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο τύπων υποδοχέα στο επίπεδο πρωτεΐνης μετά την έκφραση του γονιδίου (π.χ., κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης της πρωτεΐνης ή αναδίπλωση). Ως εκ τούτου, η ανίχνευση της έκφρασης υποδοχέων πρωτεΐνης με κηλίδωση Western δεν ήταν απόλυτα επαρκής για τη διάκριση αυτών των στενά σχετικών υποτύπων υποδοχέων για τη δημιουργία αντίστοιχων φυσιολογικών ενδιαφέρον τους. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, ώστε να διερευνηθούν οι βιολογικές επιδράσεις της στόχευσης κάθε υποτύπου ξεχωριστά, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση RT-PCR και εξέτασε την επίδραση των θεραπειών siRNA στα επίπεδα μεταγραφής του αντίστοιχου γονιδίου υπότυπο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν σαφώς ότι η 5-ΗΤ

1Β συγκεκριμένες siRNA και 5-ΗΤ

1D συγκεκριμένες siRNA επιβεβαιώθηκε ότι αναστέλλουν την έκφραση του αντίστοιχου mRNA χωρίς οποιαδήποτε σημαντική επίδραση από την άλλη σταυρό αναλόγου υποτύπου τόσο PANC-1 και MIAPaCa-2 κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 D και Ε). Είμαστε δίπλα ανέλυσε τον πολλαπλασιασμό μετά από 72 ώρες θεραπείας siRNA με δοκιμασία MTS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1F και G, τα αποτελέσματα μας απέδειξε ότι knockdown του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

έκφραση 1D ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δύο PANC-1 και MIAPaCa-2. Η συνδυασμένη ρύθμιση προς τα κάτω των δύο 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποτύπους 1D παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό περισσότερο από τα κάτω ρύθμιση είτε μόνα υποδοχέα (Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει τα βιολογικά οφέλη που παρέχονται από την ταυτόχρονη στόχευση δύο υποδοχείς.

Στόχευση 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D αναστέλλει τον κυτταρικό ικανότητας κλωνισμού των κυττάρων PaCa

Για να επαληθεύσετε περαιτέρω ο ρόλος των 5-ΗΤ-1 σεροτονινεργικά-υποδοχείς PaCa κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών, αξιολογήσαμε την κλωνογόνο ικανότητα των κυττάρων PaCa εξής knock-down του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D έκφραση υποδοχέων. Αυτή η δοκιμασία είναι ένα

in-vitro δοκιμασία

κυτταρικής επιβίωσης με βάση την ικανότητα ενός μόνο κυττάρου να αναπτυχθεί και να σχηματίσουν εστίες σε μια αποικία [36]. Knockdown του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1Δ, χρησιμοποιώντας ειδικά siRNAs τους, αναστέλλει σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων MIAPaCa-2 PANC-1 και να σχηματίσουν αποικίες (Σχ. 2Α και Β, αντίστοιχα). Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η 5-ΗΤ

1β- και 5-ΗΤ

1D μεσολάβηση σηματοδότηση εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό και κλωνογόνο ικανότητα των κυττάρων PaCa.

PANC-1 (Α) και κύτταρα MIAPaCa-2 (Β) επιμολύνθηκαν (μία φορά /εβδομάδα) με ενδεικνυόμενη siRNAs. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 14 ημέρες, οι αποικίες βάφτηκαν με τις περιοχές κατανομής αποικιών-περιοχή κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν πυκνομετρικώς στο τέλος των 14 ημερών. Τα ιστογράμματα δείχνουν τα ποσοστά των σχηματιζόμενων αποικιών, μετά από 14 ημέρες από την πρώτη διαμόλυνσης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος των ποσοστών σχηματισμού αποικίας ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt?. 0,05 έναντι κυττάρων ελέγχου

Η

Στόχευση 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D μειώνει κυτταρική εισβολή /μετανάστευση των κυττάρων PaCa

παγκρέατος πορογενές αδενοκαρκίνωμα χαρακτηρίζεται από ιδιαίτερα επεμβατική φαινότυπο και ισχυρή μεταστατική ικανότητα [38]. Επειδή η έκφραση των 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D υποδοχείς είναι αυξημένα στα κύτταρα PaCa, θα αξιολογήσει κατά πόσον οι υποδοχείς που εμπλέκονται στην προώθηση τέτοιων επεμβατική φαινότυπο. Ως εκ τούτου, γκρέμισε αυτούς τους υποδοχείς στα κύτταρα PANC-1 και-2 MIAPaCa από siRNAs και αξιολόγησε τις αλλαγές στην επεμβατική ικανότητα τους

in-vitro

δοκιμασία εισβολή χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμους Boyden. Αυτό μιμείται δοκιμασία η

in-vivo

διαδικασία εισβολής και μέτρα ο αριθμός των καρκινικών κυττάρων που διέρχεται από μια μήτρα βασικής μεμβράνης προς μέσα που περιέχουν χημειο-ελκυστικών [39]. Το πιο εντυπωσιακό εύρημα ήταν ότι knockdown του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D μείωσε σημαντικά την εισβολή των κυττάρων PANC-1 κατά περίπου 76% και 66%, αντίστοιχα (Σχ. 3Α), και μειωμένο η εισβολή των κυττάρων MIAPaCa-2 κατά περίπου 75% και 71%, αντίστοιχα (Σχ. 3Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε τη συμμετοχή των 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D στη μεσολάβηση PANC-1 κινητικότητα κυττάρου χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό μηδέν σε 12 ώρες και 24 ώρες χρόνος σημεία. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι η απόσταση που καλύπτεται από μεταναστεύοντα κύτταρα μειώθηκε σημαντικά όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 5-ΗΤ

1Β ή 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D siRNAs σύγκριση με τα κύτταρα που εκτίθενται σε μη φίμωση ελέγχου siRNA (Σχ. 3C ). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν μία συσχέτιση μεταξύ PaCa κύτταρο κινητική συμπεριφορά και 5-ΗΤ

έκφραση /1D 1Β. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D παίζουν ένα ρόλο στη μεσολάβηση PaCa κύτταρα μετανάστευση και εισβολή.

PANC-1 κύτταρα (Α) και MIAPaCa-2 κύτταρα (Β) διαμολύνθηκαν με 50 ηΜ υποδεικνύονται siRNAs (για 72 ώρες), και ίσο αριθμό των βιώσιμων κυττάρων σπάρθηκαν πάνω σε επικαλυμμένα με Matrigel φίλτρα Transwell σε θαλάμους εισβολή Matrigel. Ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μετά από 24 ώρες προσδιορίστηκε όπως στο πρωτόκολλο. Μεγέθυνσης, 100 ×. Τα ιστογράμματα δείχνουν την μέση τιμή των ποσοστών της εισβολής ± SD τριών πειραμάτων. * P & lt? Κύτταρα ελέγχου 0.05 vs.. (Γ) Η συμμετοχή της 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D στη ρύθμιση της PANC-1 κινητικότητα των κυττάρων, όπως αναλύθηκαν από την δοκιμασία επούλωσης της πληγής. Μια ενιαία αρχή έγινε στο κέντρο της συρροής μονοστιβάδας κυττάρων, και οι τραυματίες μονοστιβάδες επιμολυσμένα με υποδεικνύεται siRNAs. Η επισκευή πληγών παρακολουθήθηκε για 24 ώρες και οπτικοποιούνται με μικροσκόπιο με αρχική μεγέθυνση χ 100. Εικόνες ελήφθησαν αμέσως (0 ώρες), και μετά από 12 ώρες και 24 ώρες από ξύσιμο των καλλιεργειών. Το ιστόγραμμα δείχνει τα ποσοστά της μετανάστευσης κυττάρων, και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος των ποσοστών της μετανάστευσης ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων αναφέρεται (P & lt? 0,05).

Η

5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

Οι υποδοχείς 1D εμπλέκονται στη ρύθμιση της β1 ιντεγκρίνης έκφρασης σε PaCa κύτταρα

Αφού διαπίστωσε ότι η 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D είναι υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα PaCa, υποδηλώνουν σημαντικές μεταβολές σε αυξητικών κατάντη σηματοδότησης, ερευνήσαμε την επόμενη κάποιες κατάντη μοριακά από knockdown αυτών των υποδοχέων. Η οικογένεια ιντεγκρίνης trans-μεμβράνης υποδοχείς συνδέει την εξωκυτταρική μήτρα (ECM) με την ενδοκυτταρική κυτταροσκελετού της ακτίνης στα εστιακά σημεία αλληλεπίδρασης συμφύσεων. Εκτός από αυτό το δομικό ρόλο, ιντεγρίνη ομαδοποίησης μπορεί να κινήσει ενδοκυτταρικής σηματοδότησης γεγονότα που προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την επιβίωση και τη μετανάστευση σε αμφότερες κανονική και ογκογόνο περιβάλλοντα κυττάρου [40]. Από ιντεγκρίνης οικογένεια, β1-υπότυπος είναι γνωστό ότι επάγει Src και τη δραστηριότητα ΡΑΚ μέσω της πρόσληψης και ενεργοποίησης Src /FAK διπλή κινάση συγκρότημα [41]. Διότι, ρύθμιση προς τα κάτω του 5-ΗΤ

υποδοχείς 1Β /1ϋ καταστέλλει κύτταρα PaCa μετανάστευση /εισβολή (Εικ. 3), εξετάσαμε κατά πόσο αυτοί οι υποδοχείς ρυθμίζουν την έκφραση των β1 ιντεγκρίνης. Χρησιμοποιήσαμε κηλίδος Western και ανάλυση RT-PCR για να προσδιοριστεί η έκφραση της πρωτεΐνης β1 ιντεγκρίνης και τα επίπεδα mRNA, αντίστοιχα, μετά την φίμωση αυτούς τους υποδοχείς. Βρήκαμε ότι η 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D knockdown επάγουν σημαντικά προς τα κάτω ρύθμιση β1 έκφραση ιντεγρίνης τόσο σε πρωτεΐνη και το επίπεδο mRNA σε δύο κύτταρα PANC-1 και MIAPaCa-2 (Εικ. 4Α και Β).

(Α-Β) Η επίδραση των siRNAs μεσολάβηση 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D κάτω ρύθμιση για β1 ιντεγκρίνης /ECM-μεσολάβηση κατάντη σηματοδότησης σε PANC -1 (Α) και MIAPaCa-2 κύτταρα (Β). (Άνω πάνελ) κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ υποδεικνύονται siRNAs, και μετά από 72 ώρες, το ολικό RNA εκχυλίστηκε και τα επίπεδα μεταγραφής του 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

1D προσδιορίστηκαν με πρότυπες ΚΤ- PCR όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Κάτω πίνακας) κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ υποδεικνύονται siRNAs, και μετά από 72 ώρες, λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C-D) Η επίδραση της 5-ΗΤ

1Β και 5-ΗΤ

υποδοχείς 1D κάτω ρύθμιση σχετικά με τη διαδικασία EMT στην PANC-1 (C) και τα κύτταρα MIAPaCa-2 (D). Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.