Αφηρημένο

NRP1 ως πολυλειτουργικών μη-τυροσίνης κινάσης υποδοχέων παίζουν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του όγκου. Τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μια σημαντική κατηγορία διάχυτη γονίδια που εμπλέκονται σε μια ποικιλία βιολογικών λειτουργιών, ιδιαίτερα του καρκίνου. Παραμένει ασαφές εάν miRNAs να ρυθμίζουν την έκφραση των NRP1. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει miRNAs που θα μπορούσαν να αναστέλλουν την ανάπτυξη, την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του στομάχου με τη στόχευση της έκφρασης NRP1. Βρήκαμε ότι η έκφραση miR-338 μειώθηκε σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Επιπλέον, βρήκαμε ότι miR-338 ανέστειλε γαστρικού μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που προωθούνται με τη στόχευση της έκφρασης NRP1. Ως προς τα ανάντη ρυθμιστή της NRP1, miR-338 στοχεύει άμεσα NRP1. Η αναγκαστική έκφραση του miR-338 ανέστειλε την φωσφορυλίωση των ERK1 /2, p38 MAPK και Akt? Ωστόσο, η έκφραση της φωσφορυλιωμένη Erk1 /2, p38 MAPK και Akt αποκαταστάθηκε από την υπερέκφραση του NRP1. Σε AGS κύτταρα μολυσμένα με miR-338 ή επιμολυσμένα με SiNRP1, τα επίπεδα πρωτεΐνης φιμπρονεκτίνης, βιμεντίνη, Ν-cadherin και ΣΑΛΙΓΚΑΡΙΟΥ μειώθηκαν, αλλά η έκφραση της Ε-καδερίνης ήταν αυξημένη. Η έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών σε miR-338 κύτταρα που εκφράζουν αποκαταστάθηκε σε φυσιολογικά επίπεδα από την αποκατάσταση της έκφρασης NRP1.

In vivo

, miR-338 μείωσε επίσης την ανάπτυξη του όγκου και κατέστειλε D-MVA με στόχευση NRP1. Συνεπώς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι miR-338 δρα ως νέου ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε γαστρικό καρκίνο. miR-338 μπορεί να μειώσει τις μεταναστευτικές, επεμβατική, πολλαπλασιασμού και αποπτωτικών συμπεριφορές, καθώς και γαστρικό EMT του καρκίνου, με την εξασθένηση της έκφρασης του NRP1

Παράθεση:. Peng Υ, Liu ΥΜ, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) microRNA-338 αναστέλλει την ανάπτυξη, διήθηση και μετάσταση του καρκίνου του στομάχου με τη στόχευση Έκφραση NRP1. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10.1371 /journal.pone.0094422

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 18 Οκτ 2013? Αποδεκτές: 16 Μάρτη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 15, Απριλίου του 2014

Copyright: © 2014 Peng, et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από έργο της Επιτροπής Επιστήμης και Τεχνολογίας στην περιοχή Shapingba της Chongqing (201.302). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Neuropilins, συμπεριλαμβανομένων neuropilin1 (NRP1) και neuropilin2 (NRP2), είναι πολυλειτουργικό μη-τυροσίνης κινάσης υποδοχέων που εντοπίστηκε για πρώτη φορά με βάση κρίσιμους ρόλους τους στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα [1]. Nrp1 και Nrp2 έχουν 44% ομολογία και μοιράζονται πολλές δομικές και βιολογικές ιδιότητες. NRP1 υπάρχει κυρίως σε bloodvesselendothelia και NRP2 βρίσκεται κυρίως στα λεμφαγγεία [2], [3]. Μεταγενέστερες έρευνες που προσδιορίζονται ΕΠΜ-1 ως υποδοχέα για τον αγγειακό ενδοθηλιακό παράγοντα ανάπτυξης (VEGF) -Α ισομορφή VEGF-165 και στις δύο ενδοθηλιακά κύτταρα και ορισμένα κύτταρα όγκου [4], [5]. Η έρευνα έχει δείξει ότι NRP1 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε πολλούς τύπους όγκων και εκφράζεται σε διαφορετικά αγγειώσεις όγκων [3], [6], υποδηλώνοντας ότι NRP1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην πρόοδο του όγκου. Πρόωρη έρευνα αποκάλυψε ότι NRP1 θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ανάπτυξη όγκων, ως συν-υποδοχέα του VEGFR [5]. Οι επιστήμονες αργότερα διαπιστώθηκε ότι NRP1 θα μπορούσε να ενισχύσει tumorangiogenesis, την επιτάχυνση της ανάπτυξης των όγκων και της απόπτωσης συγκράτηση του όγκου χωρίς VEGFR [7]. NRP1 μπορεί να είναι ένα συν-υποδοχέα άλλων αυξητικών παραγόντων, η οποία αποσαφηνίζει γιατί VEGF μπορεί να σηματοδοτούν μέσω neuropilins απουσία VEGFR-1 ή VEGFR-2 [8], [9]. Ως συν-υποδοχέα του TβRI /TβRII, NRP1 μπορεί να περιορίσει την απόπτωση του όγκου και να επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου μέσω δύο κανονικών και μη κανονικών σηματοδότησης [10]. NRP1, ως συν-υποδοχέα του PDGFR /cMet, μπορεί να ενισχύσει tumorangiogenesis μέσω p38MAPK και ERK σηματοδότησης [11].

Όπως ανοδικά ρυθμιστικά γονίδια του NRP1, οι παράγοντες μεταγραφής SP1 /3 και ΑΡ1 μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση της NRP1 [ ,,,0],12]. Κάποιες έρευνες έχουν δείξει ότι το βουτυρικό καταστέλλει την έκφραση του νευροπιλίνη Ι σε κυτταρικές σειρές ορθοκολικού μέσω της αναστολής της Sp1 διενεργοποίησης [13].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA περίπου 21-23 νουκλεοτίδια σε μήκος το οποίο ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων στο επίπεδο μετα-μεταγραφικό [14], [15], [16]. έκφραση miRNA προφίλ αναλύσεις αποκάλυψαν μια συνολική ρύθμιση προς τα κάτω των επιπέδων ώριμου miRNA σε πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς [17], [18]. Έτσι, miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως καταστολείς των όγκων ή ογκογονίδια και απορυθμισμένη έκφραση των miRNAs θα μπορούσε να συμβάλει στην καρκινικών κυττάρων μετάσταση. Παραμένει ασαφές εάν miRNAs να ρυθμίζουν την έκφραση των NRP1? Ως εκ τούτου, έχουμε ως στόχο να καθορίσει τις miRNAs στόχος της NRP1. Πρόσθετες λειτουργίες του NRP1 μπορεί να ανακαλυφθεί από τη μελέτη των miRNAs στόχος της NRP1.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινο Ιστών Δείγματα και Κυτταρικές Σειρές

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε φρέσκα ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των 41 ανθρώπινο γαστρικό δείγματα καρκίνου και 24 δειγμάτων από παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο ιστών που προέρχονται από 41 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Β Ενταγμένο Νοσοκομείο του Chongqing Medical University μεταξύ 2012 και 2013. η μελέτη αυτή διεξήχθη σύμφωνα με τη «Βιοϊατρική έρευνα σε ανθρώπινα κριτική Δεοντολογίας (Αβέβαιος) «ρύθμιση του Υπουργείου Υγείας και η Διακήρυξη του Ελσίνκι σχετικά με τους κανόνες δεοντολογίας για την ιατρική έρευνα σε ανθρώπους. Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται με την ενημερωμένη συγκατάθεση των ασθενών και τα πειράματα έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Δευτέρου Ενταγμένο Νοσοκομείο του Chongqing Medical University. Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση για να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη

Η ΓΓΕ-7901, HGC-27, AGS, κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-45 και Ν87 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC?. Manassas, VA , ΗΠΑ), και η κυτταρική γραμμή GES-1 αγοράστηκε από το Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO2.

Αστάρια Απομόνωση RNA και miRNA Ανίχνευση

Οι εκκινητές για miR-338-3p και U6 παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ miScript Primer Δοκιμασία (Qiagen Ντίσελντορφ της Γερμανίας). Οι αλληλουχίες των miRNAs που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ως εξής: miR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG και U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Οι αντίστροφοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν επίσης στο στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής. Σύνολο miRNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα και τα δείγματα ανθρώπινου ιστού χρησιμοποιώντας RNAiso για τις μικρές RNA (Takara Bio, Otsu, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ουρές πολυ-Α προστέθηκαν σε miR-338 και U6 με την αντίδραση miRNA Buffer Mix (Takara Bio), και στη συνέχεια το cDNA συνετέθη από 5 ng του συνολικού RNA χρησιμοποιώντας το miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara Bio). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα CFX96 Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad) με SYBR πρόμιγμα Ex Taq II (Takara Bio). Οι συνθήκες PCR ήταν 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 30 s. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν ενάντια στην U6 snRNA. Μετά την ενίσχυση, μία ανάλυση καμπύλης τήξης διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί η εξειδίκευση των προϊόντων.

πλασμίδια έκφρασης pcDNA και πλασμίδιο Μορφομετατροπή

Η αλληλουχία ORF του NRP1 ενισχύθηκε από γονιδιωματικό DNA που απομονώθηκε από το κύτταρο AGS γραμμή, και η περιοχή ORF του cDNA NRP1 στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε εντός του φορέα GV230 (GeneChem Corporation, Σαγκάη, Κίνα) .Το πλασμίδιο επιμολύνθηκε σε AGS και τα κύτταρα ΜΚΝ45 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) .Twenty-τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, το κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για πείραμα διάσωσης. επιλεγμένα κύτταρα AGS που είχαν σταθερά επιμολυνθεί με NRP1 χρησιμοποιούσαν 2 μg /μλ πουρομυκίνης (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Γαλλία) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

miRNA γονιδίων Κλωνοποίηση και έκτοπη έκφραση

Η ανθρώπινο miR-338 γονίδιο ενισχύθηκε με PCR από φυσιολογικά γονιδιωματικό DNA και κλωνοποιείται σε ένα φορέα λεντοϊού. Οι φακοϊούς δημιουργήθηκαν με την συνδιαμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ293Τ με πλασμίδια pGC-LV, pHelper 1.0 και 2.0 pHelper χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Οι ιοί συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και οι μολύνσεις διεξήχθησαν με την παρουσία 2 mg /mL πολυβρένιο (GeneChem Corporation). Ελέγχου miRNA viruse αγοράστηκε από GeneChem Corporation (Σαγκάη, Κίνα). επιλεγμένα κύτταρα AGS που είχαν σταθερά μολυνθεί με miR-338 ήταν με τη χρήση 2 μg /μλ πουρομυκίνης (Invitrogen) 48 ώρες μετά τη μόλυνση.

Gene Expression νοκ ντάουν από την RNA-Παρεμβολές

NRP1 έκφραση από AGS κύτταρα σίγησε με επιμόλυνση τις ακόλουθες στοχευμένες αλληλουχίες siRNA (Sangon Biotech, Σαγκάη, Κίνα) με Lipofectamine 2000 (Invitrogen)? # 1: agatcgacgttagctccaa? # 2: aacacctagtggagtgata? # 3: CAATCACGTGCAGGCTCAA (όπου δεν διευκρινίζεται, χρησιμοποιήθηκε siRNA # 3). siRNAs Ελέγχου (sic) δημιουργήθηκαν με την εισαγωγή 4 υποκαταστάσεις βάσεων σε NRP1 αλληλουχία στόχευσης (GATAGGTCATGACTGCCC). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, η έκφραση NRP1 εξετάστηκε με ανοσοκηλίδωση.

Δοκιμασία λουσιφεράσης

Α Dual-Luciferase φορέα έκφρασης στόχου miRNA PsicheckTM-2 χρησιμοποιήθηκε για δοκιμασίες λουσιφεράσης 3’UTR (Sangon Biotech, Σαγκάη, Κίνα). Το ογκογονίδιο στόχος του miRNA-338 επιλέχθηκε με βάση την ηλεκτρονική στόχου microRNA https://www.microrna.org/microrna/home.do βάση δεδομένων. Οι αλληλουχίες εκκινητή για την 3 ‘UTR άγριου τύπου είχαν ως εξής: προς τα εμπρός: 5′-CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3′ και αντίστροφη 5’-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- ΤΤ-3 ‘. Επειδή υπάρχουν δύο θέσεις δέσμευσης στην NRP1 3’UTR, σχεδιάσαμε δύο αλληλουχίες εκκινητών για το μεταλλαγμένο 3’UTR. Για ένα μεταλλαγμένο 3’UTR, οι αλληλουχίες εναρκτήρα ήταν οι εξής: προς τα εμπρός: 5’-GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 ‘και αντίστροφος: 5′-GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3’. Για την άλλη μεταλλαγμένη 3’UTR, οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν ως εξής: προς τα εμπρός: 5′-GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 ‘και αντίστροφος: 5′-GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3’. Για τη δοκιμασία λουσιφεράσης, Lipofectamine 2000 χρησιμοποιήθηκε για να μορφομετατρέψει ΜΚΝ45 κυττάρων με το HSA-miR-338 και PsicheckTM-2 φορείς έκφρασης στόχου Dual-Luciferase miRNA που περιέχουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένες αλληλουχίες στόχου. Η δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) 18 ώρες μετά την επιμόλυνση και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν ενάντια λουσιφεράση της Renilla. Κάθε πλασμίδιο αναφοράς επιμολύνθηκε τουλάχιστον τρεις φορές (σε διαφορετικές ημέρες), και κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν.

Κυττάρων Η βιωσιμότητα και Clonability Δοκιμασίες

Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Ένα διάλυμα ΜΤΤ (20 μΙ 5 mg /ml ΜΤΤ) προστέθηκε στις καλλιέργειες (για συνολικό όγκο 200 υΙ) και επωάστηκαν για 4 καπέλο 37 ° C. Μετά την απομάκρυνση του μέσου καλλιέργειας, τα υπόλοιπα κρύσταλλοι διαλύθηκαν σε DMSO, και η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (1000 κύτταρα /πλάκα) και αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως ότου εμφανίστηκαν ορατές αποικίες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Giemsa, και οι αποικίες μετρήθηκαν.

Μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

Για τους προσδιορισμούς μετανάστευσης Transwell, 10 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο με ένα μη επικαλυμμένο μεμβράνη (24-φρεατίων ένθετο? 8 mm μέγεθος πόρου? BD Biosciences). Για τους προσδιορισμούς εισβολής, 2 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο με Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη (24-φρεατίων ένθετο? 8 mm Μέγεθος πόρου? BD Biosciences). Για αμφότερους τους προσδιορισμούς, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα μέσο χωρίς ορό, και ένα μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό στον κατώτερο θάλαμο. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 16 ώρες στους 37 ° C και 5% CO2 σε επωαστήρα καλλιέργειας ιστού. Μετά από 16 ώρες, τα μη μεταναστεύσαντα /μη-εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από τις άνω πλευρές των ένθετων φίλτρου μεμβράνης transwell χρησιμοποιώντας μπατονέτες μύτες. Οι μετανάστευσαν /εισέβαλαν κύτταρα στις κάτω πλευρές των ενθέτων βάφτηκαν με Giemsa, και τα κύτταρα μετρήθηκαν.

Αντισώματα

Αντισώματα έναντι ινονεκτίνης, βιμεντίνη, Ν-cadherin, E-cadherin, σαλιγκάρι και GAPDH αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Φωσφο-Erk1 /2, φωσφο-Akt, και φωσφο-p38MAPK αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, UK), και το σύνολο των Erk1 /2, Akt, και p38MAPK ήταν από BD Biosciences (USA). Ένα αντίσωμα έναντι NRP1 αγοράστηκε από R * P * P * P * P & lt?. 0.01

Η

miR-338 Μειώνει την ανάπτυξη όγκων και καταστέλλει D-MVA με στόχευση NRP1

In Vivo

Η

Με βάση τις παρατηρούμενες μειώσεις σε μεταναστευτικά, επεμβατική και πολλαπλασιαστικών συμπεριφορές σε AGS και ΜΚΝ45 κύτταρα μολυσμένα με LV-HSA-mir-338, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε ο ρόλος του miR-338 στην ανάπτυξη των in vivo. Εμείς υποδορίως γυμνά ποντίκια με ίσους αριθμούς (1 × 10

6 κύτταρα ανά ποντίκι) της AGS κύτταρα με την αναγκαστική έκφραση του miR-338 ή συν-miR, με ή χωρίς την αποκατάσταση NRP1. Tumor επίπτωση αξιολογήθηκε δύο φορές την εβδομάδα, και οι όγκοι εμφανίστηκαν σε όλα τα ποντίκια. έκφραση miR-338 στο γυμνά όγκους ποντικών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR, και βρήκαμε ότι miR-338 έκφραση αυξήθηκε σημαντικά στους όγκους που υπερεκφράζονται miR-338 (Σχήμα 6Α). Η αναγκαστική έκφραση του miR-338 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου in vivo, αλλά η υπερέκφραση NRP1 θα μπορούσε να αποκαταστήσει την ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 6Β). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση NRP1 στο γυμνά όγκους ποντικών με κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία. Βρήκαμε ότι η έκφραση NRP1 μειώθηκε σημαντικά στους όγκους που υπερεκφράζεται miR-338? Ωστόσο, η έκφραση NRP1 αποκαταστάθηκε στους όγκους που υπερεκφράζεται NRP1 (Σχήμα 6C, 4D). Έτσι, προκύπτει ότι το miR-338 ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου από τον περιορισμό της έκφρασης NRP1 in vivo. NRP1 μπορεί να ενισχύσει tumorangiogenesis? Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η αναγκαστική έκφραση του miR-338 θα αναστείλει tumorangiogenesis μέσω NPR1.