Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι τροποποιήσεις των ιστονών αμινο-τερματικό ουρές επηρεάζουν την πρόσβαση των ρυθμιστικών παραγόντων και σύμπλοκα να χρωματίνη και ως εκ τούτου επηρεάζουν τις βιολογικές διαδικασίες. Τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από εξέχοντα επιγενετική διαταραχή, συμπεριλαμβανομένων και των τροποποιήσεων ιστονών. Ωστόσο, οι λειτουργικές τους ρόλους των μεθυλτρανσφερασών ιστόνης (HMT) στον καρκίνο παραμένουν ασαφείς.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Μελετήσαμε αναστολή RNAi-based (νοκ ντάουν, KD) από 2 διαφορετικά HMTs H3K9, SUV39H1 και G9a. Knockdown από τα 2 HMTs σε PC3 κυτταρική σειρά καρκίνου ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων και προκάλεσε βαθιές μορφολογικές μεταβολές με απώλεια της δράσης της τελομεράσης και συντομεύεται τελομερή. κύτταρα SUV39H1 KD εμφάνισε σημαντική αύξηση σε G2 Μ κλάσμα /. κύτταρα G9a KD έδειξαν αυξημένη περιεκτικότητα σε DNA (1,7 φορές σε 2 ανεξάρτητους κλώνους) σε σύγκριση με αναλύσεις FACS για τον έλεγχο. Οι αναλύσεις έδειξαν Karyotype ότι αυτό οφειλόταν σε αυξημένο αριθμό χρωμοσωμάτων (από 61 έως 102) σε κύτταρα G9a KD σύγκριση με τη μητρική PC3. Περιέργως, βρήκαμε ανώμαλη μορφολογία κεντροσωμάτων και τον αριθμό σε περίπου 25% των κυττάρων G9a KD, ενώ κεντροσωμάτια ήταν μορφολογικά φυσιολογικό σε κύτταρα ελέγχου. Μικροσυστοιχιών αναλύσεις μετά KD της SUV39H1 ή G9a έδειξε πολύ λίγα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω μεταξύ των 39.000 γονίδια. Οι σιγήσει ογκοκατασταλτικών γονιδίων

p16

και

RASSF1A

δεν είχαν ενεργοποιηθεί σε κύτταρα KD.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα 2 HMTs , SUV39H1 και G9a απαιτούνται για να διαιωνίσει την κακοήθη φαινότυπο. Επιπλέον, G9a διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση κεντροσώματος η επικάλυψη πιθανώς μέσω της δομής της χρωματίνης και όχι μέσω επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου σε καρκινικά κύτταρα. Στόχευση αυτές μεθυλτρανσφεράσες ιστονών μπορεί να είναι θεραπευτικό όφελος σε καρκίνους

Παράθεση:. Κόντο Υ, Shen L, Ahmed S, Μπουμπέρ Υ, Sekido Υ, Haddad BR, et al. (2008) Ελάττωση της ιστόνης Η3 Λυσίνη 9 μεθυλοτρανσφεράσης G9a Προκαλεί κεντροσώματος Διατάραξη και χρωμοσωμάτων Αστάθεια στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 3 (4): E2037. doi: 10.1371 /journal.pone.0002037

Επιμέλεια: Axel Imhof, Πανεπιστήμιο του Μονάχου και το Κέντρο Ολοκληρωμένων Επιστημών Πρωτεΐνη, Γερμανία

Ελήφθη: 26 του Δεκεμβρίου του 2007? Αποδεκτές: 10 Μάρτη 2008? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2008

Copyright: © 2008 Kondo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις CA098006 και CA100632 από το NIH (JPJI) και επιχορήγηση από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (YK)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

χρωματίνης είναι μια κρίσιμη διαδικασία που σχετίζονται με την αντιγραφή του DNA, η γονιδιακή έκφραση και την εξέλιξη διαμέσου του κυτταρικού κύκλου. Οι ειδικές τροποποιήσεις που σχετίζονται με ορισμένες διεργασίες εκμαγείο με τη μεσολάβηση DNA [1]. Η μεθυλίωση του ιστόνης Η3 λυσίνης 9 (H3K9) είναι ένα από τα πιο καλά μελετηθεί τροποποιήσεις των ιστονών. Μετά την αρχική αναγνώριση των SUV39h1 εκτός από την άκρως σχετίζονται SUV39h2 ως H3K9 ειδικό ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση (HMT) [2], τουλάχιστον τρεις άλλες HMTs, G9a, ESET /SETDB1 και EuHMTase1, έχουν αναγνωριστεί ως HMTs για H3K9 στα θηλαστικά [3] – [5]. Αυτά τα ένζυμα έχουν διαφορετικές συγγένειες για τα ΗΕ, μονο- ή διμεθυλιωμένους καταστάσεις και παράγουν διαφορετικές καταστάσεις μεθυλίωσης. Μελέτες σε ποντίκια knockout για Suv39h1, 2 και G9a αποκάλυψε ότι G9a είναι κυρίως υπεύθυνη για μονομεθύλωσης (1Me) και διμεθυλίωση (2Me) της H3K9, ενώ Suv39h1 και Suv39h2 άμεση trimethylation (3Me) της H3K9. Επιπλέον, 1Me και 2Me για H3K9 διαμένουν κυρίως σε ευχρωματίνη, ενώ 2Me και 3Me για H3K9 βρίσκονται μέσα σε διαφορετικούς τύπους ετεροχρωματίνης, προαιρετική και συστατική ετεροχρωματίνη, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι 1Me, 2Me, ή 3Me σε K9H3 καταλαμβάνουν διακριτές περιοχές χρωμοσωμάτων και κάθε ένα από τα τρία κράτη της H3K9 μεθυλίωσης παίζει ένα μοναδικό ρόλο στη δομική και λειτουργική οργάνωση των χρωμοσωμάτων.

Κανονισμού

του χρωμοσώματος ανώτερης τάξης δομή επηρεάζει μιτωτική πιστότητα και εξασφαλίζει ισορροπημένη διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. συναρμολόγηση ετεροχρωματίνης σε κεντρομεριδίων διευκολύνει τόσο τον σχηματισμό κινητοχώρου και η αδελφή χρωματιδικές συνοχή [6]. Επιπλέον, ο σχηματισμός της χρωματίνης δομών σε τελομερή χρησιμεύει επίσης για τη διατήρηση του μήκους των τελομερών επαναλήψεων [7]. Μελέτες σε σχάση ζύμη έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ 3MeH3K9 και Swi6 /Θ1 απαιτείται για το χρωμόσωμα διαχωρισμό σε μίτωση [8]. Στα θηλαστικά, μιτωτικά χρωμοσώματα εμφανιστεί εμπλουτισμένο 2MeH3K9 σε κεντρομερική περιοχές και προφέρεται 3MeH3K9 σε μικρή περικεντρική ετεροχρωματίνης. Νοκ-άουτ του Suv39h1 και Suv39h2 στα αποτελέσματα ποντίκι σε ευρεία γονιδιωματική αστάθεια και αυξημένη συχνότητα εμφάνισης των λεμφωμάτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι 3MeH3K9 είναι μια κρίσιμη τροποποίηση για τη διατήρηση χρωμοσωμικές περιβάλλοντα [2]. 2MeH3K9 έχει επίσης εμπλακεί σε σχετικό γονίδιο DNA-μεθυλίωση φίμωση [9] – [11], αλλά ο έλεγχος ένζυμο αυτού του γεγονότος δεν έχει ορισθεί

Τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από εξέχοντα επιγενετική διαταραχή, συμπεριλαμβανομένων μεταβληθεί χρωματίνης. τροποποίηση. Προηγουμένως βρήκαμε αυξημένο επίπεδο G9a σε ανθρώπινους καρκίνους [12], αν και ο λειτουργικός ρόλος του υπερέκφραση HMTs στον καρκίνο παραμένει ασαφής. Εδώ, δείχνουμε ότι knockdown (KD) G9a και SUV39H1 σε καρκινικά κύτταρα αξιοσημείωτα ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και οδήγησε σε μορφολογικά γηρασμένα κύτταρα με ανωμαλίες των τελομερών. Βρήκαμε ότι G9a KD αλλά δεν SUV39H1 KD προκαλεί εκτεταμένη αστάθεια των χρωμοσωμάτων και κεντρόσωμα αναστάτωση. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι G9a καθώς SUV39H1 απαιτούνται για τη διατήρηση της κακοήθη φαινότυπο και θα μπορούσε να είναι έγκυρη θεραπευτικοί στόχοι στην ανθρώπινη νεοπλασία.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές, Προϋποθέσεις Πολιτισμού και Φαρμάκων Θεραπεία

ο προστάτης PC3 κυτταρική σειρά καρκίνου, η κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα Η1299 και ο καρκίνος του μαστού κυτταρική γραμμή MCF7 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Αυτά αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI (Invitrogen, Carlsbad CA), συν 10% FBS σε πλάκες πλαστικό καλλιέργειας ιστού σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα χωρίστηκαν 12-24 h πριν από τις 5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (DAC, Sigma, St. Louis, ΜΟ) θεραπεία. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 1 μΜ του DAC, ή PBS (έλεγχος) ημερησίως για 3 ημέρες.

παρεμβολή RNA

Σχεδιάσαμε ένα φορέα ρετροϊού (RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector, BD Biosciences) που κωδικοποιεί ένα μικρό RNA φουρκέτας (shRNA) που κατευθύνεται έναντι G9a και SUV39H1 σε PC3 (αλληλουχίες στόχους του 5′-AAGATTGAGCCTCCGCTGATT-3 ‘και 5′-AATCTCAAGTGTGTGCGTATC-3’ για G9a και SUV39H1, αντίστοιχα). Ως μάρτυρας, χρησιμοποιήσαμε Τα siRNAs για λουσιφεράση (Luc) συντίθεται από BD Biosciences ή φορέα shRNA χωρίς φουρκέτα ολιγονουκλεοτίδια.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα

δοκιμασίες ChIP έγιναν με βάση μια τροποποίηση της προηγουμένως δημοσιευμένες μεθόδους [13]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 1% φορμαλδεΰδη για 8 λεπτά για να συνδέσει εγκάρσια ιστόνες στο DNA. Τα κυτταρικά σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και υπερηχήθηκε 8 δευτ επτά φορές. Το προϊόν λύσεως επωάζεται με 10 μΙ αντι-Κ4 απομεθυλιώνεται ιστόνης Η3, αντι-K9 ακετυλιωμένης ιστόνης Η3, αντι-K9 απομεθυλιώνεται ιστόνης Η3 (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) και αντι-ιστόνης αντίσωμα Η3 (ως ένας εσωτερικός έλεγχος, Abcam, Cambridge, UK) σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Δύο% του συνολικού προϊόντος λύσης χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της εισόδου. DNA εκχυλίζεται με την μέθοδο φαινόλης /χλωροφορμίου, καταβυθίστηκαν με αιθανόλη, και επαναιωρήθηκε σε νερό. προϊόντα τσιπς χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτική PCR με τους εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίου που περιγράφονται στον Πίνακα S1. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, TaqMan Q-PCR διεξήχθησαν σε ένα όργανο 7000 ΑΒΙ Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA) εις διπλούν για τα γονίδια-στόχους.

ανοσοαποτύπωσης

Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με πρωτεύοντα αντισώματα για αντι-G9a (Abcam), αντι-SUV39H1, αντι-K9 απομεθυλιώνεται ιστόνης Η3, αντι-K9 τριμεθυλιωμένη Η3 ιστόνης (Upstate Biotechnology), ιστόνη Η3 (Abcam) και β-ακτίνης (Sigma).

RT -PCR αναλύσεις

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen), και 2 μg μεταγράφηκε αντίστροφα με MLV-ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen). Οι αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιήθηκαν περιγράφονται στον Πίνακα S1. Το πρωτόκολλο PCR για RT-PCR ήταν 95 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους των 30 sec στους 95 ° C, 30 sec στους 55 ° C και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C, και στη συνέχεια ένα 5 λεπτά τελική επέκταση στους 72 ΝΤΟ. TaqMan Q-PCR διεξήχθησαν εις διπλούν για τα γονίδια στόχους G9a, SUV39H1 και GAPDH χρησιμοποιώντας ανιχνευτή θέτει Hs00198710_m1, Hs00162471_m1 και Hs 00266705_gl, αντίστοιχα (Applied Biosystems).

Bisulfite Pyrosequencing Ανάλυση μεθυλίωσης

Πραγματοποιήσαμε την κατεργασία όξινου θειώδους όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [14]. Εν συντομία, 2 μα γονιδιωματικού DNA μετουσιώθηκαν με 2 Μ ΝαΟΗ για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από επώαση με 3 διθειώδες Μ νάτριο (ρΗ 5.0) για 16 ώρες στους 50 ° C. Μετά την επεξεργασία, το DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας μία Οδηγό Miniprep Στήλη (Promega, Madison, WI), καταβυθίζεται με αιθανόλη, και επαναιωρήθηκε σε 30 μΐ αραιωμένου ύδατος. Χρησιμοποιήσαμε ένα εξαιρετικά ποσοτική μέθοδο για την εκτίμηση των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA βασίζεται στην τεχνολογία Pyrosequencing [15] (Pyrosequencing ΑΒ, Uppsala, Σουηδία). Οι αλληλουχίες των εκκινητών που περιγράφονται στον Πίνακα S1.

SA-SS-gal Ανάλυση

PC3 κύτταρα μολυσμένα με ρετροϊό που κωδικοποιεί G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA ή ελέγχου-shRNA εξετάστηκαν για SA-SS- gal δραστηριότητα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

RNA Microarray Analysis

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα μολυσμένα με είτε G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA ή ελέγχου-shRNA όπως περιγράφηκε παραπάνω. Στόχοι για υβριδισμό μικροσυστοιχιών δημιουργήθηκαν από το RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Affymetrix, Santa Clara, CA). Το γονίδιο τσιπ ανθρώπινη U133A (Affymetrix) το οποίο περιέχει ~33,000 μεταγραφές χρησιμοποιήθηκε για τη σκιαγράφηση γονιδιακής έκφρασης. Υβριδισμός, πλύση, σάρωση, και την ανάλυση των γονιδίων chips πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα έκφρασης αναλύθηκαν με το στατιστικό αλγόριθμο στο Microarray Analysis Suite (MAS) 5,0 λογισμικό (Affymetrix) χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. Τα δεδομένα από τη θεραπεία ελέγχου-shRNA και τη γονική PC3 χρησιμοποιήθηκαν ως βάση έκφρασης για σύγκριση είτε με G9a-shRNA ή SUV39H1-shRNA επεξεργασμένο δείγμα.

Μέτρηση της τελομεράσης Δραστηριότητα

δράση της τελομεράσης αναλύθηκαν με μια τροποποιημένη μέθοδο του βασικού πρωτοκόλλου τελομεράσης επανάληψης ενίσχυση (TRAP), το τραπέζιο τελομεράση Detection Kit (Millipore, Billerica, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. προϊόντα της αντίδρασης τρέχουν σε μια φυσική πηκτή πολυακρυλαμιδίου 15% και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο.

ανοσοφθορισμού Κυτταρογενετική

G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA ή ελέγχου-shRNA κύτταρα επεξεργασμένα PC3 αναπτύχθηκαν για τον πολιτισμό Falcon διαφάνειες (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Αντι-CENP-A μονοκλωνικό αντίσωμα (Abcam), αντι-K9 απομεθυλιώνεται ιστόνης Η3 και αντι-K9 τριμεθυλιωμένη αντισώματα ιστόνης Η3 πολυκλωνικό (Upstate Biotechnology) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτεύοντα αντισώματα. Κεντροσώματα ανιχνεύθηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα γ-τουμπουλίνης (Sigma) χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο [17]. Το πρωτογενές αντίσωμα ανιχνεύθηκε με Alexa Fluor 488 συζυγούς κατσίκας αντι-ποντικού (Invitrogen), Alexa Fluor αντίσωμα αντι-κουνελιού 546 συζυγούς κατσίκας (Invitrogen) ή φλουορεσκεΐνη συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (Sigma) και τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ), και ενσωματωμένα σε διάλυμα αντι-ξεθωριάσματος (200 mM DABCO, 90% νοί /νοί γλυκερόλη, 20 mM TRIS-HCl, ρΗ 8) για τη μείωση φωτο-λεύκανση. Βαθμολόγηση των κυττάρων και την απόκτηση ψηφιακής εικόνας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας στόχου 63 × τοποθετημένη σε ένα μικροσκόπιο Leica DMRBE (Leica, Wetzlar, Γερμανία) εξοπλισμένη με οπτικά φίλτρα για DAPI και FITC (Chroma Technologies, Brattleboro, VT) και ψύχθηκε συσκευή ζεύξεως φορτίου ( CCD) κάμερας (Photometrics, Tucson, AZ). Το πακέτο λογισμικού IPLab (Scanalytics Inc, Fairfax, VA) χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση και επεξεργασία εικόνας. Για κάθε μία από τις προετοιμασίες των κυττάρων 3 (έλεγχος, G9a-shRNA ή SUV39H1-shRNA επεξεργασμένων κυττάρων), 100 πυρήνες βαθμολογήθηκαν από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές.

τελομερούς Μήκος Ανάλυση

G9a-shRNA, SUV39H1 -shRNA ή ελέγχου-shRNA-επεξεργασμένα κύτταρα PC3 αξιολογήθηκαν για βράχυνση των τελομερών χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Telo-FISH για να απεικονίσει τελομερή σε μεσόφαση κυτταρικούς πληθυσμούς, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, η ανάλυση FISH διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα διαθέσιμο στο εμπόριο Cy3-συζευγμένο πεπτίδιο νουκλεϊνικό οξύ (ΡΝΑ) καθετήρας τελομερές ανά (ϋΑΚΟ Corporation, Carpinteria, CA) του κατασκευαστή οδηγίες. Ανεξάρτητη ανάλυση πραγματοποιήθηκε από δύο τυφλούς παρατηρητές χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Leica DMRBE εφοδιασμένο με Cy3 και 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) φίλτρα. Περισσότεροι από 100 μεσόφαση πυρήνες οπτικά αξιολογήθηκαν, και ψηφιακές εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα ψυχόμενο CCD (συσκευή συζευγμένου φορτίου) κάμερα.

Αποτελέσματα

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του SUV39H1 και G9a σε καρκίνους, πρώτα ιδρύσαμε κλώνοι των PC3, στα οποία καμία από αυτές τις 2 HMTs ήταν σταθερά ρυθμίζεται προς τα κάτω από shRNA. Χρησιμοποιήσαμε PC3, αφού ενδογενή SUV39H1 και G9a ήταν ιδιαίτερα εκφράζονται σε αυτό το κύτταρο. Σε αυτές τις knockdown (KD) κλώνους, η έκφραση των 2 HMTs μειώθηκε κατά 80-90% (Σχ. 1Α και 1Β). κύτταρα KD για G9a (G9a-KD) έδειξε μείωση της συνολικής 2MeH3K9 και 3MeH3K9. κύτταρα KD για SUV39H1 (SUV-KD) μείωσε τη συνολική 3MeH3K9 αλλά καμία αξιοσημείωτη αλλαγή στην 2MeH3K9 (Εικ. 1Β). 2MeH3K9 είχε ευρεία ανιχνεύθηκε στους πυρήνες των κυττάρων ελέγχου, συμπεριλαμβανομένης της ΕΕ και heterochromatic περιοχή (Εικ. 1Γ). Ωστόσο, η πυρήνα του κυττάρου G9a-KD έδειξε επιλεκτικά εξασθενημένη ευρεία ευχρωματινικούς χρώση 2MeH3K9 και περιείχε μόνο θολή στίγματα, τα οποία συμπίπτει με την μικρή περικεντρική περιοχή (πυκνά χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ) και κεντρομερική περιοχή (βάφονται με CENP-A). 3MeH3K9 εντοπίστηκε στην μικρή περικεντρική περιοχή και κεντρομερική περιοχή στα κύτταρα ελέγχου. κύτταρα SUV-KD εμφάνισε μειωμένη 3MeH3K9, αλλά όχι εντελώς, στο heterochromatic εστίες και δεν μετέβαλε σημαντικά τα κράτη 2MeH3K9 (Εικ. 1Γ). G9a-KD δεν επηρέασε σημαντικά 3MeH3K9 πρότυπα της μικρή περικεντρική περιοχής και κεντρομερική περιοχή. Αυτά τα ευρήματα ήταν σύμφωνα με τις προηγούμενες μελέτες G9a- ανεπάρκεια ES κυττάρου [19], [20]. Είναι ενδιαφέρον, φάνηκε ότι G9a-KD επηρεάζεται το καθεστώς H3K9me3 σε ευχρωματινικούς περιοχή.

Σε πραγματικό χρόνο PCR (Α) και κηλίδωση Western (Β) δείχνουν ότι shRNA παρέμβαση ρυθμίζει αρνητικά την αποτελεσματική έκφραση G9a ή SUV39H1. Οι ράβδοι σφάλματος σε πραγματικό χρόνο PCR υποδεικνύουν την τυπική απόκλιση της έκφρασης σε περισσότερα από 3 ανεξάρτητα απομονωμένα κλώνων. Όσον αφορά τις τροποποιήσεις Η3, κύτταρα τα G9a-KD (2 ανεξάρτητους κλώνους) δείχνουν μείωση της συνολικής 2MeH3K9. Αντίθετα, SUV-KD μειωμένο συνολικό 3MeH3K9 αλλά καμία αξιοσημείωτη αλλαγή στην 2MeH3K9. C, Η3-K9 μέλη μεθυλίωση αναλύθηκαν με ανοσοφθορισμό με 2MeH3K9 (κόκκινο, αριστερά) ή 3MeH3K9 (κόκκινο, δεξιά) ειδικά αντισώματα σε κύτταρα ελέγχου (Ctrl), κύτταρα G9a-KD ή κύτταρα SUV-KD. 2MeH3K9 είχε ευρεία ανιχνεύτηκε σε πυρήνες ελέγχου. Ο πυρήνας G9a-KD αποκάλυψε εξασθενημένο στίγματα του 2MeH3K9 επικάλυψη με DAPI-πυκνά (μπλε) τόποι και CENP-A χρώση (πράσινη). που αντιπροσωπεύουν την μικρή περικεντρική περιοχή και κεντρομερική περιοχή, αντίστοιχα. SUV-KD μειωμένη 3MeH3K9 στο heterochromatic εστίες και δεν μετέβαλε σημαντικά την ευχρωματινικούς χρώση 2MeH3K9 μελών. Το μέγεθος κυψελίδας είναι σε σχέση με τη γραμμή 10-μm. D, G9a-KD και SUV-KD αποτέλεσμα σε ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν με την ίδια πυκνότητα και μετρήθηκαν καθημερινά με αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης. Γεμάτοι κύκλοι, γεμάτα τρίγωνα και γεμάτα τετράγωνα δείχνουν την ανάπτυξη του ελέγχου, το SUV-KD και τα κύτταρα G9a-KD, αντίστοιχα. Οι ράβδοι σφάλματος στο γράφημα δείχνουν την τυπική απόκλιση από πειράματα εις τριπλούν. Ε, ρύθμιση προς τα κάτω των δύο μεθυλτρανσφερασών ιστόνης ως αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη μορφολογική αλλαγή, η οποία χρωματίστηκαν θετικά για SA-βήτα-gal, υποδεικνύοντας επαγωγή γήρανσης. το μέγεθος των κυττάρων είναι σε σχέση με τη γραμμή 50 μm.

Η

Τόσο SUV-KD και G9a-KD εμφάνισε σημαντικά ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και βαθιές μορφολογικές αλλαγές, διευρυμένη και ισοπέδωσε σχήματα. (Σχ. 1D και 1Ε). Γήρανση σχετίζεται ανάλυση β- γαλακτοσιδάσης (ανάλυση SA-SS-gal) απέδειξαν ότι αυτή η μορφολογική αλλαγή ήταν συνεπής με την επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης.

Η επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης σε απόκριση σε ερεθίσματα εξαρτάται κυρίως από την ρ53 ή ρ16-pRB μονοπάτια [21]. Από το p16 έχει σιγήσει από μεθυλίωσης του DNA στο PC3 και η κατάσταση ρ53 του είναι μηδενική, είμαστε δίπλα εξέτασε p16 επανενεργοποίηση στα κύτταρα G9a-KD και SUV-KD. Σε αντίθεση με τη θεραπεία με τον αναστολέα ϋΝΑ μεθυλτρανσφεράση 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (DAC), βρήκαμε ενεργοποίηση ρ16 ούτε στο G9a-KD ούτε τα κύτταρα SUV-KD, σύμφωνο με καμία επίδραση στην επιγενετική κατάσταση της περιοχής του υποκινητή ( Σχ. 2). Εξετάσαμε, επίσης, μια άλλη ογκοκατασταλτικό γονίδιο,

RASSF1A

, η οποία είναι ο στόχος της μεθυλίωσης του DNA στο PC3, και διαπίστωσε ότι δεν υπήρχε καμία επίδραση στη γονιδιακή επανενεργοποίηση είτε στην G9a-KD ή τα κύτταρα SUV-KD. Δεδομένου ότι η μεθυλίωση του DNA, ένα κρίσιμο επιγενετικές μηχανισμός για φίμωση ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε ανθρώπινα νεοπλασία, έχει μηχανιστικά συνδεθεί με ιστόνη 2MeH3K9 μεθυλίωση [9] – [11]., Τα δεδομένα αυτά θα μπορούσαν να εξηγηθούν από αποζημίωση από άλλα HMTs

Α, η έκφραση του RNA του κάθε γονιδίου εξετάσθηκε με RT-PCR. Σε αντίθεση με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη θεραπεία (DAC), ούτε G9a-KD ούτε SUV-KD επανενεργοποιεί την έκφραση ρ16 και RASSF1A. p21 και GAPDH χρησιμοποιούνται για την ενεργό ελέγχου γονιδίου. Β, οι αλλαγές μεθυλίωσης του DNA σχετικά με την ρ16 και τους προαγωγούς RASSF1A αναλύθηκαν με τη ποσοτική μέθοδο Pyrosequencing. Σύμφωνα με την κατάσταση της έκφρασης και για τα δύο γονίδια, μεθυλίωσης του DNA μειώνεται κατά τη θεραπεία της ΕΑΒ, ενώ οι αλλαγές που παρατηρούνται είτε G9a-KD ή κύτταρα SUV-KD. Οι ράβδοι σφάλματος στο γράφημα δείχνουν την τυπική απόκλιση από πειράματα εις τριπλούν. C, οι Histone τροποποιήσεις που μελετήθηκαν από ChIP αναγράφεται κάτω από τις στήλες. K4Me, K9Ac, K9Me και Ab (-) δείχνει Κ4 διμεθυλίωση, Κ9 ακετυλίωση, Κ9 διμεθυλίωση και κανέναν έλεγχο αντισωμάτων, αντίστοιχα. Ο άξονας γ αντιπροσωπεύει την αναλογία του κάθε IP σε έναν πυρήνα ιστόνης Η3 ανοσοκαθίζησης. Μαύρες γραμμές, λευκές ράβδοι και γκρι μπάρες δείχνουν το τσιπ από τον κοροϊδεύει τον έλεγχο, η G9a-KD και τα κύτταρα SUV-KD, αντίστοιχα. ρ21 χρησιμοποιήθηκε σαν ένα δραστικό ελέγχου γονιδίου, στο οποίο ενεργός σήματα ιστόνης, K4Me και K9Ac, είναι υψηλά. Οι μπάρες σφάλματος στο γράφημα δείχνουν την τυπική απόκλιση από πειράματα εις τριπλούν.

Η

Για την εξέταση γονιδίων-στόχων των εξαρτώμενων H3K9 μεθυλίωσης αποσιώπηση είτε G9a ή SUV39H1, αναλύσαμε τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά την αναστολή της G9a ή SUV39H1 χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχίες. Στην ανάλυση των δεδομένων πίνακα, πρώτα έχουμε επιλέξει γονίδια με εντάσεις σήματος των 50 ή λιγότερο είτε γονικού ελέγχου ή shRNA επεξεργασμένο PC3 (δηλαδή σιγήσει γονίδια). Στη συνέχεια, αναζήτησαν γονίδια με εντάσεις σήματος αυξήθηκε περισσότερο από 2 φορές μετά KD είτε G9a ή SUV39H1. Μετά την απομάκρυνση της αυτο-ασυνεπής ανιχνευτές μεταξύ του ίδιου γονιδίου, θα μπορούσε να προσδιορίσει μόνο 4 και 6 γονίδια (3 γονίδια είναι κοινά) στην G9a-KD και τα κύτταρα SUV-KD, αντίστοιχα. Εξετάσαμε αυτά τα 7 γονίδια με RT-PCR και διαπίστωσε ότι μόνο 2 γονίδια,

Κλωθώ

και

διαφοροποίηση αυξητικού παράγοντα 8

(

GDF8

), ήταν πραγματικά σιωπή στον έλεγχο κύτταρα και τα επάνω ρυθμισμένη τόσο σε G9a-KD και τα κύτταρα SUV-KD (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, πολύ λίγα γονίδια είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά την αναστολή των 2 HMTs σε PC3. Παρά το γεγονός ότι, G9a και SUV39H1 εμπλέκονται γενικά στη γονιδιακή σίγηση, βρήκαμε ότι 12 και 2 γονίδια (2 γονίδια ήταν κοινά) έχουν κάτω-ρυθμίζονται στο G9a-KD και τα κύτταρα SUV-KD, αντίστοιχα (Πίνακας S2). Τα κάτω ρύθμιση αυτών των γονιδίων λίγα μπορεί να οφείλεται σε δευτερογενείς επιδράσεις της G9a-KD και του SUV-KD.

Παρά ελάχιστες επιδράσεις επί της έκφρασης γονιδίου, αξιοσημείωτα ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη παρατηρήθηκε τόσο στην G9a-KD και τα κύτταρα SUV-KD. Εξετάσαμε αυτά τα κύτταρα με FACS αναλύσεις για να προσδιοριστεί η εμπλεκόμενο μηχανισμό. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα G9a-KD έδειξαν αυξημένη περιεκτικότητα DNA (1,7 φορές σε 2 ανεξάρτητους κλώνους) και τα κύτταρα SUV-KD αποδεικνύεται σημαντικές αυξήσεις σε G2 Μ κλάσμα /(από 29% έως 40%) σε σύγκριση με τον έλεγχο (σχ. 3Α). Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, αναλύσεις καρυότυπο (Σχ. 3Β) αποκάλυψε αυξημένο αριθμό χρωμοσωμάτων στα κύτταρα G9a-KD σε σύγκριση με τα κύτταρα SUV-KD και το γονικό PC3 κυτταρική γραμμή (Σχ. 3Β). Αριθμοί του χρωμοσώματος μετρήθηκαν σε περισσότερα από 8 πυρήνα κάθε κυττάρου KD (Σχ. 3Β). κύτταρα G9a-KD έδειξαν σημαντικά αυξημένο αριθμό χρωμοσωμάτων (κατά μέσο όρο, 119 χρωμοσώματα,

P

& lt? 0,01) από ό, τι τα κύτταρα SUV-KD (63 χρωμοσώματα) και τα κύτταρα ελέγχου (65 χρωμοσώματα). Αυτό ίσχυε ανεξαρτήτως των τύπων κυτταρικής γραμμής που χρησιμοποιείται. Και οι δύο σταθεροί κλώνοι G9a-KD της κυτταρικής σειράς καρκίνου του μαστού MCF7 και στην κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα Η1299 έδειξε επίσης μια αύξηση του αριθμού των χρωμοσωμάτων σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (MCF7-έλεγχος vs MCF7-G9a-KD, 60 χρωμοσώματα vs 98 χρωμοσώματα? H1299- ελέγχου vs Η1299-G9a-KD, 72 χρωμοσώματα vs 104 χρωμοσώματα?. Σχήμα S1)

Ένα, FACS αναλύσεις που δείχνει το περιεχόμενο του DNA αυξάνεται 1,5-2 φορές στα κύτταρα G9a-KD σύγκριση με την παρωδία του ελέγχου σε δύο ανεξάρτητα απομονωμένα κλώνους (G9a-C1 και C2). Τα κύτταρα SUV-KD δείχνουν μια υψηλή ποσότητα κυττάρων G2M σε σύγκριση με τον ψευδο ελέγχου. Β, αναλύσεις καρυότυπος έδειξε 61, 102 και 61 χρωμοσώματα στο PC3 ελέγχου, η οι κυτταρικές σειρές SUV-KD G9a-KD και, αντίστοιχα. αριθμός χρωμοσωμάτων είναι αξιοσημείωτα αυξημένη στα κύτταρα G9a-KD. Αριθμοί του χρωμοσώματος μετρήθηκαν σε περισσότερα από 8 πυρήνα κάθε κυττάρου KD. κύτταρα G9a-KD έδειξαν σημαντικά αυξημένο αριθμό χρωμοσωμάτων από τα κύτταρα SUV-KD και τα κύτταρα ελέγχου. άξονας Υ δείχνει τον αριθμό των χρωμοσωμάτων. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση. *,

P

& lt? 0,01. C, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI. Κεντροσώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον γ-τουμπουλίνης. Στα κύτταρα ελέγχου και κύτταρα SUV-KD, 1-2 κεντροσωμάτια εμφανίζονται ως δομές σημείο-όπως φαίνεται στο κάθε κελί. Στα κύτταρα G9a-KD, ανώμαλη μορφολογία κεντροσωμάτων και αριθμός, υποδηλώνουν κεντροσωμάτων ενισχύσεως παρατηρήθηκε σε περίπου 25% των κυττάρων. Οι ασυνήθιστα ενισχύονται κεντροσωμάτια μεγεθύνεται στα κουτιά.

Η

Κεντροσώματα είναι απαραίτητη για τη σωστή κυτταρική πολικότητα και ισόρροπη κατανομή των χρωμοσωμάτων [22]. Χρησιμοποιήσαμε ένα αντίσωμα έναντι γ-τουμπουλίνης για την αξιολόγηση των κεντροσωμάτια στα κύτταρα KD. Αν και η πλειονότητα των κυττάρων τόσο του ελέγχου και G9a-KD έδειξε φυσιολογική (1 προς 2) κεντροσωμάτων αριθμούς, ανιχνεύσαμε κεντροσωμάτων ενίσχυση σε περίπου 25% των κυττάρων στα κύτταρα G9a-KD. Αυτό δεν ανιχνεύθηκε στα κύτταρα ελέγχου και κύτταρα SUV-KD (Σχ. 3C). Κεντροσώματος ανωμαλία παρατηρήθηκε επίσης και στα δύο κύτταρα MCF7-G9a-KD και τα κύτταρα Η1299-G9a-KD σε περίπου 20% των κυττάρων (Εικόνα S1). Έτσι, G9a θα μπορούσε να διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση κεντροσώματος επικαλύψεις, πιθανώς μέσω της δομής της χρωματίνης και όχι επηρεάζοντας τη γονιδιακή έκφραση σε καρκινικά κύτταρα.

Η δομή χρωματίνης σε τελομερή είναι επίσης σημαντικό να διατηρηθεί το μήκος των τελομερών επαναλήψεων [7 ]. Ερευνήσαμε λειτουργία των τελομερών σε G9a-KD και τα κύτταρα SUV-KD. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασία TELO-FISH για να αξιολογήσει το μήκος των τελομερών. Σημαντική μείωση στην ένταση του σήματος του τελομερούς παρατηρήθηκε στα κατεργασμένα κύτταρα PC3 G9a-KD και SUV-KD, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση του μήκους των τελομερών διεκόπη σε αυτά τα κύτταρα KD. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα της μείωσης στο σήμα τελομερών παρουσιάζεται στο σχήμα 4Α. Εμείς επόμενη ποσοτικοποιείται δραστικότητα τελομεράσης σε αυτά τα κύτταρα με την δοκιμασία TRAP και βρέθηκε μείωση της δράσης της τελομεράσης στην κυτταρική σειρά G9a-KD (Εικ. 4Β). Ως εκ τούτου, η συντομευμένη μήκος των τελομερών στα κύτταρα G9a-KD μπορεί να είναι το αποτέλεσμα του αλλαγμένη δραστικότητα τελομεράσης. Το μειωμένο επίπεδο έκφρασης hTERT στα κύτταρα G9a-KD προσφέρεται υποστήριξη σε αυτές τις διαπιστώσεις (Εικ. 4C). Σε αντίθεση, τα κύτταρα SUV-KD έδειξε παρόμοια επίπεδα δραστηριότητας τελομεράσης στα κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι η δυσλειτουργία των τελομερών στα κύτταρα SUV-KD μπορεί να εξαρτάται από τους μηχανισμούς πλην έκφραση hTERT, πιθανώς λόγω μεταβολών της κατάστασης μεθυλίωσης H3K9 στο τελομερές ετεροχρωματίνη.

Α, Μεσόφαση πυρήνες υβριδοποιήθηκαν με Cy3-συζευγμένο πεπτίδιο νουκλεϊνικό οξύ (ΡΝΑ) καθετήρας τελομερή και αντίθετα με DAPI. Αξιοσημείωτη μείωση στο σήμα τελομερών παρατηρείται στην μεσόφαση πυρήνες από κύτταρα KD σε σύγκριση με τους πυρήνες από τη γραμμή ελέγχου. Φαίνεται στα ένθετα είναι οι διευρυμένη εικόνες των αναφερόμενων περιοχών. δραστηριότητα Β, τελομεράση αξιολογείται με προσδιορισμό TRAP. Δείγματα με δραστικότητα τελομεράσης παράγει ένα 6-βάση στοιχειωδών σκάλα των προϊόντων TRAP στα πηκτώματα. Εσωτερική ζώνη ελέγχου εμφανίζονται στο κάτω μέρος της γέλης. Μια μειωμένη ένταση σήματος της δραστηριότητας τελομεράσης παρατηρείται στις κυτταρικές γραμμές G9a-KD. Το σήμα δεν παρατηρείται όταν τα εκχυλίσματα προεπεξεργασία με θερμότητα για να καταργήσει τα πρωτεϊνικά συστατικά του τελομεράσης, υποδεικνύοντας την ειδικότητα της τελομεράσης του σήματος μετρήθηκε με αυτή την δοκιμασία. C, το επίπεδο έκφρασης της hTERT μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. έκφραση hTERT μειώνεται στα κύτταρα G9a-KD σε σύγκριση με εκείνα του ελέγχου PC3 και τα κύτταρα SUV-KD. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση των 3 ανεξάρτητες δοκιμασίες.

Η

Dsicussion

Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η έκφραση του SUV39H1 και G9a είναι σημαντικό να υποστηριχθεί η ανάπτυξη των κακοηθών κυττάρων, αν και παίζουν διακριτούς ρόλους σε καρκινικά κύτταρα. Απροσδόκητα, πολύ λίγα γονίδια είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά την αναστολή των 2 HMTs, γεγονός που υποδηλώνει ότι H3K9 μεθυλίωσης συνδέονται αποσιώπηση, η οποία έχει μηχανιστικά συνδεδεμένο με DNA μεθυλίωση [9] – [11], είναι σταθερή όταν αυτή έχει καθιερωθεί σε καρκινικά κύτταρα, πιθανώς μέσω της δράσης των πολλαπλών HMTs.

Κεντρόμερο διαμεσολαβεί πολλαπλές λειτουργίες διαχωρισμού, συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού κινητοχώρου, τον άξονα με τη μεσολάβηση κινήσεις, η αδελφή της συνοχής και της μιτωτικής σημείο ελέγχου [6]. Η μικρή περικεντρική αρχιτεκτονική ετεροχρωματίνης διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην χρωμοσωμικές διαχωρισμού, καθώς και στην ίδρυση μεταγραφική καταστολή. Η απώλεια Suv39h1 και Suv39h2 HMTases στο μοντέλο ποντικού καταργηθεί Η3-Κ9 μεθυλίωσης σε μικρή περικεντρική ετεροχρωματίνη και προκάλεσε χρωμοσωμική αστάθεια. Ωστόσο, και μόνο διαταραχές γονίδιο είτε Suv39h1 ή Suv39h2 δεν φάνηκε να επηρεάζει τη βιωσιμότητα και τη γονιμότητα των μεταλλαγμένων ποντικών, υποδεικνύοντας αυτά τα δύο ένζυμα είναι περιττά [2]. Μελέτη σε G9a knockout ποντίκια έδειξε ότι G9a ήταν απαραίτητη για την εμβρυϊκή ανάπτυξη ή τη διαφοροποίηση και εμβρυϊκών ελάττωμα ανάπτυξης σε G9a με ανεπάρκεια ES κύτταρα μπορεί να οφείλεται σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, αλλά όχι διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Σε αυτό το μοντέλο, χρωμοσωμική αστάθεια δεν έγινε αντιληπτή στα κύτταρα νοκ-άουτ [19]. Βρήκαμε ότι εδώ σε καρκινικά κύτταρα, τα οποία συχνά φιλοξενούν παρεκκλίνουσα αριθμούς του χρωμοσώματος, G9a KD επαγόμενη κεντρόσωμα αναστάτωση και πιο εκτεταμένη αστάθεια χρωμόσωμα, το οποίο είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και κυτταρικής γήρανσης. Φάνηκε ότι 3MeH3K9 επίσης μειωμένη σε ευχρωματινικούς περιοχή στα κύτταρα G9a KD. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην δραστική μείωση του 2MeH3K9, η οποία είναι προϋπόθεση για την τροποποίηση του τρι-μεθυλίωση στο loci. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι ο ρόλος του G9a σε καρκινικά κύτταρα είναι κρίσιμης σημασίας και φαίνεται να προστατεύοντας περαιτέρω χρωμοσωμική διαταραχή. Αντίθετα, σε ένα Suv39H1 KD καταργηθεί εν μέρει 3MeH3K9 σε μικρή περικεντρική περιοχή, αλλά δεν θα μπορούσε να επάγει χρωμοσωμική αστάθεια, πιθανόν λόγω απολυθέντες ρόλους για SUV39H HMTases [2].

Πρόσφατες εκθέσεις απέδειξαν ότι κεντρομερική χρωματίνης ειδικούς συνδυασμούς των τροποποιήσεων ιστονών και ο τρισδιάστατη οργάνωση των χρωμοσωμάτων θα μπορούσε επίσης να είναι σημαντική για την πρόσληψη των συμπλεγμάτων συνοχής στην ετεροχρωματίνη κοντά κινητοχώρους αδελφή [23] [24]. 2MeH3K9 χρωματίνη, η οποία είναι παρούσα στον εσωτερικό χώρο κινητοχώρου μεταξύ μιτωτικών αδελφές χρωματίδες και σε περιοχές που πλευρίζουν κεντρομερική χρωματίνη, θα μπορούσε να αποδοθεί στη θέση του CENP-A προς την poleward όψη της μιτωτικής χρωμοσώματος [25]. Το μειωμένο επίπεδο 2MeH3K9 στην πλευρική περιοχή κεντρομεριδίου χρωματίνης με G9a KD θα μπορούσε να επηρεάσει την τρισδιάστατη οργάνωση των χρωμοσωμάτων κεντρομεριδίου, με αποτέλεσμα την χρωμοσωμική αστάθεια βρήκαμε εδώ.

Κεντροσώματα αρχίσει να διπλούν στο αργά G1 /πρώιμη φάση S του κυτταρικού κύκλου, και δύο λειτουργικές κεντροσωμάτια σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της G2 [22]. Αν τα κύτταρα αποτυγχάνουν να υποστούν κυτταροκίνηση μετά τη σύνθεση του DNA και τις επόμενες περιλήψεις του κυτταρικού κύκλου, θα μπορούσαν να έχουν το διπλάσιο της κανονικής περιεκτικότητας σε DNA και αριθμό κεντροσωμάτων. Έτσι, η σημερινή δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αποτυχία στην κυτοκίνηση μπορεί να είναι μια εξήγηση για τις ανωμαλίες στον χρωμοσωμικό αριθμό και κεντροσωμάτια στα κύτταρα G9a-KD.

G9a φαίνεται ότι απαιτείται για την έκφραση hTERT και συντήρηση των τελομερών. SUV39H1 απαιτείται επίσης για τη ρύθμιση των τελομερών έλεγχο. Στο μοντέλο ποντικού, εμβρυϊκά ινοβλαστών από ποντίκια μηδενική τόσο με Suv39h1 και Suv39h2 έδειξε ανώμαλη επιμήκυνση των τελομερών [26]. Κατάργηση των δύο HMTs είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της heterochromatic χαρακτηριστικά σε τελομερή στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και τα εμβρυϊκά ινοβλάστες ποντικού. Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι SUV39H1 KD στα καρκινικά κύτταρα έχουν μικρότερα τελομερή. Οι λόγοι για τους οποίους βρήκαμε τη βράχυνση των τελομερών στα κύτταρα SUV39KD σε αντίθεση με τα προηγουμένως αποτελέσματα μπορεί να οφείλεται στην κυτταρικούς τύπους μελετήθηκε (δηλαδή τα φυσιολογικά κύτταρα έναντι καρκινικών κυττάρων), δεδομένου ότι η λειτουργία του τελομερούς γενικά παρεκκλίνοντα ρυθμίζεται σε καρκινικά κύτταρα [27]. Περαιτέρω μελέτες χρειάζονται για την αντιμετώπιση των μηχανιστική δεσμών μεταξύ G9a, SUV39H1 και δομές χρωμοσωμικές /τελομερών, καθώς και της έκφρασης hTERT σε καρκινικά κύτταρα. Επίσης, θα μπορούσε να είναι ενδιαφέρον να δούμε αν οι επιμέρους επιπτώσεις των G9a και SUV39H1 είναι συνεταιρισμός, όταν έχουν εξαντληθεί τα δύο, και αν επανεισαγωγή των δύο HMTs επανέρχεται το φαινότυπο. Παρ ‘όλα αυτά, η στόχευση αυτών των μεθυλτρανσφεράσες ιστόνης θα μπορούσε να είναι θεραπευτικό όφελος σε θεραπείες για τον καρκίνο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Ελάττωση της G9a μεθυλοτρανσφεράση σε κυτταρικές σειρές MCF7 και Η1299. Α, σε πραγματικό χρόνο PCR δείχνει ότι shRNA παρέμβαση ρυθμίζει προς τα κάτω αποτελεσματικά G9a σε MCF7 και Η1299. Οι ράβδοι σφάλματος σε πραγματικό χρόνο PCR υποδεικνύουν την τυπική απόκλιση της έκφρασης σε 3 ανεξάρτητα απομονωθέντες κλώνοι. Β, FACS αναλύσεις δείχνουν περιεχόμενο DNA είναι αυξημένη 1,5-2 φορές στα κύτταρα G9a-KD σε σύγκριση με την ψευδο ελέγχου σε ένα απομονωμένο κλώνο. Αυξημένη περιεκτικότητα DNA παρατηρήθηκε σε δύο ανεξάρτητα απομονωμένα κλώνοι (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). C, αναλύσεις έδειξαν καρυότυπος μικρό και αυξημένη χρωμοσώματα στις δύο κυτταρικές σειρές MCF7-G9a-KD και H11299-G9a-KD. D, Κεντροσώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον γ-τουμπουλίνης. Στα κύτταρα ελέγχου, τα 1-2 κεντροσωμάτια εμφανίζονται ως δομές σημείο-όπως δει.