Αφηρημένο

Οι θεραπευτικές επιλογές για το προχωρημένο στάδιο του προστάτη και του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι περιορισμένη και υπάρχει επείγουσα ανάγκη να αναπτυχθούν πιο αποτελεσματικές και στοχευμένες νέων θεραπειών, που αρχίζει με την αναγνώριση και την επικύρωση των νέων θεραπευτικών στόχων. Πρόσφατες κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα μήτρα αναστολέα ιστού μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 (ΤΙΜΡ-1) είναι αυξημένα σε καρκίνο του πλάσματος του ασθενούς και αυξημένα ΤΙΜΡ-1 επίπεδα συνδέονται με χειρότερα κλινικά αποτελέσματα. Ωστόσο, είναι άγνωστο αν ΤΙΜΡ-1 χρησιμεύει απλώς ως βιοδείκτη της εξέλιξης του καρκίνου ή έχει μια λειτουργική ρόλο στην προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου και μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα θεραπευτικό του καρκίνου στόχου, που είναι ο κύριος στόχος της μελέτης αυτής. Εδώ, δείχνουμε ότι το στρώμα του ανθρώπινου προστάτη και του παχέος εντέρου εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα του ΤΙΜΡ-1 σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς και αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 προάγει

in vivo

ανάπτυξη και των δύο τύπων καρκίνου. Έχουμε αποδείξει για πρώτη φορά ότι η αυξημένη ΤΙΜΡ-1 έκφραση διεγείρει συσσώρευση του καρκίνου που σχετίζεται ινοβλαστών (CAFS) εντός του προστάτη και του παχέος εντέρου ιστούς και ότι ο ΤΙΜΡ-1 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό CAF προστάτη και μετανάστευση

in vitro

και προωθεί ERK1 /ενεργοποίησης 2 κινάσης σε αυτά τα CAF κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας καθορίσει τις νέες προωθητικές επιπτώσεις της TIMP-1 για την εξέλιξη του καρκίνου και για τη συσσώρευση των CAFS που με τη σειρά του παρέχει ένα μικροπεριβάλλον pro-όγκου. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν το δυναμικό της ΤΙΜΡ-1 ως νέο στόχο για θεραπεία του καρκίνου και ο μηχανισμός στηρίζεται η δραστικότητα προ-καρκινικά του ΤΙΜΡ-1

Παράθεση:. Gong Υ, Scott Ε, Lu R, Xu Υ, Ω WK, Yu Q (2013) TIMP-1 προάγει τη συσσώρευση του καρκίνου που συνδέεται ινοβλάστες και καρκίνος εξέλιξη. PLoS ONE 8 (10): e77366. doi: 10.1371 /journal.pone.0077366

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Μάρτη, 2013? Αποδεκτές: 2 Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Οκτ 2013

Copyright: © 2013 Gong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από τις Ηνωμένες Πολιτείες Στρατού Ιατρικής Έρευνας (Department of Defense) επιχορήγηση, W81XWH-10-1-0321. Οι χρηματοδότες δεν έχουν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η πρόγνωση για το μεταστατικό ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) παραμένει φτωχή, με μέση επιβίωση λιγότερο από 2 χρόνια. επιλογές θεραπείας για τον καρκίνο του προστάτη προχωρημένο στάδιο είναι περιορισμένες και υπάρχει επείγουσα ανάγκη να αναπτυχθούν πιο αποτελεσματικές και στοχευμένες νέες θεραπείες [1-5]. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου, είναι σημαντικό ότι τα καρκινικά κύτταρα αλληλεπιδρούν κατάλληλα με επιτυχία και να τροποποιήσει γύρω μικροπεριβάλλον υποδοχής τους. Τα καρκινικά κύτταρα αλληλεπιδρούν με μικροπεριβάλλον τους μέσω των υποδοχέων προσκόλλησης της κυτταρικής επιφάνειας και οι υποδοχείς για την εξωκυτταρική μήτρα (ECM) και να τροποποιήσουν το περιβάλλον τους σε μεγάλο βαθμό μέσω δραστηριοτήτων των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs). ΜΜΡ παίζουν βασικό ρόλο στην υποβάθμιση της ECM και βιοδραστικότητες των MMPs ρυθμίζεται από τους αναστολείς ιστού των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs) [6]. Υπάρχουν τέσσερα μέλη της οικογένειας ΤΙΜΡ, ιστός μήτρας αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 (ΤΙΜΡ-1), -2, -3, και -4. TIMPs μπορεί να αναστείλει τις δραστηριότητες όλων των MMPs, αλλά με κυμαινόμενη αποτελεσματικότητα προς διαφορετικές MMPs. ΜΜΡ παίζουν σημαντικό ρόλο στη διάδοση και την εξέλιξη του όγκου και είναι εγκατεστημένοι θεραπευτικοί στόχοι για μια ποικιλία τύπων καρκίνου [6-8]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι TIMPs συμπεριλαμβανομένων των δραστηριοτήτων κατά του καρκίνου TIMP-1 οθόνη [9-13]? Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει μια παράδοξη επίδραση προ-καρκινικά του ΤΙΜΡ-1 [6,14-16]. TIMPs μπορούν να επηρεάσουν την εξέλιξη του καρκίνου σε ένα ΜΜΡ-εξαρτώμενη και ΜΜΡ-ανεξάρτητο τρόπο, αν και ο υποκείμενος μηχανισμός του τελευταίου δεν είναι καλά κατανοητός [17,18].

Πολλοί ΜΜΡ αναστολείς ευρέος φάσματος (ΜΜΡΙ) που αναπτύχθηκε από φαρμακευτικές εταιρείες ελέγχθηκαν σε προοπτικές κλινικές δοκιμές και τα αποτελέσματα υπήρξαν ομοιόμορφα απογοητευτική. Καμία οριστική μηχανιστική αντίληψη για την εν λόγω ανεπάρκεια έχει αποδειχθεί. Ωστόσο, είναι πιθανό προέκυψε από την έλλειψη κατανόησης των διακριτών βιοδραστικότητες και τις λειτουργίες των διαφόρων MMPs, η οποία έκτοτε εκτιμηθεί καλύτερα για προ- ή /και των δραστηριοτήτων κατά των όγκων [6,19-22]. Αυτά τα απογοητευτικά αποτελέσματα υπογραμμίζουν επίσης τη σημασία της καλύτερης κατανόησης της βιολογίας του καρκίνου θεραπευτικών στόχων πριν από τη διεξαγωγή κλινικών δοκιμών. Πρόσφατα, αρκετές κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι το ΤΙΜΡ-1 επίπεδα σε καρκίνο ιστούς πλάσμα και τον καρκίνο των ασθενών είναι ιδιαίτερα αυξημένη και τα αυξημένα επίπεδα ΤΙΜΡ-1 συνδέεται με χειρότερα κλινικά αποτελέσματα σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη και του παχέος εντέρου [23-34]. Ωστόσο, δεν είναι σαφές αν ΤΙΜΡ-1 χρησιμεύει απλώς ως βιοδείκτη της εξέλιξης ή λειτουργίες για την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου, καθώς και τον καρκίνο? και ως εκ τούτου θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο τον καρκίνο. Αυτή η ερώτηση απευθύνεται η παρούσα μελέτη.

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι το στρώμα του ανθρώπινου προστάτη και του παχέος εντέρου εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα του ΤΙΜΡ-1 σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς και ότι η αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 προάγει

in vivo

αύξησης τόσο του καρκίνου τύπους. Επιπλέον, δείχνουμε ότι το ΤΙΜΡ-1 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό CAF προστάτη και μετανάστευση

in vitro

ενώ knockdown του ΤΙΜΡ-1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό του προστάτη CAF και τη μετανάστευση. Επιπλέον, ΤΙΜΡ-1 προάγει την ενεργοποίηση του ERK1 /2 κινάσης σε αυτά τα CAFS. Δείχνουμε επίσης ότι η αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 διεγείρει συσσώρευση του καρκίνου που συνδέεται ινοβλαστών (CAFS) εντός του προστάτη /κόλου καρκινικούς ιστούς. Μαζί, τα αποτελέσματα μας καθορίσει τις νέες προαγωγικός επιδράσεις της ΤΙΜΡ-1 επί της προόδου του καρκίνου και τη συσσώρευση CAF, το δυναμικό του ΤΙΜΡ-1 ως νέο θεραπευτικό του καρκίνου στόχου, και ο μηχανισμός που διέπει τις επιδράσεις ΤΙΜΡ-1.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενών Δείγματα Καρκίνου, Κύτταρα και Αντιδραστήρια

δείγματα του Ανθρώπου του προστάτη και του καρκίνου του παχέος εντέρου ελήφθησαν από τη Συνεργατική Ανθρώπινο Δίκτυο Tissue (CHTN) στο Πανεπιστήμιο του Πενσυλβάνια και το Πανεπιστήμιο του Οχάιο. Πρωτογενή καρκίνο του προστάτη που σχετίζεται ινοβλάστες (PCAFs) ελήφθησαν από την Asterand ΗΠΑ (Detroit) και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ανθρώπινα ινοβλάστες του προστάτη ήταν από την ScienCell (HPRF, Carlsbad) και καλλιεργήθηκαν ινοβλαστών Medium (FM, ScienCell). PC3, PC3 /Μ, DU145, 22RV1, LNCaP, vcap, RWPE-1 και WPE1-NB26-65 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου προστάτη και HCT116 και ΗΤ-29 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ήταν από το NCI (Tumor Repository DTP, DCTD) και ATCC (Manassas) και διατηρήθηκε μετά από συστάσεις των παρόχων. Ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη LAPC-4 κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC Αποθετήριο Ευρεσιτεχνίας.

Anti-V5 επιτόπου (Invitrogen), -TIMP-1, -α ακτίνη των λείων μυών (R & amp? D Systems, Santa Cruz), -ERK1 /2, -φωσφο-ERK1 /2, -Akt, και -φωσφο-ΑΚΤ (Santa Cruz, Cell Signaling) και CD63 (EMD Millipore) αντισώματα, και ο Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού αντιδραστηρίου WST-1 (Takara) χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Καθαρισμένη ανθρώπινη ΤΙΜΡ-1 ελήφθη από την R & amp? D Systems.

ανάστροφης μεταγραφάσης-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR), κατασκευάσματα έκφρασης, και του ιού Transduction

πλήρους μήκους ΤΙΜΡ-1 cDNAs δημιουργήθηκαν με PCR και κλωνοποιήθηκαν μαζί με ΟΟΟΗ-τερματικό V5 τους -epitope ετικέτες στο ρετροϊικό φορέα έκφρασης pQCXIP (BD Biosciences) όπως περιγράφεται [35,36]. Όλα τα κατασκευάσματα έκφρασης επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. Οι ρετροϊοί παράχθηκαν χρησιμοποιώντας αυτά τα κατασκευάσματα έκφρασης και pVSVG σε GP2-293 κύτταρα ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (BD Biosciences).

Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη (PC3, 22RV1, και LAPC-4) ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου (HCT116 και ΗΤ-29) υποβλήθηκαν σε μεταγωγή με τους ρετροϊούς που μεταφέρουν άδειο ρετροϊικό φορέα έκφρασης (όπως έλεγχοι) και, ή TIMP- 1. Τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν για την αντοχή τους σε πουρομυκίνη και συνενώθηκαν πληθυσμών των ανθεκτικών προστάτη και του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα φάρμακο με ή χωρίς την έκφραση του εξωγενούς V5-επισύναψη επιτόπου ΤΙΜΡ-1 χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Αντι-V5 mAb (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της έκφρασης του εξωγενούς ΤΙΜΡ-1 (ΤΙΜΡ-1v5).

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (qPCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (τεχνολογίες Life, Carlsbad,) και χρησιμοποιήθηκε για να συντεθεί cDNA με Superscript III πλατίνα ενός σταδίου κιτ qPCR ( Life Technologies). QPCR αναλύσεις της έκφρασης mRNA ανθρώπινου ΤΙΜΡ-1 πραγματοποιήθηκαν με προσδιορισμό έκφρασης Taqman γονιδίου (Hs00171558_m1) επί ViiA7 πραγματικού χρόνου PCR μηχάνημα με Taqman καθολικής 2 × κύριο μείγμα (Life Technologies). Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου κανονικοποιήθηκαν σε ενδογενείς ελέγχου ακτίνης (εκκινητή περιορισμένη ανιχνευτή, Life Technologies).

ELISA Ανάλυση

ΤΙΜΡ-1 σε καρκίνο του προστάτη υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας και ορούς ασθενών μετρήθηκαν με την ανθρώπινη ΤΙΜΡ-1 ELISA Duoset (R &? D Systems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, για τη μέτρηση της ΤΙΜΡ-1 σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας, 2 × 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους 60 mm. Μετά όλα τα κύτταρα έχουν συνδέσει, τα κύτταρα αντικαταστάθηκαν σε φρέσκο ​​πλήρες μέσο για 24 ώρες. υπερκείμενα καλλιέργειας κυττάρων συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Διάφορα υπερκείμενα των κυττάρων αραιώνονται ανάλογα για να χωρέσει μέσα στο εύρος των πρότυπων καμπυλών. Ασθενής οροί αραιώνονται 400 πτυχώσεις πριν από τη δοκιμασία για να χωρέσει μέσα στο εύρος της πρότυπης καμπύλης.

Ανάλυση Western Blot και ERK και ΑΚΤ φωσφορυλίωση

Οι κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίζονται με 4 ρυθμιστικό δείγματος × SDS Laemmli χωρίς τη βαφή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης από όλα τα δείγματα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Bio-Rad D

γ Protein Assay Αντιδραστήρια. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών αναλύθηκαν με κηλίδωση Western όπως περιγράφεται [37]. Ο καρκίνος του προστάτη και του προστάτη κύτταρα κύτταρα CAF καλλιεργήθηκαν μέχρι υπο-συρροής και να μεταφέρονται σε μέσο απαλλαγμένο από ορό (SFM) για 48 και 24 ώρες, αντίστοιχα. Καθαρισμένη ανθρώπινη (amp 250 ng /ml, R &? D Systems) ΤΙΜΡ-1 εφαρμόστηκε στα κύτταρα καρκίνου προστάτη σε παντελή στέρηση ορού και τα κύτταρα του προστάτη CAF για 3 και 12 ωρών. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύονται και ίσες ποσότητες εκχυλίζεται πρωτεΐνες αναλύθηκαν με western αποτύπωση με αντι-φωσφο-ERK1 /2 ή -φωσφο-ΑΚΤ και αντι-ERK1 /2 ή αντι-ΑΚΤ για την ανίχνευση φωσφορυλιωμένης και συνολικά ποσά των ERK1 /2 και ΑΚΤ πρωτεΐνες, αντίστοιχα.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού και Δοκιμασία Μετανάστευσης

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκε με σπορά CAFS προστάτη και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα σε 2 × 10

3 ή 4 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και λεπτομερής στο σχήμα λεζάντες σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν σε διαφορετικά μέσα καλλιέργειας όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο σχήμα θρύλους. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο απουσία ή παρουσία 250 ng /ml από ΤΙΜΡ-1 ή το εμπλουτισμένο μέσο. Αυτά τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν με νωπό μέσο με ή χωρίς ΤΙΜΡ-1 ή τα προσαρμοσμένα μέσα κάθε μέρα. Οι δοκιμασίες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν σε ένα σύνολο των κυττάρων κάθε μέρα με τη χρήση του αντιδραστηρίου Πρόμιγμα WST1 (Takara) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμασίες μετανάστευσης Transwell διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [37]. Εν συντομία, 0.5 χ 10

6 ή 1 × 10

6 κύτταρα /ml CAFS προστάτη σε 2% FBS media DMEM /F12 τοποθετήθηκαν στους άνω θαλάμους των ενθέτων Transwell (Costar) εις τριπλούν. 2% FBS media-DMEM /F12 με την παρουσία 250 ng /ml από ΤΙΜΡ-1 ή το εμπλουτισμένο μέσο προσετέθη στα κάτω διαμερίσματα του κάθε φρεάτιο. Μετά την επώαση στους 37 βαθμούς για 30 ώρες, οι CAFS οποία μετανάστευσαν μέσα από το transwell και έφθασε κάτω των ενθεμάτων μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με τη χρήση της Diff-Quick Stain Set (Siemens). Τα χρωματισμένα κύτταρα σε 20 επιλεγμένα τυχαία 200 × μικροσκοπικά πεδία ήταν τότε αντιμετωπιστεί με τη χρήση του λογισμικού QCapture Imaging.

Καρκίνος in vivo πειράματα ανάπτυξης

Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ΝΙΗ και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Mount Sinai School of Medicine. Συγκεντρωτικά πληθυσμοί PC3, 22RV1, LAPC-4, HCT116, και ΗΤ-29 κύτταρα σε μεταγωγή με ρετροϊούς που μεταφέρουν άδειο φορείς έκφρασης ή υπερεκφράζουν ΤΙΜΡ-1 χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα υποδόριου ανάπτυξη καρκίνου. Εν συντομία, 2 χ 10

6 (PC3, HCT116, και ΗΤ-29) ή 5 × 10

6 (22RV1 και LAPC-4) κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε κάθε ανοσοκατεσταλμένους Rag-2 /II2rg ποντικού (Taconic) . Έξι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για κάθε τύπο των μολυσμένων κυττάρων καρκίνου. Μετά στερεών όγκων έγιναν ορατές, μακρύτερες και βραχύτερες διάμετροι των συμπαγών όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό παχύμετρο σε διαστήματα και μήκος όπως υποδεικνύεται στα σχήματα. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: όγκος όγκου = 1/2 × (συντομότερη διάμετρος)

2 × μακρύτερη διάμετρος (mm

3). Στο τέλος των πειραμάτων, όλα τα καρκινώματα σταθεροποιήθηκαν και τομές για ιστολογική και ανοσολογικές αναλύσεις.

Ιστολογία και ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Ιστολογία διεξήχθη όπως περιγράφεται [35]. τομές παραφίνης που προέρχεται από καρκίνο του προστάτη και του παχέος εντέρου σε δείγματα ασθενών (CHTN) και του προστάτη και καρκίνο του παχέος εντέρου ιστών από το

in vivo πειράματα

αντέδρασαν με διαφορετικά αντισώματα όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο σχήμα θρύλους.

Στατιστικά

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή +/- SD.

t

δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν στατιστικές διαφορές μεταξύ του ελέγχου και πειραματικών ομάδων. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα TIMP-1 ορού είναι αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με τους άνδρες χωρίς καρκίνο

Serum ΤΙΜΡ-1 έχει αναφερθεί ότι είναι αυξημένη σε μαστού, γαστρικό, καρκίνου του παχέος εντέρου και διάφορες άλλες μορφές καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε τα επίπεδα ορού ΤΙΜΡ-1 σε 140 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε διάφορα στάδια της νόσου και 16 αρσενικά χωρίς γνωστή ένδειξη καρκίνου του προστάτη συμπεριλαμβανομένων ασθενών με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη με σάντουιτς ELISA. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι οι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη είχαν κατά μέσο όρο ορού ΤΙΜΡ-1 συγκέντρωση 351,4 ng /ml, σημαντικά υψηλότερο από το μέσο όρο συγκέντρωσης 211,0 ng /ml παρατηρήθηκαν σε άνδρες χωρίς καρκίνο του προστάτη που προσλαμβάνονται από μια κλινική ουρολογία (

ρ

& lt? 0.001) (Σχήμα 1Α).

Α. Ορός ΤΙΜΡ-1 ήταν σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (

ρ

& lt? 0.001) όπως μετρήθηκε με ELISA σάντουιτς (R &? D Systems). n = 16 για φυσιολογικά άτομα (Ctrl) και n = 140 για ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (PCA). Β Αντιπροσωπευτικές εικόνες δείχνουν ότι ΤΙΜΡ-1 είναι αυξημένα σε στρώμα του καρκίνου του προστάτη (η = 6) σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς (n = 6): ΤΙΜΡ-1 πρωτεϊνικών επιπέδων σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς του προστάτη (Bc και δ) και φυσιολογικό ανθρώπινο προστάτη ιστούς (Ba και β) αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ΤΙΜΡ-1 (R &? D Systems). 1070624A: προστάτη δείγμα αδενοκαρκίνωμα από 73 χρόνια παλιά WM (σκορ Gleason 4 + 4 = 8? PSA 5,6). 1070717A: αδενοκαρκινώματος προστάτη ιστών από 53 ετών WM (σκορ Gleason 4 + 3 = 7? PSA του 8,03). Bar, 100 μm. CD. ΤΙΜΡ-1 έκφραση ανυψώθηκε σε πιο επιθετικά κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη. ΤΙΜΡ-1 mRNA (C) και της πρωτεΐνης (Δ) της έκφρασης σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου qPCR (C) και σάντουιτς ELISA (D), αντίστοιχα. ΤΙΜΡ-1 mRNA κανονικοποιήθηκε προς βήτα-ακτίνης σε ένα duplex qPCR. ΤΙΜΡ-1 πρωτεΐνης σε ρυθμισμένα μέσα από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές γραμμές μετρήθηκε με ΤΙΜΡ-1 ELISA Duoset (R &? D Systems).

Η

Ανθρώπινο στρώμα του καρκίνου του προστάτη εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα του ΤΙΜΡ-1

Για τον προσδιορισμό του επιπέδου έκφρασης ΤΙΜΡ-1 σε μία ποικιλία ανθρώπινων τύπων καρκίνου, ψάξαμε σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης σε www.oncomine.org, η οποία έδειξε ότι τα επίπεδα ΤΙΜΡ-1 μεταγραφής είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα στους περισσότερους ανθρώπινους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου καρκίνος σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς (Σχήμα S1). Εκτός από το Σχήμα 1Α, μελέτες έχουν δείξει ότι το ΤΙΜΡ-1 επίπεδα στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη είναι αυξημένα και τα αυξημένα επίπεδα ΤΙΜΡ-1 προβλέπουν για μειωμένη επιβίωση των ασθενών ευνουχισμού ανθεκτικών (CR) του καρκίνου του προστάτη [25,38]. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω εντοπισμός της ΤΙΜΡ-1 σε ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη και τον προσδιορισμό του δυναμικού πηγή (ές) του πλάσματος αυξημένα ΤΙΜΡ-1, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε ένα πάνελ από δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και των φυσιολογικών ιστών του προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΤΙΜΡ-1 πρωτεΐνη επάνω ρυθμίζεται κυρίως σε στρώμα του καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικά ομόλογό του (Σχήμα 1Β).

Για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης ΤΙΜΡ-1 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη, θα συναρμολογηθεί ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπινου προστάτη (LNCaP, VCAP, LAPC-4, 22RV1, DU145, PC3 και PC3 /Μ), μια απαθανάτισε κανονική γραμμή του επιθηλίου του προστάτη (RWPE-1) και κακοήθεις παράγωγο της (WPE1-NB26-65) [39]. αξιολογήθηκαν Επίπεδα ΤΙΜΡ-1 mRNA και της πρωτεΐνης σε αυτά τα κύτταρα, αντίστοιχα, από τις αναλύσεις qPCR και σάντουιτς ELISA χρησιμοποιώντας ρυθμισμένα μέσα που προκύπτουν από αυτές τις κυτταρικές σειρές. Τόσο τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές γραμμές εκφράζουν διάφορα επίπεδα της ΤΙΜΡ-1 και ότι περισσότερο κακοήθεις κυτταρικές σειρές όπως DU145, PC3 και PC3 /M εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα ΤΙΜΡ-1 τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 1 C-D) . Σταθερά, WPE1-NB26-65, ένας κακοήθης κυτταρική γραμμή που προέρχεται από αθανατοποιημένα προστάτη επιθηλιακή κυτταρική σειρά RWPE-1, που εκφράζεται περίπου 10 φορές περισσότερο ΤΙΜΡ-1 από γονική κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1 C-D), δείχνοντας ότι η αυξημένη ΤΙΜΡ-1 έκφραση σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα λειτουργούν κατά το καθιερωμένο δόγμα και να προτείνει ένα προ-καρκινικά αντί για αντικαρκινική δράση του TIMP-1.

TIMP-1 προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη

Για τον προσδιορισμό του δυνητικού ρόλου του ΤΙΜΡ-1 σε εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη, επιλέξαμε τρία κύτταρα καρκίνου προστάτη, PC3, 22RV1, και LAPC-4, επειδή είναι σε θέση να σχηματίζουν όγκους σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, ώστε να υπερεκφράζουν V5-επισύναψη επιτόπου εξωγενές ΤΙΜΡ-1 (Σχήμα 2Α) . PC3, 22RV1, και τα κύτταρα LAPC-4 μεταγωγή με τα κενά φορείς έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Η αυξημένη έκφραση του V5-επισύναψη επιτόπου ΤΙΜΡ-1 ελέγχθηκε με στύπωμα Western αναλύσεις υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας των συγκεντρωμένων πληθυσμών των μετατραπέντων κυττάρων καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 2Α). Αυτά ομαδοποιήθηκαν πληθυσμοί μεταγόμενα κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε Rag-2 /II2rg ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια και οι ρυθμοί ανάπτυξης των όγκων αξιολογήθηκαν και υπολογίζεται όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 προωθείται σημαντικά την ανάπτυξη των PC3, 22RV1, και LAPC-4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη

in vivo

(Σχήμα 2Β-Ε) και την προαγωγικός επίδραση του ΤΙΜΡ-1 είναι πιο ισχυρός επί 22RV1 και LAPC-4 κύτταρα, πιθανώς λόγω του χαμηλότερου ενδογενές επίπεδο του ΤΙΜΡ-1 σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3.

Α. Σύσταση συγκεντρωμένων πληθυσμών PC3, 22RV1, και LAPC-4 κύτταρα που εκφράζουν επίτοπο V5 tagged ΤΙΜΡ-1 ή μεταγωγή με τον κενό φορέα έκφρασης μόνο (έλεγχοι). Εκκρίνεται V5-tagged ΤΙΜΡ-1 ανιχνεύθηκε με αντι-V5 mAb (Invitrogen). Β TIMP-1 προάγει PC3 και 22RV1 προστάτη ανάπτυξης καρκίνου του

στο

vivo

. Βάρη των όγκων που προέρχονται από PC3 και 22RV1 προστάτη καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν ΤΙΜΡ-1v5 ή έχουν μολυνθεί με τον κενό κατασκευές έκφρασης (PC3-ελέγχου και 22RV1 ελέγχου) μετρήθηκαν 5 ή 10-εβδομάδων, αντίστοιχα, μετά την υποδόρια εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων σε Rag-2 /II2rg ποντίκια (Taconic). n = 6.

*

σ

& lt? 0,05. Ο-Ε. Οι ρυθμοί ανάπτυξης των υποδόριων όγκων του προστάτη που προέρχονται από PC3 (C), 22RV1 (D), και τα κύτταρα LAPC-4 (Ε) που εκφράζουν ΤΙΜΡ-1v5 ή μεταγωγή με τον κενό φορέα έκφρασης (έλεγχοι) όπως υποδεικνύεται στα πάνελ. Οι ρυθμοί ανάπτυξης εκφράζονται ως ο μέσος του όγκου του όγκου (mm

3) +/- SD. Έξι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για κάθε τύπο μετατραπέντων κυττάρων του προστάτη.

*

σ

& lt? 0,05.

Η

TIMP-1 προάγει τη συσσώρευση των σχετίζονται με τον καρκίνο ινοβλάστες (CAFS) in vivo

Για να αποκτήσουν γνώσεις των πιθανών μηχανισμός στηρίζεται το αποτέλεσμα υπέρ της ανάπτυξης των TIMP-1 σε καρκίνο του προστάτη , εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία (IHC) αναλύσεις των τμημάτων του όγκου που προέρχονται από αυτά

in vivo πειράματα

και παρατήρησε ότι τα τμήματα του όγκου που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη με αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 απεικόνιση αυξημένη ποσότητα CAFS (Εικόνα 3-top και μεσαία πλαίσια). Οι CAFS ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας μυ ακτίνη (SMA) αντίσωμα αντι-άλφα-λείο, το οποίο συνήθως χρησιμοποιείται για να τονίσει CAFS [40-42]. Έχει εδραιωθεί ότι CAFS παίζουν σημαντικούς ρόλους στην προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου και μεσολαβεί θεραπευτική αντίσταση [43,44] και ότι οι CAFS σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εισβολής όγκου και μετάσταση [45-47].

Ο όγκος τομές που προέρχονται από κύτταρα PC3 /22RV1 ελέγχου και PC3 /22RV1-ΤΙΜΡ-1 κύτταρα. Οι τομές χρωματίστηκαν με Η &? Ε (AD) για να αποκαλύψει την ιστολογία του όγκου, με αντι-άλφα λείου μυός ακτίνη (αντι-SMA, R &? D Systems) για την ανίχνευση της από καρκίνο που σχετίζεται ινοβλάστες (CAFS, EH), και με αντι- Κί67 αντίσωμα (BD) για να τονίσετε τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα καρκίνου του προστάτη (IL). Bar, 100 μm σε Α-Η και 50 μm στο I-L. .

Η

TIMP-1 προάγει τον πολλαπλασιασμό του προστάτη καρκινικών κυττάρων in vivo

Είναι δεδομένο ότι CAFS εκκρίνουν πολλοί παράγοντες ανάπτυξης που με τη σειρά τους ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των όγκων και της επιβίωσης [43,46,47 ]. Για να αξιολογηθεί ο τρόπος αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη

in vivo

, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση του Κί67, ενός δείκτη πολλαπλασιασμού, στα τμήματα του όγκου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 αύξησε σημαντικά τον αριθμό των θετικών Κί67 και επομένως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα πάνελ 3-κάτω).

ΤΙΜΡ-1 είναι γνωστό ότι παίζει ένα ρόλο στην προώθηση της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) [48]. Για να ελεγχθεί αν η αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 επάγει έκφραση των δεικτών EMT, αναλύσαμε τα τμήματα του όγκου που προέρχονται από τα

in vivo

πειράματα για την έκφραση του σαλιγκαριού, Slug, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση του σαλιγκαριού, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 αλλά δεν Slug είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω στα τμήματα του καρκίνου του προστάτη που προέρχονται από PC3 και LAPC-4 κύτταρα που υπερεκφράζουν ΤΙΜΡ-1 σε σύγκριση με τα τμήματα που προέρχονται από το PC3 ελέγχου και LAPC-4 κύτταρα (Σχήμα 4).

Τα επίπεδα έκφρασης διαφόρων δεικτών EMT, όπως Σαλιγκάρι (A, E, I, M), Slug (B, F, J, Ν), ΜΜΡ-2 (C, G, K, O), και ΜΜΡ-9 (D, H, L, P) εκτιμήθηκαν στα τμήματα του όγκου που προέρχεται από /PC3 κύτταρα LAPC-4 ελέγχου (AD και IL, αντίστοιχα) και τα κύτταρα PC3 /LAPC-4-ΤΙΜΡ-1 (ΕΗ και ΜΡ , αντίστοιχα). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ΤΙΜΡ-1 ενισχύει την έκφραση του σαλιγκαριού, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, αλλά όχι Slug στους ιστούς καρκίνου του προστάτη. Bar, 50 μm σε Α, Β, Ε, F, I, J, Μ, Ν και 100 μm σε C, D, G, H, K, L, Ο, Π

Η

ΤΙΜΡ -1 είναι αυξημένη στο στρώμα των επιθετικών και μεταστατικών ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και την αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και τη συσσώρευση των CAFS σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Για περαιτέρω την επικύρωση της γενικής δραστηριότητας προ-όγκου TIMP- 1 και η γενική επίδραση της επί CAFS, αξιολογούμε ΤΙΜΡ-1 επίπεδα σε καρκίνο του παχέος εντέρου και φυσιολογικά δείγματα κόλου. Βρήκαμε ότι το επίπεδο ΤΙΜΡ-1 είναι αυξημένη στο στρώμα του καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με εκείνη του φυσιολογικού κόλου και ότι στρώμα αδιαφοροποίητων /υψηλότερη καρκίνου του παχέος εντέρου βαθμό και μεταστατικούς καρκίνους του παχέος εντέρου εμφανίζεται υψηλότερα επίπεδα ΤΙΜΡ-1 σε σύγκριση με στρώμα διαφοροποιημένων /χαμηλότερου βαθμού καρκίνου του παχέος εντέρου (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια αξιολόγησε την επίδραση του TIMP-1 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 προάγει

in vivo

ανάπτυξη των ανθρώπινων HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου (Σχήμα 5 Β-D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΤΙΜΡ-1 δεν χρησιμεύει μόνο ως προγνωστικός δείκτης για πολλαπλές εξέλιξης του καρκίνου, αλλά επίσης προάγει την εξέλιξη του καρκίνου.

A. Αντιπροσωπευτικές εικόνες δείχνουν ότι το επίπεδο ΤΙΜΡ-1 είναι αυξημένη στο στρώμα του καρκίνου του παχέος εντέρου (n = 6, πάνω μέση και κάτω πάνελ) σε σύγκριση με εκείνη του κανονικού κόλου (n = 6, επάνω αριστερά πάνελ). Στρώμα του καρκίνου του αδιαφοροποίητων /ανώτερο βαθμό κόλον (n = 6, το άνω μεσαίο πάνελ, Z4250) και μεταστατικούς καρκίνους του παχέος εντέρου (n = 6, κάτω μεσαίο και κάτω δεξιά πάνελ, Z4250 και 4.081.525) εμφανίζονται υψηλότερα επίπεδα του στρώματος σχετίζεται ΤΙΜΡ-1 σε σύγκριση με εκείνη του καρκίνου του παχέος εντέρου διαφοροποιημένων /χαμηλότερο βαθμό (κάτω αριστερά, Z4265), πρωτοπαθή καρκίνο του παχέος εντέρου (άνω μεσαίο πλαίσιο), ή τα φυσιολογικά αντίστοιχα (φυσιολογικό κόλον, επάνω αριστερά? φυσιολογικό ήπαρ, επάνω δεξιά πάνελ). Bar, 100 μm. Β Western blot αναλύσεις χρησιμοποιώντας αντι-V5 αντισώματος (Invitrogen) διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί η έκφραση του εξωγενούς V5-επισύναψη επιτόπου ΤΙΜΡ-1 (ΤΙΜΡ-1v5) σε HCT116 (αριστερό πάνελ) και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ΗΤ-29 (δεξί πάνελ) . CD. TIMP-1 προάγει HCT116 και ΗΤ-29 την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

στο

vivo

. Βάρη των όγκων που προέρχονται από HCT116 και ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου που εκφράζουν ΤΙΜΡ-1v5 ή έχουν μολυνθεί με τον κενό κατασκευάσματα έκφρασης (μάρτυρες) μετρήθηκαν 6 εβδομάδες μετά την υποδόρια εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων. n = 6.

*

σ

& lt?. 0.05

Η

Για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα του TIMP-1 στις CAFS, εκτελέσαμε παρόμοιες IHC αναλύσεις σχετικά με τα τμήματα των όγκων που προέρχονται από το

in vivo μελέτες

των καρκίνων του παχέος εντέρου HCT116 με ή χωρίς αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1. Βρήκαμε ότι σε σύγκριση με τους όγκους που προέρχονται από κύτταρα HCT116-μάρτυρα (Σχήμα S2A-C), αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 (HCT116-ΤΙΜΡ-1) προάγει τη συσσώρευση CAFS κόλον εντός των όγκων (Σχήμα S2D-F). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν πρώτη υποστήριξη για ένα νέο ρόλο του ΤΙΜΡ-1 στη ρύθμιση της διείσδυσης ή /και επέκταση CAF.

TIMP-1 προάγει τον πολλαπλασιασμό του προστάτη CAF κυττάρων και τη μετανάστευση και ενεργοποιεί Erk1 /2 κινάσες

Για να αποκαλύψει το κυτταρικό μηχανισμό με τον οποίο TIMP-1 προάγει CAF συσσώρευσης και του καρκίνου εξέλιξη

in vivo

, αξιολογήσαμε πρώτα τα αποτελέσματα της ρυθμισμένα μέσα (CM) που προέρχεται από 22RV1-ελέγχου και 22RV1-ΤΙΜΡ-1 κύτταρα σε προστάτη πολλαπλασιασμό CAF και τη μετανάστευση. Βρήκαμε ότι η CM που προέρχεται από 22RV1-ΤΙΜΡ-1 κύτταρα πιο αποτελεσματικά προωθείται πολλαπλασιασμό του καρκίνου του προστάτη και Transwell μετανάστευση σε σύγκριση με το CM που προέρχεται από κύτταρα 22RV1-αναφοράς (Σχήμα S3). Να καθορίσει περαιτέρω εάν καθαρίζεται TIMP-1 μπορεί να ασκήσει παρόμοια αποτελέσματα στην CAFS προστάτη, είχαμε διενεργήσει επιπρόσθετες πειράματα χρησιμοποιώντας καθαρισμένο ανθρώπινο ΤΙΜΡ-1. Βρήκαμε ότι ΤΙΜΡ-1 προωθείται σημαντικά τον πολλαπλασιασμό του CAF προστάτη αλλά όχι εκείνη των κυττάρων καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 6 AC) και ότι ο ΤΙΜΡ-1 σημαντικά αυξημένη κινητικότητα των εν λόγω CAFS (Σχήμα 6D), υποδηλώνοντας ότι ο ΤΙΜΡ-1-μεσολαβούμενη συσσώρευση CAFS του προστάτη είναι πιθανό αποτέλεσμα τόσο βελτιωμένη διείσδυση και επέκταση των CAFS προστάτη εντός των όγκων.

Α-C. CAFS προστάτη ή κύτταρα καρκίνου του προστάτη σπάρθηκαν σε 2 Χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν. Ο καρκίνος του προστάτη κυττάρων και δοκιμασίες πολλαπλασιασμού CAF προστάτη εκτελούνται κάθε ημέρα χρησιμοποιώντας ένα σύνολο από πλάκες των 96 φρεατίων με χρήση κιτ Πρόμιγμα WST1 (Takara) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

*

σ

& lt? 0,05. Δ προστάτη CAFS αξιολογήθηκαν για κινητικότητα τους απέναντι Transwell εμπόδιο κατά τη διάρκεια των 30 ώρες παρουσία ή απουσία 250 ng /ml από ΤΙΜΡ-1. 0.5 χ 10

6 κύτταρα /ml CAFS προστάτη τοποθετήθηκαν στους άνω θαλάμους των ενθέτων Transwell (Costar) εις τριπλούν. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των κυττάρων CAF προστάτη μετανάστευσαν μέσα από τα ένθετα φρεατίων εμφανίζονται. Οι CAFS προστάτη μετανάστευσαν μέσω επικοινωνούντα ένθετα σε 20 τυχαία επιλεγμένες 200 x μικροσκοπικά πεδία μετρήθηκαν.

*

σ

& lt? 0,05. A-D, τα αποτελέσματα δείχνουν αντιπροσωπευτικά μέσα +/- SDs τριπλών ενός από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τα αποτελέσματα TIMP-1 στις CAFS του προστάτη, θα χτυπηθεί κάτω TIMP-1 έκφρασης σε CAFS προστάτη (Σχήμα 7Α) με τη χρήση δύο διαφορετικών Τα siRNAs (Open Biosystems). Βρήκαμε ότι ΤΙΜΡ-1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό knockdown CAF προστάτη και τη μετανάστευση σημαντικά (Σχήμα 7Β-C), υποδηλώνοντας ότι το ΤΙΜΡ-1 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση CAF συμπεριφορές, οι οποίες με τη σειρά τους διαμορφώνουν την εξέλιξη του καρκίνου. Αυτή η αντίληψη υποστηρίχθηκε περαιτέρω από το εύρημα μας ότι του προστάτη CAFS αλλά όχι καρκίνου του προστάτη κύτταρα εκφράζουν ένα υψηλότερο επίπεδο του υποδοχέα ΤΙΜΡ-1, τετρασπανίνη CD63. CD63 είναι μία γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη μεμβράνης που εμφανίζουν ετερογενή μοριακού βάρους (Σχήμα 8Α). ΤΙΜΡ-1 βρέθηκε να ενεργοποιήσει το προ-σηματοδότησης επιβίωσης με σύνδεση προς το σύμπλοκο beta1 CD63 /ιντεγκρίνης στο μητρικό επιθηλιακά κύτταρα [49,50]. Βρήκαμε ότι ΤΙΜΡ-1 ενισχύει ERK1 /2 δραστικότητα του CAFS προστάτη στερήθηκαν ορού αλλά όχι κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 8Β-C), υποδηλώνοντας ότι το

in vivo

επιδράσεις της ΤΙΜΡ-1 επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη θα μπορούσε να είναι ασκείται μέσω επηρεάζουν CAFS προστάτη έμμεσα (Σχήμα 9).

Α. Σχετικά επίπεδα της ΤΙΜΡ-1 σε CAFS προστάτη μολυσμένα με μη-στόχευση Τα siRNAs ή Τα siRNAs κατά ΤΙΜΡ-1 εκτιμήθηκαν με ELISA και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δύο ΤΙΜΡ-1 Τα siRNAs χτυπηθεί κάτω έκφραση ΤΙΜΡ-1 κατά ~ 70% και -50%, αντίστοιχα. B. προστάτη CAFS σπάρθηκαν σε 4 Χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού τριπλούν και CAF προστάτη πραγματοποιήθηκαν κάθε μέρα χρησιμοποιώντας ένα σύνολο από πλάκες των 96 φρεατίων με χρήση κιτ Πρόμιγμα WST1 (Takara).

*

σ

& lt? 0,05. Γ προστάτη CAFS αξιολογήθηκαν για κινητικότητα τους απέναντι Transwell εμπόδιο κατά τη διάρκεια των 30 ώρες παρουσία ή απουσία 250 ng /ml από ΤΙΜΡ-1. 1 x 10

6 κύτταρα /ml CAFS προστάτη τοποθετήθηκαν στους άνω θαλάμους των ενθέτων Transwell (Costar) εις τριπλούν. Οι CAFS προστάτη μετανάστευσαν μέσω φρεατίων σε 20 τυχαία επιλεγμένες 200 x μικροσκοπικά πεδία μετρήθηκαν.

*

σ

& lt? 0,05.

Η

Α. Η έκφραση της πρωτεΐνης CD63 σε διάφορες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, ανθρώπινους ινοβλάστες προστάτη (HPRF), και την ανθρώπινη CAFS προστάτη (PCAFs) προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-CD63 αντίσωμα, το οποίο αναγνωρίζει ετερογενής γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη CD63. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης (κάτω πάνελ). Π.Χ. κύτταρα στερούνται ορού CAF προστάτη (Β) και 22RV1 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (C) που παρέχεται με μέσο χωρίς ορό (SFM) ή SFM που περιείχε 250 ng /ml από ΤΙΜΡ-1 για 3 και 12 ωρών. Τα κύτταρα λύθηκαν και οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-ERK1 /2 ή αντι-φωσφο-ΑΚΤ αντισώματα (άνω πάνελ), ή αντι-ERK1 /2 ή αντι-ΑΚΤ αντισώματα (κάτω πάνελ).

Η

: Αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1 από κύτταρα όγκου και CAFS οδηγεί σε αυξημένο πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση CAF μέσω δέσμευσης του ΤΙΜΡ-1 με τον υποδοχέα ΤΙΜΡ-1, CD63 εκφράζεται επί CAFS, η οποία οδηγεί σε συσσώρευση του CAFS μέσα στους ιστούς του καρκίνου.