Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται τόσο για τους άνδρες και τις γυναίκες. Η έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα έχει ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 48,8%, ωστόσο, σχεδόν το 35% των ασθενών σταδίου Ι υποτροπές μετά τη χειρουργική εκτομή, προμηνύοντας έτσι μια κακή πρόγνωση. Ως εκ τούτου, την ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα σε πρώιμο στάδιο και την περαιτέρω ταυτοποίηση των ασθενών υψηλού κινδύνου θα επιτρέψει την ευκαιρία να παρέχουν επικουρική θεραπεία και ενδεχομένως να αυξήσει την επιβίωση. Υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις ότι το ανοσοποιητικό σύστημα παράγει μια απόκριση αυτοαντισώματος σε νεοπλασματικά κύτταρα. Η ανίχνευση τέτοιων αυτοαντισωμάτων έχει αποδειχθεί ότι έχουν διαγνωστική και προγνωστική αξία. Εδώ πήραμε πλεονέκτημα της υψηλής απόδοσης τεχνική Luminex για την πολύπλεξη συνολικά 14 αυτοαντιγόνα που σχετίζονται με όγκους για να ανιχνεύσει την αυτοαντίσωμα από τους ορούς ασθενών. Τα 14 αντιγόνα που εκφράζονται από in vitro σύστημα μεταγραφής /μετάφρασης με HaloTag στο Ν-άκρο. Οι πρωτεΐνες σύντηξης στη συνέχεια ακινητοποιήθηκε ομοιοπολικά πάνω στα μικροσφαιρίδια Luminex συζευγμένα με τον συνδέτη αλο-link, εξαλείφοντας έτσι την διαδικασία καθαρισμού πρωτεϊνών. δείγματα Οροί από ασθενείς με καρκίνο και υγιείς μάρτυρες αλληλεπίδρασε με το σύμπλοκο μικροσφαίρα-αντιγόνου για τη μέτρηση των αυτοαντισωμάτων. Έχουμε αναπτύξει ένα γρήγορο σύστημα πολυπλεξίας ανίχνευσης για τη μέτρηση αυτοαντισωμάτων υπογραφή από ορούς ασθενών με ελάχιστη διασταυρούμενη αντίδραση. Μια ομάδα επτά αυτοαντισωμάτων βιοδεικτών έχει δημιουργήσει μια AUC & gt? 80% στην διάκριση των καρκίνων του πνεύμονα από υγιείς μάρτυρες. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη έκθεση που συνδυάζει την πλατφόρμα Luminex και την τεχνολογία HaloTag για την ανίχνευση χυμική ανοσολογική απόκριση σε ασθενείς με καρκίνο. Λόγω της ευελιξίας της τεχνολογίας Luminex, αυτή η προσέγγιση μπορεί να εφαρμοστεί σε άλλες συνθήκες, όπως λοιμώδη, νευρολογικές, και μεταβολικές ασθένειες. Κάποιος μπορεί να φανταστεί ότι αυτό το πολλαπλό σύστημα Luminex, καθώς και ο πίνακας των επτά βιοδείκτες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο του πληθυσμού υψηλού κινδύνου, με επακόλουθη δοκιμή CT με βάση το αποτέλεσμα της δοκιμής αίματος

Παράθεση:. Jia J, Wang W , Meng W, Ding Μ, Ma S, Wang Χ (2014) Ανάπτυξη ενός Multiplex αυτοαντισωμάτων δοκιμής για την ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (4): e95444. doi: 10.1371 /journal.pone.0095444

Επιμέλεια: Nupur Gangopadhyay, Πανεπιστήμιο του Pittsburgh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Οκτ, 2013? Αποδεκτές: 27 Μάρτη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 22η Απριλίου, 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (81172072), το Ίδρυμα Επιστημών Διακεκριμένου νέους επιστήμονες (R2101405), την υποδομή και την διευκόλυνση Πρόγραμμα Ανάπτυξης του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Zhejiang (2011F10015), Major Επιστήμης και Τεχνολογίας Πρόγραμμα Καινοτομίας της Hangzhou ( 20112313A01), Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται τόσο για τους άνδρες και τις γυναίκες σε όλο τον κόσμο. Το 2012, υπολογίστηκε ότι 226.160 άνθρωποι θα διαγνωστεί με καρκίνο του πνεύμονα και 160.340 ασθενείς θα πεθάνουν από τη νόσο τους. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για τους ασθενείς είναι 16% μέχρι το 2007, από τα χαμηλότερα όλων των καρκίνων, η οποία έχει βελτιωθεί μόνο οριακά στο παρελθόν [1] δεκαετίας. Οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα διαγιγνώσκονται σε τέλη της δεκαετίας του /μακρινό στάδια έτσι με χαμηλό ποσοστό επιβίωσης, λόγω της έλλειψης των συμπτωμάτων αντιληπτή στο πρώιμο στάδιο της ογκογένεσης [2].

Τα στοιχεία δείχνουν ότι διάγνωση καρκίνων του πνεύμονα, όταν είναι μικρό και τοπικά ορίζονται μπορεί να αυξήσει την πιθανότητα ίασης [3], [4]. Η έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών έως και 48,8% σε σύγκριση με το 3,3% των καθυστερήσεων /μακρινό στάδιο [5]. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα πρώιμου σταδίου και την ταυτοποίηση των ασθενών υψηλού κινδύνου θα παρείχε δυναμικό επικουρική θεραπεία και ενδεχομένως να αυξήσει την επιβίωση.

Οι τρέχουσες μέθοδοι για τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα απαιτούν βιοψία και παθολογική εξέταση των ιστού συνήθως μετά την ανακάλυψη της βλάβης στην ακτινογραφία θώρακα ή αξονική τομογραφία. Σήμερα δεν υπάρχει εξέταση αίματος που διατίθενται για τον καρκίνο του πνεύμονα. Αρκετές προσεγγίσεις έχουν αναπτυχθεί για τον προσδιορισμό βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα [6], [7]. Μεταξύ αυτών, το ανοσοποιητικό σύστημα έχει αποδειχθεί ότι παράγουν αυτοαντισώματα έναντι νεοπλασματικών κυττάρων, καθώς και απορρυθμισμένης που σχετίζονται με όγκο αντιγόνα [8], [9], ως εκ τούτου ανίχνευση τέτοιων αυτοαντισωμάτων έχουν διαγνωστική και προγνωστική αξία [10], [11]. Το πιο σημαντικό, χυμικών ανοσοαποκρίσεων υπάρχουν αρκετούς μήνες ή χρόνια πριν από τα κλινικά συμπτώματα, έτσι τα αυτοαντισώματα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την έγκαιρη διάγνωση των ασθενών με καρκίνο [7], [9], [12]. Επιπλέον, αναφέρεται ότι τα κύτταρα Β και τα αντισώματα Β κυττάρων που σχετίζεται με την προώθηση της de novo καρκινογένεση [13], υποδηλώνοντας ότι η χυμική ανοσολογική απόκριση μπορεί να παίζει άμεσο ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου.

(1) Οι HaloTag Amine Ligands συζεύχθηκαν σε μαγνητικά σφαιρίδια Luminex μέσω του ενεργοποιημένου καρβοξυλικού οξέος του COOH ομάδα ρίζας. Διαφορετικό χρώμα αντιπροσωπεύει διάφορους τύπους χάντρες Luminex. (2) Οι ανασυνδυασμένες Αλο-tagged πρωτεΐνες ομοιοπολικά ακινητοποιημένα πάνω στα σφαιρίδια Luminex συζευγμένα με HaloTag συνδετήρα μέσω αντιδραστικών συνδετήρες χλωροαλκάνιο επί συνδετήρες. Κάθε χάντρα ακινητοποιήθηκε με διαφορετική πρωτεΐνη ξεχωριστά. (3) – (4) Λόγω της δέσμευσης η ομοιοπολική, κάθε σύμπλεγμα σφαιριδίων-πρωτεΐνης ατομικά πέρασε από έντονα το πλύσιμο και στη συνέχεια συνδυάζονται για να κάνουν την πισίνα μικροσφαίρας. (5) Η πισίνα μικροσφαίρα συζευγμένου με πρωτεΐνη ακολούθως εξίσου δειγματίσθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Κάθε φρεάτιο περιέχει πολλαπλούς βιοδείκτες αυτοαντιγόνου και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ένα μόνο δείγμα ορού. (6) Τα αυτοαντισώματα σε ορούς δεσμεύεται στο αντιγόνο συζευγμένο μικροσφαιρίδια, και ανιχνεύθηκαν με R-φυκοερυθρίνη συζευγμένο αντι-ανθρώπινο αντίσωμα. Το σήμα διαβάστηκε σε Luminex 200 BioAnalyzer.

Η

Στην παρούσα μελέτη, περιγράφεται μια μη επεμβατική διαγνωστική συστήματος σε πλατφόρμα Luminex xMAP για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων στον ορό για τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα. Τα υποψήφια αυτοαντιγόνα επιλέχθηκαν από τη βιβλιογραφία και εκφράζονται από in vitro σύστημα μεταγραφής /μετάφρασης χρησιμοποιώντας HaloTag στο Ν-άκρο. Χωρίς καθαρισμό, οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ομοιοπολικά ακινητοποιημένο επί Luminex χάντρα. Τα δείγματα ορού επωάστηκαν με το σύμπλοκο σφαιριδίου-αυτοαντιγόνο να μετρηθεί η ποσότητα των αυτοαντισωμάτων. Μια ομάδα επτά αντιγόνα, δηλαδή ρ53, NY-ESO-1, Livin, Ubiquilin1, birc, ρ62 και PRDX, χρησιμοποιήθηκαν σε ένα πολυπαραγοντικό στατιστικό μοντέλο να διακρίνει τους ασθενείς με καρκίνο από υγιείς ελέγχους. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη για την ανίχνευση multiplex αυτοαντισώματος στην τεχνολογία Luminex.

Υλικά και Μέθοδοι

έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Τα cDNA για 14 αυτοαντιγόνα κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα Flexi ( Promega, USA) με ένα HaloTag στο Ν-άκρο. Το Halo tagged ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που εκφράζονται από in vitro σύστημα μεταγραφής /μετάφρασης (Promega). Η πρωτεΐνη HaloTag παρήχθη επίσης ως αρνητικός πρωτεΐνη. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντι-HaloTag αντίσωμα κουνελιού (Promega).

Western Blot Δοκιμασία

Halo tagged ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που εκφράζονται από

in vitro

μεταγραφής /μετάφρασης σύστημα, και στη συνέχεια υποβάλλεται για Western Blot. Εν συντομία, ένα σύνολο 3 μλ προϊόντος λύσης πρωτεΐνη φορτώθηκε σε 12% SDS-PAGE, κατόπιν μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη PVDF (GE). Το λύμα πρωτεΐνη με την πρωτεΐνη HaloTag μόνο (31 kDa) ήταν η φόρτωση ελέγχου. Μετά τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες στυπώθηκαν με αντι-HaloTag αντίσωμα κουνελιού (Promega), που ακολουθείται από επώαση με συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερεύον αντίσωμα (Proteintech). Τα σήματα πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με αντιδραστήριο ECL (GE), και φωτογραφήθηκαν με τη χρήση συστήματος ανάλυσης χημειοφωταύγειας εικόνα της Alpha Innotech Fluor Chem FC2 (Άλφα Innotech).

Ασθενών Δείγματα ορού

Η μελέτη εγκρίθηκε από το επιτροπή δεοντολογίας της Zhejiang Ακαδημία Ιατρικής Επιστημών. Όλοι οι συμμετέχοντες που παρέχονται οροί δώσει τη γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις.

Οι ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνο του πνεύμονα συλλέχθηκαν στο Τμήμα Ογκολογίας, το Hangzhou νοσοκομείο πρώτη ανθρώπων από τον Αύγουστο του 2010 έως τον Μάρτιο του 2012. Ένα σύνολο 117 δειγμάτων ασθενών συναντήθηκαν τα ακόλουθα κριτήρια επιλεξιμότητας για αυτή τη μελέτη: 1) από βιοψία-αποδεδειγμένη κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του πνεύμονα, 2) καμία προηγούμενη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, 3) ημερομηνία ορού που ήταν αμέσως πριν από την ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης, 4) δεν υπάρχουν άλλα ταυτόχρονη κακοήθεις νόσους και αυτοάνοσα ασθένειες. Από αυτά τα 117 δείγματα, 44 δείγματα επιλέχθηκαν τυχαία για να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη και την επικύρωση της πλατφόρμας Luminex, ενώ 25 δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή βιοδείκτη, και το υπόλοιπο 48 δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για πολλαπλή ανάλυση βιοδείκτη. Ομοίως, για να χρησιμεύσει ως υποκείμενα ελέγχου, το νοσοκομείο παρέχονται 110 δείγματα ορών στην ηλικιακή ομάδα των 29-76 χωρίς ιστορικό καρκίνου συλλέχθηκαν μεταξύ 2011 και 2012. Τα 110 δείγματα ήταν επίσης τυχαία χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες σε αυτή τη μελέτη, συγκεκριμένα 35 δείγματα για την ανάπτυξη Luminex, 25 δείγματα για την επιλογή βιοδεικτών και 50 δείγματα για πολλαπλή ανάλυση.

η σύζευξη του HaloTag Amine συνδετήρα για να Luminex μικροσφαιριδίων

η ελάχιστη ποσότητα HaloTag Amine (Ο4) Ligand (Promega, USA) για τη μέγιστη αποτελεσματικότητα σύζευξης επί των μικροσφαιρών Luminex (Luminex Corp.) προσδιορίστηκε ως εξής. Ένα σύνολο 5 × 10

6 Luminex μαγνητικά μικροσφαιρίδια συζεύχθηκαν με μία σειρά αραίωσης του HaloTag Amine Ligand: 0,0016 mg, 0,008 mg, 0,04 mg, 0,2 mg, 1 mg. Εν συντομία, τα μικροσφαιρίδια εναιωρούνται σε ένα διάλυμα από 100 MES mmol /L (ρΗ 6,0), που περιέχει 5 mg /mL 1-αιθυλο-3- (3-διμεθυλαμινοπροπυλο) καρβοδιιμίδιο (Thermo Scientific) και HaloTag Amine Ligand. Μετά από επώαση 2 ωρών σε σκοτάδι, τα μικροσφαιρίδια πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 100 MES mmol /L (ρΗ 4.5), και αποθηκεύτηκαν στους 4 ° C.

Τα μικροσφαιρίδια Luminex συνδυασμό με HaloTag Ligand επωάστηκαν με καθαρισμένη πρωτεΐνη HaloTag σε μια σειρά αραίωσης από 0 μg έως 5 μg. Η MFI (μέση ένταση φθορισμού) αντιπροσωπεύει το σήμα δεσμευτική και ανιχνεύθηκε από αντι-HaloTag αντίσωμα.

Ανάπτυξη και επικύρωση της πρωτεΐνης-μικροσφαιριδίων Complex

Το σύμπλεγμα συνδέτη-μικροσφαιριδίων σε διάφορες περιοχές χάντρα χωριστά επωάστηκε με ανασυνδυασμένο HaloTag πρωτεΐνες σύντηξης σε θερμοκρασία περιβάλλοντος στο σκοτάδι για 60 λεπτό. Μετά την επώαση, οι μικροσφαίρες πλύθηκαν με PBS που περιέχει 0.1% BSA και 0.5% Tween 20, και επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιέχει 0.1% BSA για επικύρωση.

Η ποσότητα της πρωτεΐνης συζευγμένο με μικροσφαίρας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την εμπορική αντίσωμα ( αντίσωμα αντι-Ρ62 κουνελιού, αντίσωμα αντι-ρ53 κουνελιού, Santa Cruz) απέναντι από κάθε πρωτεΐνη στόχο. Εν συντομία, σειριακές αραιώσεις του κάθε αντισώματος (κυμαίνονται από 0 έως 5 μg /ml σε PBS, 1% BSA) επωάστηκαν με 3000 μικροσφαιρίδια συζευγμένα με διαφορετικές πρωτεΐνες σε μια πλάκα 96 φρεατίων για 1 ώρα. Μετά την πλύση με PBS /1% BSA, τα μικροσφαιρίδια επωάσθηκαν με Κ-φυκοερυθρίνη συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα για 30 λεπτά. Το προκύπτον σύμπλοκο και πάλι πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS /1% BSA πριν από την ανάγνωση σε Luminex 200 BioAnalyzer (Luminex Corp). Η αξία των ΝΧΙ αντιπροσωπεύει το σήμα σύνδεσης.

Για να δοκιμαστεί η ικανότητα ανίχνευσης του συστήματος Luminex, 44 καρκίνου και 35 δειγμάτων ορών ελέγχου της υγείας των επιλέχθηκαν τυχαία, και η αυτοαντισωμάτων NY-ESO-1 μετρήθηκε με σύστημα Luminexe. Εν συντομία, τα διαφορετικά μικροσφαιρίδια συζευγμένα με ανασυνδυασμένο ΝΥ-ΕδΟ-1 και HaloTag χωριστά ενώθηκαν και μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Τα δείγματα ορού αραιώθηκαν σε 1:200 σε PBS /1% BSA και επωάστηκαν με τις χάνδρες στους 4 ° C όλη τη νύκτα με ανακίνηση. Τα σήματα αυτοαντισωμάτων στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με R-φυκοερυθρίνη συζευγμένο αντι-ανθρώπινο αντίσωμα πολύκλωνο (Rockland) για 0,5 ώρα με συνεχή ανάδευση. Μετά από τρεις πλύσεις, το σύμπλοκο αντίδραση επαναιωρήθηκε σε PBS /1% BSA για την ανάγνωση στο Luminex 200 BioAnalyzer. Οι τιμές MFI εκπροσωπήθηκαν από ΝΧΙ (NY-ESO-1) μείον ΝΧΙ (HaloTag).

Οι εντάσεις φθορισμού, επίσης, σε σύγκριση με ένα εμπορικό κιτ ELISA (Biovalue, USA). Το πείραμα διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανίχνευση αυτοαντισωμάτων σε ορό

Διαφορετικές μικροσφαιρίδια συζευγμένα με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες και HaloTag χωριστά ενώθηκαν και μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων στον ορό. Τα δείγματα ορού αραιώθηκαν σε 1:200 σε PBS /1% BSA και επωάστηκαν με τα σφαιρίδια επί μία νύκτα στους 4 ° C με ανακίνηση. Τα σήματα αυτοαντισωμάτων στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με Luminex όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Στατιστική Ανάλυση

χρησιμοποιήθηκαν Τόσο μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλύσεις. Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων εκτιμήθηκαν με t-test του Student. Η συσχέτιση μεταξύ της μονής plex και multi-plex συστήματα ή μεταξύ ELISA και Luminex single-plex σύστημα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το συντελεστή συσχέτισης του Pearson (R). πρόβλεψη κατηγορίας εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο Εργαλεία BRB-Array (έκδοση 3.6) διατίθενται σε https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html. Όλες οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση R γλώσσα στατιστικού προγραμματισμού (https://cran.r-project.org/) και τα πακέτα Bioconductor. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 13.0 (SPSS), GraphPad Prism 5.0, και Excel. p & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η γενική προσέγγιση της μελέτης απεικονίζεται στο Σχ.. 1

Προκειμένου να ακινητοποιήσει ομοιοπολικά τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες στην μικροσφαίρα Lumimex, ο συνδετήρας αμίνη HaloTag πρώτη φορά συζευχθούν με τα μικροσφαιρία Luminex μέσω του ενεργοποιημένου καρβοξυλικού οξέος του COOH ρίζα ομάδας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (Σχ. 2Α). Η απόδοση σύζευξης αυξήθηκε κατά εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, όπως ανιχνεύεται με πρότυπες πρωτεΐνες HaloTag (Εικ. 2Α). Επιπλέον, η MFI έφθασε στο οροπέδιο στα 0,2 mg και 1 mg αμίνη συνδέτη, υποδεικνύοντας τον κορεσμό του συνδετήρα αμίνης στην επιφάνεια του σφαιριδίου. Σε αυτή τη μελέτη, 0,2 mg του προσδέματος χρησιμοποιήθηκε για να συζευχθεί το μικροσφαίρα.

(Α) Η τιτλοδότηση του HaloTag Amine Ligand συζευγμένο επί των μικροσφαιρών Luminex. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη πρότυπο HaloTag χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της αποτελεσματικότητας της σύζευξης σε μια σειρά συγκεντρώσεων. Η MFI (μέση ένταση φθορισμού) αντιπροσωπεύει το σήμα σύνδεσης ανιχνεύεται με αντι-HaloTag αντισώματος. (Β) Επικύρωση του συγκροτήματος μικροσφαιριδίων Luminex σε συνδυασμό με HaloTag Amine Ligand. Τα σφαιρίδια Luminex συζεύχθηκαν με 0.2 mg του HaloTag Ligand και τα σήματα ανιχνεύθηκαν ως (Α).

Η

Το μικροσφαιρίδιο Luminex συζευγμένα με 0,2 mg του προσδέματος αμίνη επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τη χρήση τυποποιημένων πρωτεΐνη HaloTag σε διαφορετικά συγκέντρωση. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η μέγιστη MFI ακόμη και σε 1,25 μg του προτύπου πρωτεΐνης αποδεικνύοντας την βέλτιστη συνθήκη σύζευξης (Σχ. 2Β).

Για διαλογή γρήγορα τα υποψήφια αυτοαντιγόνα, ένα πάνελ 14 πρωτεϊνών που εκφράζονται από

in vitro

σύστημα μεταγραφής /μετάφρασης. Μετά επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (Εικ. 3Α), οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες σύντηξης με το HaloTag άμεσα επωάστηκαν με το μικροσφαίρα-συνδέτη χωρίς καθαρισμό πρωτεϊνών. Ο ομοιοπολικός δεσμός μεταξύ HaloTag και συνδέτη μορφές ταχέως υπό γενική φυσιολογικές συνθήκες και είναι πολύ ειδικό και ουσιαστικά μη αναστρέψιμη, αποδίδοντας ένα σύμπλοκο το οποίο είναι σταθερό ακόμη και υπό αυστηρές συνθήκες. Η ποσότητα πρωτεΐνης ακινητοποιημένη στο άτομο μικροσφαίρα Luminex Στη συνέχεια εξετάστηκε με τη χρήση των εμπορικών αντισώματα έναντι των αντίστοιχων πρωτεϊνών αντιγόνου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, τα σήματα MFI μετρήθηκαν σε μία εξαρτάται από τη συγκέντρωση ανιχνεύεται με αντι-Ρ62 και αντι-HaloTag αντισώματα.

(Α) Ο εκπρόσωπος Western Blot των ανασυνδυασμένων αυτοαντιγόνα με HaloTag στο Ν-άκρο που εκφράζεται από in vitro μεταγραφής /σύστημα μετάφρασης. (Β) Επικύρωση των μικροσφαιρών Luminex σε συνδυασμό με τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες HaloTag. Τα ακινητοποιημένα πρωτεΐνες ανιχνεύτηκαν με αντι-Ρ62 και αντι-HaloTag αντισώματα χωριστά και τα σήματα ήσαν σε εξαρτάται από τη συγκέντρωση. (Γ) Η σύγκριση της ΝΥ-ΕδΟ-1 αυτοαντισωμάτων σε ορούς ανιχνεύθηκε με Luminex και ELISA. Ένα σύνολο 44 καρκίνων του πνεύμονα και 35 υγιείς μάρτυρες επιλέχθηκαν τυχαία για να συγκριθεί η ΝΥ-ΕδΟ-1 αυτοαντισωμάτων μετρήθηκαν με σύστημα Luminex και δοκιμασία ELISA. R

2 = 0.92 δείχνει την υψηλή συσχέτιση μεταξύ Luminex και ELISA πλατφόρμες στην ανίχνευση NY-ESO-1 αυτοαντισωμάτων.

Η

Για να διερευνηθεί κατά πόσον το σύστημα Luminex μπορεί να ανιχνεύσει την αυτοαντισωμάτων από το ανθρώπινο δείγμα, 44 πνευμόνων καρκίνο και 35 υγιή δείγματα ορού επιλέχθηκαν τυχαία και το αυτοαντίσωμα ΝΥ-ΕδΟ-1 συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Luminex και ένα εμπορικό κιτ ELISA (Biovalue, USA). Και οι δύο πλατφόρμες δοκιμασία ανίχνευσε το σημαντικά υψηλότερο ποσό του ΝΥ-ΕδΟ-1 αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς με καρκίνο σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Εικ. 3C). Μοναδιαίος ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης έδειξε ότι ο συντελεστής συσχέτισης (Pearson r) ήταν 0,92 για NY-ESO 1-αντισωμάτων μετριέται με δύο τεχνικές Luminex και ELISA, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι δύο μέθοδοι είχαν υψηλό βαθμό συμφωνίας στην ανίχνευση NY-ESO-1 αυτοαντισωμάτων (

σ

& lt?. 0.01)

Είμαστε δίπλα ανέπτυξε το πολυπλεξίας συστήματος Luminex. Τέσσερις σύμπλοκα πρωτεΐνης-μικροσφαίρας (NY-ESO-1, ρ53, ρ62, και PRDX), καθώς και ένα HaloTag συζευγμένο χάντρα ως έλεγχος αναφοράς ήταν εξίσου συνδυάστηκαν και κατανεμήθηκε σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Το αντίσωμα αντι-ρ53 χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευθεί η μικροσφαίρα ρ53 σε αυτό το πολλαπλό σύστημα. Τα δεδομένα έδειξαν ότι τα σήματα MFI είχαν υψηλή συσχέτιση με εκείνες του ατομικού συστήματος σφαιριδίου (single-plex) (Σχ. 4Α) που αποδεικνύει το πολλαπλό σύστημα ισχύει για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων. Επιπλέον, εκτός από το μικροσφαίρα ρ53, όλα τα άλλα μικροσφαιρίδια συμπεριλαμβανομένων NY-ESO-1, Ρ62, PRDX παράγονται τα σήματα υποβάθρου υποδεικνύοντας δεν υπήρχε διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ των σφαιριδίων σε αυτό το πολλαπλό σύστημα (Εικ. 4Β).

(Α) Σύγκριση των ρ53 συζευγμένα σφαιρίδια σε singleplex (ατομική χάντρα) και το σύστημα πολυπλεξίας (πολλαπλά σφαιρίδια). Η τιμή MFI ανιχνεύθηκε με μία αραίωση σειρά αντισώματος ρ53. (Β) Δεν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ των διαφόρων βιοδεικτών στο multiplex σύστημα. Ένα πολλαπλό σύστημα που περιέχει πέντε μικροσφαιρίδια σε συνδυασμό με NY-ESO-1, ρ53, ρ62, PRDX και HaloTag χωριστά επωάστηκε με αντίσωμα ρ53, και μόνο τα μικροσφαιρίδια ρ53 αντέδρασε με αντίσωμα αντι-ρ53, ενώ άλλα μικροσφαιρίδια ανιχνεύονται παρασκήνιο τιμές MFI. (Γ) Η συσχέτιση σήματος των μικροσφαιριδίων ρ53 στο singleplex και πολυπλεξίας συστήματος. (D) Ίδιο με το (C), αλλά χρησιμοποιώντας ρ62 σε συνδυασμό μικροσφαιρίδια.

Η

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να δοκιμαστεί η συσχέτιση των δύο μονο- και πολυ-plex συστήματα Luminex συγκρίνοντας τα σήματα αυτοαντισώματα των τυχαία επιλεγμένων δειγμάτων ορού ανιχνεύεται από τα δύο συστήματα χωριστά. Όπως έδειξε στο Σχ. 4C και το Σχ. 4D, ο συντελεστής συσχέτισης (Pearson r) ήταν 0,84 για την μικροσφαίρας p53 (

ρ

& lt? 0,01), ενώ 0,81 για μικροσφαίρας ρ62 (

ρ

& lt? 0,01), The Pearson r ήταν επίσης πάνω από 0,80 για άλλα σύμπλοκα πρωτεΐνης-μικροσφαίρας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) δείχνοντας την υψηλή συσχέτιση μεταξύ των μονο- και πολυ-plex συστήματα.

με βάση το σύστημα πολυπλεξίας Luminex, έχουμε διαλογή ένα πάνελ 14 υποψήφιων αυτοαντιγόνων να την ανίχνευση των κυκλοφορούντων αντισωμάτων από ανεξάρτητους καρκίνο του πνεύμονα 25 και 25 υγιείς ελέγχου επιλέγονται τυχαία από την ομάδα δείγμα σε αυτή τη μελέτη. Επτά αυτοαντιγόνα, συμπεριλαμβανομένων των ρ62, birc, Livin-1, ρ53, PRDX, NY-ESO-1 και Ubiquilin, παρήγαγε τα αξιοσημείωτα υψηλότερα σήματα MFI σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Mann-Whitney τιμή p & lt? 0,05) (Σχ . 5).

η

επόμενο καθορίζεται εάν η ομάδα 7 βιοδείκτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την μη επεμβατική ανίχνευση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Θα προβληθεί ανεξάρτητη 48 καρκίνους του πνεύμονα και δείγματα ορών 50 έλεγχο με διάφορους τύπους καρκίνου του πνεύμονα και τα στάδια από το σύστημα multiplex Luminex. Οι βασικές παράμετροι των 48 ασθενών με καρκίνο και 50 ελέγχους συνοψίζονται στον Πίνακα 1, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, του φύλου, το κάπνισμα και την κατάσταση κατανάλωσης. Μετά το διαχωρισμό σε καρκίνο και τον έλεγχο τάξεις, η ακρίβεια των δυαδικών πρόβλεψη έκβαση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας διαφορετικούς αλγόριθμους μηχανικής μάθησης διαθέσιμα σε BRB Εργαλεία Array. αξίας κάθε δείγματος για κάθε μία από αυτές τις 7 βιοδείκτες πολλαπλασιάστηκε από τους αντίστοιχους συντελεστές που προκύπτουν από μονομεταβλητών λογιστικών παλινδρομήσεων για την κατάρτιση, οι οποίες με τον καρκίνο /ελέγχου ως δυαδική μεταβλητή απόκρισης, και στη συνέχεια έγιναν ανήλθαν οι τιμές. Οι βαθμολογίες του δείκτη που δημιουργήθηκε στη συνέχεια αξιολογήθηκαν από την καμπύλη ROC, η οποία παρείχε μια καθαρή δείκτη ακρίβειας ενός τεστ με γραφική παράσταση της ευαισθησίας έναντι 1- ειδικότητα για κάθε τιμή αποτέλεσμα της δοκιμής. Τρεις αλγόριθμοι πρόβλεψης χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία του ROC, συμπεριλαμβανομένων και των συνθέτων συμμεταβλητή προγνωστικός (ΚΚΚ), διαγώνια γραμμική διακριτική ανάλυση (DLDA), και Μπεϋζιανή ένωση συμμεταβλητή προγνωστικός (ΔΣΣΕ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ανάλυση απέδωσε μια πολύ συγκρίσιμη ROC για τους τρεις αλγορίθμους με AUC 0,82 (ΚΚΚ), 0,81 (DLDA), 0,81 (ΔΣΣΕ) αντίστοιχα (Εικ. 6), καταδεικνύοντας την έντονη διακριτική δύναμη των 7 βιοδείκτες. Καμία συσχέτιση με την ηλικία, το φύλο, παρατηρήθηκε το κάπνισμα ή την κατανάλωση για αυτό το πάνελ βιοδεικτών.

Η

Συζήτηση

Η ανίχνευση των κυκλοφορούντων αντισωμάτων έναντι σχετίζονται με όγκο αντιγόνα είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου, και τις τεχνολογίες που έχουν ευρέως αναπτυχθεί [14], [15]. Μέχρι σήμερα, ELISA είναι η συμβατική μέθοδος για την ανίχνευση της αυτοαντισωμάτων στον ορό, αλλά η εφαρμογή του στις πολυπλεξίας αυτοαντισωμάτων υπογραφή είναι περιορισμένη. Πρόσφατα, μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών και Luminex xMAP τεχνολογίες εκδόθηκαν για τη μέτρηση της ορολογικής πίνακα αυτοαντισωμάτων [16], [17].

Luminex xMAP είναι μια υψηλή σε όλη την πλατφόρμα με ανώτερη ευαισθησία και ειδικότητα από ELISA [18], [19 ], [20]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε περιγράψει μία απλή μέθοδο Luminex βασίζεται στην τεχνολογία HaloTag για την ανίχνευση των αυτοαντισωμάτων από ορούς ασθενών. Οι πρωτεΐνες HaloTag ήταν ομοιοπολικά συνδεδεμένο με τους συνδέτες χλωροαλκάνιο συζευχθούν με τα μικροσφαιρία [21], [22]. Λόγω της σύνδεσης του ειδικού ομοιοπολική, οι πρώτες Halo-tagged προϊόντα λύσης πρωτεΐνης σύντηξης επιλεκτικά ακινητοποιημένο στα σφαιρίδια Luminex και στη συνέχεια να περάσουν από έντονη στάδιο πλύσης, παρακάμπτοντας έτσι την επίπονη διαδικασία καθαρισμού πρωτεϊνών.

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι πολυπλεξίας μονό βιοδείκτες (δηλαδή αυτοαντισωμάτων profiling) θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά την ευαισθησία και την εξειδίκευση των βιοδεικτών καρκίνου σε διευκρίνιση των ασθενών με καρκίνο από υγιή δείγματα αναφοράς [23]. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να επωφεληθούν της τεχνικής Luminex για την πολύπλεξη ένα πάνελ 14 αυτοαντιγόνα που σχετίζονται με όγκους στην ανίχνευση ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. επιλεγμένα Αυτές αυτοαντιγόνα βασίστηκαν στις επιδόσεις τους στη διάκριση καρκίνους από υγιείς ελέγχους που περιγράφονται στη βιβλιογραφία. Για παράδειγμα, ρ53 αυτοαντισωμάτων ανιχνεύθηκε σε περίπου 15% των ασθενών με καρκίνο [24], [25]. Ubiquilin 1 βρέθηκε να είναι μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης για τον καρκίνο του πνεύμονα με την AUC πάνω από 0,7 [26]. Livin-1 αυτοαντισωμάτων αναφέρθηκε σε 19 από 37 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (51,3%) [27]. Επιπλέον, 25 (47%) του 53 ασθενείς με NSCLC ελέγχθηκαν θετικά για αυτοαντισώματα έναντι PRDX στους ορούς [28]. Αυτοαντισωμάτων σε NY-ESO-1, birc, και ρ62 ανιχνεύθηκαν επίσης σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα με 20%, 19,5% και 18,8% αντίστοιχα ευαισθησία [29], [30], [31].

Multiplex η έχουν αντιγόνα που σχετίζονται με όγκο εκτενώς διερευνηθεί με ELISA [32], [33], [34], [35], [36] ή μικροσυστοιχίας [37]. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη έκθεση που συνδυάζει την πλατφόρμα Luminex και την τεχνολογία HaloTag για την ανίχνευση χυμική ανοσολογική απόκριση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Ο πίνακας 7 βιοδείκτες που επιτεύχθηκε κατά ακρίβεια 80% στην ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα από υγιείς μάρτυρες. Αυτά τα αντισώματα, ωστόσο, δεν έχουν καμία σχέση με ιστολογίες όγκου, τα στάδια και τα είδη λόγω του ορίου του μεγέθους του δείγματος. Ως εκ τούτου, θα απαιτείται μελέτη παρακολούθησης σε μια μεγάλη ομάδα ασθενών με ένα μίγμα τύπων όγκων και τα στάδια για την επικύρωση της απόδοσης των αυτοαντισωμάτων απέναντι ιστολογίες όγκου και τύπων, ειδικά, η συσχέτιση μεταξύ κακοήθειας νόσος και ο τίτλος αυτοαντισωμάτων. Κάποιος μπορεί να φανταστεί ότι αυτό το πολλαπλό σύστημα Luminex, καθώς και ο πίνακας των επτά βιοδείκτες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο του πληθυσμού υψηλού κινδύνου, με επακόλουθη δοκιμή CT με βάση το αποτέλεσμα της δοκιμής αίματος.

Αξιοποίηση η ανοσολογική απάντηση σε όγκους παρέχει μια μοναδική ευκαιρία για την ανάπτυξη νέων εργαλείων για την ορολογική ανίχνευση του καρκίνου, καθώς και ένα προβάδισμα για θεραπεία. Ένα τεστ με βάση την επίδειξη των αυτοαντισωμάτων σε αντιγόνα του όγκου σε ορούς ασθενών θα μπορούσε να έχει μεγάλη σημασία για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου, λόγω του παρατεταμένου χρόνου πορεία της καρκινογένεσης και επειδή ένα ανιχνεύσιμο επίπεδο των αντισωμάτων έναντι του καρκινογόνου ερέθισμα θα μπορούσε να αποτελέσει πολύ πριν από το φαινότυπο του όγκου ανακύπτει. Όπως και άλλες μορφές καρκίνου, ο καρκίνος του πνεύμονα αναπτύσσεται ως τα αποτελέσματα της εκτροχιασμού ετερογενών και πολλαπλές ρυθμιστικές διαδικασίες. Ως εκ τούτου, δεν είναι μια ενιαία βιοδείκτης που πρέπει να διευκρινιστεί. Πολυπλεκτικά πρότυπα βιοδεικτών έχουν σημαντικά υψηλότερη θετική προγνωστική αξία από μόνο δείκτες σε νοσούντες ασθενείς διακρίσεις από τους ελέγχους μη-καρκίνου.

Η δοκιμή αυτοαντισωμάτων πολλά υποσχόμενο, αλλά πολύ περισσότερη έρευνα με εκτενή δείγματα απαιτείται για να επιβεβαιωθεί η αξιοπιστία του τεστ και να προσαρμόσουν την τεχνική για τη μαζική διαλογή. Επιπλέον, οι γιατροί θα πρέπει επίσης να μάθουν εάν η έγκαιρη διάγνωση βελτιώνει την έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, βοηθώντας έτσι να παράγουν αντισώματα για θεραπεία ασθενειών. Ως εκ τούτου, η γεφύρωση του χάσματος μεταξύ της βασικής επιστήμης και της κλινικής πρακτικής αποτελεί τον κύριο στόχο στο άμεσο μέλλον να επιτρέψει στους γιατρούς να προσαρμόσουν τις στρατηγικές ελέγχου και θεραπείας προσαρμόζεται κίνδυνο για την τρέχουσα ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.