Αφηρημένο

Η υπερέκφραση του κατιόντος-διαπερατό κανάλι TRPM8 σε καρκίνους του προστάτη μπορεί να αποτελέσει μια νέα ευκαιρία για τη θεραπεία τους. Οι αναστολείς της TRPM8 μειώνουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Έχουμε χρησιμοποιήσει δύο περιγράφηκε πρόσφατα και πολύ συγκεκριμένες αποκλειστές, AMTB και JNJ41876666, και RNAi για να προσδιοριστεί η σημασία της έκφρασης TRPM8 στον πολλαπλασιασμό των μη-όγκου και καρκινικών κυττάρων. Η αναστολή της έκφρασης ή της λειτουργίας του καναλιού μειώνει τα ποσοστά πολλαπλασιασμού και πολλαπλασιασμού κλάσμα σε όλα τα κύτταρα του όγκου που εξετάστηκαν, αλλά όχι των κυττάρων του προστάτη μη-όγκου. Δεν παρατηρήσαμε καμία συνεπής επιτάχυνση της ανάπτυξης μετά από διέγερση του καναλιού με μινθόλη ή icilin, υποδεικνύοντας ότι η βασική έκφραση TRPM8 είναι αρκετό για να στηρίξει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Παράθεση:. Valero ML, Mello de Queiroz F, Stühmer W , Viana F, Pardo LA (2012) TRPM8 Ion Κανάλια διαφορικά διαμορφώσεως του πολλαπλασιασμού και κυτταρικού κύκλου Κατανομή των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων του προστάτη. PLoS ONE 7 (12): e51825. doi: 10.1371 /journal.pone.0051825

Επιμέλεια: Αλέξανδρος Α Mongin, Albany Medical College, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6, Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 6 Νοεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 14, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Valero et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση το Max-Planck Society και επιχορηγήσεις SAF2010-14990 και PROMETEO2010-046 να FV. MV ήταν ο παραλήπτης μιας predoctoral υποτροφία της Ισπανικής κυβέρνησης (F.P.I). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

TRPM8 είναι ασβέστιο διαπερατή, μη-επιλεκτική κανάλι κατιόντων του δυναμικού υπεροικογένειας παροδική υποδοχέα [1], που απαιτείται για την μεταγωγή της μέτριας ψυχρές θερμοκρασίες [2], [3]. Η παρουσία TRPM8 σε νευρώνες κρύο ανταποκρινόμενο μικρής διαμέτρου στα γάγγλια της ραχιαίας ρίζας και τα τρίδυμα γάγγλια και τον φαινότυπο ανιχνεύεται σε TRPM8 – /- ποντίκια knockout υποστηρίζει έναν ρόλο των TRPM8 σε θερμοαίσθηση και αλγαισθησία [4] – [6]. Οι δίαυλοι TRPM8 έχουν κλωνοποιηθεί από είδη σε διάφορα γένη, από αμφίβια στον άνθρωπο [7]. Ανθρώπινα TRPM8 αρχικά προσδιορίζονται κατά τη διάρκεια μιας οθόνης για τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε καρκίνο προστάτη (και ως εκ τούτου ονομάζεται trp-P8 [8], αλλά αργότερα ανιχνεύεται σε άλλους τύπους όγκων [9], [10]. Ανάμεσα φυσιολογικούς ιστούς, η έκφραση του καναλιού είναι πολύ περιορισμένη σε ένα υποπληθυσμό πρωτογενών αισθητήριων νευρώνων [2], [3], αλλά είναι επίσης παρόν στο αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα σε σημαντικές ποσότητες [2], [3], [8], [9], [11], [12]

η ενεργοποίηση του ενδογενούς (δηλ νευρωνική) ή ανασυνδυασμένο κανάλια TRPM8 δημιουργεί ένα ρεύμα υπογραφή που χαρακτηρίζεται από την ακραία προς τα έξω διόρθωση και εξαρτώνται από την τάση πύλης [13] -. [15]. κανάλια TRPM8 μπορεί να ενεργοποιηθεί από ειδικές και εκλεκτικοί αγωνιστές, είτε φυσικά (όπως ευκαλυπτόλη και μενθόλη) ή συνθετικές ενώσεις όπως το super icilin παράγοντα ψύξης, οι οποίες είναι μέχρι στιγμής η πιο ισχυρός αγωνιστής του TRPM8 [2], [3], [16] – [19] . άλλοι αγωνιστές (λιναλοόλη, γερανιόλη, μεταξύ άλλων) ταυτοποιήθηκαν με διαλογή παραγώγων μενθόλη ή οσφρητικών ενώσεων. ειδικότερα, γερανιόλη θα μπορούσε να είναι ένα φυσιολογικό ενεργοποιητής TRPM8 διότι είναι ένα ενδιάμεσο κατά τη σύνθεση χοληστερόλης και επάγει τον πολλαπλασιασμό σε επιθήλιο προστάτη. Όλοι οι γνωστοί αγωνιστές TRPM8 επάγουν μια επίδραση ψύξης, ενισχύοντας την έννοια ενός ρόλου της TRPM8 σε κρύο αντίληψη [20].

TRPM8 mRNA έχει ανιχνευθεί σε κακοήθη κύτταρα, και αυτό έχει μελετηθεί εκτενώς σε καρκίνο του προστάτη. TRPM8 mRNA ήταν ιδιαίτερα υπερεκφράζεται σε καλά διαφοροποιημένοι όγκοι νωρίς προστάτη. Σε ένα τυπικό μοντέλο για εξαρτώμενη από ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη (LNCaP κύτταρα? Επιθηλιακά κύτταρα κορυφής με ένα εκκριτικό φαινότυπο) έκφραση ανιχνεύεται τόσο σε μεμβράνη πλάσματος και στο ενδοπλασματικό δίκτυο, όπου θα μπορούσε να λειτουργήσει ως Ca

2+ καναλιού απελευθέρωσης [ ,,,0],18], [19], [21] – [23]. TRPM8 μεμβράνη πλάσματος θα μπορούσε να ασκήσει μια προστατευτική επίδραση, αφού η ενεργοποίηση του TRPM8 με PSA (ειδικό προστατικό αντιγόνο) μείωσε την κυτταρική κινητικότητα σε κύτταρα PC3 [24].

TRPM8 θα μπορούσε να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για τον καρκίνο του προστάτη αποτέλεσμα, δεδομένου ότι η απώλεια του έκφραση TRPM8 φαίνεται να συνδέεται με τη μετάβαση στην ανεξαρτησία από ανδρογόνα και φτωχή πρόγνωση [19], [21], [25]. Αυτό μπορεί να αντανακλά την επίδραση των ανδρογόνων επί της έκφρασης TRPM8, δεδομένου ότι το γονίδιο εμφανίζει δέκα υποθετικό ανδρογόνο ανταποκρινόμενα στοιχεία [18]. Ανώμαλα επίπεδα του TRPM8 mRNA μπορεί επίσης να είναι ενδεικτική της μεταστατικής νόσου [26].

λειτουργία καναλιού Κανονικού TRPM8 μπορεί να μπλοκαριστεί από ενώσεις ουρίας (βλέπε παρακάτω), τα οποία είναι επίσης γνωστό ότι αναστέλλουν TRPV1 [17], [25 ], [27]. Αυτό περιορίζει τη χρήση τέτοιων αναστολέων στη μελέτη του ρόλου των TRPM8 στον καρκίνο του προστάτη, επειδή τα κύτταρα εκφράζουν επίσης TRPV1 [28]. Επί του παρόντος, ο μόνος εφικτός τρόπος για να τεμαχίσει ειδικά το ρόλο του καναλιού στον καρκίνο του προστάτη είναι η χρήση του siRNA. Παρεμβολή RNA μπορεί να παράγει μια αποτελεσματική και ειδική γκρεμίσουμε ενός συγκεκριμένου γονιδίου

in vivo

και

in vitro

[29], [30].

Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τα αποτελέσματα που TRPM8 σίγηση έχει στην κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των τριών ανθρώπινων κυττάρων του προστάτη γραμμές, LNCaP, PC3 και DU145. LNCaP είναι έντονα ανδρογόνο-εξαρτώμενη [19] ενώ DU145 είναι ανδρογονο-ανεξάρτητη [31] και PC3 θα αντιπροσώπευε ένα ενδιάμεσο κατάσταση [32]. Μελετήσαμε επίσης την συμπεριφορά από την άποψη αυτή από ένα μη-καρκινικές (SV40 αθανατοποιημένων) κυτταρική σειρά προστάτη, PNT1A [33]. Η αναστολή της έκφρασης ή λειτουργίας του καναλιού μειωμένους συντελεστές πολλαπλασιασμού και πολλαπλασιασμού κλάσμα σε όλα τα κύτταρα του όγκου που εξετάστηκαν, αλλά όχι των κυττάρων του προστάτη μη-όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

προστάτη που προέρχονται από κυτταρικές σειρές PNT1A (ECACC 95012614), LNCaP (DSMZ ACC 256), PC3 (DSMZ ACC 465) και DU145 (DSMZ ACC 261) ελήφθησαν από DSMZ (Braunschweig, Γερμανία) ή ECACC (Salisbury, UK) . Κάθε γραμμή διαδόθηκε και συντηρούνται σύμφωνα με τις οδηγίες του αντίστοιχου παρόχου. Ταυτότητα του κυτταρικές σειρές όγκων επιβεβαιώθηκε με έκφραση ειδικών δεικτών (PC3 Ar-, ΕΡα +, ΕΚβ +, PSA-, DD3-? DU145 Ar-, ERα-, ΕΚβ +, PSA-, DD3-? LNCaP AR +, ERα- , ΕΚβ +, PSA +, DD3 +?. Paul Thelen, Τμήμα Ουρολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Göttingen)

siRNA Οι επιμολύνσεις

η επιμόλυνση με τα siRNA (25 nM) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας είτε Lipofectamine 2000 ή Lipofectamine RNAiMAX αντιδραστήρια σε μέσο OptiMEM (Invitrogen GmbH, Καρλσρούη, Γερμανία) 24 ώρες μετά την επίστρωση. Τέσσερα διαφορετικά siRNAs σχεδιάστηκαν να στοχεύσουν κανάλι hTRPM8 χρησιμοποιώντας το HiPerformance siRNA Σχεδιασμός Αλγόριθμος (Qiagen). Οι παρακάτω ακολουθίες hTRPM8 (NM_024080) χρησιμοποιήθηκαν: TRPM8.1, tcgaatgttctcacctattaa? TRPM8.2, aaggttagattccaataaata? TRPM8.3, cagaatgttatcatactacat και TRPM8.4, ccgggacgagatggacataga.

Όλα siRNAs συντέθηκαν με Qiagen (Hilden, Γερμανία), με εξαίρεση την εμπορική αρνητικού ελέγχου # 1 και το ανθρώπινο GAPDH siRNA (Ambion, Darmstadt, Γερμανία), το οποίο χρησιμοποιήσαμε ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες αντίστοιχα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το siRNA και του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης για 6 ώρες και συλλέχθηκαν για τα πειράματα ακριβώς μετά το τέλος της διαμόλυνσης. Επιπροσθέτως, κύτταρα που κατεργάζονται μόνο με OptiMEM και το αντίστοιχο αντιδραστήριο επιμόλυνσης συμπεριλήφθηκαν ως έλεγχοι.

qPCR

Το συνολικό RNA που ελήφθη από καλλιέργειες χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Hilden, Germany) υπέστη αντίστροφη μεταγραφή ( SuperScript, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) με ολιγο-άΤ και του γονιδίου ειδικούς εναρκτήρες για hTRPM8 (5′-cttgggcaaaacacacaatg-3 ‘). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε στο πρότυπο χρησιμοποιώντας το σύστημα TaqMan σε έναν ανιχνευτή AbiPrism 7700 Sequence (Applied Biosystems, Foster City, CA) ή ένα LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germany). Τα ακόλουθα θραύσματα ενισχύθηκαν: nt 2910-3058 από NM_024080.4 αλληλουχία ανιχνεύτηκε με τον ανιχνευτή hTRPM8 (5’-FAM-tcgccatgtttggctacacggtgggcacc-TAMRA-3 ‘) και nt 1632-1732 από αλληλουχία NM_003234 ανιχνεύτηκε με τον ανιχνευτή hTFR (5 «-JOE-tgaatggctagagggatacctttcgtccc- (6-TAMRA) -3 ‘). Ο ανθρώπινος υποδοχέας τρανσφερίνης χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο ελέγχου για την ακεραιότητα του RNA και την απόδοση PCR. Σχετική ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάπαυσης (Σχετική Εργαλείο Expression Software? [34], [35])

Κυτταρομετρίας Ροής

siRNA: Μετά τη θεραπεία με siRNA, κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 6-. φρεατίων και επωάστηκαν για 24-120 ώρες πριν από τις μετρήσεις. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια διατηρούνται επί πάγου. Για μετρήσεις του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ), 0,3% σαπωνίνη και 100 U /ml ΚΝάσης. Για μετρήσεις βιωσιμότητας, μη βιώσιμα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με βαφή με 10 μg PI /ml σε PBS. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε ροή BD FACSAria κυτταρόμετρο (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). ιωδιούχο προπίδιο διεγέρθηκε στα 488 nm, και ο φθορισμός συλλέγεται χρησιμοποιώντας ένα διχροϊκό καθρέπτη 595 nm και 610/20 ζωνοπερατό φίλτρο nm (για τον κυτταρικό κύκλο) ή 655 nm διχρωματικού κατόπτρου και 695/40 ζωνοπερατό φίλτρο nm (για βιωσιμότητα) . Πύλες για βιώσιμα κύτταρα δημιουργήθηκαν από ορθοί και οι πλευρικές φάσεις διασποράς και του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (Δέντρο Αστέρι Inc., Ashland, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Εναλλακτικά, το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε απ ‘ευθείας από ΡΙ αποκλεισμός.

Για τα πειράματα με την παρουσία μενθόλης και icilin, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν για 24 έως 168 ώρες με 125-300 μΜ μενθόλη ή 10 μΜ icilin πριν από τις μετρήσεις. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν για τις μετρήσεις του κυτταρικού κύκλου και της βιωσιμότητας, όπως περιγράφεται προηγουμένως.

Imaging Ασβέστιο

Το ασβέστιο πειράματα απεικόνισης διεξήχθησαν με τον φθορίζοντα δείκτη Fura-2. Πριν από κάθε πείραμα, τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μΜ ακετοξυμεθυλεστέρα μορφή Fura-2 (Fura-δύο? Invitrogen) για 45 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από αυτό, 250 μΜ σουλφινπυραζόνη προστέθηκαν για άλλα 20 λεπτά ώστε να μπλοκάρουν την μεταφορέα ανιόν που παρεμποδίζει τη φόρτωση με Fura-δύο στις γραμμές καρκινικών κυττάρων. μετρήσεις φθορισμού έγιναν σε μια Leica (Nussloch, Γερμανία) DM IRE2 ανεστραμμένο μικροσκόπιο εξοπλισμένο με 12-bit ψύχεται κάμερα CCD (Imago QE Sensicam? ΜΕΧΡΙ Photonics, Graefelfing Γερμανία). Fura2 διεγέρθηκε στα 340 και 380 nm με Polychrome IV μονοχρωμάτορα (ΕΩΣ Photonics) και εκπεμπόμενου φθορισμού διηθήθηκε μέσω nm φίλτρο μακράς διόδου 510. Βαθμονομηθεί αναλογίες εκτέθηκαν on line στο 0,5 Hz, χρησιμοποιώντας ΜΕΧΡΙ Vision έκδοση λογισμικού 4.01 (ΕΩΣ Photonics). Τα πειράματα απεικόνισης ασβεστίου εκτελέστηκαν ταυτόχρονα με καταγραφές της θερμοκρασίας. Το διάλυμα του λουτρού, που αναφέρεται ως «διάλυμα ελέγχου», περιείχε (mM): NaCl 140, KCl 3, CaCl

2 2,4, MgCl

2 1.3, Hepes 10 και γλυκόζη 10, και ρυθμίστηκε σε ρΗ 7.4 με ΝαΟΗ.

Δοκιμασίες Πολλαπλασιασμού

ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με βάση την ικανότητα των μεταβολικά ενεργά κύτταρα για να μειώσει τα άλατα τετραζολίου σε έγχρωμα φορμαζάνη (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2 , 5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο, ΜΤΤ? Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε επίπεδου πυθμένα πλάκες των 96 φρεατίων σε πυκνότητες από το 2000 έως 5000 κύτταρα /φρεάτιο ανάλογα με την κυτταρική σειρά που εξετάστηκαν. Για τον προσδιορισμό της μεταβολικής δραστηριότητας, 10 μΐ αντιδραστηρίου ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες. Η απορρόφηση της παραγόμενης φορμαζάνης προσδιορίσθηκε σε αναγνώστη πλακός Victor2 (Wallac), χρησιμοποιώντας 570 nm και 630 nm φίλτρα διέγερσης. Για πειράματα με μενθόλη, το μέσο ανανεώθηκε κάθε 48 ώρες και οι δύο στα φρεάτια δοκιμής και ελέγχου

Επούλωση Δοκιμασία

Τα κύτταρα πρώτα καλλιεργήθηκαν σε συρροή (& gt? 90%). Σε 6- καλά πιάτα. Μια μικρή περιοχή στη συνέχεια διακόπτεται από το ξύσιμο του μονοστιβάδα με 1000 μl πλαστικό ρύγχος πιπέτας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 12, 24 ή 48 ώρες κάτω από διαφορετικές πειραματικές συνθήκες: χαμηλή ορό ή οποιοδήποτε όχημα ή μέσο που περιέχει φάρμακο. Τα κύτταρα επιθεωρήθηκαν μικροσκοπικά πάροδο του χρόνου. Το υπόλοιπο περιοχή του τραύματος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό CorelDraw και η απόσταση μετανάστευσης των κυττάρων εκτιμήθηκε με βάση τον υπολογισμό αυτό

Drugs

4- (3-χλωρο-πυριδιν-2-υλ). – πιπεραζινο-1-καρβοξυλικού οξέος (4-τριτ-βουτυλ-φαινυλ) -αμίδιο (BCTC) ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από Grünenthal AG (Aachen, Germany). [L-αργινυλ] – [Ν- [2,4-διχλωροφαιναιθυλικής] γλυκυλο] -Ν- (2,4-διχλωροφαιναιθυλικής) γλυκιναμίδιο (DD01050? (H-Arg-15-15 C σε [36]), ήταν ένα δώρο από τον Dr. Α Ferrer-Montiel (Universidad Miguel Hernández, Ισπανία) AMTB (Ν- (3-αμινοπροπυλ) -2 -. [(3-μεθυλφαινυλ) μεθοξυ] -Ν- (2-θειενυλμεθυλ) -βενζαμίδιο (1: 1) hyclate) ένα μυθιστόρημα, εξαιρετικά εκλεκτικός ανταγωνιστής TRPM8 ήταν μια γενναιόδωρη προσφορά του Δρ Stuart Bevan (King s College του Λονδίνου) JNJ41876666 (ένωση 5 στην αναφορά [37].? 3-[7-Trifluoromethyl-5-(2-trifluoromethyl-phenyl)-1

H-

benzimidazol-2-yl]-1-oxa-2-aza-spiro[4.5]dec-2-ene Υδροχλωρική,) ένας ισχυρός ανταγωνιστής TRPM8, ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο της Janssen Research & amp?.. Ανάπτυξης, LLC (Spring House, ΡΑ) Σχήμα 1 δείχνει τις χημικές δομές των φαρμάκων που χρησιμοποιούνται

Η

Στατιστική. Ανάλυση

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± SEM που λαμβάνεται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με δοκιμή Student οι τιμές Ρ υποδεικνύεται στα σχήματα με αστερίσκους κοντά στην αντίστοιχη στήλη ή σύμβολο * ρ & lt…? 0,05? ** p & lt? 0,01? *** p & lt?. 0.005

Αποτελέσματα

Ανίχνευση TRPM8 έκφρασης στις γραμμές κυττάρων του προστάτη και του προστάτη

έκφραση TRPM8 είναι πιο άφθονη σε νευρικό ιστό και του ανδρικού αναπαραγωγικού συστήματος. Προηγούμενες μελέτες περιέγραψαν την υπερέκφραση της TRPM8 σε όγκους του προστάτη και κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνο του προστάτη, ειδικά LNCaP [8]. Άλλες κυτταρικές σειρές βρέθηκαν αρνητικά σε αυτές τις αναφορές. Πιο πρόσφατα, τα κύτταρα PC3 αναφέρθηκαν ασθενώς θετικά με κηλίδα western [21]. Θέτουμε τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης της TRPM8 στην καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP, PC3 και DU145 και τη μη-καρκινική κυτταρική σειρά PNT1A από διαφορετικές προσεγγίσεις για να επεκτείνει και να συμπληρώσει τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν πριν [38].

Κατ ‘αρχάς, το περιεχόμενο TRPM8 mRNA προσδιορίστηκε με αντίστροφης-μεταγραφής πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας ανιχνευτές TaqMan σε κανονικό ανθρώπινο εγκέφαλο, του προστάτη και κυτταρικές γραμμές LNCaP, PC3, DU145 (που προέρχεται από όγκους) και PNT1A (αθανατοποιημένων μη μετασχηματισμένων προστατική κυτταρική σειρά). ακεραιότητα του RNA και την αντίστροφη μεταγραφή ελέγχθηκαν με τη χρήση του ανθρώπινου υποδοχέα τρανσφερίνης ως αναφορά για ομαλοποίηση. mRNA για TRPM8 ανιχνεύθηκε στον εγκέφαλο και του προστάτη, με μέγιστα επίπεδα στην υγιή προστάτη (δεν φαίνεται). Το μήνυμα ανιχνεύθηκε επίσης σε όλες τις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν, LNCaP, PC3, DU145 και PNT1A. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, τα επίπεδα στο μη καρκινική γραμμή PNTA1 ήταν σημαντικά χαμηλότερα από ό, τι στις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Η σχετική ποσότητα της TRPM8 μήνυμα ήταν DU145≈LNCaP & gt? PC3 & gt? PNT1A

Α (Σχήμα 2Α.).. αφθονία mRNA προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε cDNA που προέρχεται από RNA από την αναφερόμενη πηγή. Ο ανθρώπινος υποδοχέας τρανσφερίνης χρησιμοποιήθηκε ως οικιακό γονίδιο αναφοράς. RNA αφθονία εκφράζεται ως κανονικοποιημένες τιμές πάνω PNT1A. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με PNT1A. Π.Χ. κύτταρα DU145 ανταποκριθεί στο κρύο και μενθόλη. B. Διαβιβάστηκε (αριστερά) και ψευδοχρωμάτων λογομετρικό [Ca

2 +]

i εικόνες που δείχνουν ένα παράδειγμα της απόκρισης των κυττάρων DU145 σε ψυχρό (18 ° C) και μενθόλη 500 μΜ. C. [Ca

2 +]

i αποκρίσεις ενός ψυχρής και μενθόλη ευαίσθητο κύτταρο (C1) σε σύγκριση με ένα κρύο-αναίσθητη, μενθόλη-αναίσθητη κυττάρων DU145 (C2). D-F. Ανταπόκριση στο κρύο μειώνεται με TRPM8 νοκ ντάουν στα κύτταρα DU145. Ψευδοχρωματικές λογομετρικό [Ca

2 +]

i εικόνες σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA (D) ή με TRPM8.4 siRNA (Ε) στους 37 ° C (άνω πάνελ) ή 18 ° C (κάτω πάνελ). Ατομική [Ca

2 +] είναι

i απαντήσεις εκπροσωπούνται στο δικαίωμα των αντίστοιχων εικόνων. Το πλάτος και το κλάσμα των κυττάρων που ανταποκρίνονται σε κρύο ερεθίσματα είναι σαφώς μειωμένη σε TRPM8 siRNA-επεξεργασμένες καλλιέργειες. Αυτό το φαινόμενο απεικονίζεται στο ποσοτικά F.

Η

Από τα αποτελέσματα αυτά, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι TRPM8 εκφράζεται σε όλους του προστάτη κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Περαιτέρω, η πρωτεΐνη φαίνεται να σχηματίσει λειτουργικούς διαύλους. Στα χέρια μας, DU145 (Σχ. 2Β, C), LNCaP και PC3 (τα δεδομένα δεν φαίνονται) κύτταρα δείχνουν μία αύξηση του ενδοκυτταρικού Ca

2+ επίπεδα κατά τη διέγερση με μενθόλη (500 μΜ) και μέτρια ψυχρό (μείωση της θερμοκρασίας από 36 ° C έως 18 ° C), συμβατές με την λειτουργική έκφραση του TRPM8. Κρύο-προκλητά δυναμικά στα κύτταρα DU145 είχαν μειωθεί σημαντικά από siRNA που κατευθύνεται έναντι TRPM8 (Σχ. 2D-F).

Επίδραση της TRPM8 αναστολείς στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών

Τα πειράματα που περιγράφονται μέχρι στιγμής υποστηρίζουν την ιδέα ότι η έκφραση TRPM8 λαμβάνει χώρα τόσο σε φυσιολογικό προστάτη και τα καρκινικά κύτταρα. Το ερώτημα παραμένει, ωστόσο, αν η αναστολή της TRPM8 έχει παρόμοια αποτελέσματα σε όλους τους τύπους κυττάρων. Βασικός μας στόχος ήταν να ελέγξετε αν δραστηριότητα TRPM8 είναι μια γενική απαίτηση για τον πολλαπλασιασμό των διαφορετικών κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη. . Για να ελέγξετε αυτό, χρησιμοποιούνται φαρμακολογικές αναστολείς TRPM8 [39] και της τεχνολογίας siRNA

αναστολείς που χρησιμοποιούνται (Εικ. 1) ήταν κλοτριμαζόλη (ΕΚ

50 200 nM) [40]? BCTC, ενός παράγοντα αποκλεισμού των διαύλων TRPV1 [41] και του ποντικού, αρουραίου και ανθρώπου κανάλια TRPM8 (με ΕΚ

50 περίπου 0,6-1 μΜ) [13], [17], [27], [42]? θειο-BCTC, ένα λιγότερο ενεργό (ΕΚ

50 3,5 μΜ) ανάλογο της BCTC? και DD01050, ένα μυθιστόρημα αναστολέας διαύλου TRPV1 η οποία αποκλείει επίσης TRPM8 σε νευρώνες και κύτταρα ΗΕΚ293 (ΕΚ

50 περίπου 1 μΜ) [38]. Ο πολλαπλασιασμός καθορίστηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ (Εικ. 3) και την επίδραση αυτών των φαρμάκων και μια πιο εκλεκτικός ανταγωνιστής TRPM8 (βλέπε παρακάτω) για την βιωσιμότητα διανομή του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής (Σχ. 4).

η ανάπτυξη των υποδεικνυόμενων κυτταρικών σειρών παρουσία αναστολέων TRPM8. ΜΤΤ υδρόλυση, που εκφράζεται ως πολλαπλάσια αύξηση, έχει ομαλοποιηθεί σε επίπεδα σε χρόνο 0. Η κλοτριμαζόλη (συμπαγή τετράγωνα), BCTC (συμπαγείς κύκλοι), θειο-BCTC (ανοικτά τετράγωνα) και DD01050 (τρίγωνα) πάνω από 5 ημέρες του πειράματος. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν όρο 4 πειραμάτων ± SEM. *:

σ

& lt? 0,05? **:

σ

& lt? 0,01? ***:

σ

& lt? 0.005. Οι αναστολείς χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ.

Η

ιστογράμματα δείχνουν αλλαγές στην πολλαπλασιαστική κλάσμα παρουσία αναστολέων διαύλου όπως προσδιορίζεται με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου. Όλα τα φάρμακα χρησιμοποιήθηκαν σε μια συγκέντρωση 10 μΜ. Η πολλαπλασιαστική κλάσμα υπό συνθήκες ελέγχου (κύτταρα υπό αγωγή με όχημα) έχει θεωρηθεί ως το 100% του πολλαπλασιασμού.

Η

Clotrimazole είναι μια καθιερωμένη αναστολέας του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων πιθανώς μέσω πολλαπλών στόχων, συμπεριλαμβανομένης της ενδιάμεσης αγωγιμότητας ασβέστιο ενεργοποιούμενη K

+ κανάλια [43]. Στη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε (10 μΜ), η κλοτριμαζόλη παρεμπόδισε τον πολλαπλασιασμό όλων των κυτταρικών γραμμών όγκου κατά 60 έως 80% μετά από πέντε ημέρες, αλλά δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων PNT1A (Εικ. 3). BCTC στα 10 μΜ έδειξαν παρόμοια συμπεριφορά με κλοτριμαζόλη, αφού μείωσε έντονα τον πολλαπλασιασμό όλες τις κυτταρικές σειρές (50-70%), αλλά PNT1A. Τα αποτελέσματα της BCTC φαίνεται να υφίσταται, τουλάχιστον εν μέρει (βλέπε παρακάτω), μέσω της δράσης της επί TRPM8, αφού θειο-BCTC ήταν σαφώς λιγότερο αποτελεσματική σε όλες τις γραμμές που εξετάστηκαν. Κάπως εκπληκτικά, DD01050 (10 μΜ) προκάλεσε μια σημαντική αναστολή μόνο σε PC3 κυττάρων σε ένα επίπεδο συγκρίσιμο με άλλους αναστολείς, αλλά δεν δείχνουν καμία σημαντική αναστολή σε οποιαδήποτε άλλη κυτταρική γραμμή (Εικ. 3).

Η αναστολή του πολλαπλασιασμού συσχετίζεται καλά με την πολλαπλασιαστική κλάσμα το οποίο μετρήθηκε ως ποσοστό των κυττάρων σε S /G2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, η σχετική ισχύς της κάθε blocker αντικατοπτρίζεται επίσης στη μείωση της πολλαπλασιαστικής κλάσμα που προκαλείται. Κανένα από τα φάρμακα δοκιμάστηκαν αλλάξει την πολλαπλασιαστική κλάσμα των κυττάρων PNT1A. Από την άλλη πλευρά, τόσο κλοτριμαζόλη και BCTC (και τα δύο στα 10 μΜ), μειωμένη των κυττάρων σε S /G2 /M φάσεις σε όλες τις κυτταρικές γραμμές όγκου, ενώ 10 μΜ θειο-BCTC ήταν λιγότερο ισχυροί και DD01050 ήταν πιο αποτελεσματική σε κύτταρα PC3. Δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση των AMTB και JNJ41876666, νέα και εξαιρετικά εξειδικευμένοι αναστολείς TRPM8 [37], [44], σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Στα 10 μΜ, και τα δύο φάρμακα μείωσαν την πολλαπλασιαστική κλάσμα καρκινικών κυτταρικών σειρών, αφήνοντας τα κύτταρα PNT1A ανεπηρέαστη. Δεν παρατηρήσαμε καμία κυτταροτοξικές επιδράσεις των φαρμάκων στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν (δεν φαίνεται). Συλλογικά, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τους διάφορους αναστολείς είναι συνεπής με την άποψη ότι η αναστολή των αποτελεσμάτων TRPM8 σε μειωμένο πολλαπλασιασμό σε προστάτη καρκινικά κύτταρα.

Knock Down του TRPM8 Μήνυμα μειώνει τον καρκίνο του προστάτη Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

για να επιτευχθεί μια πιο άμεση συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης TRPM8 και πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε siRNA κατά TRPM8 και μετρώνται τα αποτελέσματά της επί του πολλαπλασιασμού και της διανομής του κυτταρικού κύκλου στις τρεις κυτταρικές σειρές προστάτη όγκου και του μη καρκινικές ένα. Ως θετικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε siRNA που κατευθύνεται έναντι hGAPDH. Όπως GAPDH είναι ένα ένζυμο κλειδί της γλυκόλυσης, μείωση της πρωτεΐνης αντανακλάται επί της μεταβολικής δραστηριότητας των επιμολυσμένων κυττάρων. Αυτό αποδείχθηκε για τις τέσσερις κυτταρικές σειρές με προσδιορισμούς ΜΤΤ (δεν φαίνεται) και κυτταρομετρία ροής (Εικ. 5Α).

Η επίδραση της GAPDH knockdown για την πολλαπλασιαστική κλάσμα κάθε κυτταρική γραμμή προσδιορίστηκε. Όπως ήταν αναμενόμενο, GAPDH knockdown αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό σε όλους τους τύπους κυττάρων. Β Χρονική πορεία της μείωσης των TRPM8 RNA περιεχομένου από τον προβλεπόμενο θεραπεία TRPM8 siRNA. μήνυμα TRPM8 προσδιορίστηκε στους χρόνους που υποδεικνύονται μετά τη διαμόλυνση. Σχετική αφθονία παραπέμπεται στην ποσότητα του mRNA σε χρόνο 0 και διορθώνεται για την έκφραση του υποδοχέα τρανσφερίνης σαν έλεγχος. Γ TRPM8 πρωτεΐνη νοκ ντάουν από TRPM8.3 και TRPM8.4 siRNA 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης, και η πυκνομετρική ποσοτικοποίηση σε σχέση με τον έλεγχο των siRNA παρουσιάζεται στο δεξί διάγραμμα μπάρα.

Η

Η χρήση πολλαπλών λειτουργικών siRNAs συνιστάται να εξασφαλίσουν την ιδιαιτερότητα των φαινοτυπικά αποτελέσματα που παρατηρούνται λόγω αλληλουχίες στόχευσης διαφορετικά τμήματα του μηνύματος πρέπει να έχουν ποιοτικά τα ίδια αποτελέσματα. Ποσοτικά, διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν το ίδιο γονίδιο συχνά δεν είναι εξίσου αποτελεσματική, λόγω θερμοδυναμικών ιδιοτήτων, της σταθερότητας, και την τοποθέτηση είτε των siRNAs τον εαυτό τους ή της περιοχής στόχου του γονιδίου. Ως εκ τούτου, δοκιμάζονται τέσσερις διαφορετικές siRNAs που κατευθύνονται έναντι TRPM8, τα οποία έχουν χαρακτηρισθεί TRPM8.1-4. Αυτά τα siRNAs αναγνωρίζουν χωριστό αλληλουχίες στόχους σε TRPM8 και διαφέρουν ως προς την ισχύ τους σίγηση στις διάφορες κυτταρικές γραμμές. Για να μειωθεί η πιθανότητα ανεπιθύμητων εκτός στόχου, χρησιμοποιήσαμε μία χαμηλή συγκέντρωση του siRNA (25 ηΜ) και να βελτιστοποιηθεί ο χρόνος διαμόλυνσης. Για το σκοπό αυτό, επωάσαμε κάθε κυτταρικό τύπο με εξισορροπημένη μείγμα αντιδραστήριο siRNA-επιμόλυνσης για 4, 6, 8, 12, και 24 ώρες, και παρακολουθήθηκε 24 και 48 ώρες μετά την σχετική μείωση που προκαλείται από TRPM8 TRPM8.3 και TRPM8.4 χρησιμοποιώντας PCR σε πραγματικό χρόνο? TRPM8.3 και TRPM8.4 ήταν αποτελεσματικές σε επίπεδο RNA και στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν (συμπεριλαμβανομένων PNT1A) μετά από επώαση 6 ωρών με siRNA. Έχουμε βελτιστοποιημένες επίσης το χρόνο επώασης μετά την επιμόλυνση siRNA ακολουθώντας την αφθονία του mRNA TRPM8 σε 12, 24, 72 και 120 ώρες. Για PNT1A, LNCaP και PC3 η μέγιστη μείωση του TRPM8 μήνυμα χρησιμοποιώντας TRPM8.4 siRNA παρατηρήθηκε σε 72 ώρες, ενώ DU145 έδειξε το μέγιστο αποτέλεσμα ήδη στις 48 ώρες (Σχ. 5Β). Αποσιώπηση του TRPM8 προκάλεσε μία μείωση στον πολλαπλασιασμό όπως μετρήθηκε με δοκιμασίες ΜΤΤ στα PC3 κυτταρική γραμμή. υδρόλυση ΜΤΤ σε PNT1A, DU145 και LNCaP κύτταρα δεν επηρεάστηκε προφανώς από siRNA (δεν φαίνεται). Αυτό είναι πιθανώς μια αντανάκλαση των διαφορετικών βέλτιστοι χρόνοι για RNA knockdown, διότι πρέπει κανείς να περιμένει μια μετατόπιση από αρκετές ώρες μεταξύ της μείωσης στο μήνυμά TRPM8 και τις επιπτώσεις επί του πολλαπλασιασμού, η οποία θα εξαρτηθεί από τον χρόνο διπλασιασμού και ο χρόνος που απαιτείται για την πρωτεΐνη knockdown τόσο του οι οποίες είναι διαφορετικές για κάθε κυτταρικό τύπο. Η μείωση του mRNA συσχετίζεται με σαφή μείωση της πρωτεΐνης κατά περίπου 50% σε όλες τις κυτταρικές σειρές στις 48 ώρες (Σχήμα 5C), αλλά η ατελής knockdown θα μπορούσε να εξηγήσει την έλλειψη των επιδράσεων σε ΜΤΤ υδρόλυση.

Για το λόγο αυτό , πραγματοποιήσαμε μετρήσεις της πολλαπλασιαστικής κλάσματος, το οποίο αποδείχθηκε πιο ευαίσθητο. Διαπιστώσαμε μία μείωση στο κλάσμα των κυττάρων σε S /G2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε όλες τις κυτταρικές γραμμές όγκου, αλλά παρατηρήθηκε καμία επίδραση σε κύτταρα PNT1A μη όγκου. Ένα παράδειγμα μετρήσεις κατανομής του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα DU145 φαίνεται στο Σχ. 6Α. Μια μείωση στο S και G2 κύτταρα /M φαίνεται καθαρά μετά τη θεραπεία siRNA. Το αποτέλεσμα των δύο αποτελεσματικές siRNAs ήταν διαφορετική, ανάλογα με τις κυτταρικές σειρές? PC3 και LNCaP ανταποκρίθηκαν μόνο σε μία από τις δύο αλληλουχίες (TRPM8.4, Σχ. 6Β), ενώ για DU145 αμφότερες οι αλληλουχίες ήταν αποτελεσματικά.

. Αντιπροσωπευτικά ιστόγραμμα του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με DU145 ελέγχου (κορυφή) ή hTRPM8 siRNA (κάτω). Η πολλαπλασιαστική κλάσμα (S /G2 /M) είναι σαφώς μειωμένη μετά TRPM8 νοκ ντάουν. κλάσμα Β πολλαπλασιαστικές (%) των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο ή αντι TRPM8 siRNA (αλληλουχίες 3 και 4). Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή 3-5 πειραμάτων. Γ BCTC διατηρεί ανασταλτική δράση της μετά την φίμωση της TRPM8. Κανονικοποιημένη ανάπτυξη των κυττάρων DU145 παρουσία 10 μΜ BCTC, μετά από επιμόλυνση των κυττάρων με τον έλεγχο (λευκή στήλη) ή TRPM8.4 siRNA (μαύρη στήλη). Η ανάπτυξη στην απουσία BCTC αντιπροσωπεύει το 100%.

Η

Οι επιδράσεις που παρατηρούνται στο πλαίσιο siRNA κατέστησε δυνατό να ελεγχθεί αν η αναστολή του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από φαρμακευτικούς παράγοντες διαμεσολαβείται αποκλειστικά και μόνο από τις επιπτώσεις τους στην TRPM8. Για να δοκιμάσετε αυτό, αξιολογείται κατά πόσον BCTC ήταν σε θέση να μειώσει την ανάπτυξη των κυττάρων DU145 μετά τη θεραπεία siRNA. Εάν όλα τα αποτελέσματα των BCTC έγιναν με τη μεσολάβηση TRPM8, το φάρμακο θα πρέπει να έχει μικρότερη επίδραση στον πολλαπλασιασμό μετά TRPM8 νοκ ντάουν με siRNA. Ωστόσο, BCTC (10 μΜ) ανέστειλε την αύξηση αυτής της κυτταρικής γραμμής σε παρόμοιο βαθμό μετά TRPM8 knockdown, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση της BCTC επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη δεν οφείλεται εξ ολοκλήρου στην TRPM8 αναστολής (Σχ. 6C).

προηγούμενες εκθέσεις είχε δείξει ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων LNCaP μειώνεται από την αναστολή της TRPM8 [19]. Θα μπορούσαμε να επιβεβαιώνουν αυτή την παρατήρηση, αλλά LNCaP ήταν η μόνη κυτταρική γραμμή που έδειξε αυτήν τη συμπεριφορά. Η βιωσιμότητα για PNT1A1 επίσης μειώθηκε μετά siRNA επιμόλυνση, αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν εξαρτάται από TRPM8, επειδή συνέβη σε αυτή την κυτταρική σειρά και για siRNAs ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

μενθόλη και Icilin Επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό και η βιωσιμότητα των κυττάρων του προστάτη

Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν την αντίληψη ότι η αναστολή TRPM8 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Έτσι, αποφασίσαμε να ελέγξετε αν η ενεργοποίηση της TRPM8 με μινθόλη παρήγαγε το αντίθετο αποτέλεσμα, δηλαδή, μια αύξηση στον πολλαπλασιασμό. Η μενθόλη (120 ή 300 μΜ) ή icilin (10 μΜ) προστέθηκαν στο μέσο ανάπτυξης. Κάπως παραδόξως, μενθόλη έχει περιγραφεί για τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων LNCaP [19]. Η αρχική ερμηνεία του φαινομένου αυτού είναι ότι η ενεργοποίηση του TRPM8 οδηγεί σε μια παρατεταμένη Ca

2+ εισροή που επάγει απόπτωση, αλλά η μενθόλη μπορεί να έχει εκτός στόχου αποτελέσματα σε αυτά τα κύτταρα, καθώς και [22], [45]. Δεν παρατηρήσαμε μια συστηματική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων LNCaP με την παρουσία μενθόλης, αν και υπήρξε κάποια αυξημένη θνησιμότητα σε μερικά πειράματα. Μινθόλη δεν μετέβαλε τη βιωσιμότητα των άλλων κυτταρικών γραμμών (δεν φαίνεται). ΜΤΤ και κυτταρομετρία ροής πειράματα στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές που παρέχονται ενδιαφέρουσα results.We δεν ανίχνευσε καμία σημαντική αύξηση που επάγεται από μενθόλη ή icilin υπό κανονικές συγκέντρωσης στον ορό (Εικ. 7Α). Ωστόσο, με την παρουσία του μειωμένου ορού, μόνο DU145 κύτταρα έδειξαν μια μέτρια ακόμη σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό που επάγεται από μενθόλη (Σχ. 7Β).

Η επίδραση της μενθόλης (δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις) και icilin (10 μΜ) σχετικά με την πολλαπλασιαστική κλάσμα κάθε κυτταρική γραμμή προσδιορίστηκε. Κανένα αποτέλεσμα δεν ανιχνεύθηκε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ομαλοποιούνται στη πολλαπλασιαστική κλάσμα απουσία TRPM8 ενεργοποιητών. B. Σε κύτταρα στερημένα ορού, μέτριες συγκεντρώσεις μενθόλης προκάλεσε μια αύξηση της μεταβολικής δραστηριότητας των κυττάρων DU145 μετράται με ΜΤΤ δοκιμασία. Το αποτέλεσμα ήταν ασθενέστερη σε υψηλότερες συγκεντρώσεις.

Η

Επίδραση της TRPM8 Αποκλεισμός για Επούλωση

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η δραστηριότητα TRPM8 είναι ένας σημαντικός παράγοντας που ελέγχει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [24], [46]. Ως εκ τούτου, αποφάσισε να χρησιμοποιήσει μια δοκιμασία για επούλωση της πληγής, μια κλασική μέθοδος μετεγκατάστασης για τις συνδυασμένες επιπτώσεις του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης [47], για να μελετήσει τις δράσεις των αναστολέων TRPM8 για διαταράσσεται μονοστιβάδες των LNCaP, PC3, DU145 και τα κύτταρα PNT1A. Με την παρουσία της κανονικής συγκέντρωσης ορού, όλες οι κυτταρικές σειρές μειώνεται αποτελεσματικά την περιοχή του τραύματος? Οι κυτταρικές σειρές όγκου που απαιτείται μικρότερους χρόνους για να κλείσει το τραύμα σε σύγκριση με τις μη-καρκινικές σειρές (Σχ. 8Α αριστερά, C). Επούλωση πληγών ανεστάλη σημαντικά από τους ειδικούς αναστολείς TRPM8 AMTB και JNJ41876666, σε PC3, LNCaP και κυττάρων DU145, αλλά όχι σε PNT1A (Σχήμα 8Α, C). Για την ελαχιστοποίηση των επιπτώσεων της πολλαπλασιασμού, εκτελέσαμε την ίδια ανάλυση σε όλες τις κυτταρικές σειρές σε 12 ώρες? JNJ41876666 μείωσε επούλωση τραυμάτων σε όλες τις κυτταρικές γραμμές όγκου, αλλά όχι σε PNT1A κύτταρα (Σχ. 8Β).

επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίες διεξήχθησαν επί PNT1A, LNCaP, PC3 και DU145 κυττάρων απουσία ή την παρουσία του TRPM8 αναστολείς AMTB και JNJ41876666 (10 μΜ). Α Αντιπροσωπευτικές εικόνες των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν με την παρουσία κανονικές συγκεντρώσεις ορού. Σε περίπτωση απουσίας του αποκλειστή, όλες οι κυτταρικές σειρές αποκαταστήσει αποτελεσματικά την μονοστιβάδα μετά από 24 (LNCaP και DU145) ή 48 ώρες (PNT1A? Στις 24 ώρες, δεν παρατηρήθηκε καμία ανάκτηση). Η παρουσία των αναστολέων παρεμποδίζει την επούλωση σε LNCaP, PC3 και DU145, αλλά όχι σε κύτταρα PNT1A. B. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές που έχουν ήδη 12 ώρες μετά το μηδέν. C. Ποσοτικός προσδιορισμός των αποκατασταθεί επιφάνειας από τρεις εικόνες, όπως αυτές στην Α, επί 24 ώρες σε όλες τις κυτταρικές σειρές, εκτός PNT1A (48 ώρες) παρουσία του JNJ41876666 (μαύρο) και AMTB (κόκκινο). D. Παρόμοια πειράματα σε χαμηλές συγκεντρώσεις ορού αποκάλυψε ότι PNT1A δεν μειώνει την επιφάνεια το μηδέν, ενώ τα καρκινικά κύτταρα LNCaP και PC3 (σε 3% FCS) και DU145 (σε 1% FCS) έκανε. Θεραπεία και πάλι αναστέλλεται από JNJ41876666 (10 μΜ). Ε μέντα προκάλεσε μια μικρή επιτάχυνση της επούλωσης μόνο σε κύτταρα DU145, ενώ icilin δεν έδειξε καμία επίδραση σε οποιαδήποτε από τις σειρές που ελέγχθηκαν.

Η

Σε χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό, τα κύτταρα PNT1A απέτυχε να κλείσει το τραύμα μέσα σε 48 ώρες ενώ όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του τρία μείωσε σημαντικά την επιφάνεια του τραύματος μέσα σε 24 ώρες? υπό τις συνθήκες αυτές, JNJ41876666 καθυστέρησε σημαντικά την επούλωση του τραύματος σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές, ενώ δεν είναι σε PNT1A (Εικόνα 8D)? AMTB παρήγαγε ουσιαστικά τα ίδια αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).