Αφηρημένο

Σήμερα, χρησιμοποιούνται μοντέλα τρωκτικών όγκων, συμπεριλαμβανομένων των διαγονιδιακών μοντέλων όγκων, ή υποδόρια αναπτυσσόμενους όγκους σε ποντίκια, δεν αντιπροσωπεύουν επαρκώς την κλινική του καρκίνου. Αναφέρουμε εδώ την ανάπτυξη μεθόδων για την απόκτηση ενός εξαιρετικά κλινικά ακριβή ορθού μοντέλο καρκίνου. Αυτό το μοντέλο καθιερώθηκε από ενδοορθική μεταμόσχευση ορθού καρκινικών κυττάρων ποντικού, που εκφράζουν σταθερά πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), ακολουθούμενη από την διατάραξη της επιθηλιακό κυτταρικό στρώμα του βλεννογόνου του ορθού με ενστάλαξη ενός διαλύματος οξικού οξέος. Νωρίς-στάδιο του όγκου ανιχνεύθηκε στο πρωκτικό βλεννογόνο από 6 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση. Ο όγκος στη συνέχεια έγινε επεμβατικές στον υποβλεννογόνιο ιστό. Η συχνότητα εμφάνισης όγκου ήταν 100% και ο μέσος όγκος (± SD) ήταν 1232.4 ± 994,7 χιλιοστά

3 στις 4 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση ανιχνεύονται με απεικόνιση φθορισμού. Αυθόρμητη μετάσταση λεμφαδένα και μετάσταση πνεύμονα βρέθηκαν επίσης περίπου 4 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση σε πάνω από το 90% των ποντικών. Αυτό το μοντέλο όγκου του ορθού μιμείται επακριβώς την φυσική ιστορία του καρκίνου του ορθού και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη πρώιμη ανάπτυξη όγκου, μετάσταση, και την ανακάλυψη και την αξιολόγηση των νέων θεραπευτικών για αυτή τη θεραπεία ανθεκτική νόσο

Παράθεση:. Kishimoto Η, Momiyama Μ, Aki R, Kimura Η, Σουετσούγκου Α, Μπουβέ M, et al. (2013) Ανάπτυξη Κλινικά-Ακριβής Mouse Μοντέλο καρκίνου του ορθού. PLoS ONE 8 (11): e79453. doi: 10.1371 /journal.pone.0079453

Επιμέλεια: Ματθαίος, το Πανεπιστήμιο του Stanford, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Αυγούστου του 2013? Δεκτές: 1 του Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 του Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Kishimoto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από Νέους επιστήμονες (Β), το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία (HK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Hiroyuki Kishimoto, Masashi Momiyama, Ryoichi Aki, Hiroaki Kimura, Atsushi Σουετσούγκου ήταν πρώην συνεργάτες των αντικαρκινικών Inc. Robert M. Hoffman είναι ένας μη μισθωτών θυγατρική αντικαρκινικών Inc. AntiCancer Inc. εμπορεύεται ζωικά μοντέλα καρκίνου. Δεν υπάρχουν άλλα ανταγωνιστικά συμφέροντα. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Ετεροτοπική μοντέλα εμφύτευσης όπως υποδόρια εμφυτεύματα όγκου σε ποντίκια έχουν παραδοσιακά χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση της θεραπείας κατά του όγκου, λόγω της επαναληπτικότητα και η παρακολούθηση του σχηματισμού του όγκου τους. Ωστόσο, ετεροτοπική μοντέλα δεν έχουν αντίστοιχη μικροπεριβάλλοντα όγκου (TME) [1].

Γενετικά τροποποιημένα μοντέλα ποντικών του καρκίνου συνήθως απαιτούν πολύ χρόνο για να αναπτύξουν όγκους και είναι απρόβλεπτη όσον αφορά τη συχνότητα, την ώρα και την τοποθεσία πρωτογενών όγκων και ακόμη πιο απρόβλεπτο όταν και όπου λαμβάνει χώρα μετάσταση. Δεδομένου ότι η ανάπτυξη των όγκων στα ζώα αυτά είναι σπάνια σύγχρονη, μια μεγάλη ομάδα των ζώων πρέπει να στεγάζονται, προκειμένου να προετοιμαστεί για επαρκή αριθμό των ζώων σε κατάλληλα στάδια του καρκίνου. Πρέπει Μεγάλοι αριθμοί ζώων που εξετάζονται επί μακρές χρονικές περιόδους για την αξιολόγηση της θεραπείας του καρκίνου, και μόνο η επιβίωση χρησιμοποιείται συχνά ως ένα τελικό σημείο, λόγω της δυσκολίας της παρακολούθησης όταν εμφανίζονται όγκων σε εσωτερικά όργανα [2].

Αρκετές έχουν τα είδη των μοντέλων που χρησιμοποιούν ορθοτοπική εμφύτευση όγκων έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί για να διερευνήσει κυρίως κατά του όγκου φάρμακο αποτελεσματικότητα [3]. Σε αυτά τα μοντέλα, είναι είτε καρκίνος εναιωρήματα κυττάρων εγχέεται θραυσμάτων ορθοτοπική όργανο ή ιστό όγκου ράβονται στο αντίστοιχο όργανο [4], [5] με εμφύτευση των τεμαχίων ιστού που έχει αποδειχθεί ότι είναι πιο ακριβής [5], [6] . Όσον αφορά παχέος μοντέλα καρκίνου, έχουν καθιερωθεί οι όγκοι σε ιστούς υποβλεννογόνια ή στην κολονική ορογόνο, αλλά όχι πάνω στην επιφάνεια του βλεννογόνου από το οποίο οι όγκοι πράγματι να προκύψουν σε ασθενείς.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διαπιστωθεί μια » αληθινό «κλινικά ακριβής ορθοτοπικό ορθού μοντέλο στο οποίο οι όγκοι αρχίζουν να σχηματίζονται στον βλεννογόνο ιστό του ορθού.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

Η κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου ποντίκι CT26 και το ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική σειρά HCT-116 καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. CT26 είναι μια Ν-νιτροζο-Ν-methylurethane- (NNMU) επαγόμενη αδιαφοροποίητο κύτταρο καρκινώματος κόλου γραμμή ποντικού [7]. HCT-116 προήλθε από ένα πρωτογενή ανθρώπινα δείγμα καρκίνου του παχέος εντέρου [8].

GFP και RFP διάνυσμα

παραγωγή

Ο Plein ρετροϊικός φορέας (Clontech), εκφράζοντας ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και το γονίδιο αντίστασης νεομυκίνης για το ίδιο δισιστρονικό μήνυμα, χρησιμοποιήθηκε ως φορέας έκφρασης GFP. ΡΤ67, ένα ΝΙΗ3Τ3 που προέρχεται κυτταρική γραμμή συσκευασίας, που εκφράζουν την ιικού φακέλου 10 ΑΙ, αγοράστηκε από την Clontech Laboratories, Inc. κύτταρα ΡΤ67 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Για την παραγωγή φορέα GFP, κύτταρα συσκευασίας ΡΤ67, σε 70% συρροή, επωάστηκαν με ένα καταβυθισμένο μίγμα αντιδραστηρίου ϋΟΤΑΡ ™ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana), και ποσότητες κορεσμού του Plein πλασμίδιο για 18 ώρες. Φρέσκο ​​μέσο αναπληρώθηκε αυτή τη στιγμή. Τα κύτταρα εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού 48 ώρες μετά την μεταγωγή. Για την επιλογή, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία 500-2.000 μg /ml του G418 (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη) για 7 d. Το απομονωμένο κύτταρο συσκευασίας κλώνος ονομάσθηκε ΡΤ67-GFP [9] – [12].

Για την παραγωγή RFP ρετροϊό, ο

Hind

III /

Δεν

θραύσμα από pDsRed2 (Clontech), που περιέχει το cDNA RFP πλήρους μήκους, εισήχθη εντός του

Hind III

/

Δεν

Ι θέση του pLNCX2 (Clontech) που περιέχει το γονίδιο αντοχής νεομυκίνης. κύτταρα ΡΤ67 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Για την παραγωγή φορέα, τα κύτταρα ΡΤ67 συσκευασίας, σε 70% συρροή, επωάστηκαν με ένα καταβυθισμένο μίγμα αντιδραστηρίου LipofectAMINE (Life Technologies) και ποσότητες κορεσμού του pLNCX2-DsRed2 πλασμίδιο για 18 ώρες. Φρέσκο ​​μέσο αναπληρώθηκε αυτή τη στιγμή. Τα κύτταρα εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού 48 ώρες μετά την μεταγωγή. Για την επιλογή ενός κλώνου που παράγει υψηλές ποσότητες φορέα RFP ρετροϊικού (ΡΤ67-DsRed2), τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία 200 έως 1000 μg /mL G418 (Life Technologies) για 7 d. Το απομονωμένο κύτταρο συσκευασίας κλώνος ονομάσθηκε ΡΤ67-DsRed2 [9] – [12].

GFP και RFP γονίδιο μεταγωγή των κυτταρικών σειρών καρκίνου

Για GFP και μεταγωγή γονίδιο RFP, τα καρκινικά κύτταρα ήταν επωάστηκαν με ένα 1: 1 μίγμα καταβυθίστηκε ρετροϊικών υπερκειμένων του ΡΤ67-GFP ή κύτταρα ΡΤ67-DsRed2 και RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS για 72 ώρες. Φρέσκο ​​μέσο αναπληρώθηκε αυτή τη στιγμή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τρυψίνη /ΕϋΤΑ 72 ώρες μετά την μεταγωγή και υποκαλλιεργήθηκαν με αναλογία 1:15 σε επιλεκτικό μέσο, ​​το οποίο περιείχε 200 μg /ml G418. Το επίπεδο G418 αυξήθηκε έως και 800 μg /ml με σταδιακό τρόπο. Οι κλώνοι που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του GFP ή RFP απομονώθηκαν με κυλίνδρους κλωνοποίησης (Bel-Art Products) με τη χρήση θρυψίνης /ΕϋΤΑ και ενισχύεται με συμβατικές μεθόδους καλλιέργειας εν τη απουσία του επιλεκτικού παράγοντα [9] – [12].

Ποντίκια

Γυμνό

nu /nu

ποντίκια (AntiCancer, Inc., San Diego, CA) διατηρήθηκαν σε εγκατάσταση φράγμα AntiCancer, Inc., υπό φιλτραρίσματος HEPA και τρέφονται με δίαιτα αυτόκαυστες εργαστηριακά τρωκτικά (Tecklad LM-485, Western Research Products, Orange, CA). Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν διεξαχθεί με ένα Φροντίδα Ζώων και Χρήση Επιτροπή AntiCancer Θεσμικών (IACUC) -Πρωτόκολλο ειδικά εγκεκριμένο για αυτή τη μελέτη και σύμφωνα με τις αρχές και τις διαδικασίες που περιγράφονται στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων με αριθμό Διασφάλισης A3873-1. Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν υπό αναισθησία χρησιμοποιώντας υποδορίως χορήγηση ενός μίγματος κεταμίνης (10 μl κεταμίνη HCL, 7.6 μλ ξυλαζίνη, 2,4 μΙ ακεπρομαζίνη μηλεϊνικό, και 10 μΙ PBS).

νεστίνη οδηγείται πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (ND-GFP) γυμνοί ποντικοί

εξετάστηκε Αλληλεπίδραση του όγκου CT26-RFP και υποδοχής ND-GFP-κύτταρα που εκφράζουν στην πρωκτική βλεννογόνο. κύτταρα CT26-RFP είχαν μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά σε ND-GFP γυμνούς ποντικούς [13] με τις μεθόδους που περιγράφονται παρακάτω. Δέκα ημέρες μετά την μεταμόσχευση του όγκου, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο ορθοπρωκτική αποκόπηκε. Όγκου και αλληλεπίδραση κυττάρου ND-GFP παρατηρήθηκε με το σύστημα απεικόνισης OV100

Η διακοπή της πρωκτικής βλεννογόνου φράγματος

Η πρωκτική φράγμα βλεννογόνου ήταν χημικά διαταράχθηκε με την ακόλουθη διαδικασία:. Μετά αναισθητοποιήθηκαν ποντίκια, ένας καθετήρας πολυαιθυλενίου εισήχθη εντός του ορθού αυλό μέσω του πρωκτού. Οι πρωκτική κοιλότητα πλύθηκε με 6 ml PBS για να καθαρίσει τα περιεχόμενα του εντέρου. Οι ορθού αυλός ήταν διεσταλμένες με εισαγωγή ενός αναστολέα στην περιοχή ορθοπρωκτικής, και στη συνέχεια το βλεννογόνο του ορθού ήταν καλά εμποτισμένο με διάλυμα οξικού οξέος 4% για δύο λεπτά, ακολουθούμενη από έκπλυση με 6 ml PBS (Εικ. 1).

(α) Κανονική εμφάνιση του πρωκτού ποντικιού. μπαρ κλίμακα, 1 mm. (Β) Retractor κατασκευασμένο από ένα σωλήνα στάγδην έγχυση. (Γ) Ο αυλός ορθοπρωκτικής ήταν διεσταλμένες με εισαγωγή του αναστολέα στην ορθοπρωκτική και ενστάλαξε με ένα διάλυμα οξικού οξέος. (Γ1) Πριν από την παρασκευή οξικού οξέος. (Γ2) Το χρώμα του βλεννογόνου του ορθού άλλαξε από κοκκινωπό ροζ σε λευκ μετά τη θεραπεία με διάλυμα οξικού οξέος. m = βλεννογόνο του ορθού. μπαρ κλίμακα, 1 mm. (Δ) Η ιστολογική εξέταση μόλις μετά την αγωγή οξικό οξύ έδειξε ότι το επιθηλιακό κυτταρικό στρώμα του βλεννογόνου του ορθού ήταν τραυματισμένη. (Δ1) Η & amp? Το τμήμα Ε της κανονικής ορθοπρωκτικής. Μια επιθήλιο = επιφάνεια? Β = βλεννογόνου? C = μυϊκού χιτώνα του βλεννογόνου? D = υποβλεννογόνιο? E = muscularis εξωτερική. (D2) Μετά την επεξεργασία οξικό οξύ. Σημειώστε ότι μόνο το άνω τμήμα του βλεννογόνου διαταράσσεται. Top, × 40 μεγέθυνσης? κάτω, × 100 μεγέθυνση.

Η

ενδορθικές ενστάλαξη του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων και εξέταση για το σχηματισμό όγκων

Αμέσως μετά την διακοπή του ορθού φράγμα του βλεννογόνου, τα κύτταρα CT26-GFP (2.0 × 10

6) σε 50 μΙ Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA), εισήχθησαν και ενσταλάχθηκαν στην πρωκτική βλεννογονική επιφάνεια με μια βελόνα 28-Gage παρεμβάλλεται 4 mm από το πρωκτικό δακτύλιο. Η πρωκτό σφραγίστηκε, κρατώντας τον αναστολέα στο ορθό, με πλαστική ταινία αμέσως μετά την ενστάλαξη των καρκινικών κυττάρων για την πρόληψη της διαρροής των κυττάρων. Η σφράγιση πλαστική ταινία και ο αναστολέας στο ορθό αφαιρέθηκαν από τους ποντικούς μετά ανακτήθηκε από την αναισθησία. Μετά την εμφύτευση καρκινικού κυττάρου, μη επεμβατική παρακολούθηση με το μικρό σύστημα OV100 Ζώων Imaging [14] ή το μικροσκόπιο φθορισμού MVX-10 [15] (και τα δύο από την Olympus, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό εμφυτευμένα καρκινικά κύτταρα. Στη συνέχεια, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία για να διερευνήσουν πιθανές μετάσταση και για τις ιστολογικές μελέτες. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με την ακόλουθη εξίσωση: Ο όγκος του όγκου (mm

3) = μήκος (mm) χ πλάτος (mm) χ βάθος (mm) × 0.5 [16]

φθορισμού οπτικής απεικόνισης. και επεξεργασία

το μικροσκόπιο OV100 Σύστημα απεικόνισης και MVX-10 φθορισμού χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση φθορισμού του αυξανόμενου όγκου. εικόνες υψηλής ανάλυσης συνελήφθησαν απευθείας σε έναν υπολογιστή και αναλύονται με το λογισμικό CellR (Όλυμπος-Biosystems, Melville, ΝΥ) [14].

Η ιστολογική εξέταση

Μετά την ευθανασία ποντίκια, το ορθό ήταν άνοιξε διαμήκως και επιθεωρήθηκαν για την παρουσία όγκων. Το αποκομμένο ορθού όγκου συνέχεια ενσωματώνονται σε μέσο, ​​κατεψυγμένα και χωρισμένο σε 7 μm με κρυοστάτη κατάψυξη. Διαφάνειες παρατηρήθηκαν φθορισμού των κυττάρων του όγκου και στη συνέχεια εξετάζεται στο μικροσκόπιο με χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη.

Αποτελέσματα

Η διακοπή του φράγματος βλεννογόνου του ορθού

Το φράγμα του βλεννογόνου του ορθού άτριχων ποντικών διακόπηκε με κατεργασία του βλεννογόνου με διάλυμα 4% οξικού οξέος (Σχ. 1 a-c). Δεν υπήρξαν θάνατοι ή έκδηλη τοξικότητα που σχετίζονται με αυτή τη διαδικασία. Η ιστολογική εξέταση αποκάλυψε ότι το επιθηλιακό κυτταρικό στρώμα του βλεννογόνου του ορθού διαταράχθηκε και αποφλοιωμένες μετά τη θεραπεία οξικό οξύ (Σχ. 1 d). Το βλεννογόνο ιστό ήταν πλέον έτοιμο να δεχτεί τα καρκινικά κύτταρα.

ορθοτοπική εμφύτευση κυττάρων CT26-GFP

Αμέσως μετά τη χημική διάσπαση του ορθού φραγμού βλεννογόνου, CT26-GFP ποντικού ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα μικτή σε Matrigel, εισήχθησαν στην πρωκτική κοιλότητα. Ο πρωκτός σφραγίστηκε με πλαστική ταινία μετά την πλήρωση του ορθού αυλό με το εναιώρημα καρκινικού κυττάρου, η οποία διασφάλισε ότι τα καρκινικά κύτταρα παρέμειναν στο βλεννογόνο του ορθού κατά τη διάρκεια της αναισθησίας. Ο συνολικός χρόνος διαδικασίας ήταν περίπου 15 λεπτά ανά ποντικό, και δεν υπήρχαν επιπλοκές ή θανάτους που συνδέονται με τα δύο οξικό οξύ θεραπεία και τον καρκίνο-κυττάρων εμφύτευση.

Μετά την εμφύτευση καρκινικού κυττάρου, οι ορθού αυλός ήταν μη επεμβατικά εξετάστηκε με τις MVX-10 μικροσκόπιο φθορισμού ή OV100 μικρό σύστημα απεικόνισης των ζώων (Σχ. 2α). Τα κύτταρα CT26-GFP στο πρωκτικό βλεννογόνο μπορεί να απεικονιστεί εύκολα με GFP φθορισμό αρχίζοντας 6 ημέρες μετά την εμφύτευση, το αργότερο. Η συχνότητα εμφάνισης του ορθού όγκων στο πρωκτικό βλεννογόνο ήταν 100%. Ούτε ενστάλαξη μόνος καρκινικά κύτταρα ή θεραπεία οξικό οξύ μόνο ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ενός ορθού όγκου.

(α) το ορθό απεικονίστηκε μη επεμβατικά 10 ημέρες μετά την εμφύτευση. Αριστερά, παρατήρηση φωτεινού? μέση, CT26-GFP όγκοι αναπτύσσονται στο πρωκτικό βλεννογόνο ήταν σαφώς ορατή υπό παρατήρηση φθορισμού? δεξιά, η ταυτόχρονη παρατήρηση κάτω από έντονο φως και απεικόνιση φθορισμού. μπαρ κλίμακα, 500 μm. (Β) Μετά λαπαροτομία, το ορθό ανοίχθηκε κατά μήκος από το πρόσθιο τοίχωμα. Αριστερά, ακαθάριστο εμφάνιση της κοιλιακής κοιλότητας. μπαρ κλίμακα: 10 χιλιοστά? μέση, λεπτομέρεια της εγκιβωτίζονται περιοχής? δεξιά, η ταυτόχρονη παρατήρηση κάτω από έντονο φως και το φθορισμό. Η θέση του σχηματισμού όγκων ήταν περιορισμένη στην οπισθίου τοιχώματος του τερματικού ορθού. Κόκκινη γραμμή, η κατεύθυνση της πρωκτικής διατομής του (γ). Λευκή γραμμή, η κατεύθυνση της όγκου διατομής του (δ). μπαρ κλίμακα, 2 mm. (Γ) Η ιστολογική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι GFP-θετικά βλάβες ήταν αδενοκαρκινώματα μυελοειδούς τύπου χωρίς αδενικό δομές. Αριστερά, ανίχνευση φθορισμού των όγκων σε μια παγωμένη τμήμα? μέση, GFP-θετικούς όγκους έδειξαν υψηλή κυτταροβρίθεια και επιβεβαιώθηκαν ως όγκοι αυξάνονται στο στρώμα βλεννογόνου του ορθού? δεξιά, συγχωνεύονται εικόνα της H & amp? Ε ιστολογική τομή και ανίχνευση φθορισμού. Σημειώστε ότι τα καρκινικά κύτταρα εντοπίσει μόνο στο στρώμα του βλεννογόνου του ορθού. αδενοκαρκινώματα (d1-3) CT26 μυελοειδούς τύπου κατακλύζουν το στρώμα υποβλεννογόνια πέρα ​​από τα όρια του μυϊκού χιτώνα του βλεννογόνου (κεφάλια κόκκινο βέλος). T = όγκου. Τα μαύρα κεφάλια βέλους, μυϊκού χιτώνα του βλεννογόνου. (Ε) Ιστολογική εμφάνιση του μυελώδους τύπου αδενοκαρκίνωμα του ανθρώπου. Πράσινο αιχμές βελών δείχνουν άκρη του όγκου [23].

Η

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2b, η θέση του σχηματισμού όγκων ήταν περιορισμένη στο οπίσθιο τοίχωμα του τερματικού ορθού. Αυτός ο περιορισμός του σχηματισμού όγκων μπορεί να οφείλεται σε επιτρέποντας την αναστολή καρκινικού κυττάρου να έρθει σε επαφή μόνο το διασπασμένο ραχιαία βλεννογόνο του ορθού.

Σε 10 ημέρες μετά την εμφύτευση, φθορισμού μικροσκοπία κατεψυγμένων τμημάτων και ιστολογικές αναλύσεις έδειξαν ότι οι όγκοι ήταν αυξάνεται στο στρώμα βλεννογόνου με παρόμοιο τρόπο με την ανθρώπινη μυελικό καρκίνωμα κόλου (Σχ. 2c-e). Γύρω από αυτό το διάστημα, τα κύτταρα CT26-GFP εισβάλλουν στο στρώμα υποβλεννογόνια, πέρα ​​από τα όρια του μυϊκού βλεννογόνου, ανιχνεύθηκαν επίσης (Σχ. 2δ).

Όλοι οι ποντικοί είχαν τελικά μόνο μία όγκος σχηματίζεται στο πρωκτικό βλεννογόνο , και το μέγεθος του όγκου αυξήθηκε σταδιακά με την πάροδο του χρόνου (Σχ. 3α). Δεδομένου ότι οι όγκοι του ορθού πρόπτωση μέσω του πρωκτού όταν έφτασαν περίπου 3 mm σε μέγεθος και στη συνέχεια αυξήθηκε έξω από τον πρωκτό, δεν ορθού εμπόδιο κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου παρατήρησης σε οποιοδήποτε από τα ποντίκια (Σχ. 3β).

(α) Όλες οι ποντικοί είχαν τελικά μόνο μία όγκος σχηματίζεται στο βλεννογόνο του ορθού. Το μέγεθος του όγκου αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου. (Β) Prolapsed CT26 ορθού όγκου αυξάνεται έξω από τον πρωκτό σε 4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση (κεφαλές κόκκινο βέλος). Λευκό σωλήνας εισάγεται στο ορθό (λευκό βέλος) δείχνει ότι το πέρασμα ορθοπρωκτικής είναι καλά διατηρημένα, και δεν υπάρχει κανένα εμπόδιο. Κλίμακα bar, 10 χιλιοστά

Η

Στις 4 εβδομάδες μετά την ενστάλαξη των καρκινικών κυττάρων, ο μέσος όγκος του όγκου (μέσος όγκος ± SD) ανήλθαν σε 1.232,4 ± 994,7 χιλιοστά

3 (Εικ. 3α), και αυθόρμητες μεταστάσεις λεμφαδένων ανιχνεύθηκαν με υψηλή εμφάνιση (Εικ. 4). Η μεταστατική ποσοστό έως το ουραίο μεσεντερικά λεμφαδένα (κατώτερα μεσεντερίων λεμφαδένων σε ανθρώπους) [17], [18], η οποία είναι μια περιφερειακή λεμφαδένα σε καρκίνο του ορθού, ήταν 90,9%. Μετάσταση στα παρα-αορτικής λεμφαδένες ήταν 54,5% (Πίνακας 1). Η αυθόρμητη μετάσταση πνεύμονα ανιχνεύθηκε επίσης σε 91.8% των ποντικών (Εικ. 5). Ωστόσο, μόνο το 9% των ποντικών (1/11) είχαν μετάσταση στο ήπαρ (Πίνακας 2).

(α) Σχηματικό διάγραμμα της ανατομίας στο (β). Το ουραίο μεσεντερικών λεμφαδένων στην προέλευση του ουραίου μεσεντερίου αρτηρίας. Αυτό λεμφαδένα είναι ισοδύναμη με την κατώτερη μεσεντερική λεμφαδένα σε ανθρώπους. μπαρ κλίμακα, 2 mm. (Β1) Ουραίο μεσεντερικών λεμφαδένων κάτω από έντονο φως παρατήρησης. (Β2) GFP φθορισμός του ουραίου μεσεντερικών λεμφαδένων σε (Β1), υποδεικνύοντας ότι η λεμφαδένα περιείχε μια μετάσταση. μπαρ κλίμακα, 2 mm. (Γ) Δύο παρα-αορτικής λεμφαδένες (κόκκινο και κίτρινο βέλη) ταυτοποιήθηκαν σε άλλο ποντίκι. Λευκό βέλος δείχνει μετάσταση ουραίο μεσεντερικών λεμφαδένων. μπαρ κλίμακα, 2 mm. (Δ) Υψηλότερη μεγέθυνση παρατήρηση ενός παρα-αορτικής λεμφαδένα υποδεικνύεται με κόκκινο βέλος στο (γ). GFP φθορισμός ενός μικρο-μετάσταση ανιχνεύθηκε (λευκά βέλη). μπαρ κλίμακα, 1 mm.

Η

(α) μακροσκοπική εμφάνιση του πνεύμονα. Lung μεταστατικές εστίες ανιχνεύθηκαν με φθορισμό GFP. μπαρ κλίμακα, 2 mm. (Β) Η μακροσκοπική εμφάνιση του ήπατος. απεικόνισης φθορισμού ανιχνεύεται έκφραση GFP του CT26-GFP μεταστάσεις ήπατος (κόκκινα βέλη). μπαρ κλίμακα, 10 mm.

Η

Η

Σε περίπου 4 εβδομάδες, τα ποντίκια έδειξαν καχεκτικός συμπτώματα και έπρεπε να θυσιαστούν λόγω του μεγέθους του όγκου.

Η αγγειογένεση του ορθού ποντικιού όγκου ορθοτοπικά εμφυτεύονται σε ND-GFP γυμνούς ποντικούς

RFP-κύτταρα που εκφράζουν CT26 είχαν ορθοτοπικά εμφυτεύεται στην ορθό νεστίνης καθοδηγείται GFP (ND-GFP) γυμνά ποντίκια με τις μεθόδους που περιγράφονται παραπάνω. Δέκα ημέρες μετά την εμφύτευση, ND-GFP που εκφράζουν εν τω γεννάσθαι αιμοφόρα αγγεία οπτικοποιήθηκαν να αυξάνονται μέσα στο RFP εκφράζουν CT26 ορθού όγκων στο γυμνό ποντίκι ND-GFP (Εικ. 6).

(α) όγκου CT26-RFP αυξάνεται στο βλεννογόνο του ορθού της ΝΔ-GFP γυμνά ποντίκια (λευκό βέλος κεφάλια). Κόκκινη γραμμή, η κατεύθυνση του ορθού όγκου διατομής του (β). μπαρ κλίμακα, 2 mm. (Β) Η διατομή του ορθού όγκου. Φωτεινότητα παρατήρηση φως. μπαρ κλίμακα, 2 mm. (Γ) Fluorescence παρατήρηση του (β). μπαρ κλίμακα, 2 mm. (Δ) Λεπτομέρειες του εγκιβωτίζονται περιοχή στο (γ). Υποδοχής που προέρχονται από ΝΔ-GFP που εκφράζουν τα αιμοφόρα αγγεία έγιναν ορατά στο RFP εκφράζουν CT26 ορθού όγκου στο ND-GFP nude ποντίκι (λευκά βέλη). Ράβδος κλίμακας, 200 μm.

Η

σχηματισμός όγκου με πρωκτική ενστάλαξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων σε γυμνά ποντίκια

Η εφαρμογή αυτής της μεθόδου εμφύτευσης αξιολογήθηκε με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Με την ίδια τεχνική, ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου HCT-116-RFP σχηματίζονται επίσης από το ορθό όγκων σε γυμνά ποντίκια.

Συζήτηση

Κλινικά-ακριβή μοντέλα ζώων στα οποία οι όγκοι προκύπτουν από πρώιμο στάδιο και αργότερα γίνει επεμβατική και μεταστατικό θα είναι μεγάλης αξίας με σκοπό την πρόγνωση της κλινικής έκβασης για τη θεραπεία του καρκίνου με μεγαλύτερη ακρίβεια. Λίγοι διαγονιδιακά μοντέλα του διηθητικού καρκίνου του παχέος εντέρου υπάρχουν [4]. Η

Αρο

μοντέλο Min +/- ποντίκι συνήθως αναπτύσσουν αδενώματα αλλά όχι επεμβατική αδενοκαρκινώματα [19]. Επιπλέον, η ανάπτυξη του όγκου σε γενετικά τροποποιημένα ποντίκια είναι σπάνια σύγχρονη, γεγονός που καθιστά δύσκολη την παρασκευή επαρκών αριθμών ζώων σε κατάλληλα στάδια για την αξιολόγηση της θεραπείας του καρκίνου [2].

Έχει αποδειχθεί ότι ορθότροπων εμφύτευση επιτρέπει την ανάπτυξη και μεταστατικό δυναμικό των μεταμοσχευμένων όγκων να εκφράζονται και να αντικατοπτρίζει την κλινική του καρκίνου [5], [20]. Πολλά παχέος μοντέλα καρκίνο απασχολούν ορθότροπων εμφύτευση έχουν επίσης αναφερθεί. Ωστόσο, σε αυτά τα μοντέλα, είτε ένα καρκινικό κύτταρο εναιώρημα εγχύθηκε στο στρώμα υποβλεννογόνιο του παχέος εντέρου [4], [5], [21], ή θραύσματα ιστό όγκου ήταν απλά ράβονται στο ορογόνο του παχέος εντέρου. Σε αυτά τα μοντέλα, οι όγκοι αναπτύσσονται στους ιστούς υποβλεννογόνια αφήνοντας το βλεννογόνο (η οποία είναι η πραγματική καταγωγή του καρκίνου του παχέος εντέρου) ανέπαφα ή από την αρχή όγκοι αναπτύσσονται μόνο στην επιφάνεια ορογόνο, το οποίο είναι ισοδύναμο με προχωρημένο στάδιο καρκίνου του παχέος εντέρου στην κλινική.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να δημιουργηθεί μια κλινικά ακριβή ορθοτοπικό παχέος μοντέλο στο οποίο οι όγκοι αρχίζουν να σχηματίζονται στον βλεννογόνο ιστό. Υποθέσαμε ότι η ακριβής ορθοτοπική εμφύτευση θα μπορούσε να επιτευχθεί με χημική διάσπαση της επιφάνειας του βλεννογόνου φράγματος του ορθού και επακόλουθη εγκατάσταση των καρκινικών κυττάρων CT26.

φθορισμό σημασμένο καρκινικών κυττάρων [22] ενεργοποιημένη εξαιρετικά ευαίσθητη, σε πραγματικό χρόνο, και μη επεμβατική ανίχνευση πολύ πρώιμου σταδίου καρκίνο στο βλεννογόνο του ορθού και μικρο-μεταστατικές εστίες στους λεμφαδένες και στον πνεύμονα, που θα ήταν κανονικά μη ανιχνεύσιμη σε ζωντανό ιστό ή ακόμα και ιστολογική εξέταση [20].

Η τοποθεσία σχηματισμού πρωτογενούς όγκου περιορίστηκε στο οπίσθιο τοίχωμα του τερματικού ορθού, η οποία είναι το πιο βολικό σημείο παρατήρησης στο παχέος εντέρου ποντικού. Η επαναληψιμότητα της θέσης του όγκου επιτρέπεται ευκολότερη και πιο εστιασμένη μη επεμβατική εξέταση πάροδο του χρόνου. Η ιστολογική εμφάνιση του όγκου ήταν πολύ παρόμοια με ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου που ταξινομούνται ως αδιαφοροποίητο ή μυελοειδές τύπου αδενοκαρκίνωμα [23].

μεταστάσεις λεμφαδένα και μετάσταση πνεύμονα ανιχνεύθηκαν στα ποντίκια εμφυτευμένα με τα κύτταρα CT26-GFP με υψηλή συχνότητα, η οποία θα μπορούσε να θεωρηθεί ως «αληθινό» αυθόρμητη μετάσταση, δεδομένου ότι σε αυτή τη μέθοδο είναι εξαιρετικά απίθανο ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να εισαχθούν άμεσα στο φλεβικό ή λεμφική κυκλοφορία τεχνητά κατά τη στιγμή της εμφύτευσης [4]. Αν και το ήπαρ είναι ένα πιο κοινή μεταστατική θέση του ορθοκολικού καρκίνου, μετάσταση ήπατος βρέθηκε μόνο στο 9% των ποντικών (1/11) σε αυτό το μοντέλο. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι σε αυτό το μοντέλο, οι όγκοι σχηματίζουν στο κατώτερο τμήμα του ορθού, αίμα από το οποίο αποστραγγίζεται στη συστημική φλεβική κυκλοφορία δεσπόζει πάνω από την πύλη φλεβική κυκλοφορία [24]. Ορθού καρκίνος είναι πιο πιθανό από καρκίνο του παχέος εντέρου να οδηγήσει σε μεταστάσεις πνεύμονα χωρίς ηπατικές μεταστάσεις στην κλινική [24].

Σε αντίθεση με το μοντέλο τυφλού εντέρου ένεση, το μοντέλο αυτό δεν απαιτεί λαπαροτομία, μέσω των οποίων τα ανεπιθύμητα περιτοναϊκή διάχυση προκαλείται από καρκινικά κύτταρα διασπώνται κατά τη στιγμή της μεταμόσχευσης [4]. Η τρέχουσα μέθοδος εφαρμόζεται επίσης σε ξενιστές ανοσοεπαρκείς με καρκινικές κυτταρικές σειρές προέλευσης του ποντικιού και θα είναι κατάλληλο για μελέτες ανοσολογίας των όγκων.

ND-GFP γυμνά ποντίκια, η έκφραση GFP είναι υπό τον έλεγχο του του προαγωγού νεστίνη [13], [25] στην οποία προέρχονται από ξενιστή ND-GFP που εκφράζουν αιμοφόρα αγγεία οπτικοποιήθηκαν στην πρωκτική όγκους πρώιμο στάδιο σχηματίζονται από κύτταρα CT26-RFP.

Για τις γνώσεις μας, αυτό είναι το πρώτο μοντέλο, ότι μπορεί αξιόπιστα να παρέχει αληθινά ορθοτοπικό καρκίνο του ορθού αυξάνεται στις βλεννογόνους ιστούς, και αργότερα να προκαλέσει την αυθόρμητη λεμφαδένα και μετάσταση πνεύμονα, η οποία είναι εύκολα ανιχνεύσιμες με GFP φθορισμό με υψηλή ευαισθησία. Αυτό το μοντέλο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη πρώιμα γεγονότα στην ανάπτυξη του όγκου ή την αξιολόγηση ενδοαυλική παραγόντων (διαιτητικές ενώσεις, χολικών οξέων, εντερική μικροχλωρίδα, κ.λ.π.), που μπορεί να λειτουργήσει για να ενισχύσει ή να αναστείλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου σε πρώιμο στάδιο καρκίνου.

εν κατακλείδι, η εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων στον ιστό του βλεννογόνου ενεργοποιηθεί από τις τεχνικές που περιγράφονται στην παρούσα έκθεση επέτρεψε στους όγκους να αναπτύσσονται με τρόπο που μιμείται την κλινική ανθρώπινη ασθένεια. Το μοντέλο αυτό θα ήταν χρήσιμο για την αξιολόγηση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των αντικαρκινικών φαρμάκων, και μπορεί να είναι σε θέση να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη νωρίς γεγονότα στο ΤΜΕ.

Ευχαριστίες

Αυτό το έγγραφο είναι αφιερωμένο στη μνήμη του AR Moossa, M.D.