Αφηρημένο

αμμώνιο είναι ένα μεταβολικό προϊόν αποβλήτων αποτοξινωθεί κυρίως από το ήπαρ. Ηπατική δυσλειτουργία μπορεί να οδηγήσει σε συσσώρευση κυτταροτοξική των κυκλοφορούντων αμμωνίου και σε μεταγενέστερες εγκεφαλοπάθεια. μεταφορών διαμεμβρανική αμμώνιο είναι μια ευρέως διαδεδομένη διαδικασία διασφαλίζεται από τα υψηλά συντηρημένες πρωτεΐνες της υπεροικογένειας MEP-Ποσό-Rh, συμπεριλαμβανομένων των Rhesus (Rh) παράγοντες θηλαστικών. Οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στον έλεγχο της

RH

έκφραση γονιδίων που παραμένουν ελάχιστα μελετηθεί. Εδώ απευθύνεται η ρύθμιση της έκφρασης του ενός από αυτούς τους παράγοντες,

RHBG

. Εντοπίζουμε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος HepG2 και τα κύτταρα αδενοκαρκινώματος SW480 του παχέος εντέρου ως έκφραση

RHBG

και δείχνουν ότι η έκφραση της στηρίζεται σε σηματοδότησης β-κατενίνης. siRNA μεσολάβηση β-κατενίνης knockdown οδήγησε σε σημαντική μείωση του

RHBG

mRNA σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Φαρμακευτικές αναστολή της αλληλεπίδρασης /β-κατενίνης TCF4 ή knockdown του παράγοντα μεταγραφής TCF4 μειωτικά επίσης

RHBG

έκφρασης. Έχουμε προσδιορίσει ένα ελάχιστο

RHBG

ρυθμιστική αλληλουχία εμφανίζοντας μια δραστηριότητα υποκινητή και δείχνουν ότι β-κατενίνης και TCF4 δεσμεύονται με αυτό το θραύσμα

in vivo

. Εμείς τελικά χαρακτηρίζουν το ρόλο των θέσεων δέσμευσης δυναμικό TCF4 στο

RHBG

κανονισμού. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν

RHBG

έκφρασης ως άμεσο στόχο της ρύθμισης β-κατενίνης, ένα μονοπάτι συχνά απορυθμισμένη σε πολλούς καρκίνους και που σχετίζονται με ογκογένεση

Παράθεση:. Merhi Α, De Mees C , Abdo R, Victoria Alberola J, Marini AM (2015) Wnt /β-κατενίνης Σηματοδοσίας ρυθμίζει την έκφραση του αμμωνίου Permease Gene

RHBG

σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 10 (6): e0128683. doi: 10.1371 /journal.pone.0128683

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Chunming Liu, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 19 Ιαν 2015? Αποδεκτές: 29 Απρίλη 2015? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιούν 2015

Copyright: © 2015 Merhi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το βελγικό Fonds de la Recherche Scientifique FRS-FNRS (FRSM 3.4633.09, MISF4.521.10.F), την Ομοσπονδία Wallonie-Bruxelles ( δράση de Recherche Concertée), η Διεθνής Brachet Stiftung, ο Jean Brachet και τα θεμέλια Alice et David Van Buuren. ΕΊΜΑΙ. είναι μια επιστημονική εργαζόμενος έρευνα υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση Télévie, C.D. ήταν μια επιστημονική έρευνα εργαζόμενος της F.R.S.-FNRS, JVA υποστηρίχθηκε από ένα da Vinci πρόγραμμα, και A.M.M. είναι ανώτερος επιστημονικός συνεργάτης του F.R.S.-FNRS. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αμμώνιο, εφεξής αναφερόμενος στο ποσό του NH

3 και NH

4

+ μοριακά είδη, χρησιμεύει ως κύρια πηγή αζώτου για τους μικροοργανισμούς και τα φυτά [1]. Είναι ωστόσο κυρίως περιγράφεται για τα κυτταροτοξικά συνέπειες της συσσώρευσης του σε ζώα [2]. Ηπατικού μεταβολισμού του αμμωνίου προς σύνθεσης της ουρίας και γλουταμίνη είναι κρίσιμη για την διατήρηση ενός χαμηλού πλασματικού επιπέδου του αμμωνίου που εξέρχεται από τον καταβολισμό των πρωτεϊνών και της δραστηριότητας της εντερικής χλωρίδας. Η απομείωση της αποτοξίνωσης αμμωνίου που συμβαίνουν σε περίπτωση ηπατικής δυσλειτουργίας μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη της ηπατικής εγκεφαλοπάθειας και, σε οξείες περιπτώσεις, σε θανατηφόρες εγκεφαλική παράλυση. Παράλληλα με αυτές τις τοξικές επιδράσεις, την παραγωγή νεφρική αμμωνίου από glutaminolysis και την επακόλουθη απέκκριση στα ούρα του είναι μια κρίσιμη διαδικασία για να εξασφαλίσει την ομοιόσταση του pH του αίματος [3]. Η άποψη ότι οι διαμεμβρανικές ροές του αμμωνίου είναι η μόνη συνέπεια της NH

3 δωρεάν διάχυση έγινε για δεκαετίες, μέχρι εντοπίστηκαν τα πρώτα γονίδια που κωδικοποιούν συγκεκριμένες permeases αμμωνίου [4-6]. Η ανάλυση της αλληλουχίας επέτρεψε να ορίσετε ένα νέο και ευρέως συντηρημένη οικογένεια πρωτεϊνών ονομάζεται MEP-Ποσό-Rh, που εκπροσωπούνται στο σπονδυλωτά από τα γνωστά στοιχεία η ομάδα αίματος του ανθρώπου Rhesus [7]. Μη ερυθροειδή Rh παράγοντες, RhBG και rhCG, στη συνέχεια ανακαλύφθηκαν και κυρίως βρέθηκε να εκφράζεται σε ειδικά επιθηλιακά κύτταρα πολλών οργάνων, συμπεριλαμβανομένων ποντικού και ανθρώπου ήπαρ και τα νεφρά [8-14]. μελέτες knockout ποντίκια αποκάλυψε το ρόλο των Rhbg και rhCG σε νεφρική απέκκριση στα ούρα του αμμωνίου, ενώ το δυναμικό συμμετοχή τους στο ήπαρ φυσιολογία παραμένει άλυτο [15-17]. Αξίζει να σημειωθεί ότι,

RHBG

εμφανίζεται υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα που φέρει την ενεργοποίηση μεταλλάξεις σε β-κατενίνης [18], γεγονός που υποδηλώνει συσχέτιση μεταξύ Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης και της ανθρώπινης

RHBG

κανονισμού. Η συσχέτιση αυτή φαίνεται να ισχύει και σε ένα κανονικό πλαίσιο ήπατος ποντικού ως διαγονιδιακά μοντέλα επιτρέπουν στοχευμένες απενεργοποίηση ή ενεργοποίηση της β-κατενίνης σηματοδοτήσεως δείχνουν προς τα κάτω ρύθμιση ή ρύθμιση προς τα άνω του

RHbg

έκφραση, αντίστοιχα [19,20]. Η οδός /β-κατενίνης Wnt είναι άκρως συντηρημένη σε όλη μετάζωα και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση [21-23]. Οι εκκρινόμενες πρωτεΐνες της οικογένειας WNT είναι ικανά να συνδέονται ειδικούς υποδοχείς Frizzeld /LRP και να ενεργοποιήσετε τη μεταγωγή σήματος μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Στην κανονική μηχανισμός /β-κατενίνης Wnt, απουσία σηματοδότηση Wnt συνοδεύεται από χαμηλό κυτοσολικό επίπεδο β-κατενίνης. Η σταθερότητα β-κατενίνης ρυθμίζεται από ένα συγκρότημα καταστροφή, που σχηματίζεται από αξίνη, αδενωματώδεις συγκρότημα πολυποδίαση (APC), κινάσης καζεΐνης 1 και την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3β (GSK-3 β) που φωσφορυλιώνει β-κατενίνης στο Ν-τελικό άκρο και οδηγεί του να ubiquitylation της και την επακόλουθη υποβάθμιση του πρωτεασώματος [21,22]. Σηματοδότηση Wnt πυροδοτεί τη διάσταση του συμπλέγματος β-κατενίνης /καταστροφή [23-25]. Η προκύπτουσα αναστολή της φωσφορυλίωσης οδηγεί σε κυτοσολικό συσσώρευση β-κατενίνης και μετατόπιση εντός του πυρήνα. Βήτα-κατενίνης, στη συνέχεια, μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή διαφόρων γονιδίων στόχου ως συμπαράγοντας δεσμεύονται σε μέλη του παράγοντα Τ-κυττάρων (TCF) /λεμφικών παράγοντας ενισχυτή (LEF) οικογένεια παράγοντα μεταγραφής και το αυτοκίνητο Wnt-ειδικών μεταγραφικών προγραμμάτων [23]. Ανώμαλη ενεργοποίηση σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, λόγω μεταλλάξεων απώλειας λειτουργίας σε APC ή ενεργοποίηση μεταλλάξεις σε β-κατενίνη έχει συνδεθεί με ογκογένεση σε πολλές ρυθμίσεις συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, του μαστού, του παχέος εντέρου και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [21,23].

οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στον έλεγχο της ανθρώπινης

RH

γονίδια έκφρασης και τα μονοπάτια σηματοδότησης που ενδεχομένως ενέχονται είναι μέχρι στιγμής δεν τεκμηριώνεται επαρκώς. Εδώ, επιδιώξαμε να εντοπίσει ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν το

RHBG

γονίδιο για τη μελέτη ρύθμισης της έκφρασης της και να αντιμετωπίσει το ενδεχόμενο άμεσης επιρροής της σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt. Δείχνουμε ότι

RHBG

εκφράζεται έντονα σε κύτταρα ηπατώματος HepG2 και στηρίζεται σε σηματοδότηση β-κατενίνης. Ομοίως, η

RHBG

έκφρασης αποκάλυψε σε SW480 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου εξαρτάται από την β-κατενίνης, υποστηρίζει περαιτέρω το ρόλο της σηματοδότησης β-κατενίνης σε

RHBG

κανονισμού. δοκιμασίες ανάλυση υποστηρικτής και χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση είναι συνεπείς με την άμεση συμμετοχή των TCF4 /β-κατενίνης σε

RHBG

ρύθμιση προς τα πάνω σε κύτταρα HepG2.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HepG2 και Hep3B) και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές εμβρυϊκών νεφρών (ΗΕΚ293Τ) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον καθηγητή Claude Szpirer, Université Libre de Bruxelles, Βέλγιο. Η κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου κόλον (SW480) αγοράστηκε από την CLS (Γερμανία). HepG2, Hep3B, SW480 και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ καλλιεργήθηκαν σε προχωρημένο μέσο ϋΜΕΜ (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Biowest), 2 mM L-γλουταμίνη, 50 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένο αέρα (5% CO2) στους 37 ° C. PFK118-310 (# K4394) αγοράσθηκε από την Sigma και χρησιμοποιούνται σε συγκέντρωση 0,2 ή 0,4μM από ένα διάλυμα DMSO.

πλασυίδια Κατασκευή

θραύσμα DNA (2492 bp) που αντιστοιχεί στο το δυναμικό

RHBG

προαγωγός ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με την F-Ργ BG- και R-Pr-BG (Πίνακας 1) εκκινητές και το χρησιμοποιηθέν ανθρώπινο γονιδίωμα DNA των κυττάρων ΗΕΚ293Τ ως πρότυπο. Το PCR προϊόν υπέστη πέψη με SacI και BglII ένζυμα περιορισμού και κλωνοποιήθηκε σε pGL3-Basic (Promega) που έχει γραμμικοποιηθεί με τα ίδια ένζυμα περιορισμού. Οι μεταλλάξεις διαγραφής στη συνέχεια κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο pGL3-RHBG ως εκμαγείο και τους εκκινητές υποδεικνύονται (Πίνακας 1). Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε πέψη με SacI και BglII ένζυμα περιορισμού και κλωνοποιήθηκε σε pGL3-Basic. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

Η

εκχύλιση RNA και qRT-PCR

Ολικό κυτταρικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κατεργασία ϋΝάσης έγινε χρησιμοποιώντας ένα Απομάκρυνση DNA Kit (Invitrogen, # AM1906). Ενα μα του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Realtime RT-PCR πραγματοποιήθηκαν σε ένα StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας GoTaq qPCR Master Mix (Promega) χρησιμοποιώντας τις υποδεικνυόμενες εκκινητές (Πίνακας 2) και κανονικοποιημένο επίπεδο σε β-ακτίνης mRNA μετρήθηκε παράλληλα.

χρώση ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Millicell EZ διαφανειών 8 θάλαμο (Millipore). Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) για 15 λεπτά και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 0,1% TritonX-100 για 3 λεπτά και το επόμενο αποκλείστηκαν με ορό αιγός (5%) για 30 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα β-κατενίνης (Cell # σηματοδότηση 8480, 1: 100 σε 5% ορό κατσίκας) για μία νύχτα σε 4 ° C. Τα πλακίδια πλύθηκαν και επωάστηκαν με αντι-κουνελιού IgG (H + L), F (ab ‘) 2 θραύσμα (Alexa Fluor 594 Σύζευγμα, κυτταρική σηματοδότηση, 1: 250 σε 5% ορό κατσίκας) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS, τα πλακίδια τοποθετημένα με αντιδραστήριο αντιξεθωριάσματος παρατείνει Χρυσό με ϋΑΡΙ (Invitrogen).

ανάλυση Western Blot

Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας RIPA (25mM Tris-HCl ρΗ 7.6, 150mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% ρυθμιστικό SDS) λύσης συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης και φωσφατάσης (Roche). Μετά τη φυγοκέντρηση, οι πρωτεΐνες ποσοτικά χρησιμοποιώντας Pierce BCA Microplate Protein Assay Kit μέσο αναγωγής που υποστηρίζονται δοκιμασίας (Thermo Scientific). Ίσες ποσότητες (~ 20 μg) πρωτεϊνών στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με πηκτώματα Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Protran, VWR). Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% γάλα και επωάστηκαν με αντι-β-κατενίνης (κυτταρική σηματοδότηση, # 8480, 1: 1000), αντι-TCF4 (# 2569, 1: 1000), αντι-γλουταμίνη συνθετάση (Abcam, # ab73593, 1 : 1000) ή αντι-β-ακτίνης (Sigma, # A2228, 1: 2000). Πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύθηκαν με αντι-κουνέλι ή αντι-ποντικού IgG-δευτερογενή αντισώματα κοχλιαρίας-συζευγμένο με υπεροξειδάση (GE Healthcare) που ακολουθείται από μέτρηση του χημειοφωταύγεια (Lumi-LightPLUS, Roche).

παρεμβολή RNA

τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντίστροφη προσχεδιασμένα σιγαστήρας επιλέξτε μη στόχευσης ελέγχου (Invitrogen, # 4390843) ή siRNAs που στοχεύουν β-κατενίνης (Invitrogen, # s438) ή TCF4 (Invitrogen, # s13880) με Lipofectamine siRNAMAX (Invitrogen). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 72 ή 96 ώρες και η υποδεικνύεται mRNA και πρωτεΐνες επίπεδο εξετάστηκαν με qRT-PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως.

Επιμόλυνση και λουσιφεράσης δοκιμασία

Τα κύτταρα παροδικά συν-επιμολύνθηκαν με το φορέα ρΤΚ Renilla λουσιφεράσης (Promega) και κενό πλασμίδιο (pGL3-Basic, Promega) ή το πλασμίδιο που περιέχει το υποδεικνυόμενο

RHBG

κατασκευάσματα υποκινητή για 48h χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Viafect (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης σε συνολικά κυτταρολύματα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης Dual-Glo (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας GloMax-96 Microplate φωτόμετρο (Promega).

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (CHIP) δοκιμασία

δοκιμασία CHIP έγινε χρησιμοποιώντας Kit SimpleChIP Ενζυματική χρωματίνης IP (Magnetic Beads, κυτταρική σηματοδότηση) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα φορμαλδεΰδης 1% με τις πρωτεΐνες του cross-link ιστόνης και μη ιστόνης με το DNA. Πυρηνική χρωματίνη υπέστη πέψη με μικρόκοκκη νουκλεάση για 20 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C είτε με αντι-β-κατενίνης (κυτταρική σηματοδότηση, # 8480, 1:50), αντι-TCF4 (# 2569, 1: 50) Η κανονική IgG κουνελιού (κυτταρική σηματοδότηση, # 2729). Μετά την πλύση με χαμηλή και υψηλή ρυθμιστικά ChIP αλάτι, τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-ϋΝΑ εκλούσθηκαν και διασυνδέσεις κατόπιν αναστρέφεται. Μετά πέψη με πρωτεϊνάση Κ, το DNA καθαρίζεται και ποσοτικά με πραγματικού χρόνου-PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα 2 και έχει σχεδιαστεί για να ενισχύσουν τις υποδεικνυόμενες περιοχές προαγωγού των γονιδίων-στόχων.

Στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM Στατιστικές συγκρίσεις αξιολογήθηκαν από Φοιτητών

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism έκδοση 5.00 του λογισμικού (Graph Pad Software). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν η τιμή ρ είναι κάτω από 0,05 (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001), η = 3, με εξαίρεση τα πειράματα Chip όπου n = 2.

Αποτελέσματα

RHBG

είναι ιδιαίτερα εκφράζεται σε κύτταρα ηπατώματος HepG2

Το ανθρώπινο

RHBG

γονίδιο βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε ένα υποσύνολο του ηπατοκυτταρικού καρκίνωμα [18], ωστόσο, οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται παραμένουν άγνωστα. Για τον εντοπισμό ενός καρκίνου κυτταρική γραμμή που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την αντιμετώπιση της ρύθμισης του

RHBG

, αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του στα κύτταρα ηπατώματος HepG2 και Hep3B. κύτταρα HepG2 φέρουν ετερόζυγη διαγραφή στο εξώνιο 3 του β-κατενίνης

CTNNB-1

γονίδιο, παράγοντας μία κολοβωμένη πρωτεΐνη β-κατενίνης λείπει υπολείμματα κλειδιά για φωσφορυλίωση της από το σύμπλοκο καταστροφή και έτσι οδηγεί σε κυτταρική συσσώρευση της [ ,,,0],26-28]. Τα κύτταρα Hep3B προέρχονται από ένα ηπατίτιδα Β που έχουν μολυνθεί ηπατικών όγκων, και δεν περιέχουν μεταλλάξεις στο γονίδιο β-κατενίνης [29,30].

Ο

RHBG

γονίδιο εμφανίστηκε εντόνως εκφρασμένο σε HepG2 σε σύγκριση με κύτταρα Hep3B, η τελευταία παρουσιάζει ελαφρώς υψηλότερο επίπεδο έκφρασης σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ΗΕΚ293Τ που λαμβάνονται ως ένα κανονικό μοντέλο κυττάρων (Σχήμα 1Α). Το επίπεδο έκφρασης του

GLUL

, το γονίδιο της συνθετάσης της γλουταμίνης (GS) επίσης ρυθμίζεται αυξητικά σε κύτταρα HepG2 σε σύγκριση με Hep3B (Σχήμα 1Β). Δεδομένου ότι το GS γονίδιο είναι μια αναφερόμενη στόχος της β-κατενίνης [31,32], αυτό θα μπορούσε να είναι συνεπής με μια πιο αποτελεσματική σηματοδότηση β-κατενίνης σε κύτταρα HepG2 σε σύγκριση με Hep3B. Η

GLUL

επίπεδα έκφρασης επιβεβαιώθηκαν από τα προκύπτοντα επίπεδα της πρωτεΐνης GS που εμφανίστηκαν υψηλότερα στην HepG2 σε σύγκριση με τα κύτταρα Hep3B (Σχήμα 1C). Κατά τον έλεγχο της έκφρασης της δεύτερης μη ερυθροειδή

RH

γονίδιο,

rhCG

, πολύ χαμηλά επίπεδα βρέθηκαν στα HepG2, Hep3B και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ (Σχήμα 1 D). έτσι αυτά τα δεδομένα το σημείο με τα κύτταρα HepG2 ως κατάλληλοι για τη μελέτη του

RHBG

έκφρασης.

α) Το επίπεδο της έκφρασης του mRNA των κυττάρων

RHBG

στο ΗΕΚ293Τ, HepG2 και Hep3B προσδιορίστηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. Β) Η έκφραση του mRNA της

GLUL

σε HepG2 και Hep3B καθορίστηκε με qRT-PCR. Γ) Western Blot ανάλυση GS πρωτεΐνης από συνολικά κυτταρολύματα κυττάρων HepG2 και Hep3B. Δ) Το επίπεδο της έκφρασης του mRNA της

rhCG

σε ΗΕΚ293Τ, HepG2 και Hep3B κυττάρων προσδιορίστηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. Ε) Western Blot ανάλυση των πρωτεϊνών β-κατενίνης από συνολικά κυτταρολύματα των κυττάρων ΗΕΚ293Τ, HepG2 και Hep3B.

Η

επόμενο ελέγχονται τα επίπεδα της πρωτεΐνης β-κατενίνης σε HepG2, Hep3B και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [33,34], HepG2 κύτταρα harbored δύο είδη β-κατενίνης πιθανόν αντιστοιχεί στον φυσικού τύπου και οι κομμένες μορφές (Σχήμα 1 Ε). Μια πρωτεΐνη β-κατενίνης με το μέγεθος της μορφής άγριου τύπου ανιχνεύθηκε σε αμφότερα ΗΕΚ293Τ και Hep3B, χωρίς προφανή συσσώρευση στην τελευταία κυτταρική γραμμή. Είχε προηγουμένως δειχθεί ότι β-κατενίνη είναι παρόν στον πυρήνα των κυττάρων HepG2 σε αντίθεση με τα κύτταρα Hep3B [34]. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν μια συσχέτιση μεταξύ

RHBG

έκφρασης σε κύτταρα HepG2 και την πυρηνική εντόπιση της β-κατενίνης.

κατασιγάσει της β-κατενίνης συσχετίζεται με

RHBG

ρύθμιση προς τα κάτω σε HepG2 κύτταρα

επόμενο χρησιμοποιηθούν β-κατενίνης siRNA να ελέγξετε εάν το

RHBG

γονιδιακής έκφρασης που παρατηρείται στα κύτταρα HepG2 σχετίζεται με β-κατενίνης λειτουργία. Η επιμόλυνση των κυττάρων HepG2 με β-κατενίνης siRNA για 72 ώρες οδήγησε σε μείωση του επιπέδου του mRNA β-κατενίνης σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA μη στόχευσης (Σχήμα 2Α). Η μείωση του β-κατενίνης mRNA ως αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης β-κατενίνης (Σχήμα 2Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η

RHBG

γονιδιακή έκφραση ήταν σε μεγάλο βαθμό μειωμένη κατά της β-κατενίνης σίγηση (Σχήμα 2C). Ομοίως, τα επίπεδα έκφρασης του

Axin2

και

κυκλίνης D1

, δύο στόχοι της ρύθμισης β-κατενίνης [35-38], μειώθηκαν επίσης με β-κατενίνης σίγηση (Σχήμα 2D και 2Ε). Αντίθετα, το χαμηλό επίπεδο έκφρασης του

rhCG

παρατηρήθηκε σε κύτταρα HepG2 δεν επηρεάστηκε από β-κατενίνης σίγηση (Σχήμα 2F). Ως εκ τούτου, η αναστολή της β-κατενίνης συνοδεύεται από την προς τα κάτω ρύθμιση του

RHBG

έκφραση γονιδίου σε κύτταρα HepG2.

AF) κύτταρα HepG2 ανάστροφα επιμολύνθηκαν με β-κατενίνη ή ελέγχου (σκαρφάλωμα) siRNAs. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επίπεδα έκφρασης του

β-κατενίνης

mRNA (Α), β-κατενίνης πρωτεΐνη (Β),

RHBG

mRNA (C),

Axin2

mRNA (D),

κυκλίνης D1

mRNA (Ε) και

rhCG

mRNA (F) προσδιορίστηκαν.

Η

μονάδες βήτα-κατενίνης

RHBG

έκφραση σε SW480 κύτταρα καρκίνου κόλου

οι μεταλλάξεις που επάγουν την ενεργοποίηση β-κατενίνης έχουν ταυτοποιηθεί σε διάφορους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, του προστάτη, του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου [21,33,39,40]. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η σηματοδότηση β-κατενίνης θα μπορούσαν να συσχετιστούν με το

RHBG

έκφραση σε μία άλλη κυτταρική σειρά καρκίνου που φιλοξενούν β-κατενίνης σηματοδοτήσεως ενεργοποίηση μεταλλάξεων. Τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου SW480 φέρουν περικοπή μετάλλαξη στο

APC

γονίδιο, με αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση και πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης και οδηγούν σε συστατική ενεργοποίηση του β-κατενίνης σηματοδότηση [41-44]. Σταθερά, τα πειράματα ανοσοφθορισμού αποκάλυψε ένα ισχυρό πυρηνικό εντοπισμό του β-κατενίνης σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 3Α). Η επιμόλυνση των κυττάρων SW480 με β-κατενίνης siRNA για 72 ώρες οδήγησε σε μείωση τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του β-κατενίνης (Σχήμα 3Β και 3C). Παρομοίως με κύτταρα HepG2, β-κατενίνης σίγηση συνοδεύτηκε από μία μεγάλη μείωση στην

RHBG

έκφραση σε κύτταρα SW480 (σχήμα 3D). Τα επίπεδα έκφρασης του

Axin2

, και

CylcinD1

(Σχ 3Ε και 3F) μειώθηκαν επίσης κατά β-κατενίνης σίγησης, συνεπής με β-κατενίνης αναστολή σηματοδότησης.

rhCG

έκφραση δεν επηρεάστηκε σημαντικά από β-κατενίνης σίγηση (Σχήμα 3G).

Α) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα ανοσοφθορισμού της β-κατενίνης εντοπισμό σε κύτταρα SW480 χρήση αντισώματος β-κατενίνης. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. B-G) SW480 κύτταρα αντίστροφη επιμολυσμένα με β-κατενίνης ή τον έλεγχο (αγωνίζομαι) siRNAs. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επίπεδα έκφρασης του

β-κατενίνης

mRNA (Β), β-κατενίνης πρωτεΐνη (C),

RHBG

mRNA (D),

Axin2

mRNA (Ε),

κυκλίνης D1

mRNA (F) και

rhCG

mRNA (G) προσδιορίστηκαν.

η

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συσχέτιση μεταξύ της β-κατενίνης σηματοδότηση και

RHBG

έκφραση μπορεί να επεκταθεί σε SW480 κύτταρα καρκίνου κόλου.

Ενεργοποίηση της β-κατενίνης συσχετίζεται με το

RHBG

επαγωγή γονιδίου σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ

Είμαστε δίπλα απευθύνεται κατά πόσον η ενεργοποίηση των β-κατενίνης σε μια κυτταρική γραμμή χωρίς σημαντικές πυρηνική δραστηριότητα της β-κατενίνης θα μπορούσε να είναι αρκετή για να προκαλέσει

RHBG

έκφρασης. LiCl αναφέρεται ότι αναστέλλει GSK3 κινάσης [45,46], που οδηγεί σε β-κατενίνης σταθεροποίηση και πυρηνική συσσώρευση [47,48]. Ως εκ τούτου, κατεργασμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ με LiCl (10 και 20 mM) για την ενεργοποίηση του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt. Σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις, ανοσοφθορισμό και πειραμάτων Western Blot που αποκάλυψε ότι η κατεργασία των κυττάρων ΗΕΚ293Τ με LiCl για 24 ώρες προκάλεσε μια πυρηνική συσσώρευση και τη σταθεροποίηση της β-κατενίνης (Σχήμα 4Α και 4Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία LiCl παράλληλα προκάλεσε αύξηση του επιπέδου πιΚΝΑ

RHBG

με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4C). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι το

RHBG

έκφραση μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω με τεχνητή ενεργοποίηση της σηματοδότησης β-κατενίνης και προτείνει ότι η ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού μπορεί να είναι επαρκής για να επάγει

RHBG

έκφραση στα κύτταρα ΗΕΚ293Τ.

Α) κύτταρα ΗΕΚ293Τ υποβλήθηκαν σε αγωγή με LiCI (20mM) για 24 ώρες. β-κατενίνης εντοπισμός προσδιορίστηκε με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας αντίσωμα β-κατενίνης. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Β) τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LiCI (10 ή 20 mM) για 24 ώρες. β-κατενίνης επίπεδο πρωτεΐνης προσδιορίστηκε σε συνολικά κυτταρολύματα με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας αντίσωμα β-κατενίνης. Γ) ίδιες συνθήκες καλλιέργειας όπως και στο B. Το

RHBG

επίπεδο mRNA καθορίστηκε με qRT-PCR.

Η

RHBG

έκφραση στα κύτταρα HepG2 εξαρτάται TCF4

Η οδός /β-κατενίνης Wnt οδηγεί Wnt-ειδική μεταγραφική προγραμμάτων μέσω της αλληλεπίδρασης με παράγοντες δέσμευσης DNA της οικογένειας TCF /LEF [21,22]. Ωστόσο, αναφέρεται ότι β-κατενίνης μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει την έκφραση του γονιδίου σε ένα TCF4-ανεξάρτητο τρόπο [49-51]. Για την αντιμετώπιση ρόλο του συμπλόκου /β-κατενίνης TCF4 σε

RHBG

έκφραση, αξιολογήσαμε την επίδραση της αναστολής της δραστηριότητας β-κατενίνης σε κύτταρα HepG2 με τη χρήση ενός ανταγωνιστή του συμπλόκου /β-κατενίνης TCF4, PKF118 -310. Αυτή η ένωση διαταράσσει τη σύμπλοκο /β-κατενίνης TCF4 και αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων που εξαρτώνται TCF4 [52]. Η επεξεργασία των κυττάρων HepG2 με PKF118-310 συνοδεύτηκε από μία μείωση σε

RHBG

έκφρασης (Σχήμα 5Α). Η

GLUL

επίπεδο έκφρασης επίσης μειώθηκε με την κατεργασία, σύμφωνα με μια πιθανή μείωση του TCF4 /μεσολάβηση β-κατενίνης μεταγραφής σε αυτές τις συνθήκες (Σχήμα 5Β).

ΑΒ) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με PKF118-310 (0,2 ή 0,4 μΜ) για 24 ώρες. Η

RHBG

(Α) και

GLUL

(Β) επίπεδα mRNA προσδιορίστηκαν από qRT-PCR. C-G) κύτταρα HepG2 ήταν αντίστροφη επιμολυσμένα με TCF4 ή τον έλεγχο (αγωνίζομαι) siRNAs. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επίπεδα του

TCF4

mRNA (C), TCF4 πρωτεΐνη (Δ),

RHBG

mRNA (Ε),

Axin2

mRNA (F), και

Cylcin D1

mRNA (G), προσδιορίστηκαν.

η

Για να διεκδικήσει περαιτέρω ο ρόλος της TCF4 στο

RHBG

έκφρασης, ελέγξαμε την επίδραση της TCF4 νοκ ντάουν κύτταρα HepG2. Η επιμόλυνση των τελευταίων κυττάρων με TCF4 siRNA για 72 ώρες μειώθηκε τόσο το mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του TCF4 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA μη στόχευσης (Σχ 5C και 5D). Είναι σημαντικό, η

RHBG

επίπεδο mRNA μειώθηκε κατά TCF4 φίμωση (Σχήμα 5Ε) Ομοίως, η

Axin2

και

κυκλίνης D1

επίπεδα mRNA μειώθηκαν επίσης (Σχήμα 5F και 5G ), σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις που περιγράφουν τα αντίστοιχα γονίδια ως στόχοι της TCF4 [38,40]. Επιπλέον, παρόμοια TCF4 φίμωση πειράματα που έγιναν σε SW480 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου μειώθηκε επίσης

RHBG

,

Axin2

και

κυκλίνης D1

επίπεδα του mRNA (Σχήμα 6Α-6Ε).

AE) κύτταρα SW480 ήταν αντίστροφη επιμολυσμένα με TCF4 ή τον έλεγχο (αγωνίζομαι) siRNAs. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επίπεδα του

TCF4

mRNA (Α), TCF4 πρωτεΐνη (Β)

RHBG

mRNA (C),

Axin2

mRNA (D), και

κυκλίνης D1

mRNA (Ε), προσδιορίστηκαν.

η

Αυτά τα αποτελέσματα μαζί δείχνουν ότι η β-κατενίνης με τη μεσολάβηση έκφραση

RHBG

είναι τουλάχιστον εν μέρει TCF4-εξαρτώμενη τόσο HepG2 και SW480 κυττάρων.

Η

RHBG

προαγωγός ενεργοποιείται από β-κατενίνης /TCF4

Για την περαιτέρω μελέτη

RHBG

έκφρασης και τον εντοπισμό πιθανών ρυθμιστές, ένα γονιδιακό θραύσμα (Σχήμα 7) που περιείχε 2349 bp ανοδικά και 142 bp καθοδικά του

RHBG

προβλεπόμενη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) έχει κατευθυντικά υποκλωνοποιήθηκε εντός του φορέα αναφοράς λουσιφεράσης πυγολαμπίδας pGL3-βασικό. Για να ελεγχθεί αν αυτό το θραύσμα έχει μια δραστικότητα προαγωγού, ο

RHBG

κατασκεύασμα υποκινητή (pGL3-RHBG) και η φυσική pGL3-βασικό φορέα χρησιμοποιήθηκαν για παροδική συν-επιμόλυνση των κυττάρων HepG2 μαζί με τον ανταποκριτή λουσιφεράσης Renilla ΡΤΚ φορέα ως έλεγχος επιμόλυνσης. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, η λουσιφεράση δραστηριότητα σε pGL3-RHBG επιμολυσμένα κύτταρα ήταν περίπου 30 φορές υψηλότερη από ό, τι με το pGL3-βασικό πλασμίδιο που δείχνει ότι το κλωνοποιημένο

RHBG

αλληλουχία περιέχει ένα δραστικό προωθητή (Σχήμα 8Α).

Η δυνατότητα του ανθρώπου

RHBG

αλληλουχία του υποκινητή ελήφθη από τη βάση δεδομένων υποκινητή ευκαρυωτικά (https://epd.vital-it.ch/). Μαύρο βέλος (↓) υποδεικνύει την προβλεπόμενη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) ο οποίος ορίζεται νουκλεοτιδίων 0. Τα κουτιά GC σκιασμένα. Μια επιλογή των πιθανών θέσεων πρόσδεσης (με 0 ή λιγότερο από 5% ανομοιότητα) των μεταγραφικών παραγόντων που προσδιορίζονται με τη χρήση PROMO [54,55] είναι υπογραμμισμένη. Οι πιθανές θέσεις δέσμευσης TCF4 υποδεικνύεται με άδεια κουτιά. Τα οριζόντια βέλη (→) δείχνουν την θέση εκκίνησης υπόλειμμα του κάθε κατασκευάσματος προαγωγού αναλύθηκε στο σχήμα 8.

Η

κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με το κενό πλασμίδιο (pGL3) ή

RHBG

προαγωγό (pGL3 -RHBG) μαζί με ΚβηϊΙΙβ πλασμίδιο. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση,

RHBG

δραστηριότητα υποκινητή σε συνολικά κυτταρολύματα προσδιορίστηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης. Β) κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με

RHBG

προαγωγό (pGL3-RHBG) ή η υποδεικνυόμενη κατασκεύασμα μαζί με Renilla πλασμίδιο. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση,

RHBG

δραστικότητα προαγωγού προσδιορίστηκε με μέτρηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης σε συνολικά κυτταρολύματα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος των τριπλών προσδιορισμών ± S.E.M του pGL3-RHBG κατασκεύασμα σε σχέση με pGL3-Basic. C) κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη δομή μαζί με Renilla πλασμίδιο. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση,

RHBG

δραστικότητα προαγωγού προσδιορίστηκε με μέτρηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης σε συνολικά κυτταρολύματα.

Η

ανάλυση αλληλουχίας του

RHBG

ρυθμιστική αλληλουχία δεν αποκαλύπτουν μια πιθανή κουτί ΤΑΤΑ, ενώ η περιοχή κοντά στο προβλεπόμενο TSS εμπλουτίστηκε σε περιεχόμενο G /C, δείχνοντας ότι η

RHBG

υποκινητή πιθανόν αντιστοιχεί σε ΤΑΤΑ πλούσιο σε GC υποκινητή. Δύο πιθανές θέσεις GC αποτυπώθηκαν, ενσωματωμένα σε πιθανές θέσεις πρόσδεσης Sp-1 (Σχήμα 7). Για να αναλύσουμε περαιτέρω τις περιοχές σημαντικές για την δραστικότητα της κλωνοποιημένης

RHBG

υποκινητή, μια σειρά από κατασκευάσματα παρήχθησαν φέρει προοδευτικές διαγραφές σε αυτό το θραύσμα DNA (Σχήματα 7 και 8).

Αν και οι διακυμάνσεις ήσαν Σημειώνεται, σύμφωνα με την υπό εξέταση θραύσμα, όλα τα κατασκευάσματα που περιέχουν την περιοχή -60 /+ 142 παρήγαγε μια δραστικότητα λουσιφεράσης πολύ κοντά ή υψηλότερη από την πλήρους μήκους κατασκεύασμα pGL3-RHBG (Σχήμα 8Β). Του σημειώματος του /+ 142 περιοχή του θραύσματος H -60, που περιλαμβάνει μόνο ένα από τα δύο κουτιά GC, διατήρησε υψηλή δραστηριότητα λουσιφεράσης. Οι κατασκευές που φέρουν περαιτέρω 5 ‘αποκοπής στην περιοχή αυτή οδήγησε σε σημαντική μείωση του

RHBG

λειτουργία υποκινητή, το -22 /+ 142 περιοχή παρουσιάζοντας μια πολύ χαμηλή δραστηριότητα της λουσιφεράσης (Σχήμα 8Β). Αυτό υπογραμμίζει τη σημασία του τμήματος DNA μεταξύ θραύσμα Η και Ι, και δείχνει ότι η βλάβη έκφρασης είναι πιθανότατα οφείλεται στην απώλεια του δεύτερου κουτιού GC. Επιπλέον, η ανάλυση του -60 /+ 142 λειτουργικό τμήμα αποκάλυψε την παρουσία τριών μοτίβων /CAAAG CTTTG που μπορούν να χρησιμεύσουν ως θέσεις πρόσδεσης TCF4 (Σχήμα 7). Αυτά τα μοτίβα είτε αντιπαρατίθεται ή κατάντη του θεωρούμενου TSS. Για την αξιολόγηση μια πιθανή συμβολή αυτών των μοτίβων για τη ρύθμιση των

RHBG

γονιδιακής έκφρασης, προαγωγό κατασκευάσματα που φέρουν το -60 /+ 142 περιοχή του θραύσματος Η με διαγραφή των δυνητικών TCF4 μοτίβο 2, ή μοτίβα 2 και 3 δεσμευτική, παρήχθησαν. Αμφότερα τα κατασκευάσματα έδειξε μια δραστικότητα προαγωγού (Σχήμα 8C). Ωστόσο, η διαγραφή του μοτίβου 2 μείωσε την δραστηριότητα προαγωγέα με το μισό του θραύσματος H, και ταυτόχρονη διαγραφή των μοτίβων 2 και 3 μείωσε περαιτέρω τη δραστηριότητα υποκινητή, γεγονός που υποδηλώνει μια συνεισφορά αυτών των μοτίβων για τη λειτουργικότητα του

RHBG

υποκινητή .

Πραγματοποιήσαμε τελικά ανοσοκαθίζηση χρωματίνης (chip) θα δοκιμασίες για να καθοριστεί αν TCF4 και β-κατενίνης είναι ικανά να δεσμεύουν το -60 /+ 142 του τμήματος

RHBG

υποκινητή

in vivo

. Πυρηνικά εκχυλίσματα που λαμβάνονται από τα κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε πρωτεΐνη /DNA συγκρότημα εγκάρσιας σύνδεσης και ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα που στοχεύουν είτε β-κατενίνης, TCF4 ή IgG, ως μάρτυρας. qPCR χρησιμοποιώντας εκκινητές εντός της περιοχής H αποκαλύπτουν ότι TCF4 και β-κατενίνης συνδέονται με αυτό το θραύσμα του

RHBG

προαγωγό (Σχήμα 9). Σταθερά, TCF4 και β-κατενίνης είχε επίσης συνδέονται προς το

Axin2

προαγωγού, που λαμβάνεται ως έλεγχος, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [37,53].

κύτταρα HepG2 ήταν διασυνδεδεμένη με φορμαλδεΰδη ακολουθούμενη από χρωματίνη πέψη. ανοσοκαταβυθίσεις χρωματίνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντισώματα που στοχεύουν είτε β-κατενίνης, TCF4 ή IgG, ως μάρτυρας. Το καθαρισμένο DNA αναλύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας τις υποδεικνυόμενες εκκινητές. Η ποσότητα του άνοσο DNA με κάθε αντίσωμα αναπαρίσταται ως σήματος σε σχέση με IgG (ισοδύναμο προς 1) (n = 2).

Η

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι TCF4 /β-κατενίνης συνδέεται ειδικά με το -60 /+ 142 περιοχή του

RHBG

υποστηρικτής, και πιθανόν ενισχύει

RHBG

έκφραση στα κύτταρα HepG2.

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη προσδιορίζει τα κύτταρα ηπατώματος HepG2 ως εκφράζουσα τη

RHBG

γονίδιο που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μεταφοράς του αμμωνίου. Δείχνουμε ότι σε αυτά τα κύτταρα

RHBG

έκφρασης εξαρτάται από την λειτουργία των β-κατενίνης σε μεγάλο βαθμό. Έχουμε εκτελέσει μια λειτουργική ανάλυση του

RHBG

ανάντη ρυθμιστικής αλληλουχίας, αποκαλύπτοντας μια ελάχιστη περιοχή που φέρει μια δραστηριότητα υποκινητή. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η

RHBG

ρυθμιστική αλληλουχία είναι ένα ΤΑΤΑ GC-πλούσιο υποκινητή. Δείχνουμε ότι β-κατενίνης και TCF4 είναι αμφότερα σε θέση να δεσμεύσει την ελάχιστη περιοχή

in vivo

και χαρακτηρίζουν δυναμικό μοτίβα πρόσδεσης TCF4 σημαντικό για την δραστηριότητα προαγωγέα. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν άμεσο ρόλο της β-κατενίνης /TCF4 στη ρύθμιση του

RHBG

έκφραση σε αυτή την κυτταρική γραμμή, και επιπλέον δείχνουν ότι

RHBG

θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως άμεση ρεπόρτερ της Wnt /β-κατενίνης οδού σε συγκεκριμένα πλαίσια των καρκινικών κυττάρων.

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι η πιο κοινή ενήλικου ήπατος κακοήθεια και πολλές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων συνεργάτης υπερδραστηριότητας του /της β-κατενίνης μονοπατιού Wnt την έναρξη και την ανάπτυξη [56] της. Ανώμαλη ενεργοποίηση σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, λόγω μεταλλάξεων απώλειας λειτουργίας σε APC ή ενεργοποίηση μεταλλάξεις σε β-κατενίνη έχει συνδεθεί με διάφορες ανθρώπινες κακοήθειες συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, του μαστού, του παχέος εντέρου και των καρκινωμάτων [22]. Για παράδειγμα, περισσότερο από το 80% των καρκίνων του παχέος εντέρου φέρουν κολοβώσεις σε APC, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση δραστικής β-κατενίνης στον πυρήνα, το αρχικό στάδιο του μετασχηματισμού [56-58].