Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αλλαγμένη έκφραση έκφραση miRNA συμβάλλει στην ανθρώπινη καρκινογένεση. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να ανιχνεύει παρεκκλίνουσα εκφράσεις miRNA ως πιθανό βιοδείκτη για την έγκαιρη ανίχνευση και πρόβλεψη της πρόγνωσης του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC).

Μέθοδοι

συστοιχία miRNA χρησιμοποιήθηκε στο προφίλ διαφορικά εκφρασμένη miRNAs και ποσοτικές αναλύσεις RT-PCR Taqman που βασίζονται χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των επιπέδων του miR-29c, miR-93, και miR-429 έκφραση σε δείγματα ιστών NSCLC, που αντιστοιχεί δείγματα φυσιολογικού ιστού, και δείγματα ορού από 70 ασθενείς με NSCLC, καθώς και σε δείγματα ορού από 48 υγιείς μάρτυρες.

Αποτελέσματα

τα επίπεδα του miR-29c και miR-93 έκφρασης υπερεκφράζεται σε ιστούς NSCLC, ενώ τα επίπεδα του miR-29c ορού επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω, αλλά τα επίπεδα ορού miR-429 μειώθηκαν σε NSCLC. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης miR-429 σε ιστούς NSCLC συσχετίστηκαν με εκείνα σε δείγματα ορού. Λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) ανάλυση καμπύλης έδειξε ότι στο βέλτιστο σημείο αποκοπής, οι περιοχές κάτω από την καμπύλη ROC για τα επίπεδα του miR-29c και miR-429 στον ορό ήταν 0.723 και 0.727, αντίστοιχα, επίπεδα τα οποία είναι υψηλότερη από εκείνη του καρκινώματος εμβρυϊκό αντιγόνο (0.534) στη διάγνωση του σταδίου Ι NSCLC. Επιπλέον, τα επίπεδα του miR-429 στον ορό συσχετίστηκαν με κακή συνολική επιβίωση των ασθενών με NSCLC. Και οι δύο μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι ο ορός miR-429 το επίπεδο ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας πρόβλεψης για NSCLC.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η ανίχνευση του ορού miR-29c και ΜΙΚ 429 έκφρασης θα πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω ως νέο, μη επεμβατική βιοδείκτη για το πρώιμο στάδιο NSCLC

Παράθεση:. Zhu W, Ο J, Chen D, Zhang Β, Xu L, Ma H, et al. (2014) Έκφραση του miR-29c, miR-93, και miR-429 ως πιθανοί βιοδείκτες για την ανίχνευση των πρώιμων Στάδιο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (2): e87780. doi: 10.1371 /journal.pone.0087780

Επιμέλεια: Τραγούδι Guo Zheng, Penn State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Νοεμ 2013? Αποδεκτές: 1η Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang (Y2110960), την Επιστήμη και την Τεχνολογία Γραφείου του Zhoushan (10137 και 2011C12039), και από την Ιατρική Γραφείο της επαρχίας Zhejiang (2011KYB165). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μία κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs που μπορεί να λειτουργήσει ως ενδογενές παρεμβολή RNA για τη ρύθμιση της έκφρασης των στοχευόμενων γονιδίων [1] – [3]. Μέχρι σήμερα, συνολικά 1.048 ανθρώπινης miRNAs έχουν ταυτοποιηθεί και αναφέρεται στη βάση δεδομένων του RNA, και ο αριθμός αυτός συνεχίζει να αυξάνεται. Μερικά από αυτά τα miRNAs έχουν αναφερθεί ότι είναι χρήσιμες ως πιθανοί βιοδείκτες για τη διάγνωση, την πρόγνωση και εξατομικευμένη θεραπεία καρκίνων του ανθρώπου [1] – [6], επειδή αλλαγμένη έκφραση αυτών των miRNAs συμβάλλει στην ανθρώπινη καρκινογένεση. Για παράδειγμα, παρεκκλίνουσα έκφραση miRNA έχει αναφερθεί στον καρκίνο του πνεύμονα. Ένας αριθμός ερευνητών, συμπεριλαμβανομένων των ΗΠΑ, έχουν αναφέρει την πιθανή κλινική εφαρμογή των κυκλοφορούντων miRNAs (όπως miR-1254, miR-142-3p, miR-24, miR-183, miR-21, miR-221, miR-29c, miR-486, miR-30D, miR-1, miR-499 και miR-210) [7], [8]. Έτσι, η περαιτέρω διερεύνηση της ανώμαλης έκφρασης των miRNAs θα μπορούσε να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων βιοδεικτών miRNA για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [9]. Παρά τις προόδους στην έγκαιρη ανίχνευση και βελτιώσεις στις επιλογές θεραπείας, οι ασθενείς με προχωρημένη νόσο ακόμα συχνά αναπτύσσουν υποτροπιάζουσα νόσο μετά από εκτεταμένη ριζική εκτομές, και το ποσοστό συνολικής επιβίωσης 5 ετών εξακολουθεί να είναι μόνο 5%. Έτσι, καινοτόμες προσεγγίσεις για την αποτελεσματική διαχείριση αυτής της ασθένειας σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσε να προσδιορίσει τους ασθενείς που έχουν μια υψηλότερη ή χαμηλότερη κίνδυνο υποτροπής μετά από χειρουργική επέμβαση και να παρέχει βιοδείκτες για την πρόβλεψη της επιβίωσης των ασθενών. Από την άποψη αυτή, η χρήση των miRNAs ορού ως πιθανοί βιοδείκτες για τη διάγνωση και την πρόβλεψη πρόγνωση των καρκίνων του πνεύμονα έχει αναφερθεί [7], [10]. Πράγματι, αρκετές μελέτες έχουν προσδιορίσει miRNA υπογραφές που διαφέρουν μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ιστών για την ταξινόμηση των τύπων καρκίνου και για τη διάγνωση και την πρόγνωση όγκων. Μπορεί επίσης να είναι δυνατή η χρήση της έκφρασης miRNA ως βιοδείκτη για παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας ή την πρόβλεψη της εξέλιξης του καρκίνου [11] – [12]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, οι περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην καρκινικό ιστό, και οι αλλαγές στα κυκλοφορούντα επίπεδα miRNAs ορού και τη σχέση μεταξύ αυτών των αλλαγών και του ιστού κατά την έναρξη της νόσου παραμένουν αμφιλεγόμενα [7]. Επιπλέον, η χρησιμότητα πολλών κυκλοφορούντων miRNAs έχει καταδειχθεί στη διάγνωση του NSCLC, αλλά λίγοι κυκλοφορεί miRNAs έδειξε διαγνωστική αξία για πρόωρη στάδιο NSCLC [13], [14]. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω έλεγχος σε διαφορετικούς πληθυσμούς. Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε τα επίπεδα τριών miRNAs (MIR-29γ, miR-93, και miR-429) σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ιστούς και σε σύγκριση τους με εκείνα σε δείγματα ορού από ασθενείς με NSCLC και υγιείς ελέγχων, ιδίως, τα επίπεδα έκφρασης τους σε ασθενείς πρώιμο στάδιο NSCLC. Εν τω μεταξύ, αναλύσαμε τα δεδομένα σε σχέση με εμβρυονικό αντιγόνο καρκινώματος (CEA), το οποίο είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη για τη διάγνωση της NSCLC [15]. Στη συνέχεια διερευνώνται συσχετίσεις μεταξύ τους έκφραση και κλινικοπαθολογοανατομικές και την επιβίωση δεδομένα από ασθενείς με ΜΜΚΠ.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Αναθεώρηση του Zhoushan Δημοτική κυβέρνηση της Κίνας, και όλα τα βιολογικά δείγματα ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση των ασθενών.

τα δείγματα ασθενών

Σε αυτή τη μελέτη, θα προσληφθούν 70 ασθενείς με χειρουργικά NSCLC και συμφωνημένα μακρινό noncancerous ιστούς από Zhoushan Νοσοκομείο, Zhejiang, Κίνα μεταξύ Ιανουαρίου 2008 και Μαΐου 2009. Υπήρχαν 56 άνδρες και 14 γυναίκες ασθενείς με ΜΜΚΠ, συμπεριλαμβανομένων 34 ασθενών ηλικίας κάτω των 60 ετών και 36 ηλικίας άνω των 60 ετών. Εν τω μεταξύ, οι οροί από όλους τους ασθενείς με NSCLC και 48 υγιείς εθελοντές ταιριάζουν ανάλογα με το φύλο και την ηλικία συλλέχθηκαν επίσης. Κανένας από τους ασθενείς που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη είχαν λάβει χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Για τη συλλογή δειγμάτων ιστού, κατά την απομάκρυνση των χειρουργικά δείγματα, οι ιστοί αμέσως μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο Παθολογίας, και τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε ένα κρυοφυαλίδιο, snap-καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για 30 λεπτά και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση . Όλα τα δείγματα ιστού εξετάστηκαν από δύο παθολόγους, και η διάγνωση έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια National Comprehensive Cancer Network (NCCN). Υπήρχαν 34 αδενοκαρκινώματα πνεύμονα και 36 του πνεύμονα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, και 46 όγκοι μέτρια έως πολύ διαφοροποιημένα, ενώ 24 ήταν ελάχιστα διαφοροποιημένες. Επιπλέον, 18 ασθενείς με NSCLC είχε έναν όγκο μικρότερο από 3 cm σε μέγεθος, ενώ 52 ασθενείς με όγκο μεγαλύτερο από 3 cm. Λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες βρέθηκε σε 32 ασθενείς και 36 ασθενείς είχαν σταδίου Ι NSCLC και 34 ασθενείς είχαν σταδίου ΙΙ, ΙΙΙ ή IV NSCLC (Πίνακας 1). Επιπλέον, τα επίπεδα του CEA στον ορό μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας χημειοφωταύγειας ως μέρος των συνήθων κλινικών δοκιμών, και την τιμή αναφοράς αποκτήθηκε από την κλινική βάση δεδομένων σε Zhoushan Νοσοκομείο.

Η

απομόνωση RNA και ποσοτική RT-PCR

το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από 100 mg ιστού πνεύμονα ή 600 δειγμάτων μl ορού χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης miRNAs ή mirVana PARIS κιτ απομόνωσης RNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA), και η ποιότητα του RNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μετουσιωτική 15% πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής διεξήχθη χρησιμοποιώντας το TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε ένα συνολικό όγκο αντίδραση των 7.5 μΐ. qPCR διεξήχθη εις τριπλούν χρησιμοποιώντας TaqMan 2 × καθολική PCR Master Mix χωρίς AmpErase UNG (Applied Biosystems) σε ένα σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ΑΒΙ 7500 (Applied Biosystems) με τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Οι κατώφλι κύκλου (Ct) τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας SDS 2.0.1 λογισμικό (Applied Biosystems). Πρότυπο-free ελέγχους τόσο για RT και PCR συμπεριελήφθησαν σε κάθε πείραμα για να εξασφαλισθεί η ενίσχυση ειδικού στόχου.

Τα μέσα επίπεδα έκφρασης miRNA σε ιστούς και ορούς κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με το μέσο όρο των ποσοτήτων U6 snRNA και U48 snRNA χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο [16] – [17]. Οι μέσες τιμές Ct για τις πέντε αυτές miRNAs είχαν υπολογίζεται χωρίς ακραίες τιμές (δηλαδή, αντιγράφεται με τιμές Ct που διαφέρουν κατά περισσότερο από ένα κύκλο από το διάμεσο). Επιπλέον, εάν CtU6, ave και CtU48, ave κάθε δεν βρίσκονται μέσα σε 32 κύκλους, η δοκιμασία επαναλήφθηκε. Δείγματα με χαμηλή U6 ή τα επίπεδα U48 snRNA δεν αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις των δεδομένων.

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 5.0 λογισμικό (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ΗΠΑ). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ομοιογένεια της διακύμανσης. Μονόδρομη ANOVA ή Wilcoxon τεστ δύο δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμή για τις ενώσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης miRNA και κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών. Ένα δείγμα ζεύγη t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές στην έκφραση μεταξύ miRNA πνευμονικού ιστού και δείγματα ορού. χαρακτηριστικό λειτουργίας (ROC) καμπύλη Receiver δημιουργήθηκαν για να εκτιμηθεί η διαγνωστική ακρίβεια της κάθε παραμέτρου. επιβίωση των ασθενών εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier, και η δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της επιβίωσης μεταξύ των ομάδων. Το μοντέλο παλινδρόμησης κινδύνου Cox χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν οι παράγοντες κινδύνου για NSCLC. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων, και

P

αξίας 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η διαφορική έκφραση των τριών miRNAs σε NSCLC ιστό και ο ασθενής ορούς

με βάση την miRNA σειρά μας (Agilent) και επικύρωση των δεδομένων, επιλέξαμε τρία miRNAs (miR-29γ, miR-93, και miR-429) για περαιτέρω μελέτη σε δείγματα NSCLC. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση qRT-PCR για τις τρεις αυτές miRNAs σε 70 ζεύγη NSCLC και τα αντίστοιχα noncancerous ιστούς των πνευμόνων. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι τα επίπεδα του miR-29c και miR-93 έκφρασης υπερεκφράζεται σε ιστούς NSCLC σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μη καρκινικούς ιστούς των πνευμόνων (

P

= 0,0408 και

P

= 0.0444, αντίστοιχα), ενώ τα επίπεδα miR-429 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ NSCLC και noncancerous ιστούς των πνευμόνων (

P

= 0,3903, Σχήμα 1Α).

Α, ανίχνευση qRT-PCR τριών miRNAs σε 70 όγκους NSCLC και οι αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί των πνευμόνων.

P

-τιμές για το miR-29c, miR-93, και miR-429 ήταν 0,0408, 0,0444 και 0,3903, αντίστοιχα, με χρήση ενός αντίστοιχου δείγματος

t-test

. Β, ανάλυση qRT-PCR των επιπέδων miRNA ορού σε δείγματα ορού από 70 ασθενείς με NSCLC vs. 48 υγιείς μάρτυρες.

P

-τιμές του ορού miR-29c, miR-93, και miR-429 ήταν 0,0012, 0,9291, 0,0001 και, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας ένα t-test unpaired δείγμα. C, D, Ε, σύνδεση των εν λόγω επιπέδων miRNA μεταξύ NSCLC ιστού και δείγματα ορού. τεστ συσχέτισης Pearson έδειξαν ότι η έκφραση του miR-429 στον ορό ήταν σημαντικά σχετίζονται με αυτό σε ιστούς NSCLC (r = 0,3578,

P

= 0,0024), ενώ τα επίπεδα του miR-29c και miR-93 δεν συνδέθηκαν με ορό εκείνες NSCLC ιστούς (r = -0,07877,

P

= 0.5169 και r = 0,1515,

P

= 0,2105, αντίστοιχα). *

P

& lt? 0,05 μεταξύ των ομάδων

Η

Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον αυτές οι διαφορές στην έκφραση των miRNAs ήταν παρόντες σε δείγματα ορού από αυτούς τους ασθενείς.. Βρήκαμε ότι η έκφραση του ορού miR-93 δεν διέφεραν μεταξύ των ασθενών με NSCLC και των υγιών μαρτύρων (

P

= 0,3530). Ωστόσο, η έκφραση του miR-29c ήταν σημαντικά αυξημένη ορού από ασθενείς με NSCLC (

P

= 0,0012), και miR-429 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη (

P

= 0,0001, Σχήμα 1Β). Το επίπεδο της έκφρασης miR-429 ορού συσχετίστηκε σημαντικά με ότι σε ιστούς NSCLC (r = 0,3578,

P

= 0,0024, Σχήμα 1Ε), ενώ τα επίπεδα του miR-29c και miR-93 έκφρασης στον ορό δεν σχετίζεται με εκείνους στους ιστούς NSCLC (r = -0,07877,

P

= 0.5169 και r = 0,1515,

P

= 0.2105, αντίστοιχα, Εικόνα 1C και D).

Σύλλογοι μεταξύ αλλοιωμένη έκφραση των miRNAs και κλινικά χαρακτηριστικά των NSCLC

στη συνέχεια ερευνήσαμε τις ενώσεις μεταξύ των μεταβάλλονται τα επίπεδα των miRNAs έκφρασης (miR-29γ και miR-93 στο NSCLC και miR-29c και miR-429 στον ορό) με τις κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά των ασθενών με NSCLC. Βρήκαμε ότι η αυξημένη έκφραση του miR-93 συσχετίστηκε ισχυρώς με NSCLC ιστολογία (

P

= 0,031, Πίνακας 2), ενώ η έκφραση του miR-29c ορού συσχετίστηκε με μη φυσιολογικά επίπεδα CEA (

P

= 0,030, Πίνακας 2). Σε αντίθεση, δεν άλλες ενώσεις ανιχνεύθηκαν μεταξύ των επιπέδων έκφρασης αυτών των miRNAs. Επιπλέον, απεικονίζονται τα δεδομένα έκφρασης για miR-29c και miR-429 χρησιμοποιώντας τις καμπύλες ROC για να προσδιορίσει μια τιμή αποκοπής που θα μπορούσαν να διακρίνουν τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα από υγιείς μάρτυρες. ανάλυση καμπύλης ROC έδειξε ότι κατά τη βέλτιστη cut-off, τα επίπεδα του miR-29c ορό είχε ευαισθησία 65,7% και ειδικότητα 74,1% για τη διάκριση των ασθενών με NSCLC από υγιείς ελέγχους με εμβαδόν κάτω από την καμπύλη (AUC) του 0,676 (

P

= 0,0004, 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI]: 0,584 – 0,759, Εικόνα 2Α). Επιπλέον, τα επίπεδα του miR-429 στον ορό είχαν ευαισθησία 54,3% και ειδικότητα 81,2% για τη διάκριση των ασθενών με NSCLC από υγιείς μάρτυρες με την AUC του 0,713 (

P

& lt? 0.0001, 95% CI: 0,623 -0.793, Σχήμα 2Β). Επειδή η δοκιμή CEA στο αίμα είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη για NSCLC, συγκρίναμε τα αποτελέσματα CEA με τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs και διαπίστωσε ότι CEA είχε μια AUC των 0,576 (

P

= 0.1493, 95% CI: 0,482 έως 0,666, Σχήμα 2C). Ωστόσο, για το συνδυασμό της έκφρασης miR-29c και CEA, τα δεδομένα έδειξαν μια AUC των 0.712 (

P

& lt? 0.0001, 95% CI: 0,622 – 0,792)? για το συνδυασμό της έκφρασης miR-429 και CEA, η AUC ήταν 0,707 (

P

= 0.0007, 95% CI: 0,616 – 0,787)? και για το συνδυασμό της έκφρασης miR-29c και miR-429 με CEA, η AUC ήταν 0,797 (

P

& lt? 0.0001, 95% CI: 0,713 – 0,865).

Α, miR -29c? Β, miR-429? C, CEA παρουσίασαν καμπύλες ROC και την AUC με διαγνωστική δύναμη να διακρίνει τους ασθενείς με NSCLC από υγιείς μάρτυρες. D, miR-29c? Ε, miR-429? F, CEA παρουσίασαν καμπύλες ROC και AUC με διαγνωστική δύναμη να διακρίνει το στάδιο Ι NSCLC ασθενείς από υγιείς μάρτυρες.

Η

Επιπλέον, έχουμε επίσης διαπίστωσε ότι τα επίπεδα του miR-29c στον ορό είχαν ευαισθησία 50,0% και ειδικότητα 95,8% για τη διάκριση του σταδίου Ι NSCLC από υγιείς μάρτυρες με την AUC του 0,727 (

P

= 0.0001, 95% CI 0,619 έως 0,818, Εικόνα 2D). miR-429 είχε ευαισθησία 94,4% και ειδικότητα 41,7% για τη διάκριση του σταδίου Ι NSCLC ασθενείς από υγιείς μάρτυρες με την AUC του 0,723 (

P

= 0.0001,95% CI 0,615 έως 0,815, Εικόνα 2Ε) . CEA είχε ευαισθησία 66,7% και ειδικότητα 52,1% για τη διάκριση του σταδίου Ι NSCLC ασθενείς από υγιείς μάρτυρες με την AUC του 0,534 (

P

= 0.6040, 95% CI 0,422 έως 0,644, Εικόνα 2F). Επιπλέον, ο συνδυασμός της έκφρασης miR-29c και CEA είχε μια AUC των 0.757 (

P

& lt? 0,0001, 95% CI: 0,651 έως 0,844), ο συνδυασμός του miR-429 έκφρασης και CEA είχε την AUC από 0.659 (

P

= 0.0128, 95% CI: 0,547 – 0,759), και ο συνδυασμός της έκφρασης miR-29c, miR-429 έκφρασης, και CEA είχε AUC του 0,833 (

P

& lt? 0.0001, 95% CI: 0,736 – 0,906)

σύνδεσης μεταξύ miR-429 επίπεδα ορού και της επιβίωσης του NSCLC ασθενών

Επειδή η έκφραση των τριών δοκιμάζονται miRNAs μεταβλήθηκε σε NSCLC δείγματα ιστού και ορού, έχουμε αξιολογηθεί περαιτέρω εάν η ανίχνευση των επιπέδων τους θα μπορούσε να προβλέψει την πρόγνωση σε ασθενείς με NSCLC. Βρήκαμε ότι το επίπεδο της έκφρασης miR-429 ορού συσχετίστηκε με τη συνολική επιβίωση των ασθενών με ΜΜΚΠ (

P

= 0,0030 χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία log-rank, Σχήμα 3). Ωστόσο, η έκφραση του miR-29c, miR-93, και miR-429 σε ιστούς NSCLC και τα επίπεδα του miR-29c και miR-93 δεν σχετίζεται με τη συνολική επιβίωση των ασθενών με NSCLC ορού. Η μονοπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης κινδύνου Cox έδειξαν ότι τα επίπεδα του miR-429 στον ορό ήταν ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης του NSCLC (προσαρμοσμένη αναλογία κινδύνου = 6,458, 95% CI: 1,409 έως 29,593,

P

= 0,016). Η πολυπαραγοντική ανάλυση Cox παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου έδειξε ότι τα επίπεδα του miR-429 στον ορό ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας πρόβλεψης για ασθενείς με ΜΜΚΠ (αναλογία κινδύνου = 12.875, 95% CI: 2,295 έως 72,230,

P

= 0,004, Πίνακας 3) .

P

-τιμή για την επιβίωση των ασθενών με υψηλά και χαμηλά επίπεδα έκφρασης των miRNAs υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. *

P

& lt?. 0.05 μεταξύ των ομάδων

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε την έκφραση των τριών miRNAs, που επιλέγονται με βάση την προηγούμενη μας miRNA συστοιχία και επικύρωση δεδομένων, σε δείγματα ιστού και ορού NSCLC σύνδεσης με κλινικοπαθολογοανατομικές και την επιβίωση των δεδομένων από ασθενείς. Βρήκαμε ότι το miR-29c και miR-93, η έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστούς NSCLC σε σύγκριση με τα αντίστοιχα noncancerous ιστούς των πνευμόνων. Επιπλέον, τα επίπεδα του miR-29c στον ορό αυξήθηκαν σημαντικά και τα επίπεδα του miR-429 στον ορό μειώθηκαν σημαντικά στο στάδιο Ι NSCLC σύγκριση με τα επίπεδα σε 48 υγιείς μάρτυρες. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα miR-429 κάτω στον ορό συσχετίστηκαν με την κακή συνολική επιβίωση των ασθενών με NSCLC. Οι μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι το επίπεδο του miR-429 στον ορό ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της συνολικής επιβίωσης των ασθενών με NSCLC. τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ανίχνευση του ορού miR-29c και την έκφραση του miR-429 θα πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω ως νέο μη επεμβατικό βιοδείκτη για το πρώιμο στάδιο της NSCLC.

Πράγματι, μέχρι σήμερα, ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχουν έδειξαν ότι αλλοιωμένη έκφραση συγκεκριμένων miRNAs παίζει σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη ογκογένεση οφείλεται στις λειτουργίες αυτών των miRNAs ως καταστολείς του γονιδίου ή ογκογονίδια [17] – [19]. Έτσι, η ανίχνευση ανώμαλων επιπέδων έκφρασης miRNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την έγκαιρη διάγνωση καρκίνων του ανθρώπου ή την πρόβλεψη της πρόγνωσης επειδή miRNAs είναι πιο σταθερά και ανθεκτικά σε πέψη με RNase Α και άλλες σκληρές συνθήκες από ότι οι παραδοσιακές πρωτεϊνικών δεικτών [7], [10], [ ,,,0],17], [20]. Για παράδειγμα, Chen

κ.ά.

[10] έδειξε ότι miRNAs είναι σταθεροί στην κυκλοφορία του ορού και μπορεί να χρησιμεύσει ως πιθανές διαγνωστικοί δείκτες για καρκίνο του πνεύμονα. Hu

et al

[7] ανέφερε ότι τέσσερις miRNAs είναι ανεξάρτητοι προγνωστικοί δείκτες της συνολικής επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Le και συνεργάτες [20] έδειξαν ότι τα επίπεδα των miRNAs ορού είναι διαφορετικά σε προ- και μετεγχειρητικές δείγματα καρκίνου του πνεύμονα και ότι αυτά τα miRNAs μπορούν ενδεχομένως να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για υποτροπή της νόσου μετά από χειρουργική επέμβαση. Ωστόσο, μόνο λίγες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στο διαγνωστικό ρόλο των miRNAs σε πρώιμο στάδιο NSCLC [13], [14]. Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε την έκφραση τριών miRNAs σε ιστούς NSCLC και τα δείγματα ορού για δυνητική αξία τους στην πρώιμη διάγνωση και την πρόγνωση των ασθενών με NSCLC. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι τα επίπεδα του miR-29c και miR-93 έκφρασης υπερεκφράζεται σε ιστούς NSCLC σε σύγκριση με τα αντίστοιχα noncancerous ιστούς των πνευμόνων. Επιπλέον, τα δεδομένα ROC έδειξε ότι οι AUCs για miR-29c και miR-429 ήταν 0.723 και 0.727, αντίστοιχα, και αυτές οι τιμές ήταν σημαντικά υψηλότερες από ότι για το CEA (0.534), στη φάση Ι NSCLC ασθενείς, γεγονός που υποδηλώνει αυτά τα miRNAs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη διάγνωση του NSCLC. Το CEA είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο βιοδείκτης στη διάγνωση NSCLC και επιλέχθηκε ως θετικός έλεγχος [15]. Πράγματι, Heegaard

κ.ά.

[8] έδειξε ότι η έκφραση του miR-29c ήταν σημαντικά αυξημένη σε 220 ασθενείς πρώιμο στάδιο NSCLC σε σύγκριση με 220 της ομάδας μαρτύρων. Σε άλλες μελέτες, miR-93 έκφραση βρέθηκε να προωθήσουν την αγγειογένεση όγκων και τη μετάσταση με καταστολή μεγάλο ογκοκατασταλτικό ομολογίας 2 έκφραση [21] – [22]. Ωστόσο, miR-429 είναι ένα μέλος της οικογένειας των miR-200 που είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι αναστέλλει την μετάβαση επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά ρυθμίζοντας Ε-καδερίνης, ZEB1, και έκφραση SIP1 [23] – [25]. Καμία μελέτη δεν έχει ακόμη αποκαλυφθεί ο ρόλος της στη διάγνωση και πρόγνωση του NSCLC. Στην παρούσα μελέτη, για πρώτη φορά, έδειξε ότι η έκφραση του miR-429 στον ορό ήταν κατιούσα ρύθμιση σε ασθενείς με NSCLC σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες και ότι η χαμηλότερη έκφραση miR-429 συσχετίστηκε με κακή συνολική επιβίωση των ασθενών με NSCLC, υποδηλώνοντας miR-429 έκφραση είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για NSCLC. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα του miR-429 στον ορό ήταν σημαντικά σχετίζεται με την έκφραση του miR-429 σε ιστούς NSCLC, η οποία οδήγησε στην υπόθεση ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιήσουν miRNAs να μεταφέρει γενετικές πληροφορίες με το περιβάλλον ή μακρινά κύτταρα και έτσι να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου και την εξέλιξη [26]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, ανέφερε ότι τα επίπεδα του miR-96 στον ορό και του όγκου συσχετίστηκαν [18], υποστηρίζοντας την ιδέα ότι κάποιοι miRNAs θα μπορούσε να εκκρίνεται από τον ιστό του όγκου και την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου, η οποία είναι επίσης συνεπής με τις εκθέσεις από Μίτσελ

et al

[17] και Hu

κ.ά.

[7].

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ανίχνευση miRNAs ορού θα μπορούσε να είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την έγκαιρη διάγνωση του κλινικά ασυμπτωματικά καρκίνων [ ,,,0],27] – [29]. Για παράδειγμα, σε προηγούμενες μελέτες του καρκίνου του πνεύμονα, τα επίπεδα του miR-1254, miR-574-5p, miR-486, miR-30D, miR-1, και miR-499 έκφραση ήταν σημαντικά δυσρυθμισμένη στον καρκίνο του πνεύμονα πρώιμου σταδίου [7] , [30]. Chen

et al

[31] αποδεικνύεται μέσω των χαρακτηριστικών που 10 miRNAs ορού μπορεί να χρησιμεύσει ως νέα μη επεμβατική βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα. Keller

et al

[32] πρότεινε, επίσης, ότι η ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα μπορεί να είναι ανιχνεύσιμες έτη πριν από τη διάγνωση μέσω ενός ειδικού υπογραφή miRNA και ότι η υπογραφή αυτή αλλάζει κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου. Μερικώς συνεπής με τα αποτελέσματα αυτών των μελετών, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μας αποδεικνύουν την χρησιμότητα των τριών δοκιμάστηκαν miRNAs, οι οποίες ήταν πιο ευαίσθητα από CEA για την ανίχνευση του σταδίου Ι NSCLC. Ωστόσο, τα σημερινά δεδομένα μας είναι απόδειξη της αρχής, και την περαιτέρω προοπτική μελέτη χρησιμοποιώντας ένα μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος θα ελέγχει αν η ανίχνευση αυτών των miRNAs είναι χρήσιμη για την έγκαιρη διάγνωση του σταδίου Ι NSCLC και την πρόβλεψη της επιβίωσης σε ασθενείς με NSCLC.

Βρήκαμε διαφορές στην έκφραση των τριών miRNAs μεταξύ ιστών NSCLC και αντίστοιχη noncancerous ιστούς των πνευμόνων. Είναι σημαντικό ότι, εντοπίσαμε miR-29c και miR-429 ως δυσρυθμισμένη στα κυκλοφορούντα δείγματα ορού από ασθενείς με πρώιμο στάδιο NSCLC, και η έκφραση αυτών των miRNAs ήταν πιο ευαίσθητη από τα επίπεδα CEA του ορού σε ασθενείς που διακρίνουν NSCLC από υγιείς ελέγχους. Επιπλέον, μπορούμε επίσης να προσδιορίζονται μειωμένη έκφραση του miR-429 στον ορό ως ανεξάρτητο προγνωστικό βιοδείκτη για NSCLC. Η κλινική αξία των τριών δοκιμάζονται miRNAs στη διάγνωση και πρόγνωση της NSCLC εγγυάται περαιτέρω εξέταση σε μεγαλύτερες ομάδες.