Abstract

Ιστορικό

προηγούμενα αποτελέσματα της έρευνας μας έδειξαν ότι Type II cGMP εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (ΡΚΟ II) θα μπορούσε να μπλοκάρει την ενεργοποίηση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και κατά συνέπεια αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και η σχετική ΜΑΡΚ /ΕΚΚ-μεσολαβούμενη μεταγωγή σήματος του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή BGC-823, υποδηλώνοντας ότι PKG II θα μπορούσαν να αναστέλλουν άλλες οδούς μεταγωγής σήματος του EGFR πυροδοτείται και συναφείς βιολογικές δραστηριότητες του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Το έγγραφο αυτό σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τη δυνατότητα αναστολής της PKG II στις EGF δραστηριότητα μετανάστευση /EGFR που προκαλείται και τις σχετικές οδούς μεταγωγής σήματος.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή AGS, έκφραση και τη δραστηριότητα των PKG II αυξήθηκαν με μόλυνση των κυττάρων με αδενοϊικούς κατασκεύασμα που κωδικοποιεί τη ΡΚΟ II cDNA (Ad-PKG II) και κατεργασία των κυττάρων με cGMP αναλόγου 8-pCpT-cGMP. Η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western και ενεργός μικρό Ras πρωτεΐνη G και Rac1 μετρήθηκε με τη μέθοδο «pull-down». δραστικότητα μετανάστευσης κυττάρων ανιχνεύθηκε με εξοπλισμό trans-καλά. Πρόσδεση μεταξύ PKG II και EGFR ανιχνεύθηκε με Co-IP. Τα αποτελέσματα έδειξαν EGF διεγείρονται μετανάστευση του AGS κυττάρων και το αποτέλεσμα ήταν συνδεδεμένος με PLCγ1 και οδούς μεταγωγής σήματος ERK μεσολάβηση. PKG II ανέστειλε την προκαλούμενη από EGF δραστικότητα μετανάστευσης και μπλοκάρει EGF-ξεκίνησε μεταγωγής σήματος της PLCγ1 και ΜΑΡΚ /μονοπάτια ERK-μεσολάβηση πρόληψη EGF που προκαλείται από Tyr 992 και Tyr 1068 φωσφορυλίωση του EGFR. PKG II δεσμεύεται με EGFR και προκάλεσε θρεονίνης του.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν συστηματικά την αναστολή της ΡΚΟ II για το ΕΤΠ που προκαλείται από τη μετανάστευση και συναφή μεταγωγής σήματος της PLCγ1 και ΜΑΡΚ /ERK μεσολάβηση μονοπάτια, υποδεικνύοντας ότι PKG II έχει μία αναστολή fargoing επί μεταγωγής σήματος που σχετίζονται /EGFR EGF και βιολογικές δραστηριότητες του γαστρικού καρκίνου κυττάρων μέσω φωσφορυλίωσης του EGFR και εμποδίζουν την ενεργοποίηση των αυτό

Παράθεση:. Jiang L, Lan T , Chen Υ, Sang J, Li Υ, Wu M, et al. (2013) PKG II Αναστέλλει EGF /EGFR-Induced μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του στομάχου. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10.1371 /journal.pone.0061674

Επιμέλεια: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 του Σεπτέμβρη 2012? Αποδεκτές: 12 Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Απρίλη του 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, No.81272755, No.31040002, No.81001100 και No.31100974? Η Grant Καινοτομίας του Πανεπιστημίου Jiangsu. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τύπος II οΟΜΡ-εξαρτώμενη κινασών πρωτεΐνης (PKG II) είναι μια κινάση σερίνης /θρεονίνης και συσσώρευση ερευνητικά δεδομένα έδειξαν ότι αυτή η κινάση είχε σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των κυττάρων βιολογικές δραστηριότητες, όπως πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, ιδιαίτερα σε κύτταρα όγκου . Το 2004, Cook

et al

διαπίστωσε ότι PKG II θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση των ανθρώπινων καλλιεργημένα κύτταρα του προστάτη στρωματικά [1]. Το 2009, Swartling

κ.ά.

ανέφεραν ότι PKG II ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων νευρογλοιώματος και η αναστολή σχετίζεται με μείωση της έκφρασης του παράγοντα μεταγραφής SOX9 και την φωσφορυλίωση της Akt [2]. Το 2011, Fallahian

κ.ά.

βρήκαν ότι cGMP θα μπορούσε να προκαλέσει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του μαστού και το αποτέλεσμα αυτό σχετίζεται με τη ΡΚΟ II [3]. Κατά τη διάρκεια της έρευνας μας βρήκαμε ότι η έκφραση και η δραστικότητα της PKG II στον ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των φυσιολογικών κυττάρων γαστρικού βλεννογόνου [4]. Περαιτέρω μελέτη στο εργαστήριο μας έδειξαν ότι PKG II θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου και μπλοκ EGF μεταγωγή επαγόμενου σήματος της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μεσολάβηση οδού μέσω της πρόληψης της ενεργοποίησης του EGFR με EGF [5], [6]. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση του EGFR μπορεί να κινήσει αρκετά μονοπάτια μεταγωγής σήματος συμπεριλαμβανομένων ΜΑΡΚ /ΕΚΚ, ΡΙ3Κ /Akt, JAK /STAT και PLCγ1 μεσολάβηση οδών [7], [8], η κατασταλτική δράση της PKG II στην ενεργοποίηση του EGFR υποδεικνύει ότι αυτό το ένζυμο μπορεί να έχει ένα ευρύ φάσμα ανασταλτική επίδραση στην μεταγωγή σήματος και τις συναφείς βιολογικές δραστηριότητες του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Το έγγραφο αυτό σχεδιάστηκε για να επιβεβαιώσει αυτό το ευρύ φάσμα ανασταλτική δράση της PKG II μέσω διερεύνηση της αναστολής της PKG II σχετικά με τη δραστηριότητα της μετανάστευσης EGF που προκαλείται και τη σχετική μεταγωγής σήματος στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

PKG II αναστέλλει προκαλούμενη από EGF κυτταρική μετανάστευση η οποία συνδέεται με μεταγωγή σήματος του PLCγ1 και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μεσολάβηση Pathways

η μετανάστευση των κυττάρων είναι σημαντική στην κανονική φυσιολογία και στη νόσο. Απόκτηση μεταναστευτικών ικανότητα από καρκινικά κύτταρα είναι ένα χαρακτηριστικό που συμβάλλει στην εξάπλωση των μεταστατικών κυττάρων όγκου σε απομακρυσμένα όργανα. Πρόσφατα δεδομένα έδειξαν ότι ο EGF μπορεί να διεγείρουν την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Ο μηχανισμός μέσω του οποίου EGF διεγείρει την κυτταρική μετανάστευση δεν είναι σαφής, αλλά ορισμένα στοιχεία έδειξαν ότι το ΕΤΠ μπορεί να το κάνει αυτό μέσω έναρξη της μεταγωγής σήματος της PLCγ1 και ΜΑΡΚ /μονοπάτια ΕΚΚ μεσολάβηση. Σε αυτό το πείραμα, ανιχνεύσαμε την μετανάστευση-διεγερτική δράση του ΕΤΠ AGS κύτταρα και χρησιμοποιείται αναστολέας των βασικών συστατικών στις οδούς σήματος να ερευνήσει την πιθανή μεταγωγής σήματος που σχετίζεται με το αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία EGF αύξησε την δραστικότητα μετανάστευσης των κυττάρων AGS και τόσο ΜΕΚ (βασικό συστατικό της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μεσολάβηση οδός) αναστολέα U0126 και PLCγ1 αναστολέα U73122 αναστέλλει ΕΟΡ-επαγόμενη μετανάστευση, υποδεικνύοντας ότι οι EGF διεγείρονται δραστηριότητα μετανάστευση κυττάρων μέσω ενεργοποίησης τόσο ΜΑΡΚ /μονοπάτια μεταγωγής σήματος με τη μεσολάβηση της ERK και PLCγ1 (Εικ. 1).

δραστηριότητα μετανάστευση των κυττάρων AGS αναλύθηκε με transwell σύστημα. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-LacZ ή Ad-ΡΚΟ II για 48 ώρες και στερήθηκαν ορού o /n. Στο Ad-LacZ + EGF και ομάδες Ad-PKGII + EGF, EGF (100 ng /ml) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας? Σε Ad-LacZ + cGMP + EGF και Ad-PKGII + cGMP + EGF ομάδες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 8-pCpT-cGMP για 1 ώρα και στη συνέχεια EGF (100 ng /ml) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Ο χρόνος μετάβασης ήταν 12 ώρες. Α: Εκπρόσωπος στοιχεία της μετανάστευσαν-κύτταρα χρωματίζονται με Giemsa (× 200)? Β: Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν σε κάθε ομάδα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από 5 ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν (* Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ?

& amp? Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ + EGF).

Η

PKG II Blocks EGF επαγόμενη Tyr 992 και Tyr 1068 φωσφορυλίωση του EGFR

Όταν EGF συνδέεται με EGFR, προκαλεί αυτο-φωσφορυλίωση του υποδοχέα. Υπάρχουν διάφορες περιοχές αυτο-φωσφορυλίωση τα οποία συνδέονται με διαφορετικά μονοπατιού μεταγωγής σήματος. Τυροσίνη 992 και τυροσίνη 1068 είναι μεταξύ των τόπων αυτο-φωσφορυλίωση του EGFR και συνδέονται με PLCγ1 μεσολάβηση και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μεσολάβηση σηματοδότηση αντίστοιχα. Σε αυτό το πείραμα, ερευνήσαμε την ανασταλτική δράση της PKG II για την Τυροσίνη 992 και τυροσίνη 1068 φωσφορυλίωση του EGFR σε διαφορετικά αντιμετωπίζονται AGS κύτταρα χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία EGF προκάλεσε μία αύξηση 14 πτυχώσεις Τυροσίνη 992 και μια αύξηση 8 πτυχώσεις τυροσίνης 1068 φωσφορυλίωσης του EGFR. Σε κύτταρα μολυσμένα με Ad-ΡΚΟ II και διεγείρονται με cGMP, η φωσφορυλίωση μειώθηκε σημαντικά (Εικ. 2, 3). Αυτό έδειξε ότι PKG II θα μπορούσε να αποτρέψει προκαλούμενη από EGF Τυροσίνη 992 και τυροσίνη 1068 φωσφορυλίωση του EGFR και συνεπώς αναστέλλουν PLCγ1 μεσολάβηση και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ σηματοδότηση μεσολάβηση.

AGS κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-LacZ ή Ad-ΡΚΟ II για 48 ώρες και στερήθηκαν ορού o /n. Στο Ad-LacZ + EGF και Ad-PKGII + EGF ομάδες, τα κύτταρα επωάστηκαν με EGF (100 ng /ml) για 5 λεπτά. Σε Ad-LacZ + cGMP + EGF και Ad-PKGII + cGMP + EGF ομάδες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 8-pCpT-cGMP για 1 ώρα και στη συνέχεια με EGF (100 ng /ml) για 5 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Το κυτταρόλυμα υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western με αντίσωμα κατά της Tyr 992 φωσφο-EGFR και EGFR. Τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης EGFR χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. πυκνομετρική ανάλυση διεξήχθη για να ποσοτικοποιήσει τις θετικές ζώνες. Α: Ένας εκπρόσωπος των πρώτων αποτελεσμάτων των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β: Τα αποτελέσματα της ανάλυσης πυκνομετρίας. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ και ομάδα PKG II?

& amp? Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 μΜ) + ομάδα EGF και ομάδα PKG II + EGF).

η

AGS κύτταρα επεξεργάστηκαν ίδιες όπως περιγράφονται στο Σχήμα 2. κηλίδωση Western εφαρμόστηκε για την ανίχνευση Tyr 1068 φωσφορυλίωση του EGFR και ανάλυση πυκνομετρίας διεξήχθη για την ποσοτικοποίηση της θετικές ζώνες. Α: Ένας εκπρόσωπος των πρώτων αποτελεσμάτων των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β: Τα αποτελέσματα της ανάλυσης πυκνομετρίας. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ και ομάδα PKG II?

& amp? Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 μΜ) + ομάδα ΕΤΠ και της ομάδας PKG II + EGF).

Η

PKG II Εμποδίζει EGF-ενεργοποιείται Main Events του PLCγ1 μεσολάβηση Μεταγωγή σήματος Διαδρομή

(1) ενεργοποίηση PLCγ1.

ΡΙ_Ογ είναι το κατάντη συστατικό των κινασών τυροσίνης υποδοχέα (RTKs). Έχει δύο ισομορφές: PLCγ1 είναι παντού κατανεμημένο και PLCγ2 εκφράζεται κυρίως σε αιμοποιητικά κύτταρα. Η ενεργοποίηση της PLCγ1 απαιτεί την πρόσληψη του στη μεμβράνη και σύνδεσης, μέσω τομέα του SH2, με ενεργό RTKs όπως EGFR. Η ένωση αυτή θα έχει ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση του PLCγ1 επί υπολειμμάτων τυροσίνης, ιδιαίτερα στην τυροσίνη 783, και μια αύξηση της ενζυμικής δραστικότητας της. Εφαρμόσαμε τη μέθοδο IP για να απομονώσει PLCγ1 και, στη συνέχεια, χρησιμοποιείται η μέθοδος κηλίδος Western για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της PLCγ1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία EGF προκάλεσε μια προφανή αύξηση της φωσφορυλίωσης Tyr783 της PLCγ1 και την αύξηση της δραστηριότητας PKG II μέσω μολύνοντας τα κύτταρα με Ad-ΡΚΟ II και την τόνωση των κυττάρων με cGMP εμπόδισε αποτελεσματικά την προκαλούμενη από EGF φωσφορυλίωσης του PLCγ1 (Εικ. 4 ).

AGS κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες των 100 mm και μολύνθηκαν είτε με Ad-LacZ ή Ad-PKG II. Στη συνέχεια, τα κύτταρα στερούνται ορού o /n και αντιμετωπίζονται με διαφορετικό τρόπο: στην ομάδα Ad-LacZ, χωρίς φαρμακευτική αγωγή? στην ομάδα Ad-LacZ + EGF, τα κύτταρα επωάστηκαν με EGF (100 ng /ml) για 5 λεπτά? σε ομάδα + cGMP + EGF Ad-ΡΚΟ II, τα κύτταρα επωάστηκαν με 250 μΜ 8-pCpT-cGMP για 1 ώρα και ακολούθησε επώαση με EGF (100 ng /ml) για 5 λεπτά. Ανοσοκαταβύθιση με το αντίσωμα έναντι PLCγ1 διεξήχθη για να καθιζάνει PLCγ1 και η φωσφορυλίωση της καθιζάνει PLCγ1 ήταν αναλύσουμε με κηλίδωση Western με αντίσωμα κατά της φωσφο PLCγ1 (Tyr783). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

(2) σχηματισμό DAG.

Μόλις ενεργοποιηθεί, PLCγ1 να καταλύουν την υδρόλυση της φωσφατιδυλινοσιτόλης 4,5-BISPHOS-phate (ΡΙ-4,5P

2) μέσα ινοσιτόλη 1,4,5-τριφωσφορική (ΙΡ

3) και διακυλογλυκερόλη (DAG), δύο μόρια που ρυθμίζουν την κινητοποίηση του ενδοκυτταρικού Ca

2+ και πρωτεΐνη κινάση δραστηριότητα C αντίστοιχα. Για να παρατηρήσουμε τα αποτελέσματα του EGF και PKG II για το σχηματισμό DAG, μέθοδος ELISA χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει συγκέντρωση DAG σε κύτταρα AGS. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε EGF διεγερμένα κύτταρα AGS, το επίπεδο της DAG αυξημένη προφανώς και προ-μόλυνση με Ad-ΡΚΟ II και θεραπεία με 8P-CPT-cGMP ανέστειλε το σχηματισμό DAG που προκαλείται από διέγερση με EGF (Εικ. 5).

AGS κύτταρα επεξεργάστηκαν ίδιες όπως περιγράφονται στο Σχήμα 4. Η συγκέντρωση των DAG στα κυτταρικά εκχυλίσματα μετρήθηκε με ELISA. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από 5 ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν [* Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ?

& amp? P & lt?. 0.05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 μΜ) + ομάδα ΕΤΠ και της ομάδας PKG II + EGF]

Η

(3) Ca

2+ απελευθέρωση.

IP3 και DAG είναι δεύτεροι αγγελιοφόροι στη PLCγ1 μεσολάβηση της οδού μεταγωγής σήματος. IP3 είναι γνωστό ότι διεγείρει την απελευθέρωση του ασβεστίου από τα εσωτερικά αποθέματα. Χρησιμοποιήσαμε ασβέστιο δείκτης fluo-3 /ΑΜ για την ανίχνευση του ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία EGF αύξησε την απελευθέρωση Ca

2+ από ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) για κυτταρόπλασμα και υψηλή έκφραση και δραστικότητα του ΡΚΟ II ανέστειλε σημαντικά την απελευθέρωση, αντιστρέφοντας την επίδραση της θεραπείας EGF (Εικ. 6).

είτε Ad-ΡΚΟ II μολυσμένα ή Ad-LacZ-μολυσμένα κύτταρα αναπτύσσονται σε μια πλάκα 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε παντελή στέρηση ορού για 12 ώρες, φορτωμένο με 5 μΜ μεμβράνη διαπερατή δείκτη ασβεστίου fluo-3 /AM για 30 min στους 37 ° C σε DMEM. Μετά τη φόρτωση με το fluo-3 /ΑΜ, τα κύτταρα πλύθηκαν με διάλυμα PBS και εναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ, και μετά επωάστηκαν με 8-pCpT-cGMP (100 μΜ και 250 μΜ) επί 30 λεπτά, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με EGF (100 ng /ml) για 5 λεπτά. Οι μετρήσεις φθορισμού διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ομοεστιακού της Olympus Fluoview-500. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από 5 ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν [* Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ?

& amp? P & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 μΜ) + ομάδα ΕΤΠ και της ομάδας PKG II + EGF]

Η

(4) Ενεργοποίηση των ΡΚΟα..

ΡΚΟα, μια ισομορφή της πρωτεϊνικής κινάσης C, είναι ένα βασικό συστατικό της PLCγ1 μεσολάβηση μονοπάτι σήματος και μπορεί να ενεργοποιηθεί με Ca

2+ και DAG. Ενεργοποιούνται, ΡΚΟα μετατοπίζεται από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη των κυττάρων. Έτσι, η ποσότητα του ΡΚΟα επί της μεμβράνης αντιπροσωπεύει την ενεργοποίηση του ΡΚΟα. Σε αυτό το πείραμα, ερευνήσαμε την ανασταλτική δράση της PKG II στην ενεργοποίηση των ΡΚΟα σε διαφορετικά αντιμετωπίζονται AGS κύτταρα χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μέσα σε πέντε λεπτά μετά την προσθήκη του EGF σε μέσο καλλιέργειας, την μετατόπιση του ΡΚΟα από το κυτοσόλιο στη μεμβράνη αυξήθηκε δραματικά και ο μετατόπιση αναστάλθηκε με προ-επιμόλυνση των κυττάρων με Ad-ΡΚΟ II και κατεργασία με 8-pCpT-cGMP ( Εικ. 7).

AGS κύτταρα επεξεργάστηκαν ίδιες όπως περιγράφονται στο Σχήμα 4. Υποκυτταρική κλασμάτωση σε κλάσματα κυτοσόλης και μεμβράνη διεξήχθη με χρήση μεμβρανών και Κυτταρικό Διάλυμα Kit Protein Extraction. Κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει ΡΚΟα είτε στη μεμβράνη ή στο κυτταρόπλασμα. πυκνομετρική ανάλυση διεξήχθη για να ποσοτικοποιήσει τις θετικές ζώνες. Α: Ένας εκπρόσωπος των πρώτων αποτελεσμάτων των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β: Τα αποτελέσματα της ανάλυσης πυκνομετρίας. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με ομάδα LacZ?

& amp? Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ + EGF).

Η

( 5) Ενεργοποίηση των CaMKIIα.

Μελέτες σχετικά με τη ρύθμιση του Ca

2 + /καλμοδουλίνη (CaM) -εξαρτώμενη κινάσης II άλφα (CaMKIIα), το οποίο είναι ένα πρωταρχικό ισομορφή CaMKII, έχουν προτείνει ότι όταν Ca

2 + /CAM συνδέεται με CaMKIIα, ενδο-μοριακών αυτοφωσφορυλίωση εμφανίζεται και η φωσφορυλίωση διατηρεί την επίμονη ενεργοποίηση του ενζύμου. Το αντίσωμα έναντι φωσφο-CaMKIIα (Thr286) εφαρμόστηκε σε κηλίδωση Western για να ανιχνευθεί η φωσφορυλίωση του CaMKIIα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε AGS κύτταρο υποβάλλεται σε επεξεργασία με EGF, φωσφορυλίωση Thr286 του CaMKIIα αυξήθηκε κατά σχεδόν 2,5 πτυχώσεις και μόλυνση με Ad-ΡΚΟ II και κατεργασία με 8-pCpT-cGMP ανέστειλε την αύξηση της φωσφορυλίωσης που προκαλείται από EGF (Εικ. 8).

AGS κύτταρα επεξεργάστηκαν ίδιες όπως περιγράφονται στο Σχήμα 2. κηλίδωση Western εφαρμόστηκε για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της CaMK ΙΙα. πυκνομετρική ανάλυση διεξήχθη για να ποσοτικοποιήσει τις θετικές ζώνες. Α: Ένας εκπρόσωπος των πρώτων αποτελεσμάτων των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β: Τα αποτελέσματα της ανάλυσης πυκνομετρίας. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με ομάδα LacZ?

& amp? Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 μΜ) + ομάδα EGF και PKG ομάδα II + EGF).

Η

PKG II Αναστέλλει EGF-επαγόμενη ενεργοποίηση των βασικών συνιστωσών της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μεσολάβηση Μεταγωγή σήματος Διαδρομή

(1) Η ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ /ΕΚΚ .

ΜΑΡΚ /ΕΚΚ είναι το βασικό συστατικό της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ με τη μεσολάβηση της οδού. Η φωσφορυλίωση στα δύο θρεονίνη 202 και της τυροσίνης 204 υπολείμματα ERK1 και θρεονίνη 185 και της τυροσίνης 187 υπολείμματα του ERK2 απαιτείται για την πλήρη ενζυματική ενεργοποίηση. Το αντίσωμα έναντι π-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) εφαρμόστηκε σε κηλίδωση Western για να ανιχνευθεί η διπλή φωσφορυλίωση του ERK. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μέσα σε πέντε λεπτά μετά την προσθήκη EGF σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, τη φωσφορυλίωση των ERK1 /2 σε AGS κύτταρα αυξήθηκε δραματικά (10 πτυχώσεις) και το φωσφορυλίωσης ανεστάλη από την προ-επιμόλυνση των κυττάρων με Ad-ΡΚΟ II και ενεργοποίηση του ενζύμου με 8-pCpT-cGMP (Εικ. 9).

AGS κύτταρα επεξεργάστηκαν ίδιες όπως περιγράφονται στο Σχήμα 2. κηλίδωση Western εφαρμόστηκε για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της ERK. πυκνομετρική ανάλυση διεξήχθη για να ποσοτικοποιήσει τις θετικές ζώνες. Α: Ένας εκπρόσωπος των πρώτων αποτελεσμάτων των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β: Τα αποτελέσματα της ανάλυσης πυκνομετρίας. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με ομάδα LacZ?

& amp? Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 μΜ) + ομάδα EGF και PKG ομάδα II + EGF).

Η

(2) Η ενεργοποίηση της ras.

Μικρές G πρωτεΐνες Ras είναι ένα άλλο βασικό συστατικό σε ΜΑΡΚ /σηματοδοτικό μονοπάτι ERK με τη μεσολάβηση. Έχει δύο μορφές στα κύτταρα: GTP-δεσμεύεται δραστική μορφή και ανενεργό μορφή ΑΕΠ-δεσμεύεται. Μόλις Ras είναι στην GTP-δεσμευμένη μορφή, μπορεί να δεσμεύουν και ενεργοποιούν Raf-1 και αρχίζουν τις επακόλουθες ενεργοποιήσεις των κινασών σερίνης /θρεονίνης στην οδό σήματος. Εφαρμόσαμε τη μέθοδο «pull-down» για την ανίχνευση της ενεργοποιημένης Ras. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι μετά την προσθήκη του ΕΤΠ στο μέσο καλλιέργειας, ενεργό Ras σε κύτταρα AGS αυξημένη προφανώς μέσα σε πέντε λεπτά. Μολύνοντας τα κύτταρα με Ad-ΡΚΟ II και την τόνωση τους με 8-pCpT-cGMP πριν από την προσθήκη του ΕΤΠ εμπόδισε σημαντικά την προκαλούμενη από EGF ενεργοποίηση του Ras (Εικ. 10).

Η μέθοδος «pull-down» χρησιμοποιείται για να ανίχνευση της ενεργοποιημένης Ras. κυτταρόλυμα προετοιμάστηκε και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης επωάστηκαν με σφαιρίδια GST-RBD όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. σύμπλοκα Δεσμευτική συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, επιλύονται με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF και ανιχνεύθηκαν με αντι-τηγάνι Ras αντίσωμα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

PKG II Αναστέλλει EGF-επαγόμενη ενεργοποίηση των RAC1

Μικρές G RAC1 πρωτεΐνη είναι το κύριο μέλος της οικογένειας Rho οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στην που ρυθμίζουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Τόσο PLCγ1 και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μεσολαβεί μεταγωγής σήματος μπορεί να ενεργοποιήσει RAC1 και στη συνέχεια διεγείρει την κυτταρική μετανάστευση. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η ανασταλτική επίδραση της PKG II στις EGF /EGFR επαγόμενη σηματοδότηση η οποία σχετίζεται με τη μετανάστευση, τη μέθοδο «pull-down» εφαρμόστηκε για την ανίχνευση της αναστολής της PKG II στην ενεργοποίηση του RAC1. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η θεραπεία EGF προκάλεσε μια προφανής αύξηση των ενεργών RAC1 και υψηλή δραστικότητα του ΡΚΟ II ανέστειλε αποτελεσματικά την ενεργοποίηση του RAC1 (Εικ. 11). Αυτό έδωσε περαιτέρω απόδειξη της αναστολής της PKG II στις EGF-επαγόμενη μετανάστευση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων.

Η μέθοδος «pull-down» χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του ενεργοποιημένου RAC1. κυτταρόλυμα προετοιμάστηκε και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης επωάστηκαν με σφαιρίδια GST-ΡΒϋ όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. σύμπλοκα Δεσμευτική συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, επιλύονται με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF και ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-RAC1 τηγάνι. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

PKGII αλληλεπιδρά με EGFR και Προκαλεί Thr-phoshporylation του υποδοχέα

Ο μηχανισμός μέσω του οποίου PKGII δεσμεύει την προκαλούμενη από EGF ενεργοποίηση του EGFR προκαταρκτικά ερευνήθηκε σε αυτό το πείραμα. Συνανοσοκαθίζησης εφαρμόστηκε για την ανίχνευση της αλληλεπίδρασης μεταξύ PKGII και EGFR. Κηλίδωση Western με αντι τηγάνι φωσφορυλίωση αντίσωμα θρεονίνης χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευθεί η φωσφορυλίωση του EGFR Θρεονίνη προκαλείται από PKGII. Τα αποτελέσματα της συνανοσοκαθίζησης έδειξε ότι στην AGS κύτταρα μολυσμένα με Ad-ΡΚΟ II και διεγείρονται με 8-CPT-cGMP, άμεση σύνδεση μεταξύ PKG II και EGFR ανιχνεύθηκε (Εικ. 12, πλαίσιο Α). Αποτελέσματα κηλίδωση Western έδειξε ότι η ενεργοποίηση του ΡΚΟ II που προκαλείται θρεονίνης του EGFR (Εικ. 12, πλαίσιο Β). Αυτό έδειξε ότι PKG II μπλοκάρει την EGFR ενεργοποίηση μέσω δέσμευσης με τον υποδοχέα και προκαλώντας φωσφορυλίωση αυτό

Α:. Αποτελέσματα συνανοσοκαθίζησης. κύτταρα AGS αναπτύχθηκαν σε πλάκες των 100-mm και μολύνθηκαν με Ad-ΡΚΟ II. Αφού στερούνται ορού o /n, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 250 μΜ 8-pCpT-cGMP για 1 ώρα, και επωάστηκαν με EGF (100 ng /ml) για 5 λεπτά, τα κύτταρα λύθηκαν και το κυτταρόλυμα ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-ΡΚΟ II αντίσωμα ή ισότυπο IgG. Τα ιζήματα ανιχνεύτηκαν με αντι-EGFR αντίσωμα. Πέντε ποσοστό κυτταρολύματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εισόδου πρωτεΐνη. Το αντίθετο πείραμα, δηλ ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΕΟΡΚ και ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-ΡΚΟ II, πραγματοποιήθηκε επίσης. Β: Αποτελέσματα ανοσοκαταβύθιση και κηλίδωση Western. AGS κύτταρα επεξεργάστηκαν ίδιο ως Α, και το λύμα ανοσο-καταβυθίστηκαν με αντίσωμα έναντι EGFR για τον εμπλουτισμό της πρωτεΐνης. Τα ιζήματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western με τηγάνι φωσφορυλίωση αντίσωμα αντι-θρεονίνη. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Προς το παρόν, δύο cGMP εξαρτώμενη πρωτεϊνικές κινάσες (PKGs), ΡΚΟ Ι και PKG II, έχουν ταυτοποιηθεί σε κύτταρα θηλαστικών [10], [11]. ΡΚΟ Ι κατανέμεται ευρέως μέσα στο σώμα και λόγω ανασταλτική δράση της επί της ανάπτυξης του όγκου και της διεισδυτικότητας και επαγωγική επίδραση επί της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων, έχει αναγνωριστεί ως καταστολέας όγκου [12]. Η έκφραση του ΡΚΟ II είναι περισσότερο ιστού-περιορισμένο [13]. Για μεγάλο χρονικό διάστημα, σε αντίθεση με το καλά αποδείχθηκε κατά του όγκου αποτέλεσμα του ΡΚΟ Ι, δεν υπάρχουν ερευνητικά δεδομένα σαφώς αντικαρκινική ρόλο της PKG II και αυτό κινάσης εμπλέκεται μόνο σε διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων εντερική έκκριση, την ανάπτυξη των οστών, και της μάθησης και μνήμη [14]. Ωστόσο, το ερευνητικό ενδιαφέρον για PKG II αυξάνει και έχουν κάποιες νέες λειτουργίες του PKG II έχουν βρεθεί πρόσφατα, συμπεριλαμβανομένου του ρόλου της PKG II στη ρύθμιση των επιθηλιακών διαύλων νατρίου και μεταγωγή μηχανο-σήματος [15] – [17]. Το πιο σημαντικό, συσσωρεύοντας ερευνητικά δεδομένα έδειξαν ότι PKG II σχετιζόταν με τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση σε ορισμένα κύτταρα, ειδικά σε κύτταρα όγκου, γεγονός που υποδηλώνει έντονα τον πιθανό ρόλο αυτού του ενζύμου στη ρύθμιση βιολογικές δραστηριότητες των κυττάρων του όγκου [1] – [6].

EGFR υπάρχει στην επιφάνεια όλων των κυττάρων. Με ένα μοριακό βάρος 170KD, EGFR έχει μία εξωκυτταρική περιοχή, μία περιοχή εγκάρσιας μεμβράνης και μια ενδοκυτταρική περιοχή. Η ενδοκυτταρική περιοχή του EGFR έχει 542 υπόλοιπα αμινοξέων και μπορούν να διαιρεθούν σε κατά προσέγγιση μεμβράνη υπο-τομέα, τυροσίνη κινάσης υπο-τομέα, και C-τερματικό υπο-τομέα [18]. Η διαδικασία ενεργοποίησης του EGFR περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση τυροσίνης της ενδοκυτταρικής περιοχής του και διαφορετικές θέσεις φωσφορυλίωσης με τον τομέα σχετίζονται με διαφορετικές οδούς σήματος. Όταν EGFR ενεργοποιείται, μπορεί να προσλάβει πρωτεΐνες τελεστές προς φωσφορυλιωμένο Ο-τερματικό υπο-τομέα του και κινεί τις τελεστή μονοπάτια πρωτεΐνη μεσολάβηση [19], [20]. Μεταξύ των θέσεις φωσφορυλίωσης, τυροσίνη 1068 και 1086 συνδέονται με ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μεσολάβηση μονοπάτι και της τυροσίνης 992 και 1173 συνδέονται με ΡΙ_Ογ μεσολάβηση οδού σήματος [7], [8]. προηγούμενα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι PKG II θα μπορούσε να αναστείλει EGF που προκαλείται τυροσίνης 1068 φωσφορυλίωση του EGFR σε γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή BGC-823 [6], εγείροντας το ερώτημα αν ΡΚΟ II μπορεί να αναστέλλει τη φωσφορυλίωση των άλλων sites τυροσίνης σε EGF /EGFR και στη συνέχεια να έχουν μια αναστολή ευρύ φάσμα για το ΕΤΠ μεταγωγές σήματος /EGFR που προκαλείται και συναφείς βιολογικές δραστηριότητες των γαστρικών καρκινικών κυττάρων.

στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η δράση της PKG II στις EGF-επαγόμενη μετανάστευση δράση του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή AGS. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι PKG II είχε σημαντική αναστολή στην κυτταρική μετανάστευση που προκαλείται από EGF. Αυτό παρέχει περαιτέρω απόδειξη για την αποκάλυψη του ανασταλτικού αποτελέσματος του όγκου του ΡΚΟ II. Ερευνητικά δεδομένα έχουν δείξει ότι μεταξύ των /EGFR ξεκίνησε μονοπάτια μεταγωγής σήματος EGF, τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος με τη μεσολάβηση PLCγ1 και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ που σχετίζονται με τη δραστηριότητα της μετανάστευσης [21], [22]. Για να επιβεβαιωθεί αυτό στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε αναστολέας του συστατικού μεταγωγής σήματος για τον προσδιορισμό της συμμετοχής των ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και PLCγ1 μεσολάβηση οδών στη διαδικασία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΜΕΚ αναστολέα U0126 και PLCγ1 αναστολέα U73122 μερικώς μπλοκαριστεί EGF EGFR επαγόμενη δραστικότητα /μετανάστευσης των κυττάρων AGS, υποδεικνύοντας ότι και οι δύο οδοί μεταγωγής σήματος συμμετείχαν στη διαδικασία ρυθμίσεως. Για να διαλευκανθεί το δυναμικό ανασταλτική δράση της PKG II σε αυτά τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος, διερευνήσαμε πρώτα το ανασταλτικό αποτέλεσμα του PKG II στις EGF κινηθεί PLCγ1 μεσολάβηση μονοπάτι μεταγωγής σήματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι PKG II εμπόδισε όλα τα κύρια γεγονότα σε αυτή την οδό μεταγωγής σήματος, συμπεριλαμβανομένου του Tyr 992 φωσφορυλίωση /ενεργοποίηση του EGFR, της φωσφορυλίωσης /ενεργοποίησης των PLCγ1, ο σχηματισμός του δεύτερου αγγελιοφόρου DAG, την απελευθέρωση του ασβεστίου σε κυτταρόπλασμα, και η ενεργοποίηση της PKC και CaMK ΙΙα. Για την αναστολή της PKG II στις EGF προκάλεσε /EGFR ΜΑΡΚ /ΕΚΚ με τη μεσολάβηση της οδού μεταγωγής σήματος, την προηγούμενη εργασία μας έχουν δείξει ότι PKG II αναστέλλει την ενεργοποίηση όλων των βασικών εξαρτημάτων στην οδό που προκαλείται από το ΕΤΠ στην γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή BGC-823 [ ,,,0],6]. Στο έγγραφο αυτό, διερευνήθηκε η ανασταλτική επίδραση της PKG II στις EGF /EGFR επαγόμενη ενεργοποίηση των βασικών συστατικών σε αυτό το μονοπάτι. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι PKG II ανέστειλε προκαλούμενη από EGF ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Ras και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ στο AGS κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΡΚΟ II ανέστειλε επίσης EGF /EGFR επαγόμενη μεταγωγή σήματος του ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μεσολάβηση μονοπάτι σε αυτή την καρκινική κυτταρική γραμμή. Αυτά τα αποτελέσματα συστηματικά αποκάλυψε ότι PKG II ανέστειλε EGF-επαγόμενη μετανάστευση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων μέσω παρεμπόδισης EGF /EGFR ξεκίνησε μεταγωγής σήματος της PLCγ1 και MAP /ERK-μεσολάβηση μονοπάτια.

Η μεταγωγή σήματος τόσο PLCγ1 και MAP /ERK μεσολάβηση μονοπατιών μπορεί να ενεργοποιήσει μικρή πρωτεΐνη G Rac1, η οποία αποτελεί βασικό συστατικό στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης [23], [24]. Για να επιβεβαιώσετε την αναστολή της ΡΚΟ II σε αυτό το σημαντικό γεγονός στην ΕΤΠ που προκαλείται από τη μετανάστευση των κυττάρων GAS, εφαρμόσαμε τη μέθοδο «pull-down» για να ελέγξετε τη δραστηριότητα της Rac1 σε διαφορετικά επεξεργασμένα κύτταρα AGS. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κατά τη διάρκεια της EGF-επαγόμενη μετανάστευση, Rac1 ενεργοποιήθηκε και ενεργοποίηση συνδεόταν με τόσο PLCγ1 και ΜΑΡ /ΕΡΚ μεσολάβηση σηματοδότηση. Επιπλέον, PKG II ανέστειλε την προκαλούμενη από EGF ενεργοποίηση της Rac 1. Αυτό επιβεβαίωσε περαιτέρω την ανασταλτική δράση της PKG II στις EGF /EGFR ξεκίνησε τη μετανάστευση των κυττάρων.

EGFR είναι στενά συνδεδεμένη με tumorigenensis. Πάνω έκφρασης και η μετάλλαξη του EGFR συχνά συμβαίνει στις περισσότερες μορφές καρκίνου. Έρευνα δεδομένα έδειξαν ότι πάνω από το 50% -70% του καρκίνου του πνεύμονα, του καρκίνου του παχέος εντέρου και του καρκίνου του μαστού έχουν υψηλή έκφραση του EGFR [25]. Επιπλέον, οι ασθενείς με καρκίνο με υπερ-έκφραση του EGFR έχουν συνήθως κακή πρόγνωση. Για παράδειγμα, EGFR υπερ-έκφραση ανιχνεύθηκε στο 60% των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς και η πρόγνωση των ασθενών ήταν φτωχοί, με επιβίωση μόνο 4-5 μηνών [26].

In vitro

πειράματα επιβεβαίωσαν ότι η υπερ-έκφραση του EGFR που προκαλείται μετασχηματισμός των ΝΙΗ-3Τ3, Rat-1 και τα κύτταρα NRK και αποκλεισμό της ενεργοποίησης EGFR ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό ορισμένων καρκινικών κυττάρων [27]. Κατά συνέπεια, EGFR είναι ο πρώτος υποδοχέας αυξητικού παράγοντα λαμβάνεται ως στόχο τη θεραπεία του καρκίνου. Αρκετές μέθοδοι αναστολής δραστηριότητας EGFR και συναφή μεταγωγή σήματος, συμπεριλαμβανομένων των ειδικών αντισωμάτων έναντι EGFR και αναστολείς του EGFR, που ελήφθη εντατική έρευνα [28] – [30]. Νέες και πιο αποτελεσματικές μεθόδους στον αποκλεισμό EGFR μεσολάβηση της μεταγωγής σήματος θα είναι χρήσιμη στη θεραπεία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, το εύρημα ότι ΡΚΟ II μπορούν να αναστείλουν την ενεργοποίηση του EGFR και την επακόλουθη μεταγωγή σήματος έχει σημαντική σημασία. Αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι PKG II είναι μια πιθανή ενδογενής αναστολέας του EGFR και θα δώσει νέα υπόδειξη σχετικά με τη στρατηγική της θεραπείας του καρκίνου.

Τα ερευνητικά δεδομένα έδειξαν ότι ορισμένες πρωτεΐνες κινάσες μπορεί να προκαλέσει φωσφορυλίωση του EGFR και να επηρεάσει την ενεργοποίηση ή /και του προορισμού του. Για παράδειγμα, πρωτεϊνική κινάση C (PKC) μπορεί να προκαλέσει την φωσφορυλίωση θρεονίνη 654 του EGFR και ρυθμίζει τη σύνδεση υποδοχέα και εσωτερίκευση [31]. Σερίνη 1046/1047 (Ser1046 /1047) θέση φωσφορυλίωσης απαιτείται για την απευαισθητοποίηση EGFR σε κύτταρα EGF-αγωγή [32] .Σε πειράματα μας, ανιχνεύσαμε τη φωσφορυλίωση της Thr654 και Ser1046 /1047 του EGFR και διαπίστωσε ότι PKG II δεν προκάλεσε ο φωσφορυλίωση αυτών των θέσεων φωσφορυλίωσης. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπήρχε άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ PKG II και EGFR και PKG II που προκαλείται θρεονίνης του EGFR. Αυτό έδειξε ότι PKG II μπλοκάρει την ενεργοποίηση του EGFR μέσω σύνδεσης με και φωσφορυλίωση του υποδοχέα. Η ακριβής θέση φωσφορυλίωσης θα είναι ο επόμενος στόχος της έρευνας μας.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμή κυττάρων και αντιδραστήρια

Ανθρώπινο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή AGS δόθηκε από το Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας (Σαγκάη, Κίνα). Αδενοϊικοί φορείς που κωδικοποιούν β-γαλακτοσιδάση (Pad-LacZ) και PKG II (Pad-PKG II) ήταν ευγενικό δώρο από τον Dr. Gerry Boss και ο Δρ Renate Pilz στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) και ορό εμβρύου μόσχου (FBS) ήταν από την GIBCO (Grand Island, ΝΥ). Το αντίσωμα έναντι ΡΚΟ II ήταν από ABGENT Biotechnology (San Diego, CA). Goat αντι-β-ακτίνης, ποντικού αντι-παν-Ras, και ποντικού αντι-PLCγ1 αντισώματα ήταν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Rabbit anti-ρ-EGFR (Tyr1068), κουνέλι αντι-ρ-EGFR (Tyr992), κουνέλι αντι-ΕΟΡΚ, αντι-ρ-ΕΚΚ (Thr 202 /Tyr 204), κουνέλι αντι-ERK και κουνελιών αντι-ρ-PLCγ1 (Tyr783) αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Rabbit anti-ΡΚΟα και κουνελιών αντι-ρ-CaMK ΙΙα (Thr286) ήταν από Bioworld Τεχνολογίας (St. Louis Park, ΜΝ). Rabbit anti-ρ-Thr αντίσωμα ήταν από Abcam (MA, USA) .Horseradish υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης δευτερεύοντα αντισώματα ήταν από την Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, ΡΑ). Το κυτταρικό ανάλογο διαπερατό cGMP 8-pCpT-cGMP ήταν από την Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 και U0126 ήταν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Ηλεκτροχημικοφωτεινότητα (ECL) τα αντιδραστήρια ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Ca

2+ δείκτης Fluo-3 /AM και μεμβράνης και κυτοσόλιο Kit Πρωτεΐνη Εξόρυξη ήταν από Beyotime (Jiangsu, Κίνα). Ανθρώπινα διακυλ γλυκερόλης (DAG /ΓΔ) ELISA Kit ήταν από Cusabio Biotech Co., Ltd. (Newark, DE).