Αφηρημένο

Οι περισσότερες κλινικές περιπτώσεις καρκίνου του ήπατος δεν μπορεί να διαγνωσθεί έως ότου έχουν εξελιχθεί σε ένα προχωρημένο στάδιο, με αποτέλεσμα υψηλό θνησιμότητα. Είναι καλά αναγνωρισμένο ότι η εφαρμογή των μεθόδων έγκαιρης ανίχνευσης και η ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών για τον καρκίνο του ήπατος είναι απαραίτητες για τη μείωση των υψηλών ποσοστών θνησιμότητας που σχετίζεται με την ασθένεια αυτή. Για την επίτευξη αυτών των στόχων, οι μοριακοί ανιχνευτές ικανά να αναγνωρίζουν καρκίνο του ήπατος κύτταρο-ειδικούς στόχους που απαιτούνται. Εδώ περιγράφουμε μια ομάδα απταμερών σε θέση να διακρίνει ηπατοκαρκινώματος από τα φυσιολογικά ηπατικά κύτταρα. Τα απταμερή, τα οποία επελέγησαν από κύτταρο-βασισμένη SELEX (Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού), έχουν Kd τιμές στο εύρος των 64-349 ηΜ προς το στόχο κύτταρο ανθρώπινου ηπατώματος HepG2, και επίσης να αναγνωρίσουν τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και αδενοκαρκινώματος πνεύμονα. Το πείραμα θεραπεία πρωτεϊνάση έδειξε ότι όλα τα απταμερή μπορούσε να αναγνωρίσει τα κύτταρα HepG2 στόχο μέσω πρωτεϊνών επιφανείας. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι αυτές οι απταμερή μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί ανιχνευτές για περαιτέρω έρευνα σε μελέτες του καρκίνου, όπως η ανάπτυξη προσδιορισμών έγκαιρη ανίχνευση, στοχευμένες θεραπείες, και μέσα απεικόνισης, καθώς και για τη διερεύνηση κοινών πρωτεϊνών μεμβράνης σε αυτές τις διακριτές καρκίνους.

Παράθεση: Xu J, Teng IT, Zhang L, Delgado S, Champanhac C, Cansiz S, et al. (2015) Μοριακή αναγνώριση των ανθρωπίνων καρκίνο του ήπατος κύτταρα Χρησιμοποιώντας απταμερή DNA που παράγεται μέσω κυττάρων-SELEX. PLoS ONE 10 (5): e0125863. doi: 10.1371 /journal.pone.0125863

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: 26 Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 25 Μαρτίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 4 Μάη του 2015

Copyright: © 2015 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και υποστήριξη αρχείων πληροφοριών του

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας GM079359 και Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας CA133086? Κρατικό Ταμείο Υποτροφιών, PI = Jiehua Xu? Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας 81101866, PI = Jiehua Xu? Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας 81430041, PI = Jiehua Xu? και των θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για την Κεντρική Πανεπιστήμια 11ykpy41, PI = Jiehua Xu. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στην degign μελέτη, συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του ήπατος είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο και η τρίτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1], με αποτέλεσμα σε 0.7 εκατομμύρια θανάτους ετησίως. Καθώς το μεγαλύτερο εσωτερικό όργανο και το μεγαλύτερο αδένας στο ανθρώπινο σώμα, το ήπαρ εξυπηρετεί πολλές ζωτικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης χωρίς να χαλάσει και να αποθηκεύει θρεπτικά συστατικά που απαιτούνται για την παραγωγή ενέργειας ή την επισκευή των ιστών, διήθηση και αποικοδόμησης τοξικών αποβλήτων στο αίμα, συνθέτοντας περισσότεροι από τους παράγοντες πήξης που κρατούν το σώμα από μαζική αιμορραγία, και παράγουν χημικές ουσίες και ορμόνες απαραίτητες για τη ρύθμιση πολλές σωματικές λειτουργίες. Παρά αυτή κρίσιμο ρόλο, η ανάπτυξη του καρκίνου του ήπατος είναι σπάνια διαγιγνώσκεται σε πρώιμο στάδιο επειδή, στις περισσότερες περιπτώσεις, τα σημάδια και τα συμπτώματα δεν εμφανίζονται μέχρι τα μεταγενέστερα στάδια, καθιστώντας το ένα εξαιρετικά θανατηφόρα κακοήθεια με ένα μικρό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών. Έτσι, ανάπτυξη μεθόδων έγκαιρης ανίχνευσης και προηγμένες στοχευμένες θεραπείες είναι απαραίτητη για την καταπολέμηση του καρκίνου του ήπατος.

Τα απταμερή είναι σύντομες, μονόκλωνο DNA ή RNA ολιγονουκλεοτίδια ικανά σύνδεσης προς μία περιοχή αντίστοιχου μορίων στόχων με υψηλή συγγένεια συγκεκριμένο. Η μέθοδος παραγωγής απταμερών που ονομάζεται SELEX (Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού) [2, 3], ακολουθεί μια σειρά βημάτων: 1) χημική σύνθεση μιας βιβλιοθήκης ολιγονουκλεοτιδίων που έχουν 10

13-10

16 μονόκλωνο μόρια νουκλεϊκών οξέων, 2) την άμεση έκθεση της βιβλιοθήκης με τους στόχους για τη διαφοροποίηση δεσμευτικών κλώνων από θεατές, 3) η εκχύλιση και την ενίσχυση των επιζώντων, 4) ο εμπλουτισμός των επιζώντων απταμερούς από επαναληπτική γύρους, και, τέλος, 5) αλληλουχίας για τον εντοπισμό μεμονωμένων υποψηφίους.

Η τεχνολογία SELEX αναπτύχθηκε περαιτέρω στο εργαστήριο μας να χρησιμοποιήσουν ολόκληρα κύτταρα ως στόχους στη διαδικασία επιλογής απταμερούς. Η διαδικασία κύτταρο-SELEX εξασφαλίζει ότι υποψήφιος ολιγονουκλεοτίδια δεσμεύονται με την φυσική κατάσταση των στόχων πρωτεΐνη στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων [4]. Χρησιμοποιώντας κύτταρο-SELEX, απταμερή μπορούν να δημιουργηθούν για άρρωστα κύτταρα, χωρίς προηγούμενη γνώση των μοριακών υπογραφή ενός δεδομένου στόχου, καθιστώντας έτσι δυνατή την εξεύρεση μοριακών ανιχνευτών για ασθένειες με άγνωστα μέχρι τώρα βιοδείκτες, η οποία μπορεί στη συνέχεια να ταυτοποιηθούν με χρήση χημικών και μοριακών βιολογικών μεθόδων [5 , 6]. Ένας αριθμός απταμερών ικανών να αναγνωρίζουν διαφορετικούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBCs) [7], και τα κύτταρα για λεμφοκυτταρική λευχαιμία [4], μυελοειδή λευχαιμία [8], ορθοκολικό καρκίνο [9], του καρκίνου του μαστού [10], των ωοθηκών καρκίνος [11], μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [12], μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [13, 14], και τον καρκίνο του παγκρέατος [15], έχουν όλα παράγονται χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο. Επιπλέον, αρκετές κυτταρικής επιφάνειας ζεύγη βιοδεικτών-απταμερές έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων αλκαλική φωσφατάση πλακούντα-σαν 2 (ALPPL-2) [15], προμινίνη-1 (CD133) [16], του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) [17] , παράγοντας υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού 2 (HER2) [18, 19], ανοσοσφαιρίνη βαρειάς αλυσίδας μ (IGHM) [20], της πρωτεϊνικής κινάσης της τυροσίνης 7 (PTK7) [4, 5], και τα αντίστοιχα απταμερή τους. Η ανακάλυψη του καρκίνου συγκεκριμένες απταμερών παρέχει μεγάλες δυνατότητες στη βιοϊατρική έρευνα και στην ανάπτυξη της διάγνωσης κυττάρου-ειδική και θεραπευτικών [21], ειδικά όταν στην κυτταρική επιφάνεια βιοδείκτες συχνά σχετίζονται με τους κανονισμούς κυττάρων ή μονοπατιών σηματοδότησης.

Όπως ολιγονουκλεοτίδια , απταμερή εύκολη αναπαραγωγή με χημική σύνθεση με ελάχιστο παρτίδα σε παρτίδα παραλλαγές. Επιπλέον, με χημική τροποποίηση, είναι εύκολο να εισαχθεί λειτουργικές ενότητες πάνω απταμερή για την εκπλήρωση ειδικών αναγκών, όπως φθοροφόρα [22-25], χημική συνδέτες [26, 27], θεραπευτικά [28-30], ή ακόμη και νανοσωματίδια [31- 33]. Με τις ανωτέρω αναφερθείσες αξιοσημείωτες ιδιότητες, η ανάπτυξη των απταμερών έχει αξιοποιηθεί σε διάφορους τομείς, ιδιαίτερα εκείνες που αφορούν βιοϊατρικές εφαρμογές [34-41]. Περαιτέρω έρευνα έχει οδηγήσει στην ανάδειξη της ιδιαιτερότητας και της αποτελεσματικότητας της παροχής απεικόνισης, διαγνωστικές ή θεραπευτικές ουσίες με απταμερών συνοδεία [24, 33, 42].

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να ανακαλύψει απταμερών που αναγνωρίζουν ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), το οποίο είναι η κύρια μορφή του καρκίνου του ήπατος, που αντιπροσωπεύουν το 90% όλων των καρκίνων του ήπατος [43]. Εδώ, η μέθοδος κύτταρο-SELEX χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία απταμερών ικανά διαφοροποίησης ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ήπατος κυτταρική γραμμή HepG2 από φυσιολογικό ήπαρ επιθηλιακή κυτταρική σειρά THLE-2. Αυτά τα απταμερή μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργαλεία για την περαιτέρω βιοϊατρικές μελέτες και κλινικές εφαρμογές.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και Ρυθμιστικά

HepG2 (ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα) και THLE-2 ( φυσιολογικά κύτταρα ήπατος) επελέγησαν ως θετικά και αρνητικά κύτταρα επιλογής, αντίστοιχα. Άλλες κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων HeLa (καρκίνος του τραχήλου της μήτρας), MCF-7 και MDA-MB-231 (αδενοκαρκίνωμα μαστού), PL45 (καρκίνος του παγκρέατος), H226 (πνεύμονας καρκίνωμα πλακωδών), Α549 (αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα), Ramos (λέμφωμα Burkitt), CCRF-CEM (λευχαιμία Τ κυττάρων), και TOV-21G (καρκίνος των ωοθηκών), χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση της επιλεκτικότητας των υποψηφίων απταμερούς. Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την American Tissue Culture Collection (ATCC). HepG2, Α549, MCF-7, και PL45 διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM)? Ramos, CCRF-CEM, H226 και HeLa κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640. Η κυτταρική γραμμή TOV-21G διατηρήθηκε σε καλλιέργεια με MCBD 105: Μέσο 199 (1: 1). Όλα τα παραπάνω μέσα αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich. Η κυτταρική σειρά MDA-MB-231 καλλιεργήθηκε σε Leibovitz του L-15 Medium (ATCC) στους 37 ° C και εμποδίζεται από την επαφή CO

2. BEGM Kit Bullet (Lonza /Clonetics Corporation) χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή μέσο ανάπτυξης για τα κύτταρα THLE-2. Γενταμυκίνη /Αμφοτερικίνη (GA) και επινεφρίνη απορρίφθηκαν από το κιτ, αλλά ένα επιπλέον 5 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), 70 ng /mL του φωσφοαιθανολαμίνης, και όλα τα άλλα πρόσθετα στο κιτ περιλήφθηκαν στο βασικό μέσο. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (100 μονάδες /κ.εκ πενικιλλίνη και 100 mg /mL στρεπτομυκίνης) (Gibco). Όλα τα κύτταρα, εκτός από την MDA-MB-231, επωάστηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

ρυθμιστικό πλύσης παρασκευάσθηκε από ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο Dulbecco (PBS) με χλωριούχο ασβέστιο και χλωριούχο μαγνήσιο (Sigma-Aldrich) με επιπλέον γλυκόζη (4.5 g /L) και MgCl

2 (5 mM). ρυθμιστικό Δέσμευσης παρασκευάστηκε με προσθήκη tRNA ζυμομυκήτων (0,1 mg /mL) (Sigma-Aldrich) και BSA (1 mg /mL) (Fisher) στο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης.

Σύνθεση και καθαρισμός του DNA βιβλιοθήκης και εκκινητές

Η προς τα εμπρός και οι αντίστροφοι εκκινητές σημάνθηκαν με FAM και βιοτίνη, αντίστοιχα, στο 5 ‘άκρα τους. Η αλληλουχία του εκκινητή ήταν 5’-FAM-AGA GAC ΚΔ GAC TGC GAA-3 ‘? η αλληλουχία του εκκινητή ήταν 5’-Βιοτίνη-AAG AAG CCA CCG TGT CCA-3 ‘. Η βιβλιοθήκη DNA αποτελείτο από μια τυχαιοποιημένη περιοχή 25-nt περιστοιχίζεται από θέσεις πρόσδεσης εκκινητή: 5’-AGA GAC CCT GAC TGC GAA- (N

25) -TGG ACA CGG TGG CTT CTT-3 ‘. Όλα βιβλιοθήκη και αλληλουχίες εναρκτήρα αγοράστηκαν από Integrated DNA Technologies (IDT) και καθαρίστηκε με HPLC ανάστροφης φάσης.

Polymerase Chain Reaction

παράμετροι ενίσχυσης PCR βελτιστοποιήθηκαν πριν από τη διαδικασία επιλογής. Όλα τα μείγματα PCR περιείχε 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl (ρΗ 8.3), 1.5 mM MgCl

2, dNTPs (0,2 mM το καθένα), 0.5 μΜ από κάθε εκκινητή, και hot start Taq DNA πολυμεράση (0,015 μονάδες /μL) . PCR πραγματοποιήθηκε σε είτε ένα T100 BioRad ή C1000 Θέρμο Cycler, και όλα τα αντιδραστήρια PCR αγοράστηκαν από την Takara. Κάθε κύκλος ενίσχυσης διεξήχθη στους 90 ° C για 30 sec, 57 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από μία τελική επέκταση για 3 λεπτά στους 72 ° C.

στην επιλογή Vitro

Η

Η διαδικασία των κυττάρων-SELEX εκτελέστηκε με βάση το πρωτόκολλο [44] που αναπτύχθηκε από την ομάδα μας με μερικές τροποποιήσεις. Η επιλογή πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικές μονοστοιβάδες, τόσο ως θετικός HepG2 και αρνητικών THLE-2 που χρησιμοποιούνται εδώ είναι προσκολλημένα κυτταρικές γραμμές. Για τον πρώτο γύρο της επιλογής, η πισίνα DNA αποτελείτο από 20 nmol της βιβλιοθήκης ολιγονουκλεοτιδίου σε 700 mL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Για τους γύρους αργότερα, χρησιμοποιήθηκαν 250 nM των ολιγονουκλεοτιδίων ενισχύονται από το προηγούμενο υπόλοιπο πισίνα. Η βιβλιοθήκη DNA θερμάνθηκε στους 95 ° C για πέντε λεπτά, ακολουθούμενο από ταχεία ψύξη σε πάγο για 5 λεπτά πριν από την επώαση, επιτρέποντας στις αλληλουχίες DNA για να σχηματιστούν τα πιο ευνοϊκές δευτερογενείς δομές. Η βιβλιοθήκη DNA επωάστηκε στη συνέχεια με μονοστιβάδα κυττάρων HepG2 για 1 ώρα στους 4 ° C μετά την απομάκρυνση του μέσου και έκπλυση δύο φορές με ρυθμιστικό πλύσης. Ο χρόνος επώασης μειώνεται καθώς προχωρούσε η επιλογή: 60 min για τους γύρους 1 και 2, 45 λεπτά για στρογγυλά 3, και 30 λεπτά για όλες τις επόμενες γύρους. Ανάμεσα σε κάθε κύκλο, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσεως προς απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου αλληλουχίες. Ο χρόνος πλύσης και ο όγκος του ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης αυξήθηκαν καθώς η επιλογή προχωρούσε προς απομάκρυνση αδύναμη υποψηφίων και να αποκτήσουν απταμερή με υψηλή εξειδίκευση και επιλεκτικότητα. Τα κύτταρα στη συνέχεια αποσπάται από το πιάτο με ένα ξέστρο κυττάρων, και τα συντρίμμια συλλέχθηκε σε 500 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Το συγκρότημα θερμάνθηκε στους 95 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και ήταν έτοιμη για ενίσχυση PCR κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων γύρων όταν συμπεριλήφθηκε καμία αρνητική επιλογή. Για γύρους αργότερα με αρνητική επιλογή, το υπερκείμενο επωάστηκε με το μονοστιβάδα αρνητικά κύτταρα THLE-2 για 1 ώρα στους 4 ° C και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν.

Το υπερκείμενο που περιέχει δεσμευμένο DNA αλληλουχίες ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας φώνων και επισημασμένο με βιοτίνη εκκινητές. Ο αριθμός των κύκλων PCR ενίσχυσης βελτιστοποιηθεί επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια sepharose (GE Healthcare Life Sciences) χρησιμοποιήθηκαν για να απομονωθούν τα προϊόντα PCR από το μείγμα αντίδρασης. Το επισημασμένο με φθοροφόρο μονόκλωνο DNA (ssDNA) στη συνέχεια διαχωρίζεται από το βιοτινυλιωμένο αντινόημα ssDNA με έκλουση με 200 mM ΝαΟΗ. Τέλος, το ssDNA αφαλατώθηκε με μία στήλη ΝΑΡ-5 (GE) και επαναδιαλύεται σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης.

Η όλη διαδικασία επιλογής επαναλαμβάνεται μέχρι ένα παρατεταμένης σημαντικό εμπλουτισμό λήφθηκε στο 19ο γύρο. Ο εμπλουτισμός των ομάδων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (Accuri C6, BD).

αλληλουχίας επόμενης γενιάς και Ανάλυση

Εμπλουτισμένο πισίνα 19 επιλέχθηκε για ανάλυση αλληλουχίας. Το ssDNA διαχωρίζεται από την πισίνα 19 ενισχύθηκε με PCR και πάλι για να προσθέσετε τις αλληλουχίες προσαρμογέα (CCA TCT CAT CCC TGC ΟΤΟ TCT CCG TCT CCG ACT CAG AGA GAC ΚΔ GAC TGC GAA και ΚΔ CTC ΤΑΤ GGG CAG TCG ΟΤΟ ΑΤΑ AGA AGC CAC CGT GTC CA ) και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού PCR (Qiagen). Τα καθαρισμένα δείγματα υποβλήθηκαν σε Ion Torrent αλληλουχίας επόμενης γενιάς στο Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, ICBR αλληλουχίας πυρήνα Διευκόλυνσης. Τα προϊόντα που ευθυγραμμίστηκαν για τον εντοπισμό των πιο άφθονα ακολουθίες χρησιμοποιώντας το λογισμικό Galaxy. Οποιαδήποτε με λιγότερα από 10 αντίγραφα απομακρύνθηκαν από την ανάλυση. Το υπόλοιπο διαβάζει (501,084) στη συνέχεια συγκεντρωμένα, και τα 20 πιο άφθονες αλληλουχίες (Πίνακας S1 σε S1 File) συντέθηκαν χημικά για περαιτέρω χαρακτηρισμό.

ανάλυση δέσμευσης

Τα ανακτημένα υποψήφιοι απταμερούς συντέθηκαν με η τυπική μέθοδος φωσφοραμιδίτη χρησιμοποιώντας συσκευή σύνθεσης DNA 3400 (Applied Biosystems) και καθαρίστηκε με ανάστροφης φάσης HPLC (Varian Prostar χρησιμοποιώντας μία στήλη C18 και ακετονιτρίλιο /τριαιθυλαμμωνίου ως κινητή φάση). Αντιδραστήρια για σύνθεση αγοράστηκαν από Glen Research. κυτταρομετρία ροής BD Accuri C6 (BD Immunocytometry Systems) εφαρμόστηκε για την παρακολούθηση του εμπλουτισμού των αλληλουχιών ssDNA στις πισίνες κατά τη διάρκεια της διαδικασίας επιλογής και για την αξιολόγηση της συνάφειας πρόσδεσης και η εξειδίκευση των επιλεγέντων υποψηφίων απταμερές. Μη ενζυμικό διάλυμα διαστάσεως κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για να αποκολληθούν τα κύτταρα και τα διεσπαρμένα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Όταν χρειάστηκαν κύτταρα πρωτεάση αγωγή, τρυψίνη χρησιμοποιήθηκε αντί του διαλύματος μη-ενζυματική διαστάσεως κυττάρων. Η θρυψίνη και διάλυμα μη-ενζυματική διαχωρισμού κυττάρων και οι δύο αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Διεξήχθησαν δοκιμασίες σύνδεσης με κυτταρομετρία ροής μετά από επώαση 4 x10

5 διεσπαρμένα κύτταρα σε 200 μL ρυθμιστικού διαλύματος με πισίνες ή απταμερών συνδέσεως εις 250 ηΜ για 30 λεπτά στους 4 ° C (ή 37 ° C όπως υποδεικνύεται). Για κάθε υποψήφιο απταμερούς, η συγγένεια δέσμευσης (ως Κ

δ) προς κύτταρο στόχο γραμμή HepG2 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Sigma Plot προσαρμόζοντας τη σχετική μέση ένταση φθορισμού της πρόσδεσης έναντι της συγκέντρωσης των απταμερών χρησιμοποιώντας την εξίσωση κορεσμού Υ = Β

MAXX /(Κ

d + Χ) (Υ είναι ειδική σύνδεση, σε συγκέντρωση απταμερούς = X στην nanomolar, και Bmax είναι η μέγιστη δεσμευτική.) τα κύτταρα επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά με μια σειρά συγκεντρώσεων (0.1, 0.5, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 ηΜ) εκάστης ανακτηθεί απταμερούς με βιοτίνη σημασμένο στο 5′-άκρο. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος έκπλυσης, αιωρήθηκε σε 200 μι ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει στρεπταβιδίνη-ΡΕ δέσμευσης, και χρωματίστηκαν για 20 λεπτά. Τα κύτταρα και πάλι πλύθηκαν δύο φορές με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος πλύσεως και στη συνέχεια εναιωρήθηκαν σε 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Η βιοτίνη σημασμένο μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος για τον προσδιορισμό της πρόσδεσης υποβάθρου. Η μέση ένταση φθορισμού της μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη αφαιρέθηκε από εκείνο της αντίστοιχης απταμερούς με τα κύτταρα-στόχους για να προσδιοριστεί η ειδική σύνδεση του επισημασμένου απταμερούς. Όλες οι δοκιμασίες πρόσδεσης επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Η διαδικασία επιλογής άρχισε με μια τυχαία βιβλιοθήκη περιέχει περίπου 1.2 × ακολουθίες 10

16 (20 nmol) ssDNA 61 νουκλεοτιδίων ( nt), ακολουθούμενη από διαδοχική πρόσδεσης με τον στόχο HepG2 κύτταρα, έκλουση και την επακόλουθη ενίσχυση PCR για συνολικά 19 κύκλους. Counter-επιλογή με κύτταρα THLE-2 εισήχθη στον τρίτο γύρο και πραγματοποιούνται σε όλα τα παρακάτω γύρους για να εξαλειφθεί η πιθανότητα τυχόν ολιγονουκλεοτιδίων αναγνώριση κοινών δεικτών επιφανείας τόσο στόχου και αρνητικές κυτταρικές σειρές. Εμπλουτισμός πρόοδος παρακολουθήθηκε με τη δοκιμή της δέσμευσης των ανακτηθέντων ssDNA από κάθε γύρο σε κύτταρα στόχο χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Σταδιακή μετατοπίσεις στην ένταση φθορισμού παρατηρήθηκαν σε επόμενους γύρους. Το φθορίζον σήμα σταματήσει να αυξάνεται μεταξύ των γύρων 17 και 19, πράγμα που σημαίνει ότι τα κορεσμένα πρόσδεση των εμπλουτισμένων δεξαμενών είχε επιτευχθεί (σχήμα 1Α). Αριθ εμφανής αύξηση έντασης φθορισμού βρέθηκε με φυσιολογικό THLE-2 κύτταρα ήπατος σε πισίνα 19 (Σχήμα 1 Β), που δείχνει ότι, σε σύγκριση με την αρχική βιβλιοθήκη, εμπλουτισμένη ssDNA πισίνα 19 έδειξε επιλεκτική σύνδεση με κύτταρα HepG2, δεν THLE-2 κύτταρα.

δοκιμασίες δέσμευσης (Α) έδειξε μια αξιοσημείωτη μετατόπιση χύμα πρόσδεση της πισίνας σε καρκίνο του ήπατος κύτταρα (HepG2) και σταμάτησε την αύξηση μετά το 17

ου γύρο επιλογής. (Β) Ένα λεπτό μείωση στην ένταση φθορισμού παρατηρήθηκε για τα φυσιολογικά κύτταρα ήπατος (THLE-2), φθάνοντας σε ένα ελάχιστο μετατόπιση στην 19

ου γύρου. Η κόκκινη καμπύλη αντιπροσωπεύει κύτταρα που επωάστηκαν με μη επιλεγμένων αρχική βιβλιοθήκη.

Η

Το ssDNA ανακτηθεί από γύρο 19 υποβλήθηκε για βαθιά αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Οι πιο άφθονη 20 αλληλουχίες (Πίνακας S1 σε S1 File) συντέθηκαν χημικά, σημασμένο με βιοτίνη στο 5 ‘άκρο, και στη συνέχεια καθαρίζεται με HPLC. Οι αλληλουχίες ποσοτικοποιήθηκαν (UV 260/280) και αραιώνεται σε τυποποιημένες συγκεντρώσεις.

ανάλυση σύνδεσης διεξήχθη με επώαση θετική ή αρνητική κυττάρων με 250 ηΜ του κάθε υποψηφίου απταμερούς. Σύμφωνα με την ροή αποτελέσματα ανάλυσης κυτταρομετρικής, κανένα από τα ολιγονουκλεοτίδια εμφανίζονται δέσμευση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του ήπατος THLE-2, ενώ οι επτά υποψηφίους απταμερές έδειξε εμφανή μετατοπίσεις στην ένταση φθορισμού σε κύτταρα HepG2 σε σχέση με τυχαία σειρά (Σχήμα 2, Πίνακας S2 σε S1 File), υποδηλώνοντας ότι όλες οι επιλεγμένες απταμερή θα μπορούσαν να διαφοροποιήσουν τον καρκίνο του ήπατος κύτταρα από τα φυσιολογικά κύτταρα του ήπατος.

τα επιλεγμένα απταμερή έδειξαν προφανή πρόσδεση σε κύτταρα ηπατώματος HepG2 (Α), ενώ δεν ενίσχυση φθορισμός βρέθηκε με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του ήπατος (Β), χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα πειράματα διεξήχθησαν στους 4 ° C.

Η

Οι συγγένειες πρόσδεσης των επιλεγμένων απταμερών στην συνέχεια προσδιορίζεται με την αξιολόγηση των σταθερών διαστάσεως (Κ

δ). Ένα μικρότερο K

δ τιμή υποδεικνύει ισχυρότερη σύνδεση του επιλεγμένου απταμερούς στα κύτταρα-στόχους. Όπως παρατίθεται στον Πίνακα 1, τα απταμερή που αναφέρθηκαν σε αυτή τη μελέτη έδειξε συγγένειες δέσμευσης έναντι κυττάρων HepG2 σε νανομοριακή περιοχή (64-349 ηΜ), υποδηλώνοντας ότι αυτά τα απταμερή δεσμεύεται σφικτά με κύτταρα HepG2-στόχο τους.

Η

Για την πρόληψη των δεσμευτικών αλληλουχίες από το να εσωτερικεύεται, εκτελέσαμε το

in vitro

επιλογή στους 4 ° C, καθώς και τις δοκιμασίες σύνδεσης που αναφέρονται παραπάνω. Τα επιλεγμένα απταμερή δεν έχασαν την αναγνώρισή τους να στοχεύουν κύτταρα HepG2 σε φυσιολογική θερμοκρασία (Σχήμα 3Α). Η μετατόπιση φθορισμός από τα κύτταρα επωάζονται με απταμερή σε σύγκριση με κύτταρα που επωάστηκαν με την βιβλιοθήκη διατηρήθηκε όταν διεξήχθησαν οι δοκιμές δέσμευσης στους 37 ° C.

(Α) Η μετατόπιση της έντασης φθορισμού σε HepG2 επωάστηκαν με καθένα από τα επιλέγεται απταμερή διατηρήθηκαν στους 37 ° C. (Β) Οι εντάσεις φθορισμού δεν μετατοπίσει όταν τα κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με θρυψίνη για 30 λεπτά πριν από την επώαση, υποδηλώνοντας ότι οι πρωτεΐνες της μεμβράνης είναι οι πιθανοί στόχοι.

Η

Έχει αναφερθεί ότι τα απταμερή αλληλεπιδρούν ειδικά με τις επιφάνειες των κυττάρων στόχων κατά τη διάρκεια της επιλογής [5, 20]? Ως εκ τούτου, μια άλλη σειρά δεσμευτικών δοκιμών (37 ° C) χρησιμοποιώντας κύτταρα HepG2 σε επεξεργασία με θρυψίνη για 30 λεπτά πριν από την επώαση με ανιχνευτές εκτελέστηκε για να εξετάσει εάν τα επιλεγμένα απταμερή στόχευαν πρωτεΐνες μεμβράνης επί HepG2. Όπως φαίνεται στο Σχ 3Β, όλα τα επιλεγμένα απταμερή έχασαν κατά προτίμηση σύνδεση τους στη βιβλιοθήκη με τα κύτταρα HepG2 πρωτεάση αγωγή, αναφέροντας τους στόχους αυτών των απταμερών είναι πιθανό να είναι μεμβράνη πρωτεΐνες.

Έχει αναφερθεί ότι ορισμένες πρωτεΐνες είναι σχετίζονται με τον καρκίνο [45, 46]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των κοινών πρωτεΐνες που παρουσιάζονται από καρκινικά κύτταρα και διερεύνηση της σημασίας τους για καρκίνους μπορεί να παρέχει ενδείξεις για την ανάπτυξη του καρκίνου. Μετά αποδεικνύοντας τα επιλεγμένα απταμερή ήσαν ικανά να διαφοροποιούνται ηπατοκυτταρικού καρκινώματος από τα φυσιολογικά κύτταρα του ήπατος επιθηλιακά, εξετάσαμε περαιτέρω την δέσμευση εκλεκτικότητα των απταμερών κατά κυτταρικών σειρών για άλλους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα πλακώδους καρκινώματος (Η226), αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (Α549), του τραχήλου της μήτρας αδενοκαρκίνωμα (HeLa), αδενοκαρκίνωμα του μαστού (MCF-7, MDA-MB-231), αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών (TOV-21G), παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα (PL45), και λευχαιμία (Ramos, CCRF-CEM) (Πίνακας 2). Διαπιστώθηκε ότι οι επτά απταμερών εμφανίζονται επίσης σημαντική δεσμευτική προς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, καρκίνο των ωοθηκών και τα εμβρυϊκά κύτταρα νεφρού, υποδεικνύοντας την ισχυρή δυνατότητα μερικών κοινών πρωτεϊνών που εκφράζονται από αυτά τα κύτταρα, ενώ, την ίδια στιγμή, έδειξαν καμία συγγένεια για λευχαιμία ή του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Δεδομένου ότι ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ένα κοινό προορισμό της μετάστασης του καρκίνου του ήπατος [47], το αποτέλεσμα αυτό θα μπορούσε να υποστηρίξει τη χρήση αυτών των απταμερών ως μοριακοί ανιχνευτές για τη μελέτη της μετάστασης του καρκίνου. Επιπλέον, όλα τα απταμερή παρουσίασαν αναγνώριση προς κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού μία, MCF-7, αλλά όχι την άλλη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού, MDA-MB-231. Η διαφορά αυτή μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι πρόκειται για δύο διακριτούς υποτύπους στον καρκίνο του μαστού. Για παράδειγμα, MCF-7 πέφτει στον υπότυπο αυλού Α με υψηλή έκφραση υποδοχέα οιστρογόνου (ER) και υποδοχέα προγεστερόνης (PR), και MDA-MB-231 ανήκει στην Basal-όπως υποτύπου που είναι αρνητική για ER και PR [48] . Συνεπώς, αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι αυτά τα απταμερή μπορούν να εφαρμοστούν σε μελέτες ορμονοεξαρτώμενου καρκίνου του

Η

Συμπέρασμα

Όλα επτά απταμερή που αναφέρονται εδώ είναι ικανά να διακρίνουν ηπατώματος από φυσιολογικά ηπατικά κύτταρα.? απέδειξαν υψηλές συγγένειες προς την κυτταρική σειρά HepG2 στους 4 ° C (K

d’s του 64 έως 349 ηΜ), καθώς και στους 37 ° C, ενώ καμία ανιχνεύσιμη δεσμευτική για φυσιολογικά ηπατικά κύτταρα παρατηρήθηκε. Τα πειράματα της θεραπείας πρωτεϊνάση έδειξαν ότι και οι επτά απταμερών αναγνωρίζουν κυττάρου στόχου HepG2 μέσω επιφανειακές πρωτεΐνες. Επιπλέον, αυτά τα απταμερή έδειξε αναγνώριση προς τον καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο των ωοθηκών, και του αυλού Ένας καρκίνος υπότυπο του μαστού. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτά τα απταμερή μπορεί να αποτελούν πιθανές ανιχνευτές για περαιτέρω έρευνα σε μελέτες του καρκίνου, όπως η ανάπτυξη προσδιορισμών έγκαιρη ανίχνευση, στοχευμένες θεραπείες, και μέσα απεικόνισης, καθώς και για τη διερεύνηση κοινών πρωτεϊνών μεμβράνης σε αυτές τις διακριτές καρκίνους.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 αρχείου. . Σε συνδυασμό αρχείων υποστήριξης πίνακες

Πίνακας S1: Αριθμός διαβάζει και το ποσοστό για τις 20 πιο άφθονα ακολουθίες. Ακολουθία # ορίζεται με τη σειρά της αφθονίας. Το σύνολο # των διαβάζει στο σύνολο της ομάδας DNA είναι 501.084. Μεταξύ των πιο άφθονο είκοσι ακολουθίες, επτά από αυτά αναφέρονται ως απταμερή στόχευση κυττάρων HepG2. Πίνακας S2: ένταση φθορισμού ανιχνεύονται από κύτταρα επωάστηκαν με 250 ηΜ του καθενός από τα απταμερή ή μία τυχαία βιβλιοθήκη DNA 61-μερές. (G-μέση: γεωμετρικός μέσος)

doi: 10.1371 /journal.pone.0125863.s001

(DOCX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω τον Δρ Kwame Sefah για το σχεδιασμό εναύσματα και παρέχοντας χρήσιμες συμβουλές που συνέβαλαν σε αυτή την εργασία, ο Δρ Κάθριν R. Williams για την κριτική εξέταση της από το χειρόγραφο, και τον πυρήνα της αλληλουχίας του DNA, ICBR, στο Πανεπιστήμιο της Φλόριντα για βοήθεια κατά τη διάρκεια του βαθύ αλληλουχίας επόμενης γενιάς.