Αφηρημένο

Ιστορικό

Αν και μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε παγκόσμιο επίπεδο, οι μοριακοί μηχανισμοί που επιτρέπουν τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μετάστασης παραμένουν ασαφείς. Αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι μεταστατικά κύτταρα αναπτύσσουν με σφετερισμό της μεταγραφής δίκτυα από τα κύτταρα των εμβρυϊκών βλαστικών (ES) να διευκολύνει μια επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT), την εισβολή και τη μεταστατική εξέλιξη. Προηγούμενες μελέτες προσδιορίζονται HMGA1 ως βασικό παράγοντα μεταγραφής εμπλουτισμένο σε κύτταρα ES, ο καρκίνος του παχέος εντέρου, και άλλους επιθετικούς όγκους, αν και ο ρόλος του σε αυτές τις ρυθμίσεις είναι ελάχιστα κατανοητή.

Μέθοδοι /Κύρια Ευρήματα

Για να προσδιορίσετε πώς HMGA1 λειτουργίες σε μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου, εμείς χειραγωγείται

HMGA1

έκφραση σε διαγονιδιακά ποντίκια και καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Ανακαλύψαμε ότι HMGA1 οδηγεί πολλαπλασιαστικές αλλαγές, σχηματισμός μη-φυσιολογικών κρυπτών και εντερικών πολυποδίαση σε διαγονιδιακά ποντίκια. Σε κόλον καρκινικές κυτταρικές γραμμές από πενιχρά διαφοροποιημένο, μεταστατικούς όγκους, knock-down του μπλοκ HMGA1 την κυτταρική ανάπτυξη, μετανάστευση, εισβολή, ξενομόσχευμα ογκογένεσης και τρισδιάστατες colonosphere σχηματισμός αγκύρωσης-ανεξάρτητη. Αναστέλλοντας

HMGA1

μπλοκ έκφραση ογκογένεση στον περιορισμό αραιώσεις, σύμφωνα με την εξάντληση των καρκινικών κυττάρων-εκκινητή στα κύτταρα knock-down. Νοκ-κάτω της HMGA1 επίσης αναστέλλει τη μεταστατική εξέλιξη στο ήπαρ

in vivo

. Σε μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, HMGA1 επάγει την έκφραση του

Twist1

, ένα γονίδιο που εμπλέκεται στην εμβρυογένεση, ΕΜΤ και την εξέλιξη του όγκου, ενώ HMGA1 καταστέλλει

Ε-καδερίνης

, ένα γονίδιο που ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της EMT και τη μεταστατική εξέλιξη. Επιπλέον,

HMGA1

είναι από τις πιο εμπλουτισμένο γονιδίων στον καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι HMGA1 οδηγεί πολλαπλασιαστικές αλλαγές και σχηματισμός πολυπόδων στο έντερο των διαγονιδιακών ποντικών και επάγει τη μεταστατική εξέλιξη και ιδιότητες βλαστικών-όπως σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι HMGA1 είναι ένας ρυθμιστής κλειδί, τόσο στην μεταστατική εξέλιξη και στη διατήρηση μιας κατάστασης στέλεχος-όπως. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι HMGA1 ή προς τα κάτω μονοπάτια θα μπορούσε να είναι ορθολογική θεραπευτικοί στόχοι στη μεταστατική, ελάχιστα διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Belton Α, Gabrovsky Α, Bae YK, Reeves R, Iacobuzio-Donahue C, Huso DL, et al. (2012) HMGA1 Προκαλεί Εντερική πολυποδίαση σε διαγονιδιακά ποντίκια και οδηγεί την εξέλιξη του όγκου και ιδιότητες βλαστοκυττάρων στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 7 (1): e30034. doi: 10.1371 /journal.pone.0030034

Επιμέλεια: Wafik Σ El-Deiry, Penn State Hershey Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Ιουλ 2011? Αποδεκτές: 12 Δεκ 2011? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιαν 2012

Copyright: © 2012 Belton et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήρθε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) RO1CA092339 και R21CA2149550 με το Ν Resar, ΝΙΗ T32HL007525 σε Α Belton, και το Μέριλαντ Stem Cell Ταμείο Έρευνας για την L. Resar και Α Belton. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά την πρόσφατη πρόοδο στην παχέος εντέρου και τη θεραπεία του καρκίνου, μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου παραμένει η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1] – [2]. Οι μοριακοί μηχανισμοί που επιτρέπουν τα καρκινικά κύτταρα να κάνουν μετάσταση είναι ελάχιστα κατανοητές, αν και οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι μεταγραφική δίκτυα που απαιτούνται για τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης είναι συνεπιλεγέντος διάρκεια μεταστατική εξέλιξη [3] – [4]. Πρόσφατες μελέτες που προσδιορίζονται HMGA1 ως βασικό παράγοντα μεταγραφής εμπλουτισμένο σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ES) [3], αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα [5] – [8], πυρίμαχα λευχαιμία [6] – [7], [9] και υψηλής ποιότητας /χαμηλής διαφοροποίησης καρκίνους από το στήθος, τον εγκέφαλο, και της ουροδόχου κύστης [3]. Επιπλέον, οι όγκοι υπερεκφράζουν

HMGA1

και οκτώ άλλα γονίδια παράγοντα μεταγραφής ES είχαν μειωμένη επιβίωση, υπογραμμίζοντας τη σημασία αυτών των γονιδίων στην πρόοδο του όγκου [3]. Πιο πρόσφατα, βρήκαμε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης HMGA1 συσχετίζονται με κακή κατάσταση διαφοροποίησης και μειωμένη επιβίωση στον καρκίνο του παγκρέατος, περαιτέρω εμπλέκουν HMGA1 σε μια αδιαφοροποίητη, τα βλαστικά κατάσταση όμοια και την εξέλιξη του όγκου [10]. Η

HMGA1

γονίδιο κωδικοποιεί τα χρωματίνης αναδιαμόρφωση πρωτεΐνες HMGA1a και HMGA1b, που λειτουργούν για να ρυθμίζουν έκφραση γονιδίου με μεταβολή δομής της χρωματίνης και συναρμολόγηση συμπλοκών παράγοντα μεταγραφής σε συγκεκριμένους προαγωγείς [11] – [18]. Προηγούμενες μελέτες αποδεικνύουν ότι HMGA1 επάγει ογκογόνο ιδιότητες σε καλλιεργημένα κύτταρα [19] – [27] και προκαλεί επιθετικούς όγκους σε διαγονιδιακά ποντίκια [9], [28] – [32]. Οι ακριβείς μοριακές οδοί ρυθμίζεται από HMGA1 στο μετασχηματισμό, όμως, μόλις τώρα αρχίζουν να αναδύονται και μελέτες για τη διαλεύκανση HMGA1 μεταγραφικά δίκτυα είναι πιθανό να αποκαλύψει θεμελιώδη οδών που εμπλέκονται στην εξέλιξη και την ανάπτυξη των όγκων.

Εδώ, αναφέρουμε για πρώτη φορά που ο HMGA1 οδηγεί πολλαπλασιαστική αλλαγές και σχηματισμό πολυπόδων στο έντερο των διαγονιδιακών ποντικών και κατευθύνει μοριακών οδών σημαντική στην πρόοδο του όγκου και ιδιότητες βλαστοκυττάρων σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι

HMGA1

προωθεί την εξέλιξη του όγκου στον καρκίνο του παχέος εντέρου με τον επαναπρογραμματισμό του παχέος επιθήλιο σε μια κατάσταση στέλεχος-όπως.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την επιτροπή του Πανεπιστημίου Johns Hopkins των ζώων Φροντίδα και Χρήση (πρωτόκολλο # MO08M263). Όλα τα ποντίκια που στεγάζεται σε ένα αποστειρωμένο περιβάλλον, όπου είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό όπως περιγράφεται στο θεσμικό οδηγίες μας.

Ποσοτική μεταγραφή-PCR (qRT-PCR) ανάλυση αντίστροφη.

RNA ήταν που παρασκευάζεται όπως περιγράψαμε [9], [27]. Οι εκκινητές για

HMGA1

[28],

Twist

,

βιμεντίνης

,

E-cadherin

,

FOXC2

,

Snail1

,

Slug

,

TCF-3

,

Twist1

,

Twist2

,

SFH1B

) ήταν προηγουμένως αναφερθεί [4].

GAPDH

εκκινητές είναι εμπορικώς διαθέσιμα (Applied Biosystems). Αντιδράσεις qRT-PCR έγιναν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον μία φορά

ανάλυση Western

Western αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράψαμε [9], [19] -.. [20], [33 ] χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα εμπορική HMGA1 (Abcam, κατάλογος # AB4078) αραιωμένο 1:1000 και β-ακτίνης (Cell Signaling, κατάλογος # 4967) αραιωμένο 1:1000 σαν ενδογενές ελέγχου.

Κυτταρικές σειρές.

HCT116 (CCL-247? American Type Culture Collection) και SW480 (CCL-228? American Type Culture Collection) καλλιεργήθηκαν όπως συνιστάται. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν σε πουρομυκίνη (3 μg /ml)

καμπύλες ανάπτυξης

Κινητή ρυθμούς ανάπτυξης προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] -.. [20], [26] – [ ,,,0],29], [33]

Anchorage-ανεξάρτητη κυτταρική ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ δοκιμασίες, τη μετανάστευση, και εισβολή

Αυτές οι δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράψαμε [19] -.. [20], [ ,,,0],26] – [28], εκτός του ότι η δοκιμασία μετανάστευσης έγινε με 60000 κύτταρα /φρεάτιο και δοκιμασίες εισβολή έγιναν με 20 μΙ αυξητικού παράγοντα μειωμένη matrigel

δοκιμασία Colonosphere

Colonosphere δοκιμασίες.. διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34].

In vivo

δοκιμασία μετάστασης.

Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [35] με κύτταρα (10

5 ) εγχέεται ανά ποντικό (NOD /Shi-

scid

/IL-2Rγ

null?.. Jackson Laboratory)

ξενομοσχεύματος ογκογενετικότητας

οι μελέτες αυτές έγιναν σε nude (NU – /-) ποντίκια όπως περιγράφεται [19] -.. [20]

Φορείς

η μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) πλασμίδιο παρέμβαση για

HMGA1

έχει έχουν περιγραφεί [36]. Το κενό φορέα shRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση.

Τομές ιστού (πάχους 4 μm) από λεπτό και παχύ έντερο των διαγονιδιακών και ελέγχου ποντικοί δημιουργήθηκαν και αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και έπειτα ενυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αλκοόλη. Heat-επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου διεξήχθη σε ένα αυτόκλειστο για 10 λεπτό σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0). Η ενδογενής δραστηριότητα υπεροξειδάσης απενεργοποιήθηκε με επώαση των τμημάτων σε 4% Η

2O

2 για 5 λεπτά. Μετά το ξέπλυμα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, οι τομές επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντι-Ki-67 αντίσωμα (κλώνος 30-9, Ventana, Tucson, ΑΖ, κατάλογος # 790-4286) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Θετική χρώση οπτικοποιήθηκε με το κιτ ανίχνευσης DAKO EnVision Plus-HRP (DAKO, Carpinteria, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ki-67 θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε 5 τυχαία επιλεγμένα πεδία από συγκρίσιμες περιοχές στο λεπτό και το παχύ έντερο από διαγονιδιακά ποντίκια και ελέγχου σε 20 × μεγέθυνση. Συνολικά 100 κρυπτών για κάθε ποντικό μετρήθηκαν από χρωματισμένες τομές από διαγονιδιακά και έλεγχο ποντίκια (2 ποντίκια /ομάδα).

Κυττάρων μορφολογία και το μέγεθος προσδιορισμών.

Τα κύτταρα απλώθηκαν και αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως 80% συρροή. Φωτογραφίες για μετρήσεις αξιολόγηση των μορφολογικών και διάμετρο ελήφθησαν με τη χρήση της Zeiss Ανεστραμμένη M-πεδίο με την Olympus DP72 κάμερας και λογισμικού (JHMI Ομοεστιακή Διευκόλυνσης). Τουλάχιστον πέντε τυχαία πεδία φωτογραφήθηκαν για κάθε κυτταρική σειρά με ή χωρίς HMGA1 knock-down. Η μεγαλύτερη διάμετρος (μm) μετρήθηκε για 700-1000 κύτταρα από κάθε ομάδα. Οι μεγαλύτερες διάμετροι αντιπροσωπεύθηκαν ως η μέση τιμή ± την τυπική απόκλιση? σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test του φοιτητή.

Αποτελέσματα

HMGA1a

διαγονιδιακά αναπτύξουν πολύποδες και επέκταση στο χώρο των βλαστικών κυττάρων

Για να καθορίσει το ρόλο του HMGA1 στην ογκογένεση, έχουμε μηχανικής διαγονιδιακά ποντίκια με ποντικού

hmga1a

διαγονιδίου οδηγείται από τον ενισχυτή Η2Κ προαγωγό και mu ανοσοσφαιρίνης [9], [27] – [29]. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, όλα τα ποντίκια να υποκύψει σε επιθετική λεμφικών κακοηθειών [9] και οι γυναίκες αναπτύσσουν σαρκώματα της μήτρας [28] – [29]. Για να προσδιορίσετε αν HMGA1 προωθεί νεοπλασματικό μετασχηματισμό στο εντερικό επιθήλιο, ερευνήσαμε τα έντερα από αυτά τα ποντίκια. Το διαγονίδιο εκφράζεται στα μικρά και μεγάλα έντερα από 4 έως 7 φορές πάνω από αυτή που βρέθηκε σε ελέγχους (Εικ. S1). Κατά την νεκροψία, τα έντερα είναι υπεραιμίας με ένα διογκωμένο βλεννογόνο και αυξημένο βάρος σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 1Α-D). Ιστολογικά, μεγάλων και μικρών έντερα εμφανίζουν σημαντικές πολλαπλασιαστικές αλλαγές, έκτοπο σχηματισμό κρύπτη, και ο σχηματισμός πολύποδα (Σχ. 1C-D). Υπήρξε μια σημαντική αύξηση στην Ki-67 τόσο στο λεπτό και παχύ έντερο, ένας δείκτης του πολλαπλασιασμού (Σχ. 2Α-Β). Η αύξηση του αριθμού κρύπτη υποδηλώνει ότι αυτοί οι ποντικοί θα μπορούσαν να έχουν επέκταση του διαμερίσματος εντερικού βλαστικών κυττάρων [37].

(Α) Η

HMGA1

διαγονιδιακά έντερα είναι υπεραιμίας με αυξημένο βάρος σε σύγκριση με τους ελέγχους ( η = 7 για κάθε ομάδα?. ρ = 0,000000138 από t-test του Student) (Β) αριθμός πολύποδας στα διαγονιδιακά και τους ελέγχους (η = 7 για κάθε ομάδα? p = 0,000426 με t-test του Student). Τα εντερικά spreads (δεξιά πάνελ) βάφονται με 1,5% μπλε του μεθυλενίου για να τονίσουν πολύποδες για την καταμέτρηση. (Γ) χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης του λεπτού και του παχέως εντέρου δείχνει σημειώνονται πολλαπλασιαστικές αλλαγές στα διαγονιδιακά (bar = 50 μm). (D) Επέκταση της πολλαπλασιαστικής ζώνης με αποτέλεσμα μια διάχυτη υπερπλαστική εμφάνιση του βλεννογόνου και cystically διεσταλμένες κρύπτες στα διαγονιδιακά. Το υψηλότερο θέα δύναμη του μικρού εντερικού βλεννογόνου δείχνει σχηματισμό της έκτοπης κρύπτη εστιών (βέλη).

Η

(Α) Ki-67 χρώση των μικρών και μεγάλων έντερα από

HMGA1

διαγονιδιακά ( κάτω πάνελ) και ποντίκια ελέγχου (επάνω πάνελ) δείχνουν μια σημαντική αύξηση της Ki-67 ανοσοαντιδραστικότητα στο

HMGA1

διαγονιδιακά (20 × μεγέθυνση). (Β) Ki-67 θετικών κυττάρων σε

HMGA1

διαγονιδιακών και ελέγχου ποντικοί που απαριθμούνται στο κρύπτες του λεπτού και του παχέως εντέρου στους 20 × μεγέθυνση. Η μέση ± τις τυπικές αποκλίσεις του Ki-67 θετικά κύτταρα ανά κρύπτη για 100 κρύπτες για κάθε ζεύγος των ποντικών σε κάθε τοποθεσία εμφανίζονται. Πολύ σημαντικές διαφορές καταδείχθηκαν μεταξύ διαγονιδιακών και των ελέγχων τόσο στις λεπτού και παχέος εντέρου (ρ & lt? 0,00001, t-test του Student) (C)

HMGA1

έκφραση αξιολογήθηκε με qRT-PCR και η αυξημένη στον πρωτογενή, υψηλή βαθμός (βαθμού 3-4) αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου σε σύγκριση με παρακείμενες, φυσιολογικό κολονικό ιστό.

β-ακτίνης

χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο για τη φόρτωση και η κανονική ιστός arbritrarily ανατεθεί μια τιμή 1,0. (D) ανάλυση κηλίδας Western για HMGA1 και ελέγχου πρωτεΐνη (GAPDH) διεξήχθη σε 3 όγκους με επαρκές δείγμα και έδειξε αύξηση της πρωτεΐνης HMGA1 με μειούμενη διαφοροποίηση και την αύξηση της ικανότητας εισβολής ή μετάστασης ειλικρινής. Ο βαθμός, το καθεστώς της διαφοροποίησης, εισβολής, και η παρουσία της μεταστατικής νόσου υποδεικνύονται.

Η

HMGA1

είναι εμπλουτισμένο σε ανθρώπινα καρκινώματα του παχέος εντέρου

Τα υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης HMGA1 ή mRNA αναφέρθηκαν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου ή πρωτογενών όγκων σε μία μικρή πιλοτική μελέτη [38]. Για να προσδιοριστεί εάν

HMGA1

υπερεκφράζεται σε μεγαλύτερες μελέτες των πρωτογενών καρκίνων του παχέος εντέρου, που αμφισβήτησε την ανάλυση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης των πρωτογενών καρκίνων του παχέος εντέρου από έξι ανεξάρτητες μελέτες μέσω της Oncomine ™ δημόσια βάση δεδομένων (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). Βρήκαμε ότι

HMGA1

είναι πολύ εμπλουτισμένο σε αδενοκαρκίνωμα του κόλου σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό σε 5/5 προηγούμενες μελέτες. Σε όλες αυτές τις μελέτες, HMGA1 ήταν μεταξύ των κορυφαίων 10% εμπλουτισμένο γονιδίων, και σε 4 μελέτες, ήταν μεταξύ των κορυφαίων 1-3% του εμπλουτισμένου γονιδίων. Σε μια πιλοτική 10 πρωτοβάθμια, υψηλής ποιότητας (βαθμού III-IV) καρκίνων του παχέος εντέρου (ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Bert Vogelstein), βρήκαμε ότι η έκφραση HMGA1 αυξήθηκε στα περισσότερα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου (8/11) σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από στον ίδιο ασθενή. Επιπλέον, η μέση HMGA1 έκφραση από όλους τους όγκους αυξήθηκε κατά 3 φορές σε σύγκριση με τον παρακείμενο ιστό ελέγχου (Σχ. 2C). Εκτιμήσαμε επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης σε ένα υποσύνολο των πρωτογενών όγκων του παχέος εντέρου με επαρκές υλικό και βρήκε τα υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης HMGA1 στην υψηλής ποιότητας, μεταστατικούς όγκους με μη ανιχνεύσιμα επίπεδα στο διπλανό φυσιολογικό ιστό (Σχ. 2D).

HMGA1 απαιτείται για ανάπτυξη ανεξάρτητη από προσκόλληση κυττάρου, μετανάστευση, εισβολή, και ογκογένεση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

για να διερευνηθεί ο λειτουργικός ρόλος του HMGA1 στον καρκίνο του παχέος εντέρου, εμείς ανέστειλε

HMGA1

έκφραση σε δύο άνω και κάτω τελεία καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από φτωχά διαφοροποιημένα (βαθμός 4), μεταστατικούς καρκίνους του παχέος εντέρου (HCT116 και SW480) χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση shRNA. Η επιμόλυνση των κυττάρων με ένα

HMGA1

διάνυσμα shRNA είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική, σταθερή μείωση στην πρωτεΐνη HMGA1 (Εικ. 3Α) στα κύτταρα shRNA σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου. Βρήκαμε ότι knock-down του HMGA1 μπλοκαριστεί ανεξάρτητη από προσκόλληση κυτταρική ανάπτυξη ή σχηματισμός εστιών σε μαλακό άγαρ, μετανάστευση, και εισβολή στις δύο HCT116 και SW480 κύτταρα (Σχ. 3Β-C). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν όγκοι που σχηματίζονται σε γυμνούς ποντικούς μετά από ένεση των κυττάρων HCT116 με HMGA1 knock-down (10

5 ή 10

4 κύτταρα), ενώ οι όγκοι που σχηματίζονται από τα κύτταρα επιμολυσμένα με φορείς ελέγχου (Σχ. 3D). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά σε ρυθμούς ανάπτυξης στις κυτταρικές γραμμές με ή χωρίς HMGA1 knock-down

in vitro

(Εικ. S2), υποδεικνύοντας ότι ο

HMGA1

shRNA δεν ήταν τοξικό για το κόλον τα καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι HMGA1 οδηγεί κυτταρική ιδιότητες που απαιτούνται για τόσο στην έναρξη του όγκου (κυτταρική ανάπτυξη αγκύρωση ανεξάρτητη, ογκογένεση) και την εξέλιξη του όγκου (μετανάστευση, εισβολή).

(Α) Επιμόλυνση με ένα knockdown φορέα shRNA για

HMGA1

σε εξαιρετικά επιθετική, ελάχιστα διαφοροποιημένη ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου (HCT116 και SW480) οδηγεί σε σημαντική μείωση της πρωτεΐνης HMGA1. (Β) τη μετανάστευση και την εισβολή αξιολογήθηκαν σε έλεγχο (σκούρα μπάρες) και HMGA1 knock-down (ανοιχτό μπαρ) καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (HCT116 και SW480). Η γραφική παράσταση δείχνει τη μέση ± την τυπική απόκλιση από 2 πειράματα γίνονται εις τριπλούν. (Οι ρ-τιμές προσδιορίζονται με t-tests σπουδαστή φαίνεται). (C) Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων σε μαλακό άγαρ σε έλεγχο (σκούρα μπάρες) και HMGA1 knock-down (ανοιχτό μπαρ) καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (HCT116 και SW480). Όλα εστίες & gt? Μετρήθηκαν 50 μm. Το ραβδόγραμμα παρουσιάζει τη μέση ± την τυπική απόκλιση από δύο πειράματα γίνονται εις τριπλούν. (Οι ρ-τιμές προσδιορίζονται με t-tests σπουδαστή φαίνεται). (Δ) Ο πίνακας δείχνει ότι knock-down του σχηματισμού μπλοκ HMGA1 όγκου στον περιορισμό αραιώσεις. Η φωτογραφία δείχνει εκπρόσωπος άτριχων ποντικών 4 εβδομάδες μετά την ένεση με τον έλεγχο ή HMGA1 knock-down σε κύτταρα HCT116 (10

5 /ένεση). Δεν όγκοι που σχηματίζονται στα κύτταρα knock-down HMGA1.

Η

HMGA1 εξαρτώμενη από τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Επειδή

HMGA1

είναι εμπλουτισμένο με βλαστικά κύτταρα [ ,,,0],5] – [8] και προκαλεί αλλαγές στο έντερο ποντικού που θα μπορούσε να είναι συνεπής με την επέκταση στο διαμέρισμα εντερικό βλαστοκυττάρων, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί εάν

HMGA1

εμπλέκεται στις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε σχηματισμός τρισδιάστατου colonosphere στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, με ή χωρίς knock-down του HMGA1. Ανακαλύψαμε μια σημαντική μείωση του αριθμού των colonospheres τόσο στο HCT116 και SW460 κυττάρων με HMGA1 knock-κάτω σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 4Α). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι HMGA1 είναι αναγκαίες για το βλαστοκυττάρων φαινότυπο (τρισδιάστατη ανάπτυξη) σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Περιορίζοντας τα πειράματα ογκογενετικότητας αραίωση, knock-down της HMGA1 μπλοκάρει το σχηματισμό όγκων, όταν χορηγήθηκαν με ένεση 104 ή 105 κύτταρα, ενώ όγκοι που σχηματίζονται στα κύτταρα ελέγχου. Οι όγκοι που σχηματίζονται τόσο τον έλεγχο και knock-down ομάδες, αν 106 κύτταρα εγχέονται (Σχήμα 3D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι knock-down του HMGA1 μειώνει τα καρκινικά κύτταρα-εκκινητή.

(Α) Τρισδιάστατο colonosphere σχηματισμός στον έλεγχο (σκοτεινές ράβδοι) και HMGA1 knock-down (ανοικτές ράβδοι) καρκινικά κύτταρα κόλου (HCT116 και SW480). Σφαίρες μετρήθηκαν μετά από 10 ημέρες. Η γραφική παράσταση δείχνει τη μέση ± την τυπική απόκλιση από 3 πειράματα γίνονται εις τριπλούν. (Οι ρ-τιμές προσδιορίζονται με t-tests σπουδαστή φαίνεται). (Β) μεταστατικές εστίες στο ήπαρ μετρήθηκαν 5 εβδομάδες μετά την ένεση του ελέγχου (σκοτεινές ράβδοι) ή HMGA1 knock-down (ανοικτές ράβδοι) κύτταρα HCT116 (1 × 10

5) στις σπλήνες γυμνών ποντικών. Το ραβδόγραμμα παρουσιάζει τη μέση ± την τυπική απόκλιση του μεταστατικών εστιών από δύο πειράματα γίνονται εις τριπλούν. Οι ποντικοί εγχύθηκαν με κύτταρα ελέγχου (μαύρη μπάρα) συγκρίθηκαν με ποντικούς που ενέθηκαν με knock-down κύτταρα HMGA1 (ανοιχτές ράβδοι? Ρ-τιμές προσδιορίζονται με t-tests σπουδαστή δείχνονται). (C) Μικτό φωτογραφίες των μεταστατικών εστιών στο ήπαρ μετά την ένεση των κυττάρων HCT116 στις σπλήνες των ποντικών Jude. Το αριστερό ήπαρ έχει ληφθεί από ένα αντιπροσωπευτικό ποντίκι ενίεται με κύτταρα ελέγχου? το δικαίωμα του ήπατος έχει ληφθεί από έναν αντιπρόσωπο του ποντικιού ένεση με κύτταρα knock-down HMGA1. Οι φωτογραφίες απεικονίζουν εκπρόσωπος συκώτια από ποντίκια που έλαβαν τον έλεγχο ή

HMGA1

knock-down κύτταρα. (Δ) Η ιστολογική εξέταση του ήπατος επιβεβαίωσε ότι οι μεταστατικές εστίες αυξήθηκε σημαντικά από τις σπλήνες ένεση με τα κύτταρα ελέγχου σε σύγκριση με knock-down κύτταρα HMGA1 (Bar = 100 μm).

Η

HMGA1 απαιτείται για μεταστατική εξέλιξη σε καρκίνο του παχέος εντέρου

για να προσδιορίσετε αν HMGA1 απαιτείται για την εξέλιξη του όγκου, χρησιμοποιήσαμε ένα προκλινικό μοντέλο για τη μεταστατική εξέλιξη σε καρκίνο του παχέος εντέρου [35]. HCT116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου εγχύθηκαν απευθείας στα σπλήνες ποντικών με ανοσοανεπάρκεια και ηπατικές μεταστάσεις εκτιμήθηκαν μετά από 5 εβδομάδες. Εντυπωσιακά, βρήκαμε μία αξιοσημείωτη μείωση στην μεταστατικές εστίες στα ήπατα από ποντικούς που ενέθηκαν με κύτταρα HMGA1 knock-down (Σχ. 4Β-C). Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τον κρίσιμο ρόλο της HMGA1 στη μεταστατική εξέλιξη σε αυτό το μοντέλο.

HMGA1 επάγει την έκφραση των γονιδίων EMT

Twist1

και

βιμεντίνης

Η

Επειδή πρόσφατες μελέτες συνδέουν EMT σε επιθηλιακά βλαστικά ιδιότητες των κυττάρων [3] – [4], επιδιώξαμε να καθορίσει εάν HMGA1 ρυθμίζει γονίδια EMT στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Για το σκοπό αυτό, εκτιμήσαμε τα επίπεδα έκφρασης της 11ης γονιδίων προηγουμένως δείξει ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ΕΜΤ και κύτταρα καρκίνου του εκκινητή [4]. Στα κύτταρα HCT116, βρήκαμε ότι και οι δύο

Twist1

και

βιμεντίνης

ήταν σημαντικά κατασταλεί σε κύτταρα με HMGA1 knock-down (Εικ. 5Α), υποδεικνύοντας ότι HMGA1 επάγει την έκφρασή τους. Σε κύτταρα SW480,

E-cadherin

είναι επάνω ρυθμισμένη στα κύτταρα knock-down, γεγονός που υποδηλώνει ότι HMGA1 καταστέλλει κανονικά έκφραση του (Εικ. 5Β).

Twist1

επίσης καταστέλλεται σημαντικά στα κύτταρα knock-down SW480, αν και λιγότερο από ό, τι παρατηρήθηκε στα κύτταρα HCT116. Στο σύνολό τους, οι μελέτες μας δείχνουν ότι HMGA1 προωθεί την εξέλιξη του όγκου μέσω μεταγραφικής δίκτυα που διευκολύνουν τη μεταστατική εξέλιξη και μια κατάσταση στέλεχος-όπως, τουλάχιστον εν μέρει, από την πρόκληση του

Twist1

και

βιμεντίνης

, ενώ καταστολή

E-cadherin

. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπήρχαν αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία ή το μέγεθος στα κύτταρα knock-down (Εικ. S3), υποδηλώνοντας ότι η προς τα κάτω ρύθμιση HMGA1 σε αυτά τα κύτταρα δεν είναι επαρκής για να επάγει μορφολογικές αλλαγές που συμφωνούν με μια αναστροφή προς μία περισσότερο επιθηλιακά κατάσταση όταν αναπτύσσονται ως μονοστοιβάδα. Όπως σημειώθηκε προηγουμένως, υπήρχαν σημαντικές αλλαγές στα χαρακτηριστικά της ανάπτυξης όταν καλλιεργούνται σε ένα ανεξάρτητο από αγκύρωση τρόπο ή μετά από την εμφύτευση σε ποντικούς. Η διακύμανση στα γονίδια που ρυθμίζονται από ΕΜΤ HMGA1 σε αυτές τις δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές πιθανότατα αντικατοπτρίζει τη διαφορετική περιβάλλον και το δυναμικό επαναπρογραμματισμό στα καρκινικά κύτταρα με βάση την υποκείμενη γενετικές και επιγενετικές μεταβολές.

(Α) σε κύτταρα HCT116,

Twist1

, και

βιμεντίνης

έκφρασης mRNA είχαν κατασταλεί από qRT-PCR στα κύτταρα HMGA1 knock-κάτω σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

Ε-καδερίνης

και άλλα γονίδια EMT δεν επηρεάστηκαν σε αυτά τα κύτταρα. (Οι ρ-τιμές προσδιορίζονται με t-tests του φοιτητή φαίνεται). (Β) Σε κύτταρα SW480,

βιμεντίνης

καταστέλλεται και

E-cadherin

επάγεται στα κύτταρα με HMGA1 knock-down. (Οι τιμές p καθορίζεται από t-τεστ του φοιτητή φαίνεται).

Η

Συζήτηση

Ο μεταστατικός καρκίνος του παχέος εντέρου είναι εξαιρετικά θανατηφόρα και η συχνότητα αυξάνεται, ιδιαίτερα σε νεότερα άτομα [1] – [2]. Οι τρέχουσες θεραπείες περιορίζονται από την εμφάνιση των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων που είναι ανθεκτικά στη θεραπεία. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι αυτά τα πυρίμαχα κύτταρα αναπτύσσουν επειδή συν-επιλέξουν τα κυψελοειδή δίκτυα που εμπλέκονται στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και να γίνουν ικανά να μεταστατικά και να αποφύγουν τη θεραπεία [3] – [4]. Η

HMGA1

ογκογονίδιο πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως βασικό παράγοντα μεταγραφής εμπλουτισμένο σε κύτταρα ES και όγκους υψηλού βαθμού με κακή έκβαση [3], αν και η λειτουργία του σε αυτές τις ρυθμίσεις έχει παραμείνει άπιαστο. Αυτό το γονίδιο είναι μέλος του

HMGA

οικογένεια γονιδίων, που περιλαμβάνει επίσης

HMGA1

[11] – [18] και

HMGA2

[31], [39] – [40]. Όλες οι πρωτεΐνες HMGA είναι μικρές, χαμηλού μοριακού βάρους (πρωτεΐνες έτσι υψηλή ομάδα κινητικότητα) με ένα πεδίο σύνδεσης AT-hook DNA που μεσολαβεί στη δέσμευση σε ΑΤ-πλούσιες περιοχές στην ελάσσονα αύλακα της χρωματίνης. HMGA1 και άλλες πρωτεΐνες AT-hook πιστεύεται ότι λειτουργούν με ρύθμιση δομής της χρωματίνης και την γονιδιακή έκφραση [15] – [18], [41] – [42]. Εδώ, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι

HMGA1

επάγει πολλαπλασιαστικές αλλαγές και σχηματισμό πολυπόδων στο έντερο των διαγονιδιακών ποντικών. Επιπλέον,

HMGA1

απαιτείται για τον περιορισμό ογκογένεση αραίωση

in vivo

μαζί με σχηματισμό 3-διαστάσεων colonosphere

in vitro

, και τα δύο εκ των οποίων είναι φαινοτύπων χαρακτηριστικές των επιθηλιακών βλαστικών κυττάρων. Επιπλέον, αναστέλλοντας

HMGA1

μπλοκ έκφραση όχι μόνο ιδιότητες μετασχηματισμού που εμπλέκονται στην έναρξη του όγκου (κυτταρική ανάπτυξη αγκύρωση ανεξάρτητη, ογκογονικότητα), αλλά και κυτταρικά χαρακτηριστικά που προωθούν τη μεταστατική εξέλιξη (εισβολή και μετανάστευση). Ανακαλύψαμε επίσης ότι

HMGA1

απαιτείται για τη μεταστατική εξέλιξη στο ήπαρ

in vivo

. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι

HMGA1

είναι εμπλουτισμένο σε φυσιολογικά αρχέγονα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των εμβρυϊκών και αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων [3] – [8], εκτός από ελάχιστα διαφοροποιημένες, ή ανθεκτική καρκίνοι στέλεχος που μοιάζει με [ ,,,0],8] – [32], υποδηλώνοντας ότι η HMGA1 βοηθά για να οδηγήσει ένα κράτος στέλεχος-όπως, τόσο υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης και τον καρκίνο.

HMGA1

είναι επίσης εξαιρετικά εκφράζεται κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, με χαμηλή ή μη ανιχνεύσιμη έκφραση σε πιο διαφοροποιημένες, ιστούς ενηλίκων [43].

Για να προσδιορίσετε πώς HMGA1 ενορχηστρώνει την εξέλιξη του όγκου και βλαστικών κυττάρων φαινοτύπων, μελετήσαμε την έκφραση γονιδίων που έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι είναι σημαντική σε ΕΜΤ, την ανάπτυξη, και τα κύτταρα του όγκου εκκινητή [4]. Σε κύτταρα HCT116, βρήκαμε ότι HMGA1 up-ρυθμίζει την έκφραση των δύο

Twist1

και

βιμεντίνης

. Σε κύτταρα SW480, HMGA1 και up-ρυθμίζει

Twist1

, ενώ καταστέλλει

E-cadherin

.

E-cadherin

δεν άλλαξε στα HCT116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου με knock-down του

HMGA1

, το οποίο θα μπορούσε να αντανακλά σταθερό αποσιώπηση του

E-cadherin

σε αυτά τα μεσεγχυματικά, άκρως μεταστατικές καρκινικές σειρές παχέος εντέρου. Τα μεταγραφικά δίκτυα ρυθμίζονται από HMGA1 εξαρτάται πιθανότατα από τον κυτταρικό περιβάλλον και την υποκείμενη γενετική και επιγενετική χαρακτηριστικά.

Εν περιλήψει, οι μελέτες μας παρέχει την πρώτη απόδειξη που να συνδέει HMGA1 σε κυτταρικές ιδιότητες και μεταγραφικά δίκτυα σημαντικό σε βλαστικά κύτταρα, EMT, και μεταστατική εξέλιξη σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Αν και απαιτείται περαιτέρω εργασία, τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν το ρόλο της HMGA1 ως βασικό ρυθμιστή στην πρόοδο του όγκου και μια κατάσταση στέλεχος-όπως στον καρκίνο του παχέος εντέρου και δείχνουν ότι η στόχευση μονοπάτια HMGA1 μπορούσε να είναι επωφελής σε θεραπεία για καρκίνο του παχέος εντέρου. Επειδή

HMGA1

είναι εμπλουτισμένο σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, βλαστικά κύτταρα του ιστού-ειδική, και σχεδόν όλα επιθετικούς όγκους που μελετήθηκαν μέχρι σήμερα, τα ευρήματά μας είναι πιθανό να σχετικές όχι μόνο σε διαφορετικές ανθρώπινους καρκίνους, αλλά και για την κανονική ανάπτυξη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

HMGA1

έκφραση διαγονιδίου σε όλες τις μικρές και μεγάλες έντερα στο διαγονιδιακό (TG) ποντικούς σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (WT) μάρτυρες. qRT-PCR για

HMGA1

και το γονίδιο ελέγχου,

GAPDH

, διεξήχθη από ιστό που λαμβάνεται σε όλο το λεπτό έντερο (δωδεκαδάκτυλο, νήστιδα και ειλεό) και το παχύ έντερο (ανιόν κόλον, ορίστηκε του παχέος εντέρου, και κατιόντος κόλου, που ορίζεται D κόλον) από τους ποντικούς TG και WT.

HMGA1

έκφρασης στα έντερα TG αυξάνεται κατά 4 έως 8 φορές πάνω από εκείνη που παρατηρήθηκε στα ποντίκια WT, η οποία αυθαίρετα μία τιμή 1. Όλα qRT-PCR αντιδράσεις έγιναν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον μία φορά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. ποσοστά

Διάδοση στο HCT116 ή καρκίνου του παχέος εντέρου SW480 κύτταρα με HMGA1 knock-down ή φορέα ελέγχου. ποσοστά (Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων HCT116 επιμολυσμένα με το HMGA1

HMGA1

φορέα shRNA να knock-down (κόκκινα τετράγωνα) ή φορέας ελέγχου (μπλε κύκλοι) δείχνουν έναν παρόμοιο ρυθμό πολλαπλασιασμού. Οι τυπικές αποκλίσεις είναι ≤10% και ως εκ τούτου δεν είναι ορατές. τα ποσοστά (Β) την ανάπτυξη των κυττάρων SW480 επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου (μπλε κύκλοι) ή

HMGA1

φορέα shRNA (κόκκινα τετράγωνα) δείχνουν έναν παρόμοιο ρυθμό πολλαπλασιασμού. Οι τυπικές αποκλίσεις είναι ≤10% και ως εκ τούτου δεν είναι ορατό

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3. Αποτελέσματα αναζήτησης HMGA1 knock-down σε μεταβολές στα γονίδια EMT χωρίς αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων. (Α) knock-down του HMGA1 σε κύτταρα HCT116 δεν οδηγεί σε αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων ή διάμετρο σε σύγκριση με τους μάρτυρες. (Β) knock-down του HMGA1 σε κύτταρα SW480 δεν οδηγεί σε αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων ή διάμετρο σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Ελήφθησαν φωτογραφίες των ζωντανών κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα αντικειμενικό 10 Χ? κλίμακα bar, 100 μm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s003

(PPTX)