Αφηρημένο

Ιστορικό

Τόσο γαστρικού και του παχέος εντέρου (CRC) είναι οι πιο συχνές κακοήθειες σε όλο τον κόσμο με τη συνολική επιβίωση των ασθενών αυτών παραμένει ανικανοποίητο. Ταυτοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΕΠΠΕ) φιμώνονται από υποστηρικτής CpG μεθυλίωση αποκαλύπτει μηχανισμοί της ογκογένεσης και προσδιορίζει νέα επιγενετική βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου και την αξιολόγηση πρόγνωση. ΚυσταθειονίνΓΚ-βήτα-συνθάσης (CBS) λειτουργεί στην οδό φυλλικού οξέος μεταβολισμό, η οποία είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με μεθυλίωση του γενωμικού DNA. Απορύθμιση της μεθυλίωσης του DNA συμβάλλει ουσιαστικά στην ανάπτυξη του καρκίνου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Για τον εντοπισμό δυνητικών ΕΠΠΕ φιμώνονται από ανώμαλη μεθυλίωση προαγωγού σε CRC, αναλύσαμε όγκου και των παρακείμενων ιστών από τις περιπτώσεις CRC χρησιμοποιώντας το Illumina Ανθρώπινα Methylation45 BeadChip. Εντοπίσαμε υπερμεθυλίωση το

CBS

γονιδίων σε δείγματα CRC, σε σύγκριση με γειτονικούς ιστούς. Η μεθυλίωση και μειωμένη έκφραση του mRNA του

CBS

ανιχνεύθηκαν στις περισσότερες CRC κυτταρικές γραμμές με μεθυλίωση-ειδική PCR και ημιποσοτική RT-PCR, καθώς και σε γαστρικό καρκίνο. Η θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη και /ή τριχοστατίνη Α ανάστροφου μεθυλίωση και αποκαθίσταται

CBS

έκφραση mRNA υποδεικνύοντας μια άμεση επίδραση. Η ανώμαλη μεθυλίωση περαιτέρω ανιχνεύθηκε στο 31% της πρωτογενούς CRCs (29, 96) και το 55% των γαστρικών όγκων (11 από 20). Σε αντίθεση, η μεθυλίωση ήταν σπάνια βρέθηκε σε φυσιολογικούς ιστούς πλησίον του όγκου.

CBS

μεθυλίωση συνδέθηκε με

KRAS

μεταλλάξεις στην πρωτοβάθμια CRCs (

P

= 0,04, με χ

2-test). Ωστόσο, δεν διαπιστώθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ

CBS

μεθυλίωση ή

KRAS

μεταλλάξεις με τον καρκίνο υποτροπή /μετάσταση στο Στάδιο ΙΙ ασθενείς CRC.

Συμπέρασμα

Ένα μυθιστόρημα εύρεση από αυτή τη μελέτη είναι ότι το φυλλικό οξύ ένζυμο μεταβολισμού του

CBS

επίπεδα mRNA συχνά μειωτικά μέσω CpG μεθυλίωσης του

CBS

γονιδίου σε καρκίνο του στομάχου και CRC, γεγονός που υποδηλώνει ότι

CBS

λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Τα ευρήματα αυτά χρήζουν περαιτέρω μελέτης του

CBS

ως επιγενετική βιοδείκτη για τη μοριακή διάγνωση των γαστρεντερικών καρκίνων

Παράθεση:. Zhao Η, Li Q, Γουάνγκ J, Su Χ, Ng KM, Qiu Τ, et al. (2012) Η συχνή Επιγενετική αποσιώπηση του Φυλλικό οξύ-μεταβολίζουν Gene

ΚυσταθειονίνΓΚ-β-συνθετάση

στον Καρκίνο του γαστρεντερικού συστήματος. PLoS ONE 7 (11): e49683. doi: 10.1371 /journal.pone.0049683

Επιμέλεια: Αντώνης WI. Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 27 Ιουλ 2012? Αποδεκτές: 11 του Οκτωβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30801344), του Πεκίνου Nova πρόγραμμα (Αρ 2009A70) και το πρόγραμμα κράτους Βασικά Εργαστήριο (Νο 2060204). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τόσο γαστρικού και του παχέος εντέρου είναι οι πιο συχνές κακοήθειες σε όλο τον κόσμο του οποίου η συχνότητα έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια [1], [2]. Αν και ποικίλες νέες μορφές θεραπείας, συμπεριλαμβανομένων των χειρουργικών, ιατρικών, και ακτινολογικά, έχουν εισαχθεί, η κλινική πορεία του στομάχου και του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) είναι μεταβλητή και η γενική πρόγνωση παραμένει μη ικανοποιητική. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των βασικών γονιδίων που εμπλέκονται στη μοριακή παθογένεση του καρκίνου του στομάχου και CRC είναι πιθανό να οδηγήσει σε νέες και πιο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές.

Η αδρανοποίηση των πολλαπλών ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΕΠΠΕ) είναι ένα βασικό μοριακό γεγονός στην πολλαπλών σταδίων γενετική παθογένεση της CRC [3]. Εκτός από τις γενετικές αλλαγές, επιγενετική αδρανοποίηση των ΟΚΓ παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση [4]. Επιγενετική αποσιώπηση μέσω παρεκκλίνουσα μεθυλίωση των νησίδων CpG (CGI) στις περιοχές υποκινητή ΕΠΙΠ εμφανίζεται σχεδόν σε όλους τους τύπους όγκων [4]. Ιδιαίτερα, μια αυξανόμενη λίστα των έκτροπα μετουσιωμένο ΕΠΠΕ έχει αναφερθεί σε CRCs, συμπεριλαμβανομένων των

APC

,

MGMT

,

MLH1

,

p16

ΙΝΚ4 &

,

VHL

,

RASSF1A

,

HIC1

,

CHFR

,

ADAMTS18

,

PCDH10

και

DLEC1

[5] – [10], καθώς και σε καρκίνο του στομάχου [11], [12]

στην παρούσα μελέτη, ελέγχονται για ΕΠΠΕ φιμώνονται από ανώμαλη μεθυλίωση προαγωγού σε CRC. και βρέθηκε υπερμεθυλίωση του γονιδίου

cystathionine-βήτα-συνθάση

(

CBS

) που κωδικοποιεί για ένα ένζυμο-κλειδί στον μεταβολισμό του φολικού οξέος [13], [14]. Πρόσφατες εργασίες έχει επικεντρωθεί σε ένζυμα που εμπλέκονται σε φολικό οξύ μεταβολισμό, δεδομένου ότι μεθυλίωση του DNA εξαρτάται από αυτές τις πορείες [15] – [19]. Γενετική αστάθεια με τη χαρακτηριστική χρωμοσωμική ανισορροπίες είναι ένα χαρακτηριστικό της καρκινογένεσης. Η ομοκυστεΐνη και φυλλικό οξύ μεταβολισμός σχετίζεται με την ακεραιότητα του DNA και γενετικές παραλλαγές που επηρεάζουν λειτουργικά ομοκυστεΐνης και του μεταβολισμού φολικού οξέος συνδέονται με διάφορα είδη καρκίνου, όπως CRC, λέμφωμα μη-Hodgkin, κλπ [20], [21]. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να εξετάσει κατά πόσον

CBS

ήταν ένα νέο δυναμικό ΕΠΠΕ και να ελέγξετε εάν

CBS

έκφραση του mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω από υπερμεθυλίωση προαγωγού στην CRC, καθώς και σε καρκίνο του στομάχου. Ερευνήσαμε επίσης τον δυνητικό ρόλο του

CBS

γονίδιο υπερμεθυλίωση ως βιοδείκτη για την πρόβλεψη υποτροπής του όγκου ή μετάσταση στο στάδιο ΙΙ (Τ

3Ν

0M

0) ασθενείς CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Ελσίνκι για τα ανθρώπινα υποκείμενα μελέτες και εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Αντικαρκινικού Νοσοκομείου, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών (ΚΑΜΕΡΕΣ), Πεκίνο, Κίνα. Υπεγράφη ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη για τη συλλογή και την ανάλυση των δειγμάτων.

τηλέφωνα Γραμμές

Τέσσερις CRC (HCT116, ΗΤ29, LoVo και SW480) και 16 του γαστρικού καρκίνου (Κάτω III, YCC1, YCC2, YCC3, YCC6, YCC7, YCC9, YCC10, YCC11, YCC16, SNU719, AGS, ΜΚΝ28, ΜΚΝ45, SNU 1 και SNU 16) κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν [10]. Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν με συνήθη τρόπο σε RPMI-1640 με 10% FBS. Η HCT116 κυτταρική γραμμή με τη γενετική νοκ-άουτ γονιδίων μεθυλ-τρανσφεράσης DNA

DNMT1

και

DNMT3B

(διπλό νοκ-άουτ, HCT116

DKO) ήταν ένα δώρο από τον Dr. Bert Vogelstein, Johns Hopkins University [22] και καλλιεργήθηκαν παρουσία των 0,4 mg /ml genecitin ή 0,05 mg /ml υγρομυκίνη.

δείγματα όγκων

Όλα τα πρωτογενή δείγματα των οποίων τέσσερα ζεύγη φρέσκα CRC και φυσιολογικούς ιστούς, 96 πρωτοβάθμια φορμόλη σταθερό παραφίνη παραφίνη ιστούς (FFPE) CRC και 20 FFPE γαστρικό καρκίνο των ιστών, ελήφθησαν από το Τμήμα Παθολογίας, Αντικαρκινικό Νοσοκομείο, ΚΑΜΕΡΕΣ, Πεκίνο, Κίνα. Επιπλέον, για τη μελέτη μεθυλίωση, αναλύθηκαν αντίστοιχο άνευ όγκου περιθώρια από 20 γαστρικό καρκίνο και 17 ασθενείς CRC. Όλοι οι ασθενείς δεν υποβλήθηκαν σε προηγούμενη χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, δεδομένου ότι παρουσιάζονται με χειρουργικά εξαιρέσιμων όγκων. Φρέσκα δείγματα καταψύχθηκαν ακαριαία εντός υγρού N

2 και ακολούθως αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι να μεταποιηθούν. Η διάγνωση επιβεβαιώθηκε με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) -χρώση και ιστοπαθολογική ανάλυση διεξήχθη για να καθορίσουν αντιπροσωπευτικές περιοχές του όγκου. Κλινικές πληροφορίες ήταν διαθέσιμες για όλους τους CRC ασθενείς, συμπεριλαμβανομένου του φύλου, της ηλικίας, της διαφοροποίησης, και τα δεδομένα παρακολούθησης. Η μέση ηλικία των ασθενών CRC ήταν 68 έτη (εύρος 37-93), και αναλογία ανδρών-γυναικών ήταν 1.4:1 (56:40). Ο αριθμός των καλά, μέτρια και κακής διαφοροποίησης περιπτώσεις ήταν 14, 56 και 26, αντίστοιχα. Καρκίνος στάσης (pTNM) ορίστηκε σύμφωνα με την 7

η έκδοση του αμερικανικού Μικτής Επιτροπής του καρκίνου [23]. Όλα τα CRC ασθενείς είναι στο στάδιο ΙΙ (PT

3Ν

0M

0).

DNA και RNA Extraction

Το συνολικό RNA και του DNA που εξάγεται από κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το Το αντιδραστήριο TRI (Κέντρο Μοριακής Έρευνας). Για τα νωπά ιστούς όγκων, ελήφθησαν και επανεξετάζονται για να βεβαιωθείτε ότι το περιεχόμενό του όγκου ήταν περισσότερο από το 80% της περιοχής τμήμα κατεψυγμένων τομών. DNA εκχυλίστηκε από φρέσκο ​​ιστούς και δείγματα FFPE χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp® DNA Mini (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η φαρμακολογική απομεθυλίωση

Δύο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (YCC10 και SNU719) και ένα CRC (HCT116) κυτταρική γραμμή με σιγήσει

CBS

υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 υΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (αζα) (Sigma) επί τρεις ημέρες και ακολούθησε με 100 ηΜ τριχοστατίνη Α (TSA, Cayman) για μία ημέρα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Μετά την επεξεργασία, το συνολικό DNA και RNA εκχυλίστηκε.

μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση

Όλα τα δείγματα DNA υποβλήθηκαν σε τροποποίηση όξινου θειώδους χρησιμοποιώντας το EZ μεθυλίωσης του DNA Kit (Zymo Research) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα μg γονιδιωματικού DNA από κάθε δείγμα ήταν διθειώδες μετατροπή και εκλούεται σε ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης 18 μΙ, και 5 μΐ από κάθε δείγμα αναλύθηκε με την δοκιμασία μεθυλίωσης Illumina Infinium DNA χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη Methylation45 BeadChip (Infinium Μεθυλίωση 450 Κ, Illumina), η οποία είναι ένα αλληλόμορφο-ειδική δοκιμασία με 480.000 CpG θέσεις που καλύπτουν ολόκληρο το γονιδίωμα [25]. Τα πρωτόκολλα και οι πληροφορίες καθετήρα είναι διαθέσιμα σε www.illumina.com. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας μεθυλίωσης του DNA, έχουν συγκεντρωθεί για κάθε τόπο, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Illumina Bead Studio (Illumina) και αναφέρονται ως βήτα τιμές (β) τα οποία είναι τα σκορ μεθυλίωσης του DNA που κυμαίνονται από 0 έως 1, αντανακλώντας την κλασματική επίπεδο μεθυλίωσης DNA ενός μονού CpG περιοχή [25].

ημι-ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR)

RT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9], με τη χρήση

GAPDH

ως έλεγχος. Οι εκκινητές για το

CBS

παρατίθενται στον Πίνακα 1. Το πρόγραμμα PCR χρησιμοποιείται μια αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, 35 κύκλοι (94 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s), και ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 ° C για 10 λεπτά.

Η

KRAS

Μετάλλαξη Ανίχνευση με Real-time PCR

Οι επτά hotspot μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 και 13 του

KRAS

γονιδίου εξετάστηκαν με τη χρήση του Ανθρώπου

KRAS

Mutation ποιοτική ανίχνευση Kit (ΣΕΤΚ Biotech Ltd.). Φθορίζοντες ανιχνευτές σχεδιάστηκαν για να ανιχνεύσουν ειδικά 7 διαφορετικές σημειακές μεταλλάξεις (G12V /S /R /D /A /C και G13D). Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας το σύστημα πραγματικού χρόνου PCR MX3000P (Stratagene). Παρουσία ή απουσία μεταλλάξεων εκτιμήθηκε ποιοτικά από την καμπύλη ενίσχυση του φθορισμού.

διθειώδους Θεραπεία και μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) Ανάλυση

όξινου θειώδους τροποποίηση του DNA διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως χρησιμοποιώντας 2,4Μ μεταδιθειώδες νάτριο [26]. MSP διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Οι MSP εναρκτήρες που απαριθμούνται στον Πίνακα 1. ειδικότητα εκκινητή MSP PCR επιβεβαιώθηκε καθώς δεν ενισχύουν μη-όξινο θειώδες επεξεργασμένο πρότυπα γονιδιωματικό DNA. Τα προϊόντα MSP των επιλεγμένων δειγμάτων επιβεβαιώθηκαν με άμεση αλληλούχιση.

Στατιστική Ανάλυση

χ

2 τεστ χρησιμοποιήθηκαν για να αναλύσει πιθανές συσχετίσεις μεταξύ κλινικών παραμέτρων,

KRAS

μετάλλαξη και

CBS

κατάσταση μεθυλίωσης των δειγμάτων όγκου. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS for Windows.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Αναγνώριση

CBS

ως υπερμεθυλίωση Gene στο CRC

αναλύονται όγκου και των παρακείμενων ιστών από τέσσερις Κινέζοι περιπτώσεις CRC χρησιμοποιώντας Illumina σειρά μεθυλίωσης που διαλογή 480.000 CpG

τόπους

καλύπτει το σύνολο του γονιδιώματος. Μεταξύ όλων των CpG θέσεων που υπερμεθυλίωση σε δείγματα όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), τέσσερα CpG θέσεις που βρίσκονται βρίσκονταν στο

CBS

γονίδιο (Σχήμα 1Α). Ανάλυση της γονιδιωματικής αλληλουχίας του

CBS

γονίδιο, αποκάλυψε ότι υποθετικό προαγωγό του, το εξόνιο 1 και ιντρόνιο 1 ήταν μία τυπική CGI και έτσι ευπαθή σε επιγενετικές σίγηση (Σχήμα 1Α) [27].

Μια

, σχηματικό διάγραμμα του

υποστηρικτής CBS

νησί CpG (CGI), με το εξόνιο 1 (μαύρο ορθογώνιο), CpG θέσεις (short κάθετες γραμμές), περιοχή MSP εμφανίζεται. Η θέση έναρξης μεταγραφής υποδεικνύεται με ένα καμπύλο βέλος. Οι τέσσερις θέσεις CpG βρίσκεται στο

CBS

γονιδίου περιοχής που προσδιορίζονται από Illumina συστοιχία μεθυλίωση να υπερμεθυλιωμένο σημαντικά το όγκου σε σύγκριση με μη καρκινικούς ιστούς (CT /CN) δείχνονται.

Β

, έκφραση του

CBS

ανιχνεύεται εύκολα σε φυσιολογικούς ιστούς.

C

, Έκφραση και μεθυλίωση του

CBS

σε κυτταρικές σειρές καρκίνου εξετάστηκαν με RT-PCR και MSP, με

GAPDH

ως μάρτυρας. Μ, μετουσιωμένες, U, μη μεθυλιωμένα.

Η

Η συχνή κατασιγάσει του

CBS από

Διοργανωτής μεθυλίωση σε πολλαπλές CRC και τον καρκίνο του γαστρικού Γραμμές κυττάρων

Προηγουμένως,

CBS

έχει δειχθεί ότι εκφράζεται έντονα στον εγκέφαλο, καθώς επίσης και το ήπαρ, το πάγκρεας, τα νεφρά και εμβρυϊκούς ιστούς [13]. Για να εξεταστεί περαιτέρω η συσχέτιση μεταξύ

CBS

μεθυλίωση και η έκφραση του mRNA, ερευνήσαμε πρώτα ένα πάνελ κανονικών ανθρώπινων ιστών με ημιποσοτική RT-PCR. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

CBS

εκφράστηκε σε όλους τους φυσιολογικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου, του ορθού και του στομάχου, αν και σε διαφορετικά επίπεδα έκφρασης. Το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης βρέθηκε στο πάγκρεας και το αναπνευστικό σύστημα ιστούς (λάρυγγας, τραχεία και πνεύμονες), ενώ χαμηλή έκφραση ήταν σε ιστό του μυελού των οστών (Εικόνα 1Β).

Για να αντίθεση

CBS

έκφραση σε φυσιολογικό ιστών σε κακοήθη κύτταρα, αναλύσαμε το γαστρεντερικό κυτταρικές γραμμές όγκου. Ημιποσοτική RT-PCR έδειξε ότι

CBS

έκφραση μειώθηκε ή σιγήσει στο 56,3% (9/16) του καρκίνου του στομάχου και του 75,0% (3/4) των κυτταρικών σειρών CRC (Σχήμα 1C).

CBS

κατάσταση μεθυλίωσης αναλύθηκε επίσης με MSP σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε ότι οι κυτταρικές σειρές με μειωμένη ή σιγήσει

CBS

έκφραση είχε μεθυλιωμένο υποστηρικτές, ενώ δεν μεθυλίωση βρέθηκε στην κανονική

CBS

κυττάρων έκφρασης γραμμές (Σχήμα 2Β), υποδεικνύοντας ότι

CBS

μεθυλίωση υποκινητής είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για μεταγραφική σίγηση του γονιδίου αυτού στα περισσότερα των εξετασθέντων καρκινικές κυτταρικές γραμμές CRC και του στομάχου.

A

, φαρμακολογική ή γενετική απομεθυλίωση χρησιμοποιώντας Αζα με TSA επάγει

CBS

έκφραση σε μετουσιωμένο και φιμώνονται κυτταρικές σειρές. Α + Τ: Aza και θεραπεία TSA.

Β

, τα αποτελέσματα Εκπρόσωπος MSP της

CBS

μεθυλίωση σε πρωτογενή καρκίνο του στομάχου (GC) και του παχέος εντέρου (CRC). U: MSP για μη μεθυλιωμένα υποκινητή, Μ:. MSP για μεθυλιωμένα υποστηρικτής

Η

Αποκατάσταση του

CBS

Έκφραση από φαρμακολογική και Γενετικής απομεθυλίωση

Για να καθοριστεί εάν η μεθυλίωση μεσολαβεί άμεσα η μείωση του

CBS

έκφραση mRNA, μία μεθυλιωμένη CRC (HCT116) και δύο μεθυλιωμένα κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου (YCC10 και SNU719) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Aza, έναν αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης DNA, και TSA. Μετά τη θεραπεία,

CBS

έκφραση αποκαταστάθηκε το μεθυλιωμένο κυτταρικές σειρές μαζί με μια σημαντική αύξηση του μη μεθυλιωμένων αλληλίων προαγωγέα (Σχήμα 2Α). Βρήκαμε επίσης ότι

CBS

θα μπορούσε να επανενεργοποιηθεί στην HCT116

κυτταρική σειρά DKO CRC που είναι γενετικά απομεθυλιωθεί με διπλό νοκ-άουτ τόσο DNMT1 και DNMT3B. Ταυτόχρονα, μη μεθυλιωμένες

CBS

αλληλόμορφα ανιχνεύθηκαν σε Aza-θεραπεία και HCT116

κύτταρα DKO, υποδεικνύοντας ότι η μεθυλίωση του

CBS

υποστηρικτής οδηγεί άμεσα στην αποσιώπηση της στην CRC και του γαστρικού καρκίνου.

Συχνές

CBS

μεθυλίωση στην πρωτοβάθμια CRC και γαστρικών όγκων

Ερευνήσαμε περαιτέρω την παρουσία του

CBS

μεθυλίωση προαγωγού σε 96 πρωτοβάθμια CRC και 20 γαστρικό δείγματα καρκίνου χρησιμοποιώντας ανάλυση MSP.

CBS

μεθυλίωση προαγωγού ανιχνεύθηκε στο 30% των CRC (29/96) και 55% των γαστρικών όγκων (11 από 20), αλλά σπάνια βρέθηκε σε φυσιολογικό γαστρικό (1/20, 5%) ή του παχέος εντέρου ιστού (0/17, 0%) δείγματα (Σχήμα 2Β). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση του

CBS

μεθυλίωση με το φύλο, την ηλικία ή τη διαφοροποίηση του όγκου σε ασθενείς CRC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι υπερμεθυλίωση το

CBS

υποκινητής είναι μια κοινή εκδήλωση στη CRC και του γαστρικού καρκίνου.

Συσχέτιση του

CBS

μεθυλίωση και

KRAS

Μετάλλαξη στην πρωτοβάθμια CRC όγκοι

κοινή μεταλλάξεις κωδικονίων 12 και 13 στο εξόνιο 2 του

KRAS

γονιδίου εξετάστηκαν σε 96 πρωτοβάθμια CRC, όπου

CBS

κατάσταση μεθυλίωσης ήταν προηγουμένως αναλύθηκαν (Πίνακας 2).

KRAS

μετάλλαξη ανιχνεύθηκε στο 45% (13/29) των

CBS

-μεθυλιωμένη και 24% (16/67) των

CBS

-unmethylated πρωτογενή CRCs δείχνει μια θετική συσχέτιση μεταξύ του

CBS

μεθυλίωση και

KRAS

μεταλλάξεις (

P

& lt? 0,05). Περαιτέρω ανάλυση δεν έδειξε συσχέτιση του

CBS

μεθυλίωση και

KRAS

μετάλλαξης με καρκίνο υποτροπή /μετάσταση στο στάδιο ΙΙ ασθενείς CRC (Πίνακας 2).

Η

Συζήτηση

για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση για τον εντοπισμό

CBS

ως μεθυλιωμένο υποψήφιος TSG στο γαστρεντερικό καρκίνους. Έχουμε αποδείξει ότι

CBS

έκφραση mRNA ήταν απούσα σε πολλά παχέος εντέρου και κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου λόγω της μεθυλίωσης του υποκινητή. Επιπλέον, η

CBS

γονίδιο συχνά μεθυλιωμένη στο CRC και ασθενείς με γαστρικό καρκίνο, γεγονός που υποδηλώνει ότι

CBS

ενεργεί ως ΕΠΠΕ στο CRC και γαστρικό καρκίνο που απενεργοποιείται συχνά από μεθυλίωση.

Το γονίδιο

CBS

, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 21q22.3, κωδικοποιεί ένα σημαντικό ένζυμο που εμπλέκεται στη transulfuration της ομοκυστεΐνης παράγεται κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού μεθυλο-ομάδα [27]. Αξίζει να σημειωθεί ότι,

CBS

αιτίες ανεπάρκειας αυξημένα επίπεδα μεθειονίνης πλάσματος και μειωμένα επίπεδα κυστείνης [14], [28], η οποία με τη σειρά της είναι γνωστό ότι συσχετίζονται με ομοκυστινουρία, καρδιαγγειακή νόσο και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [14], [21]. Η οδός transulfuration συνδέει το μεταβολισμό της μεθειονίνης στη βιοσύνθεση των κυτταρικών μορίων οξειδοαναγωγής ελέγχουσες όπως κυστεΐνη, γλουταθειόνη, και ταυρίνη [18]. Η κυστεΐνη που παράγεται μέσω της οδού transulfuration προσδιορίζει κυτταρικά επίπεδα μόριο redox ελέγχου, όπως η γλουταθειόνη και ταυρίνη προστασία των κυττάρων έναντι αντιδραστικά είδη που προκαλείται από βλάβη [29] του DNA μέσω της βάσης και ζάχαρης τροποποιήσεις, βασικές θέσεις-free, διασταυρωμένες συνδέσεις DNA-πρωτεΐνης, και κλώνου διαλείμματα [30], [31]. Έτσι, μειωτικά την έκφραση του

CBS

μπορεί να επηρεάσει την παραγωγή της γλουταθειόνης διευκολύνοντας έτσι την ογκογένεση [16]. Επιπλέον, οξειδοαναγωγής ανισορροπία διεγείρει κινάση πρωτεΐνης και πολυ- (ADP ριβοζυλίωση) οδών που οδηγούν στην αναστολή της απόπτωσης και σαν αποτέλεσμα νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο, που ακολουθείται από φλεγμονώδεις αποκρίσεις και την ανάπτυξη του όγκου [32]. Υπάρχουν μερικές μελέτες που έχουν αξιολογήσει τη σχέση μεταξύ κακοήθους ευαισθησία του όγκου και πολυμορφισμοί του

CBS

γονίδιο (844ins68) στο CRC [19], [33] αλλά όχι σε οισοφαγικό ή γαστρικό καρκίνο [15]. Επιπλέον,

CBS

844ins68 πολυμορφισμός σχετίζεται με μειωμένη επιβίωση στο κεφάλι και το λαιμό καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων [34].

Επιπλέον, η απώλεια του

CBS

έκφραση θα μπορούσε να οδηγήσει σε η συσσώρευση ομοκυστεΐνης, η οποία θα πρέπει να ανακυκλώνεται σε μεθειονίνη από μεθειονίνη systhase μέσω της οδού επαναμεθυλίωση [14]. Όπως μεθειονίνη δρα ως η πηγή του δότη ομάδα μεθυλίου για μεθυλίωσης του DNA, η αύξηση της προκαλείται από την απώλεια του

CBS

έκφρασης μπορεί dysregulate μεθυλίωσης DNA. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψε συχνή μεθυλίωση του

CBS

στο γαστρεντερικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές και πρωτογενείς όγκους. Έτσι, η καταστολή της

CBS

με μεθυλίωση προαγωγού, αντί γενετικές αλλαγές, θα οδηγήσει επίσης σε μια διαταραχή του μεταβολισμού μεθυλο-ομάδα και να συμβάλει στην ανάπτυξη του καρκίνου με αυξημένη βλάβη του DNA από το οξειδωτικό στρες, αλλοιώνοντας αντιοξειδωτική ικανότητα, και dysregulating μεθυλίωσης του DNA. Ωστόσο,

CBS

μεθυλίωσης που δεν συνδέονται με υποτροπή στην ομάδα των ασθενών μας με τη φάση ΙΙ CRC. Προτείνουμε ότι οι μεγαλύτερες ομάδες ασθενών είναι αναγκαία για να μελετήσει αυτό το δυναμικό συνδυασμό με επαρκή στατιστική δύναμη.

Η προγνωστική αξία του

KRAS

μεταλλάξεις σε ασθενείς με CRC παραμένει αμφιλεγόμενη. Μια μελέτη από Roth

et al.

Πρότεινε ότι η προγνωστική αξία για

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης για την PFS και OS έλειπε σε ασθενείς με σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ εκτομή καρκίνου του παχέος εντέρου [35]. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι οι ασθενείς σταδίου III που έχει

KRAS

μεταλλάξεις εμφανίζονται σημαντικά χειρότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους που έχουν άγριου τύπου

KRAS

[36]. Το πιο σημαντικό, λίγες μελέτες έχουν διαφοροποιηθεί

KRAS

μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 από αυτά στο κωδικόνιο 13 σε σχέση με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και την επιβίωση [37] – [40]. Σε αυτή τη μελέτη, δεν θα μπορούσαμε να εντοπίσει

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης ως προγνωστικός παράγοντας για υποτροπή ή μετάσταση σε ασθενείς με στάδιο ΙΙ εκτομή CRC. Αντ ‘αυτού, διαπιστώσαμε ότι

CBS

μεθυλίωση συσχετίστηκε σημαντικά με το

KRAS

μεταλλάξεις. Αυτό το χαρακτηριστικό είναι σύμφωνο με προηγούμενη έκθεση που δείχνει ότι φαινότυπο CpG νησί methylator (CIMP) συνδέεται με

KRAS

μεταλλάξεις [41].

Εν ολίγοις, το εξέχον εύρημα αυτής της μελέτης είναι ότι οι

CBS

καταστέλλεται με μεθυλίωση προαγωγού σε παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνου. Βρήκαμε ότι η μεθυλίωση μεσολάβηση αποσιώπηση των

CBS

θα μπορούσε να αναστραφεί με γενετική ή φαρμακολογική απομεθυλίωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι

CBS

λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων σε αυτούς τους τύπους καρκίνου. Η απελευθέρωση του

CBS

και η σύνδεσή της με κακοήθη φαινότυπο όγκου που ενδεχομένως συνδέονται με τον κρίσιμο ρόλο του CBS στο μεταβολισμό της μεθειονίνης και τη διατήρηση της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης οξειδοαναγωγής. Η μελέτη μας δικαιολογεί περαιτέρω ανάλυση των

CBS

ως επιγενετική βιοδείκτη για τη μοριακή διάγνωση του CRC και τον καρκίνο του στομάχου.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθηγητές Qian Tao και Jing Wang για χρήσιμη σχόλια και τεχνική υποστήριξη, και Δρ Sergio Rey και Yuan Qiao για κρίσιμες επεξεργασίας για αυτό το χειρόγραφο. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Bert Vogelstein για την κυτταρική σειρά HCT116

DKO και ο Δρ Keith Robertson για δείγματα DNA από μερικές κυτταρικές σειρές CRC.