Αφηρημένο

πολύπλοκο παράγοντα Ctf18-αντιγραφή C συμπεριλαμβανομένων Dscc1 (αντιγραφή του DNA και η αδελφή χρωματιδικές συνοχή 1) εμπλέκεται στην αδελφή χρωματίδων συνοχή, την αντιγραφή του DNA και τη σταθερότητα του γονιδιώματος στο

S. cerevisiae

και

C. elegans

. Έχουμε προηγουμένως πραγματοποιηθεί γονιδιακή έκφραση προφίλ σε πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα για την ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ένα χαρακτηριστικό του καρκίνου που σχετίζεται με μεταγραφική υπογραφή αποκαλύπτεται από αυτή την προσπάθεια είναι η αυξημένη έκφραση του πρωτο-ογκογονιδίου

DSCC1

. Εδώ, έχουμε ανέκριναν τη μοριακή βάση για αποκλίνουσα έκφραση ανθρώπινης DSCC1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου και την ικανότητά της να προάγει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Ποσοτική PCR και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις επιβεβαιώνεται ότι το επίπεδο έκφρασης της DSCC1 είναι αυξημένη σε 60-70% των όγκων του παχέος σύγκριση με συμφωνημένα noncancerous κολονικό βλεννογόνο τους. Ένα

in silico

αξιολόγηση των τεκμηρίων

DSCC1

περιοχή υποκινητή για συναινέσεως DNA μεταγραφικά ρυθμιστικά στοιχεία αποκάλυψαν έναν πιθανό ρόλο για την οικογένεια E2F πρωτεϊνών δέσμευσης DNA στον έλεγχο της έκφρασης DSCC1. Μεσολάβηση RNAi μείωση του E2F1 μειωμένη έκφραση του DSCC1 σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα. Gain- και πειράματα απώλειας λειτουργίας έδειξαν ότι DSCC1 εμπλέκεται στην βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σε απόκριση σε γενοτοξικό ερεθίσματα. Αποκαλύπτουμε ότι η E2F-εξαρτώμενη έκφραση DSCC1 προσδίδει αντι-αποπτωτικό ιδιότητες σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, και ότι η καταστολή της μπορεί να είναι μια χρήσιμη επιλογή για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Yamaguchi Κ, Yamaguchi Κ, Takahashi Ν, Ikenoue Τ, Fujii Τ, Shinozaki M, et al. (2014) Η υπερέκφραση της Συνοχής Ίδρυση Factor DSCC1 μέσω E2F στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (1): e85750. doi: 10.1371 /journal.pone.0085750

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28, Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 30 Νοέμβρη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 17η, Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Yamaguchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από την Grant-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (# 23790126), MEXT /JSPs, Ιαπωνία για να K. Yamaguchi, και Παγκόσμια ΣτΕ Πρόγραμμα «Κέντρο της εκπαίδευσης και της έρευνας για την προηγμένη γονιδίωμα που βασίζεται φάρμακο για εξατομικευμένη ιατρική και η τον έλεγχο των μολυσματικών ασθενειών σε όλο τον κόσμο «, MEXT /Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης, της Ιαπωνίας με το Υ Furukawa. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις πιο συχνές ανθρώπινων νεοπλασμάτων στον κόσμο. Σε κύτταρα CRC, διατάραξη των συστημάτων που διέπουν τη γενετική ή επιγενετική ακεραιότητα καθιστά διαφορετικά χαρακτηριστικά, όπως χρωμοσωμική αστάθεια (CIN), μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI), και CpG φαινότυπο νησί methylator (CIMP). Μια μεγάλη πλειοψηφία των όγκων παχέος εντέρου παρουσιάζουν CIN που περιλαμβάνει το ακαθάριστο γενετικές αλλαγές, όπως διαγραφές, ενισχύσεις, αναστροφές, μεταθέσεις, κέρδος ή ζημία του συνόλου ή μεγάλα τμήματα των χρωμοσωμάτων, και οι μετατοπίσεις [1]. Μια προηγούμενη μελέτη προσδιόρισε σωματικές μεταλλάξεις σε πέντε γονίδια συμπεριλαμβανομένων των

MRE11

,

ZW10

,

ZWILCH

,

ROD

, και

DING

, μεταξύ 100 ανθρώπινη CIN-υποψήφια γονίδια που μοιράζονται ομοιότητα με μαγιά ή πετάξει τα γονίδια «αστάθειας» [2]. Τα στοιχεία τους πρότεινε ότι τουλάχιστον μία από τις τρεις λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων διπλό σκέλος επισκευή διάλειμμα, λειτουργία κινητοχώρου και χρωματιδικές διαχωρισμού, είναι μειωμένη σε όγκους CIN με σωματική μετάλλαξη. Μια άλλη μελέτη αναζήτηση για μεταλλάξεις των 102 ανθρώπινα ομόλογα των γονιδίων CIN μαγιά σε 132 παχέος εντέρου. Κατά συνέπεια, εντόπισαν συνολικά 11 μεταλλάξεις σε πέντε γονίδια που περιελάμβανε τέσσερις που σχετίζονται με τη συνοχή αδελφών χρωματίδων (

SMC1L1

,

CSPG6

,

NIPBL

, και

STAG3

, τα ομόλογα της μαγιάς

SMC1

,

SMC3

,

SCC2

, και

SCC3

, αντίστοιχα) [3]. Δεδομένου ότι η αδελφή χρωματιδίων συνοχή είναι απαραίτητη για τις κυτταρικές διεργασίες όπως χρωμόσωμα διαχωρισμός, ομόλογου ανασυνδυασμού επισκευή και ρύθμιση της μεταγραφής [4], γενετικές μεταβολές στα συστατικά του και οι ρυθμιστικές αρχές θα πρέπει να διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην CIN των όγκων παχέος εντέρου.

Έχουμε ήδη πραγματοποιηθεί ανάλυση του γονιδίου προφίλ έκφρασης στο CRC [5], και διαπίστωσε ότι την αντιγραφή του DNA και η αδελφή χρωματιδικές συνοχή 1 (

DSCC1

, επίσης γνωστή ως

DCC1

) ήταν συχνά αυξημένα σε όγκους παχέος εντέρου σε σύγκριση με το μη-καρκινικές βλεννογόνο του κόλου. Dcc1p, ένα ομόλογο του DSCC1, αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως μέλος του C (RFC) σύμπλοκο εναλλακτική παράγοντας αντιγραφής σε ζυμομύκητα, και φυσικά συνδέεται με Ctf8p και Ctf18p [4]. Η διαγραφή του συστατικού, Ctf18p, Ctf8p, ή Dcc1p, προκάλεσαν σοβαρές βλάβες συνοχής αδελφών χρωματίδων και αυξημένη ευαισθησία σε μικροσωληνίσκων αποπολυμερισμού φάρμακα, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα συστατικά είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της ακεραιότητας της χρωματίνης [4]. Αν και Dcc1p δεν ήταν απαραίτητη για τη βιωσιμότητα της ζύμης, διαγραφή Dcc1p οδήγησε σε συνθετικό θνησιμότητα σε συνδυασμό με μετάλλαξη άλλων πρωτεϊνών αδελφών χρωματίδων συνοχής [6]. Εκτός από τις επιπτώσεις στο θυγατρικό χρωματίδων συνοχή, το σύμπλοκο CTF18-DSCC1-CTF8-RFC διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην αντιγραφή του DNA μέσω της αλληλεπίδρασης με μονόκλωνο και πριμοδοτημένο DNA ως φορτωτή του πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων [7]. Επιπλέον, η ανάλυση της γενετικής δίκτυο συνδέονται λειτουργικά με τα γονίδια στην μαγιά πρότεινε ότι τα συστατικά των σύνθετων CTF18-DSCC1-CTF8-RFC αλληλεπιδρούν με το MAD /BUB οδού άξονα σημείο ελέγχου, η RAD51 DNA οδού επιδιόρθωσης για διπλό σκέλος διαλείμματα, τη ζημιά Rad9 DNA σημείο ελέγχου, και ο TOF1 /MRC αντιγραφή του DNA οδοφράγματος της οδού [8], [9]. Το εύρημα ότι η μετάλλαξη στο CTF18-RFC αυξημένη τριπλέτα επανάληψη αστάθειας ενισχύεται ο ρόλος αυτού του συγκροτήματος στο σημείο ελέγχου DNA-αντιγραφή του [10]. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι DSCC1 παίζει σημαντικό ρόλο στην αντιγραφή, άτρακτο σημείο ελέγχου και επιδιόρθωσης του DNA, το οποίο μας ώθησε να διερευνήσει κατά πόσον απορυθμισμένη έκφραση DSCC1 εμπλέκεται στην ανθρώπινη παχέος ογκογένεση.

Εδώ, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι DSCC1 είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω σε CRC τουλάχιστον εν μέρει μέσω της ενισχυμένης μεταγραφική ενεργοποίηση από E2F. Έχουμε, επίσης, αποκαλύπτουν ότι η αυξημένη έκφραση του DSCC1 παρέχει χημειοαντίσταση στα κύτταρα CRC παρέχοντας τα καρκινικά κύτταρα με αντι-αποπτωτική ιδιότητες. Τα ευρήματα αυτά θα συμβάλουν στην καλύτερη κατανόηση της CRC, και να χρησιμεύσει ως σημείο εκκίνησης για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη διάγνωση και τη θεραπεία της CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

το έργο εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Ινστιτούτου Ιατρικών Επιστημών, του Πανεπιστημίου του Τόκιο (IMSUT-IRB, 21-14-0806). Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς σε αυτή τη μελέτη. Όλα παχέος καρκινικούς ιστούς και αντίστοιχα μη καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από χειρουργικά δείγματα των ασθενών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση.

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο CRC κυτταρικές σειρές HCT116, HCT-15, SW480, DLD-1 , LoVo, Caco-2, LS174T, ΗΤ-29, και RKO αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε κατάλληλο μέσο συμπληρωμένο με FBS (Life Technologies, Carlsbad, CA) και διάλυμα αντιβιοτικού /αντιμυκητιακού (Sigma, St. Louis, ΜΟ).

Παρασκευή των πλασμιδίων που εκφράζουν DSCC1 και E2Fs

Το ολόκληρη την περιοχή κωδικοποίησης του

DSCC1

cDNA (GenBank με αρ NM_024094) ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας ένα σετ εκκινητών? εμπρόσθιος εναρκτήρας: 5′-CCGGAATTCATGAAGAGGACCCGCGAC-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής: 5′-CGGCTCGAGAGAAATGGGTCTTCTCGAATTAT-3’ (υπογραμμισμένα νουκλεοτίδια υποδεικνύουν τις θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού). Τα προϊόντα της PCR κλωνοποιήθηκαν στο

Eco

RI και

Xho

sites Ι του pcDNA3.1 /myc-His. Εμείς επιπλέον δημιουργούνται πλασμίδια που εκφράζουν ΗΑ-tagged DSCC1 (ρΟΑΟΟδ-DSCC1). Τα κατασκευάσματα pcDNA3-ΗΑ-E2Fs ευγενικά από τον Dr. JR Nevins (Πανεπιστήμιο Duke, Durham, NC).

Ποσοτική PCR και αντίγραφο γονιδίου ανάλυση αριθμό

Σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ). Γονιδιωματικό ϋΝΑ που εξάγεται από κυτταρικές γραμμές CRC για ανάλυση αριθμού αντιγράφων. Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε ΑΒΙ PRISM 7900HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας FAM-ιχνηθετημένων ανιχνευτών (5′-TCAGGTTTCCTACCTTCCGGCTGCTT-3 ‘) και ένα σύνολο εκκινητών (προς τα εμπρός: 5′-GGCGCGCTTTCAAACG-3′, αντίστροφος: 5’-GCGGGCAAGAAAGAAGTTCC-3 ‘) για

DSCC1

, και TaqMan Copy Number Αναλύσεις αναφοράς RNase P ως ποσοτικό έλεγχο (Life Technologies). Ο αριθμός αντιγράφων του

DSCC1

στα καρκινικά κύτταρα υπολογίστηκε σε σύγκριση με το γενωμικό DNA από υγιείς εθελοντές χρησιμοποιώντας CopyCaller Λογισμικού.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση και ανοσοκηλίδωση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ραδιοανοσοκαθίζησης ρυθμιστικό δοκιμασίας (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 1% Nonidet Ρ-40, 0,1% SDS) συμπληρωμένο με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης Σετ III (Calbiochem, San Diego, CA). Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ πυρηνικό εκχύλισμα (Active Motif, Carlsbad, CA). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Χρένο συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) χρησίμευσε ως δευτερεύον αντίσωμα για το Σύστημα Ανίχνευσης ECL (GE Healthcare).

Η ανοσοχρώση

Πρωτοβάθμια αντισώματα που χρησιμοποιούνται για ανοσοϊστοχημική και ανοσοκυτταροχημική χρώση ήταν αντι-DSCC1 (B01P, Abnova, Taipei, Ταϊβάν) και αντι-Myc (Sigma). Η ειδικότητα του αντισώματος DSCC1 επιβεβαιώθηκε με το μπλοκάρισμα με DSCC1 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11].

Επαγωγή της απόπτωσης και κυτταρομετρία ροής

Για να μελετηθεί η επαγωγή της απόπτωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καμπτοθεκίνη (Wako, Osaka, Japan), δοξορουβικίνη (LC Laboratories, Woburn, ΜΑ), MG132 (Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία), ή εκτίθεται σε γ-ακτινοβολία (Gammacell 40, Atomic Energy of Canada, Ontario, Canada). Η έκφραση του διασπασμένου πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και διασπασμένη κασπάση 3 ανιχνεύτηκε με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-διασπασμένη PARP (9541) και αντι-κασπάση-3 αντισώματα (9662), αντίστοιχα (Cell Signaling Technology, Danvers , ΜΑ). Αξιολόγηση της απόπτωσης διεξήχθη επίσης με αννεξίνη V και ΡΙ διπλό βαφή χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 488 αννεξίνης V /Dead κυτταρικής απόπτωσης Kit (Life Technologies). Εν συντομία, τα καλλιεργημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή καμπτοθεκίνη για 24 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Annexin V και ΡΙ, και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε ένα FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας

πλασμίδια που εκφράζουν μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) χρησιμοποιώντας προαγωγό U6 (psiU6BX3.0) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Τα πλασμίδια που εκφράζουν DSCC1 shRNA (psiU6-shDSCC1) κατασκευάστηκαν με κλωνοποίηση δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια μέσα στο

Bbs

θέσεις Ι του φορέα psiU6BX3.0. Δύο αλληλουχίες στόχους, 5′-GUGGACAGAAGAAGAUAUU-3 ‘(shDSCC1 # 1) και 5′-GCAAACCAUAGGUGCAUUA-3′ (shDSCC1 # 2), χρησιμοποιήθηκαν για DSCC1 Τα siRNAs. Ως αρνητικοί μάρτυρες, έχουμε ετοιμάσει ένα πλασμίδιο στόχευσης ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (psiU6-shEGFP) και εκείνων που στοχεύουν ομελέτα ακολουθίες shDSCC1 # 1 (5’-AAAUUGCGAAGGUGAUGAA-3 ‘? PsiU6-shDSCC1 # 1scr) ή shDSCC1 # 2 (5’ AACACGUUAAUAACCGGUG-3 ‘? psiU6-shDSCC1 # 2scr). δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας κύτταρα HCT116, SW480, και RKO επιμολυσμένα με πλασμίδια που εκφράζουν shEGFP, shDSCC1, ή σκαρφάλωμα shDSCC1 [11]. Για να διερευνηθεί η επίδραση της υπερέκφρασης DSCC1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επιμολύναμε κύτταρα SW480 και HCT116 με pCAGGS-DSCC1 και καθιερωμένες δύο ή τρεις κλώνους που εκφράζουν σταθερά εξωγενές DSCC1. Ελέγχου SW480 και HCT116 κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα ήταν επίσης καθιερωθεί ως παρωδία κύτταρα.

δοκιμασίες Ανάδοχος δημοσιογράφος και κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξιγένεση

λουσιφεράσης πλασμίδια αναφοράς που περιέχει το

DSCC1

υποστηρικτής ήταν παρασκευάστηκε με κλωνοποίηση του 5′-πλαγιοκοπική περιοχή του

DSCC1

στο

ΜΙυ

Ι και

Bgl

θέσεις ενζύμου περιορισμού ΙΙ του pGL3-Basic (Promega, Madison, WI ). Ένα θραύσμα DNA περίπου 1.0 kb-στην 5′-πλαγιοκοπική περιοχή του

DSCC1

ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό DNA από υγιείς εθελοντές και ένα σύνολο εκκινητών (προς τα εμπρός: 5′-CGACGCGTATGTCTGCTCAGATCCTTTGAAT-3 ‘, αντίστροφη : 5’-GAAGATCTCGCCGGGTCTAGGAGTCC-3 ‘). Μεταλλαγμένα πλασμίδια που περιέχουν υποκαταστάσεις σε υποθετικές θέσεις πρόσδεσης E2F του

DSCC1

προαγωγού δημιουργήθηκαν με κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξογονία χρησιμοποιώντας τη QuikChange II XL τοπο-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με τα πλασμίδια αναφοράς μαζί με ρΡΙ_-ΤΚ (Promega) με τη χρήση Fugene 6 αντιδραστήριο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, και δραστηριότητες ρεπόρτερ μετρήθηκαν με διττό σύστημα λουσιφεράσης (ΤΟΥΟ Β-Net, Tokyo, Japan). Για την knockdown έκφρασης E2F1, συνθετικά E2F1 siRNA αγοράστηκε από την Sigma (νόημα: 5′-GGGAGAAGUCACGCUAUGA-3 ‘, αντινόημα: 5′-AUAGCGUGACUUCUCCCCC-3’).

δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης

για να διερευνηθεί η αλληλεπίδραση του E2F1 με το

DSCC1

περιοχή υποκινητή, μια ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (μάρκας) δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο Agilent θηλαστικών τσιπ με ελαφρές τροποποιήσεις. κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν διασυνδεδεμένη με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και σβήστηκε με 0.4 Μ γλυκίνη. εκχυλίσματα χρωματίνης είχαν διατμηθεί με μικροκοκκική πέψη νουκλεάσης, και ακολούθως τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-ΟΝΑ ανοσοκαταβυθίστηκαν με 3 μg αντι E2F1-πολυκλωνικό αντίσωμα (C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) δεσμευμένο σε Dynabeads αντι-κουνελιού IgG επικαλυμμένα ( Life Technologies). Μη-άνοσο IgG κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Οι καταβυθίζονται DNA που υποβλήθηκαν σε ποσοτική ανάλυση PCR με ένα σύνολο εκκινητών (προς τα εμπρός (-26) 5′-CCGGAAACACGCCCATGGC-3 ‘και όπισθεν (127) 5′-GGGTCCTCTTCATCGCAGC-3’) για την ενίσχυση του

DSCC1

υποστηρικτής περιοχή. Ιδιαιτερότητα της δοκιμασίας προσδιορίστηκε με την ενίσχυση μιας περιφερικής περιοχής ανοδικά στο

DSCC1

υποκινητή με τους ακόλουθους εκκινητές: πρόσθιος (-1279) 5′-AGTTGTAGGGAATGTTTCCCATT-3 ‘και αντίστροφος (-1111) 5’- GATTGGTTCATGTGACCTACTTC-3 ‘. Επιπλέον, οι ενισχύσεις του κύκλου κυτταρικής διαίρεσης 2 (

CDC2

) προαγωγό και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (

GAPDH

) υποκινητή χρησιμοποιήθηκαν για θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, αντίστοιχα (εκκινητές:

CDC2

μπροστά 5′-CGCCCTTTCCTCTTTCTTTC-3 ‘,

CDC2

αντίστροφη 5′-ATCGGGTAGCCCGTAGACTT-3′,

GAPDH

μπροστά 5′-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3 ‘,

GAPDH

αντίστροφη 5′-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3 ‘).

Αποτελέσματα

η έκφραση της DSCC1 συχνά αυξημένα σε CRC

για την ταυτοποίηση νέων μορίων στόχων για το θεραπεία ή /και διαγνωστικές βιοδείκτες του CRC, εμείς προηγουμένως πραγματοποιήθηκε ανάλυση προφίλ έκφρασης των όγκων παχέος εντέρου και του παχέος συμφωνημένα κανονική ιστούς τους από cDNA microarray [5]. Μεταξύ των γονιδίων απελευθερωμένη σε όγκους παχέος εντέρου, η έκφραση της αντιγραφής του DNA και η αδελφή χρωματιδικές συνοχή 1 (

DSCC1

) αυξήθηκε περισσότερο από δύο φορές σε 5 από τα 7 καρκίνων του παχέος εντέρου σε σύγκριση με το αντίστοιχο μη-καρκινικές βλεννογόνου του παχέος εντέρου (Εικόνα 1Α ). Μεταγενέστερες ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιώντας 20 επιπλέον CRC ιστούς και το αντίστοιχο μη-καρκινικές βλεννογόνο αποκάλυψε ότι

DSCC1

έκφραση ανυψώθηκε πάνω από δύο φορές σε 12 από τις 20 όγκων (Σχήμα 1Α). Μία ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξε συσσωρευμένη πρωτεΐνη DSCC1 σε 29 από 40 ιστών CRC σε σύγκριση με τα αντίστοιχα γειτονικά μη-καρκινικές βλεννογόνο του κόλου (Σχήμα 1Β). Αν και ψάξαμε για συσχετισμούς μεταξύ της έκφρασης της και κλινικοπαθολογικών παραγόντων που περιλαμβάνουν την ηλικία και το φύλο των ασθενών, την τοποθεσία, το μέγεθος, και ιστολογικά δεδομένα των όγκων όπως το βάθος της εισβολής, εμπλοκή λεμφαδένων, και η αγγειακή ή λεμφικό εισβολή σκάφος, κανένας από τους παράγοντες συσχετίστηκε σημαντικά με την έκφραση DSCC1 (Πίνακας S1). Επιπλέον, ανάλυση κηλίδας western χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές CRC αποκάλυψε ότι DSCC1 είχε εκφράζεται σε αφθονία σε HCT116, ΗΤ-29, και τα κύτταρα DLD-1, και ότι εκφράστηκε σε χαμηλά επίπεδα σε SW480, SW620, και τα κύτταρα Caco-2 (Σχήμα 1 C) . Παρά το γεγονός ότι σε σύγκριση με τη σταθερότητα των DSCC1 πρωτεΐνης σε HCT116 (DSCC1-υψηλή) και SW480 (DSCC1-χαμηλή) κύτταρα με τη δοκιμασία κυκλοεξιμίδιο κυνηγητό, DSCC1 ήταν σχετικά σταθερές και στα δύο κύτταρα HCT116 και SW480. Η θεραπεία με MG132, ένας αναστολέας πρωτεασώματος επίσης δεν ενίσχυσε την έκφραση DSCC1 (Σχήμα S1A). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η σταθερότητα της πρωτεΐνης δεν είναι πιθανό να παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην αυξημένη έκφραση του DSCC1 σε καρκινικά κύτταρα.

(Α) αναλογίες σχετική έκφραση

DSCC1

σε επτά παχέος καρκινικούς ιστούς να τους αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς στα δεδομένα των μικροσυστοιχιών μας (άνω πάνελ). Σχετικά επίπεδα έκφρασης του

DSCC1

σε επιπλέον 20 ορθοκολικούς όγκους και η αντίστοιχη μη-καρκινικές βλεννογόνο αναλύθηκε με ποσοτική PCR (κάτω πίνακας). Ποσότητα

DSCC1

ομαλοποιήθηκε να

HPRT1

έκφρασης. άξονας Υ δείχνει την αναλογία του μέσου όρου των

DSCC1

έκφραση σε καρκινικά με αυτό στο αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό τους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από πειράματα εις τριπλούν. (Β) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανοσοϊστοχημική χρώση DSCC1 σε έναν ανθρώπινο ιστό καρκίνου του κόλου που περιέχει καρκινικά κύτταρα και παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο. (Γ) έκφραση του DSCC1 σε κυτταρικές γραμμές CRC ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-DSCC1 αντίσωμα. (D) Κύτταρα HCT116 ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-DSCC1 που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού IgG (πράσινο). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με ϋΑΡΙ (μπλε). (Ε) HCT116, RKO, και DLD-1 κύτταρα διαχωρίστηκαν σε κυτταροπλασματική (CF) και πυρηνική κλάσματα (NF), και οι κυτταροπλασματικές και πυρηνικές πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση Western. Η καθαρότητα των κλασμάτων προσδιορίστηκε με την παρουσία της β-τουμπουλίνης (κυτταροπλασματική δείκτης) και λαμίνη Β (πυρηνικό δείκτη). αριθμός (F) Αντίγραφο ανάλυση των

DSCC1

σε οκτώ κυτταρικές σειρές CRC και τα κύτταρα ΗΕΚ293. Σχετική αριθμός αντιγράφων του

DSCC1

γονίδιο προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας

RPPH1

σαν ενδογενές αναφοράς. Ο αριθμός αντιγράφων υπολογίσθηκε με διαίρεση των προϊόντων τους PCR με εκείνες των περιφερικών λευκοκυττάρων από υγιείς εθελοντές, και στη συνέχεια πολλαπλασιάζοντας με 2.

Η

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση απεικονίζονται απροσδόκητα συσσωρευτεί DSCC1 στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα του DSCC1-θετικού καρκίνου κύτταρα (Σχήμα 1 Β), αν και Dscc1 αναφέρθηκε να παίξει ένα ρόλο στην καθιέρωση της συνοχής κατά την αντιγραφή του DNA στο ζυμομύκητα. Για να αποσαφηνιστεί υποκυτταρική εντόπιση του, διενεργήσαμε ανοσοκυτταροχημική χρώση των ενδογενών DSCC1 σε κύτταρα HCT116. Σε συμφωνία με την ανοσοϊστοχημική χρώση των καρκινικών ιστών, DSCC1 πρωτεΐνη εντοπίστηκε τόσο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα (Σχήμα 1D και S1B). Επιπλέον, ανάλυση κηλίδας western χρησιμοποιώντας κυτταροπλασματικό και πυρηνικό κλάσματα εκχυλίζονται από HCT116, RKO, και κύτταρα (Σχήμα 1 Ε) και κύτταρα που εκφράζουν Myc-tagged DSCC1 επιβεβαίωσε υποκυτταρικό εντοπισμό του στο κυτταρόπλασμα, καθώς και τον πυρήνα 1 DLD-(Σχήμα S1c και S1D) .

Αντιγραφή αριθμού ανάλυση των

DSCC1

η

Για την αντιμετώπιση είτε ενίσχυση του γονιδίου που εμπλέκεται στην υπερέκφραση DSCC1, πραγματοποιήσαμε ανάλυση αριθμού αντιγράφων με ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας RNase P ως μάρτυρας . Σε σύγκριση με περιφερικά λευκοκύτταρα από υγιείς εθελοντές, ο αριθμός αντιγράφων του

DSCC1

δεν αυξήθηκε σε οποιεσδήποτε κυτταρικές σειρές CRC που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 1 F). Αξίζει να σημειωθεί ότι η μείωση στον αριθμό αντιγράφων παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΗΤ-29 που εκφράζεται σε αφθονία DSCC1 (Σχήμα 1 C). Αναλύσαμε περαιτέρω αριθμό αντιγράφων αλλοίωση του

DSCC1

στο παχύ έντερο και το αδενοκαρκίνωμα του ορθού (Το έργο Cancer Genome Atlas καρκίνο του παχέος εντέρου) με τη χρήση της βάσης δεδομένων cBioPortal (https://www.cbioportal.org/public-portal/). Ως αποτέλεσμα, ο αριθμός υποθετικές αντίγραφο αλλαγές βρέθηκαν σε 7 από 257 παχέος αδενοκαρκινώματα (2,7%), γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενίσχυση του

DSCC1

δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην έκφραση ενισχυμένη DSCC1.

κανονισμός του

DSCC1

δραστηριότητα υποκινητή

Για να επιλύσετε το μηχανισμό της αυξημένης έκφρασης DSCC1 στην CRC, διερευνήθηκε η δράση του υποκινητή του

DSCC1

στα κύτταρα HCT116. δοκιμασία Reporter χρησιμοποιώντας πλασμίδια που περιέχουν μία 5′-πλευρική περιοχή του

DSCC1

(pDSCC1-1023 /+ 109) έδειξαν ότι η περιοχή αυτή έχει ουσιαστική δραστηριότητα υποκινητή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στην περιοχή, εντοπίσαμε ένα υποτιθέμενο μοτίβο E2F-δεσμευτική, EBS1 (-3 /+ 5? 5′-CTTGGCGC-3 ‘) χρησιμοποιώντας το JASPAR (https://jaspar.genereg.net/) και βάσεις δεδομένων TFSEARCH (http: //www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (Σχήμα 2Α). Αυτή η υποθετική θέση δέσμευσης μοιράζεται υψηλή ομοιότητα με το συναινετικό μοτίβο για E2F, TTTSSCGC με S = G ή C. Από E2F μεταγραφικών παραγόντων συχνά απορυθμισμένη σε μία ποικιλία όγκων, ελέγξαμε την επίδραση της E2Fs στο

DSCC1

δραστηριότητα του υποκινητή. Παρά το γεγονός ότι E2F1, E2F2, E2F3, και E2F4 αύξησε τη δραστηριότητα υποκινητή, E2F6 δεν άλλαξε τη δραστηριότητα. E2F1, η οποία έδειξε την ισχυρότερη επαγωγή μεταξύ των τεσσάρων μελών, αύξησε τη δραστικότητα με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β και S2A). Αυτή η βελτίωση παρατηρήθηκε επίσης σε άλλες κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένης LoVo, HeLa, ΗΕΚ293 και (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να εξεταστεί η πιθανή εμπλοκή του EBS1 στην ενίσχυση, μετρήθηκε δραστικότητα ανταποκριτή χρησιμοποιώντας τα κατασκευάσματα pDSCC1-10 /+ 109 και + 10 /+ 109 με την παρουσία ή απουσία του E2F1 (Σχήμα 2C). Basal δραστηριότητες ρεπόρτερ από αυτά τα πλασμίδια ανταποκριτής δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σε απουσία E2F1 πλασμιδίων. Η διαγραφή του EBS1 (pDSCC1 + 10 /+ 109) μειώθηκε δραματικά δραστηριότητα ανταποκριτή E2F1-επαγόμενη (από 20,4-πλάσια έως 3.2 φορές). Απροσδόκητα, ενίσχυση της δραστικότητας ανταποκριτή από E2F1 παρατηρήθηκε ακόμη σε + 10 /+ 109. Περαιτέρω διαγραφή έως 70 του υποκινητή (pDSCC1 + 70 /+ 109) εντελώς μειωμένη E2F1-επαγόμενη δραστικότητα ανταποκριτή (Σχήμα 2C). Σε συμφωνία με αυτό το αποτέλεσμα, βρήκαμε δύο επιπλέον τεκμαρτή EBSS, EBS2 (+ 31 /+ 38? 5′-CTTCCGGC-3 ‘) και EBS3 (+ 57 /+ 64? 5′-TTGCCCGC-3’) στην περιοχή μεταξύ +10 και +70. Για την αντιμετώπιση ευθύνες EBS1, EBS2, και EBS3 για την επαγωγή, παρασκευάσαμε τέσσερα μεταλλαγμένο κατασκευάσματα ανταποκριτή (Σχήμα 2D) με αντικατάσταση του GC-πλούσιων τμήματος σε E2F συναινετικών μοτίβων, TTTSSCGC (S = C ή G) ή STTTS, επειδή αυτά τα πυρήνας μοτίβα ήταν σύμφωνα με πληροφορίες ζωτικής σημασίας για την E2F δεσμευτική [13], [14]. Σε σύγκριση με την άγριου τύπου pDSCC1-10 /+ 109 (14,8-πλάσια επαγωγή), και οι δύο τύποι EBS1-μεταλλαγμένο πλασμίδια (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1, και Mut1 ‘) αξιοσημείωτα μείωσε τη δραστηριότητα ανταποκριτή σε απόκριση προς E2F1 (5,2-πλάσια και 5,8-φορές, αντίστοιχα). Μεταλλάξεις σε δύο EBS1 και EBS2 (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1 + 2) μειώθηκε περαιτέρω στη δραστηριότητα E2F1-επαγόμενη (3,7 φορές). Μεταλλαγμένα πλασμίδιο αναφοράς που περιέχει υποκαταστάσεις στα τρία στοιχεία (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1 + 2 + 3) σχεδόν μείωσε την ενίσχυση (1,7 φορές), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι τρεις μοτίβα πρόσδεσης E2F είναι υπεύθυνες για τη ρύθμιση της

DSCC1

δραστικότητα προαγωγού.

(Α) Νουκλεοτιδική αλληλουχία του ανθρώπινου -10 έως +90 bp

DSCC1

. Οι τρεις υποθετικές μοτίβα πρόσδεσης E2F υπογράμμισε. (Β) pDSCC1-1023 /+ 109 παροδικά επιμολυσμένα με ρΡΙ_-ΤΚ και pcDNA3-ΗΑ E2Fs σε SW480, ή με ρΡΙ_-ΤΚ και pcDNA3-ΗΑ E2F1 (0,01-1 μg) εντός SW480 και κύτταρα HCT116. (Γ) pDSCC1-10 /+ 109 ή οι βραχύτερες κατασκευάσματα υποκινητή επιμολύνθηκε με E2F1 ή τον κενό φορέα σε κύτταρα SW480. (Δ) Ανάλυση μετάλλαξης Η τοποκατευθυνόμενη του υποθετικές θέσεις πρόσδεσης E2F στην περιοχή εγγύς υποκινητή. pDSCC1-10 /+ 109 ή μεταλλαγμένων κλώνων του επιμολύνθηκε με E2F1 ή τον κενό φορέα σε κύτταρα SW480. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. δραστηριότητα υποκινητή δείχνει τη σχετική μονάδα λουσιφεράσης ή φορές επαγωγής πάνω κενό φορέα επιμόλυνσης. (Ε) χρωματίνης ανοσοκαθίζηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-E2F1 αντίσωμα. Τα καταβυθισθέντα DNAs υποβλήθηκαν στην ενίσχυση του

DSCC1

υποκινητή με ποσοτική PCR. Για να εξακριβωθεί η ειδική σύνδεση με την EBS, την ενίσχυση μιας περιφερικής περιοχής ανοδικά στο

DSCC1

υποκινητή χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Μια σημαντική διαφορά προσδιορίστηκε με t-test. (F) Κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με έλεγχο ή E2F1 siRNA (25 ηΜ) για 48 ώρες.

DSCC1

έκφραση ανιχνεύθηκε με ποσοτική PCR. Μια σημαντική διαφορά προσδιορίστηκε με t-test. (G) κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή E2F1 siRNA (25 ηΜ), που ακολουθείται 8 ώρες αργότερα με επιμόλυνση με πλασμίδιο αναφοράς (pDSCC1-10 /+ 109) και φορέα έκφρασης E2F1 ή τον κενό φορέα. Μετά από 48 ώρες, μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Αλληλεπίδραση του E2F1 με το

DSCC1

περιοχή του υποκινητή

Για να προσδιορίσετε αν E2F1 συνδέεται με την περιοχή του υποκινητή του

DSCC1

, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ποσοτικών ChIP χρησιμοποιώντας αντι-E2F1 αντίσωμα και ένα σετ εκκινητών που περιλαμβάνει τις τρεις υποθετικές E2F-δεσμευτικά στοιχεία. Ο υποκινητής του γονιδίου κυτταρικής διαίρεσης κύκλου 2 (

CDC2

), ένα γνωστό στόχο E2F1, εμπλουτίστηκε 13,4 φορές με το ανοσοκαταβυθισμένο DNA (Σχήμα S2B). Όπως ήταν αναμενόμενο, η

DSCC1

περιοχή του υποκινητή εμπλουτίστηκε με έως και 15,4 φορές στο DNA, γεγονός που υποδηλώνει μια αλληλεπίδραση του

DSCC1

περιοχή του υποκινητή με E2F1 (Σχήμα 2Ε).

για να επιβεβαιώσετε τη συμμετοχή του E2F1 στη ρύθμιση της έκφρασης DSCC1, διερευνήσαμε την επίδραση αποσιώπηση του E2F1 στην έκφραση DSCC1. Real-time PCR και στύπωμα Western αναλύσεις έδειξαν ότι η εξάντληση των E2F1 μειωμένη έκφραση DSCC1 (Σχήμα 2F και S2C). Μεσολάβηση RNAi knockdown δραστηριότητας E2F1 επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία ρεπόρτερ που δείχνει σημαντική μείωση του

DSCC1

δραστικότητα προαγωγέα από 10,4 (Ctrl siRNA) σε 4,7-πλάσιο με E2F1 siRNA σε κύτταρα SW480 (Σχήμα 2G). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι

DSCC1

τρανσενεργοποίηση είναι, τουλάχιστον εν μέρει, που ρυθμίζεται από E2F1 σε CRC μέσω της αλληλεπίδρασής του με το

DSCC1

περιοχή προαγωγέα, και ότι οι τρεις EBSS διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην μεταγραφική ενεργοποίηση. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η έκφραση DSCC1 διαμορφώνεται από E2F μεταγραφική δραστηριότητα, συγκρίναμε την σχετική έκφραση

DSCC1

με

CDK1

(

CDC2

), ως ένδειξη της δραστηριότητας της μεταγραφής E2F , χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων (E-Μπειραμ-3715 και GEOD-23878) στην έκφραση του γονιδίου της βάσης δεδομένων Atlas (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). Στα σύνολα δεδομένων,

DSCC1

και

CDK1

ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε όγκους παχέος εντέρου σε σύγκριση με την κανονική του παχέος ιστούς (Εικόνα 3). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα δύο σύνολα δεδομένων υπολογίζεται υψηλές τιμές του συντελεστή συσχέτισης (E-Μπειραμ-3715,

r

= 0,912 και GEOD-23878,

r

= 0.864) μεταξύ των

DSCC1

και

CDK1

, υποστηρίζοντας την άποψη ότι

DSCC1

είναι ένα άλλο κατάντη γονίδιο ρυθμίζεται από E2F.

Αυτή η συσχέτιση φαίνεται από δύο σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών, E-Μπειραμ-3715 (Α) και GEOD-23878 (B), στην έκφραση του γονιδίου της βάσης δεδομένων Atlas (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). συντελεστή συσχέτισης του Pearson του (r) μεταξύ των

DSCC1

και

CDK1

τιμές έκφραση υπολογίζεται στη συνέχεια να αξιολογηθεί η συσχέτισή τους.

Η

Επίδραση της DSCC1 στον πολλαπλασιασμό των CRC κύτταρα

Για να εξεταστεί ο ρόλος της αυξημένης έκφρασής της σε κύτταρα CRC, ερευνήσαμε αν DSCC1 εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση βιωσιμότητας κυττάρων με χρήση πλασμιδίων που εκφράζουν τόσο DSCC1 shRNA (shDSCC1 # 1, ή shDSCC1 2 #) και γονίδιο ανθεκτικό στη νεομυκίνη. Τα πλασμίδια που περιέχουν την αλληλουχία του κωδικοποιημένα DSCC1 Τα siRNAs (shDSCC1 # 1scr και shDSCC1 2scr #) και πλασμίδιο που περιέχει EGFP shRNA (shEGFP) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Η επιμόλυνση με αυτά DSCC1 Τα siRNAs (shDSCC1 # 1, ή shDSCC1 2 #) μείωσε την έκφραση του DSCC1, ενώ διαμόλυνση με ελέγχους (shEGFP, shDSCC1 # 1scr και shDSCC1 2scr #) δεν είχε καμία επίδραση (Σχήμα 4Α). κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν σε μέσα που περιέχουν κατάλληλη συγκέντρωση του G418 και το κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε. Βρήκαμε ότι ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων επιμολυσμένων με DSCC1 # 1 ή DSCC1 # 2 shRNA μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με EGFP, DSCC1 # 1scr, ή DSCC1 # 2scr shRNA, υποδεικνύοντας ότι DSCC1 παίζει ένα ρόλο στη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 4Β). Συνεπής δεδομένα ελήφθησαν σε SW480 και RKO κύτταρα (Σχήμα S3A). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε επανειλημμένα πειράματα.

(Α) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με τον έλεγχο (Mock και EGFP) και DSCC1 Τα siRNAs για 48 ώρες με τη χρήση του κιτ Nucleofector, και ανάλυση κηλίδας Western εκτελέστηκε. Έκφραση της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με Τα siRNAs μετρήθηκε με WST-8 δοκιμασίας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα επιμολύνσεις. Οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν με τεστ του Dunnett για πολλαπλές συγκρίσεις για να shEGFP-επιμολυσμένα κύτταρα. (Γ) Η υπερέκφραση του DSCC1 σε κύτταρα SW480 επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-DSCC1 αντίσωμα. Ισοδύναμο αριθμό τρία mock και τρία DSCC1 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, και προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρου διεξήχθησαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από πέντε πειράματα. Μια σημαντική διαφορά μεταξύ παρωδία και DSCC1 κυττάρων προσδιορίστηκε με αμφίδρομη επαναλαμβανόμενες μετρήσεις ANOVA.

Η

Επιπλέον, ιδρύσαμε SW480 κύτταρα που εκφράζουν συντακτικά εξωγενείς DSCC1, και σε σύγκριση πολλαπλασιασμό τους με τα κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα με mock διάνυσμα (Σχήμα 4C). Σύμφωνα με τα στοιχεία DSCC1-νοκ ντάουν, τα κύτταρα που εκφράζουν εξωγενή DSCC1 έδειξε πολλαπλασιασμό επαυξημένης κυττάρων σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα SW480 ή κύτταρα ελέγχου (

σ

= 2.2 × 10

-5). Παρομοίως, εξωγενές DSCC1-έκφραση ενισχυμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCT116 (Σχήμα S3b).

Ο ρόλος της DSCC1 στην επαγωγή της απόπτωσης

Από E2F1 ανατίθενται αντίσταση γενοτοξικών προσβολών [15], [16 ], [17], ερευνήσαμε περαιτέρω εάν η αυξημένη έκφραση DSCC1 παίζει ένα ρόλο στην ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να γονιδιοτοξική ερεθίσματα. SW480 κύτταρα που εκφράζουν εξωγενή DSCC1 (SW480-DSCC1 # 1, # 3 και # 8) εκτέθηκαν σε γ-ακτινοβολία, και επαγωγή απόπτωσης αναλύθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-διασπασμένη PARP.