Abstract

ΝΡ-κΒ σηματοδότηση παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, επιβίωση κυττάρων, αγγειογένεση, εισβολή, μετάσταση και αντοχή φαρμάκου /ακτινοβολία. Η συνδυασμένη θεραπεία που περιλαμβάνει ΝΡ-κΒ αναστολή οδός είναι μια ελκυστική στρατηγική για τη θεραπεία του προχωρημένου μορφών καρκίνου του θυρεοειδούς. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα του ΝΡ-κΒ αναστολή οδού σε συνδυασμό με κυτταροτοξική χημειοθεραπεία, χρησιμοποιώντας docetaxel και ιονίζουσα ακτινοβολία σε

in vitro

μοντέλα καρκίνου του θυρεοειδούς. Βρήκαμε ότι, ενώ και οι δύο docetaxel και ιονίζουσα ακτινοβολία ενεργοποιημένων ΝΡ-κΒ σηματοδότηση στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα, δεν υπήρχε συνεργική δράση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και /ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είτε με γενετική (μεταγωγή της δεσπόζουσας αρνητική μεταλλαγμένη μορφή του ΙκΒα) ή φαρμακολογική ( πρωτεασώματος αναστολέα βορτεζομίμπη και ο αναστολέας ΙΚΚβ GO-Y030) αναστολή του μονοπατιού NF-κΒ στον καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές BCPAP, 8505C, THJ16T και SW1736. Docetaxel συν βορτεζομίμπη μειώθηκε συνεργικά

in vitro

εισβολή των κυττάρων 8505C, αλλά όχι στις άλλες κυτταρικές σειρές. Διαλογή ενός πάνελ κλινικά σχετικές στοχευμένες θεραπείες για συνέργεια με γενετική αναστολή ΝΡ-κΒ σε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού /κυτταροτοξικότητας προσδιόρισε την αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολέα σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) ως πιθανό υποψήφιο. Ωστόσο, η συνεργιστική δράση επιβεβαιώθηκε μόνο στα κύτταρα BCPAP. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι αναστολείς του ΝΡ-κΒ είναι απίθανο να είναι ωφέλιμη ως συνδυαστική θεραπεία με ταξάνη κυτταροτοξική χημειοθεραπεία, θεραπεία με εξωτερική ακτινοβολία ή θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο. Μπορεί να υπάρχουν μοναδικές περιπτώσεις όπου οι αναστολείς του ΝΡ-κΒ μπορεί να θεωρηθεί σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη για τη μείωση εισβολή όγκου ή σε συνδυασμό με αναστολείς HDAC να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου, αλλά αυτό δεν φαίνεται να είναι μια θεραπεία συνδυασμού που θα μπορούσε να εφαρμοστεί ευρέως σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του θυρεοειδούς. Περαιτέρω έρευνα μπορεί να προσδιορίσει ποια υποσύνολα των ασθενών /όγκοι μπορεί να ανταποκριθεί σε αυτή την θεραπευτική προσέγγιση

Παράθεση:. Pozdeyev Ν, Berlinberg Α, Zhou Q, Wuensch Κ, Shibata Η Wood WM, et al. (2015) Στόχευση του NF-κΒ Pathway ως συνδυαστική θεραπεία για τον προχωρημένο καρκίνο του θυρεοειδούς. PLoS ONE 10 (8): e0134901. doi: 10.1371 /journal.pone.0134901

Επιμέλεια: Jacques Emile Dumont, Universite Libre de Bruxelles (ULB), Βέλγιο

Ελήφθη: 6 Ιουλ, 2015? Αποδεκτές: 10 Ιουλ 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Pozdeyev et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από ΝΙΗ /NCI επιχορήγηση για έρευνα R01 CA100560 (www.nih.gov) να BRH, από την Mary Rossick Kern και Jerome H. Kern Κληροδότημα για τους ενδοκρινικούς Νεοπλάσματα έρευνας να BRH, και από μια ερευνητική επιχορήγηση του ενδοκρινικού συστήματος Συνεργάτης Ιδρύματος (www.endocrinefellows.org) σε NP. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου

θυρεοειδούς είναι ένα μείζον πρόβλημα δημόσιας υγείας με & gt? 60.000 εκτιμάται νέες περιπτώσεις προκαλώντας περίπου 2.000 θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες κατά το έτος 2015 [1]. Αναπλαστικό καρκίνο του θυρεοειδούς (ATC) είναι η πιο θανατηφόρα μορφή καρκίνου του θυρεοειδούς με διάμεση επιβίωση των 5 μηνών και 20% 1-χρόνου επιβίωσης παρά την επιθετική αντιμετώπιση με ένα συνδυασμό χειρουργικής επέμβασης, ακτινοβολίας και χημειοθεραπείας [2]. Κυτταροτοξική χημειοθεραπεία με docetaxel είναι μία από τις λίγες θεραπείες που έδειξε ενθαρρυντικά αποτελέσματα σε ATC, ειδικά όταν συνδυάζεται με ακτινοθεραπεία [3].

ΝΡ-κΒ είναι μια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται σε διάφορες πτυχές της βιολογίας των όγκων όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, επιβίωση, αγγειογένεση, εισβολή, μετάσταση και αντίστασης στα φάρμακα [4]. ΝΡ-κΒ σηματοδότηση βρέθηκε να ενεργοποιείται ιδιοσυστατικά σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [5], ορθοκολικό καρκίνο [6], του καρκίνου του μαστού [7], ο καρκίνος του προστάτη [8] και άλλα στερεά και αιματολογικές κακοήθειες [4]. Αντικαρκινικά φάρμακα και ιονίζουσα ακτινοβολία upregulate NF-κΒ μονοπάτι που οδηγεί στην ανάπτυξη αντοχής θεραπείας [9,10]. Αυτό οδήγησε σε μια σημαντική προσπάθεια για την ανάπτυξη αναστολέων ΝΡ-κΒ και μελέτη της αποτελεσματικότητάς τους για τη θεραπεία των καρκίνων, τόσο σε προκλινικά μοντέλα και σε κλινικές δοκιμές [4,11].

Όπως έχει δειχθεί για άλλους όγκους, καρκίνο του θυρεοειδούς ιστός έχει αυξημένη έκφραση παραγόντων μεταγραφής ΝΡ-κΒ που σχετίζεται με ένα μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου, παρουσία κομβικών μεταστάσεων, εξωθυρεοειδική επέκταση και

BRAF V600E

μετάλλαξη [12-15]. Ο ρόλος του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση στην κυτταρική ανάπτυξη του καρκίνου του θυρεοειδούς, τη μετανάστευση, εισβολή και αγγειογένεση έχει δειχθεί [16-18]. Μια συνεργική επίδραση του docetaxel και ο ΝΡ-κΒ αναστολέα οδού κουρκουμίνης στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση του ATC κυτταρικής γραμμής 8505C έχει αναφερθεί [19]. Ο συνδυασμός της αναστολής I

131 και NF-κΒ με είτε ένα κινάσης ΙκΒ (ΙΚΚ) αναστολέα Bay 11-7082 ή ρ65 siRNA οδήγησε σε μεγαλύτερη μείωση της ανάπτυξης καρκίνου του θυρεοειδούς

in vitro

[20] και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος πλευρά σε ποντικούς [21], είτε από μόνη της θεραπείας. Ενθαρρυμένοι από αυτά τα ευρήματα σχεδιάσαμε αυτή τη μελέτη είχε σκοπό να διερευνήσει συστηματικά τα οφέλη της θεραπείας συνδυασμού είτε με docetaxel ή την ιονίζουσα ακτινοβολία και NF-κΒ αναστολή της οδού χρησιμοποιώντας το

in vitro

μοντέλα του καρκίνου του θυρεοειδούς.

μέθοδοι

κυτταρικές σειρές και γενετικές δομές

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός καρκίνου του θηλώδους θυρεοειδούς (PTC) κυτταρική σειρά BCPAP και τρεις ATC κυτταρικές σειρές 8505C, THJ16T και SW1736 που έχουν επικυρωθεί από σύντομη tandem επαναλάβετε τα προφίλ [22,23]. Οι κυτταρικές γραμμές μηχανικής για να εκφράσουν την κυρίαρχη αρνητική μεταλλαγμένη μορφή του ΙκΒα (mIκBα) η οποία είναι ανθεκτική σε αποικοδόμηση του πρωτεασώματος [24]. Η συσσώρευση απέραντα περίσσειας κυτταροπλασματικής mIκBα αποτρέπει πυρηνική μετατόπιση παραγόντων μεταγραφής ΝΡ-κΒ κλείνοντας κανονική σηματοδότηση ΝΡ-κΒ. Δημιουργία pQCXIP-mIκBα κατασκεύασμα, μεταγωγή και επιλογή αντιβιοτικού περιγράφονται λεπτομερώς αλλού [17]. Ο φαινότυπος των κάθε κυτταρική γραμμή εξετάστηκε με μέτρηση της συσσώρευσης ΙκΒα πρωτεΐνης με κηλίδα western και λειτουργικά με εκτίμηση ΝΡ-κΒ δέσμευση σε συναινετικές θέσεις κΒ DNA (Transam ΝΡκΒ ρ65 κιτ ELISA, Active Motif) παράγοντα μεταγραφής ρ65. Ο παράγοντας νέκρωσης όγκου α (TNFa) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την ενεργοποίηση σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Έχουμε αποδείξει ότι mIκBα μεταγωγή οδηγεί σε συσσώρευση ΙκΒα και αναστολή τόσο βασικής γραμμής και άλλων ο καρκίνος του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές ΤΝΡα-διεγερμένα ρ65 DNA δεσμευτική σε κύτταρα BCPAP (Σχήμα 1) και (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα προς η ομάδα φορέα που έλαβαν φορέα. * -ρ & Lt? 0,01 για την επίδραση του TNFα στην ομάδα φορέα (αμφίδρομη ΑΝΟνΑ που ακολουθήθηκε από Bonferroni posttest)

Η

Για την παρακολούθηση βολικά δραστικότητα μονοπατιού ΝΡ-κΒ κατασκευάσαμε ένα λεντοϊού φορέα που περιέχει ένα

Renilla

αναφοράς λουσιφεράσης οδηγείται από ένα ελάχιστο

c-fos

προαγωγό υπό τον έλεγχο των τεσσάρων ανοδικά στοιχεία απόκρισης ΝΡ-κΒ (κΒ). Αυτός ο φορέας μεταχθεί στα BCPAP και τον καρκίνο του θυρεοειδούς 8505C κύτταρα που εκφράζουν ήδη

Firefly

λουσιφεράσης οδηγείται από έναν συστατικό προαγωγό CMV ως μη-NF-κΒ-ρυθμιζόμενη ελέγχου. Μετά την μεταγωγή και επιλογή αντιβιοτικού με πουρομυκίνη, τα κύτταρα αξιολογήθηκαν για έκφραση και των δύο

Firefly

και

Renilla

δραστηριότητα της λουσιφεράσης (Σχήμα 2, Dual-λουσιφεράσης σύστημα προσδιορισμού, Promega).

πρωτεασώματος αναστολέα βορτεζομίμπης και ΙΚΚ συγκρότημα αναστολέα GO-Y030 εξουδετερώσει την ενεργοποίηση του NF-κΒ με docetaxel. Τα κύτταρα επωάστηκαν με φάρμακα για 48 ώρες πριν από τις μετρήσεις δραστικότητα λουσιφεράσης. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων είναι πολύ σημαντική (ρ & lt? 0,0001, μονόδρομη ANOVA). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική μεταβολή (p & lt? 0,05, posttest Newman-Keuls) σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου (TNFα, η docetaxel μόνη της και bortezomib μόνη συγκρίθηκαν με όχημα? Συνδυασμούς docetaxel και bortezomib /GO-Y030 συγκρίθηκαν με την docetaxel μόνη ομάδα) .

Η

Φάρμακα και θεραπείες ακτινοβολίας

οι περισσότεροι φαρμακολογικών παραγόντων έχουν ληφθεί σε μορφή σκόνης από LC Labs και Sellekchem και να ανασυσταθεί σε DMSO. Η τελική συγκέντρωση του DMSO στο μέσο καλλιέργειας δεν υπερέβη το 0,05%. Η bortezomib αναστολέας πρωτεασώματος, ένα FDA εγκεκριμένο φάρμακο που μπλοκάρει NF-κΒ μονοπάτι με αναστολή ΙκΒα πρωτεόλυση [25], χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η συνέργεια φαρμάκου-φαρμάκου. Μια πειραματική αναστολέας ΙΚΚβ GO-Y030 [26] χρησίμευσε ως εναλλακτική αναστολέας σηματοδότηση φαρμακολογική NF-κΒ και ελήφθη από το εργαστήριο του Δρ Shibata του (Akita, Japan).

X-ray ιονίζουσα ακτινοβολία παραδόθηκε σε μία δόση 2 και 5 Gy ακτινοβολίας από ένα RS2000 ακτίνων Χ (Rad Πηγή Technologies).

δοκιμασίες

κυτταροτοξικότητας /πολλαπλασιασμός /βιωσιμότητα

Οι επιπτώσεις των ναρκωτικών, ιονίζουσας ακτινοβολίας και της γενετικής τροποποίησης στα κύτταρα του όγκου επιβίωση και πολλαπλασιασμό μετρήθηκαν με δοκιμασία 72 ώρες σουλφοροδαμίνης Β (SRB) [27], καθώς και με άμεση μέτρηση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων με χρήση Vi-CELL XR την Κυτταρική βιωσιμότητα Analyzer (Beckman Coulter).

In vitro

εισβολή δοκιμασία

καρκίνος του θυρεοειδούς κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5χ10

6 κύτταρα ανά πλάκα, και αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 5% FBS για 6 ώρες. Τα μέσα στη συνέχεια αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με τις μέσα συμπληρωμένα με 0.1% FBS, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 18 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και 1×10

6 κύτταρα σπάρθηκαν στα ανώτερα θαλάμους του Matrigel επικαλυμμένων θαλάμους Transwell (24-φρεατίων, μέγεθος πόρων 8 μm? BD Biosciences) σε RPMI-1640 με 0,1% FBS. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις διπλούν. Κύτταρα εισβάλει στον κατώτερο θάλαμο που περιέχει μέσο με 10% FBS. Μετά από 18 ώρες, μη εισβάλλοντα κύτταρα στον άνω θάλαμο απορρίφθηκαν, και εισβάλλοντα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, χρωματίστηκαν με 3 μg /mL 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ? Invitrogen) και μετρήθηκαν σε πέντε μικροσκοπικά πεδία κάτω από 10x χρησιμοποιώντας το λογισμικό Metamorph (Molecular Devices).

Προβολή των κλινικά σχετικών στοχευμένων φαρμάκων για τη συνέργεια με NF-κΒ αναστολή της οδού

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων που εκφράζουν mIκBα (όπως ένα γενετικό μοντέλο NF -κB αναστολή μονοπάτι, που φαίνεται να παράγει ένα εξαιρετικά αποτελεσματικό φαινότυπο (Σχήμα 1)) εκτιμήθηκε με δοκιμασίες SRB. Τρεις θυρεοειδούς καρκινικές κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε έναν αριθμό κυτταροτοξικών και στοχευμένων θεραπειών. Από τα 15 στοχευμένες θεραπείες που χρησιμοποιούνται για την διαλογή, 12 ήταν αναστολείς κινάσης, DAPT είναι ένας αναστολέας γ-σεκρετάσης, δεκιταβίνη είναι ένας αναστολέας methyltrasferase DNA, και σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA, vorinostat) αναστέλλει αποακετυλασών ιστόνης. Οκτώ καμπύλες απόκρισης δόσης σημείο ελήφθησαν και το ήμισυ της μέγιστης ανασταλτική συγκέντρωση του φαρμάκου (IC

50) υπολογίστηκε με προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων με τη χρήση 4-παραμέτρων λογιστική μη γραμμικής παλινδρόμησης με τη βοήθεια ενός κατά παραγγελία σενάριο R. Επισκέψεις ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση IC

50 για φορέα ελέγχου και mIκBα μεταδιηγερμένα κύτταρα και υποβλήθηκαν σε περαιτέρω αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία SRB και βιώσιμα κύτταρα μετρώντας.

Caspase-3/7 δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων εις διπλούν με πυκνότητα 7.5×10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε RPMI-1640 μέσο συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS). Μετά από ολονύκτια επώαση φάρμακα προστέθηκαν είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό για 24 ώρες και FBS στα μέσα ενημέρωσης άλλαξε σε 0,1%. Caspase-3/7 Δράση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία caspase φωταύγειας που βασίζεται, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Caspase GloTM 3/7 Assay, GloMax Πολύτροπη Reader, Promega).

Στατιστική και συνέργεια υπολογισμούς

Στατιστικοί υπολογισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism. Η συγκεκριμένη μέθοδος ανάλυσης που χρησιμοποιείται και οι υπολογισμένες ρ-τιμές που περιγράφονται στο αντίστοιχο σχήμα μύθο. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση.

δείκτης Bliss ανεξαρτησίας (ΒΙ) και δείκτη συνδυασμού (CI) υπολογίστηκαν ως μέτρο της συνεργική δράση. Ένα BI και CI & lt? 0.8 έγιναν δεκτά ως αποδεικτικά στοιχεία της συνέργειας. BI υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: BI = ((F

α + F

b) – (F

α * F

β)) /F

ab, όπου F

α είναι το αποτέλεσμα μιας θεραπείας φαρμάκου ή ακτινοβολία? F

b είναι το αποτέλεσμα μιας φαρμακολογικής αναστολέα του ΝΡ-κΒ ή mIκBα? (F

α + F

b) – (F

α * F

β) είναι η προβλεπόμενη άθροισμα των επιδράσεων των δύο θεραπείες? F

ab είναι το πραγματικό αποτέλεσμα της θεραπείας συνδυασμού βρεθεί πειραματικά

συνέργεια Φαρμάκων /φαρμάκου αξιολογήθηκε επίσης με τον δείκτη Chou συνδυασμού (CI) [28] χρησιμοποιώντας το λογισμικό Compusyn (http:. //Www. combosyn.com). Για αυτούς τους υπολογισμούς κατασκευάσαμε καμπύλες απόκρισης δόσης 8 σημείων για τα ενιαία συνδυασμού φαρμάκων και ναρκωτικών. CI για IC

50 αναφερθεί.

Αποτελέσματα

Η docetaxel και ιονίζουσα ακτινοβολία ενεργοποιούν NF-κΒ μονοπάτι στα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς

Χρησιμοποιώντας BCPAP και 8505C κύτταρα τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν

Renilla

λουσιφεράσης δραστικότητα ΝΡ-κΒ ως ένδειξη της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ, τόσο θετικό έλεγχο 25 ng /ml TNFa και 5 ηΜ ντοσεταξέλη για 48 ώρες αυξημένη δραστηριότητα ανταποκριτή ΝΡ-κΒ (Σχήμα 2). Η επίδραση της docetaxel ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα BCPAP (σχήμα 2Α και 2Β). Οι αναστολείς της οδού φαρμακολογική ΝΡ-κΒ ήταν αποτελεσματικά στην κατάργηση της docetaxel επαγόμενη αύξηση στη δραστικότητα ρεπόρτερ σε συγκεντρώσεις ≥ 5 ηΜ και ≥ 250 ηΜ για bortezomib (Σχήμα 2Α και 2C) και GO-Y030 (Σχ 2Β και 2D), αντίστοιχα.

Μια χρονική πορεία της επίδρασης της ιονίζουσας ακτινοβολίας σε ΝΡ-κΒ αναφοράς λουσιφεράσης δραστηριότητα σε BCPAP και 8505C κύτταρα δείχνεται στο σχήμα 3Α και 3Β. Παρόμοια με docetaxel, NF-κΒ οδός ενεργοποιήθηκε μετά την έκθεση ≥ 48 ώρες σε ιοντίζουσα ακτινοβολία. Αυτό το εύρημα επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας μία λειτουργική δοκιμασία η οποία μετράται ρ65 δέσμευση σε τμήματα DNA που περιέχουν αλληλουχίες ΝΡ-κΒ σε κύτταρα BCPAP (Σχήμα 3C). Σε mIκBα υπερεκφράζουν κύτταρα, τόσο βασική και την ακτινοβολία που προκαλείται από NF-κΒ σηματοδότηση είχαν μπλοκαριστεί.

πείραμα δέσμευσης p65 DNA έγινε 72 ώρες μετά την έκθεση σε ακτινοβολία. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα προς μη ακτινοβολημένα ομάδα (σε χρόνο μηδέν h για πάνελ Α και Β). * -p & Lt?. 0.05, (αμφίδρομη ANOVA, Bonferroni posttest)

Η

Η έλλειψη ενός συνεργιστική δράση της docetaxel ή την ιονίζουσα ακτινοβολία και φαρμακολογικές ή γενετική αναστολή της οδού NF-κΒ στο θυρεοειδή καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιασμού /θάνατος

η επόμενη σειρά πειραμάτων εξετάστηκαν την υπόθεση ότι η επίδραση των κλινικά σχετικές θεραπείες, όπως docetaxel και ιονίζουσα ακτινοβολία είναι γνωστό για την ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση ενισχύεται από φαρμακολογικές (βορτεζομίμπη και GO-Y030) ή από γενετική (mIκBα ) ΝΡ-κΒ αναστολή σηματοδότησης. Δεν συνέργεια βρέθηκε ανεξαρτήτως της μεθόδου υπολογισμού συνέργειας, δοκιμασία βιωσιμότητας κυτταροτοξικότητας /κύτταρο ή καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε (Πίνακας 1). Ομοίως, καμία συνέργεια βρέθηκε όταν ιοντίζουσα ακτινοβολία σε 2 και 5 δόσεις Gy συνδυάστηκε με αποκλεισμό ΝΡ-κΒ με mIκBα για 48 ή 72 ώρες σε BCPAP και SW1736 κύτταρα (Πίνακας 2).

Η

η docetaxel δεν ενεργοποιεί κασπάση-3/7 σε θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα

αναστολή σηματοδότησης ΝΡ-κΒ ευαισθητοποιεί κύτταρα σε απόπτωση που επάγεται από κυτοκίνες όπως ΤΝΡα [24]. Έχει αναφερθεί ότι docetaxel επάγει επίσης την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς [29], αλλά απέτυχε να δείξει συνέργεια με ΝΡ-κΒ αναστολή μονοπάτι στα πειράματά μας. Λαμβάνοντας αυτή την ασυμφωνία υπόψη αποφασίσαμε να εκτιμήσει κατά πόσον η docetaxel προκαλεί απόπτωση στα μοντέλα μας. Σε αντίθεση με τα δημοσιευμένα στοιχεία, docetaxel, ενώ είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό στη δοκιμασία SRB (IC

50 σε πικομοριακό εύρος, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), απέτυχε να επάγει κασπάσης-3/7 Δράση σε BCPAP και 8505C κύτταρα (Σχήμα 4). Bortezomib, χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος, η δόση εξαρτώμενο ενεργοποιημένη κασπάση-3/7 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές

σημείο αστερίσκοι σε στατιστική σημαντικότητα σε σύγκριση με μια ομάδα χαμηλότερης δόσης (ρ & lt?. 0.05, μονόδρομη ANOVA, posttest Newman-Keuls).

Η

Η επίδραση της docetaxel και βορτεζομίμπης για τον καρκίνο του θυρεοειδούς κυττάρων εισβολής

in vitro

Η

Η επίδραση του συνδυασμού docetaxel /βορτεζομίμπη σε ένα πιο πολύπλοκη όψη της βιολογίας του όγκου, εισβολή μήτρα, ελέγχθηκε (Σχήμα 5). Ο συνδυασμός φαρμάκων συνεργιστικά ανέστειλε την εισβολή 8505C θυρεοειδούς καρκινικών κυττάρων

in vitro

(BI 0,47 προτείνει ένα μέτριο βαθμό συνέργειας), αλλά δεν είχε επίδραση στην εισβολή των κυττάρων THJ16T. Μια τάση μειώθηκε εισβολή στα κύτταρα BCPAP μετά τη θεραπεία με συνδυασμό docetaxel /βορτεζομίμπης δεν ήταν σημαντική

Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντική επίδραση του συνδυασμού του φαρμάκου (p & lt?. 0.05, επαναλαμβανόμενες μετρήσεις μονόδρομη ANOVA, Newman-Keuls posttest ). Η επίδραση των φαρμάκων για την εισβολή των BCPAP και THJ16T κύτταρα δεν ήταν σημαντική. BI-Bliss δείκτη ανεξαρτησίας.

Η

Η διαλογής για φάρμακα τα οποία κυτταροτοξικά /αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς ενισχύεται από NF-κΒ οδού αναστολή με mIκBα

Έχουμε επεκταθεί μας προσπάθειες για την εξεύρεση φαρμάκου /ΝΡ-κΒ συνέργεια αναστολή από την εκτέλεση μιας ανίχνευσης με μία σειρά από κλινικά σχετικές στοχευμένων φαρμάκων. επιλέχθηκε mIκBα ως «καθαρή» μέθοδο του ΝΡ-κΒ η αναστολή της οδού που είναι λιγότερο πιθανό να παράγουν εκτός στόχου επιδράσεις σε σύγκριση με φαρμακολογικές αναστολείς ΝΡ-κΒ. Τρεις κυτταρικές γραμμές μηχανική για να εκφράσει mIκBα και ο φαινότυπος επιβεβαιώθηκε όπως περιγράφεται στο τμήμα των μεθόδων και εμφανίζονται στην δοκιμασία Σχ 1. Η SRB IC

50 τιμές συνοψίζονται στον Πίνακα 3. Πέντε φάρμακα (cabozantinib, dabrafenib, DAPT , selumetinib και βανδετανίμπη) ήταν αναποτελεσματική στην μέγιστη συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν και IC

50 δεν θα μπορούσε να υπολογιστεί. Το everolimus ήταν η πιο ισχυρό φάρμακο. Μεταξύ των τριών κυτταρικών γραμμών, BCPAP ήταν πιο ευαίσθητη και πιο ανθεκτικά 8505C συνολικά και αυτό συσχετίζεται με το ρυθμό πολλαπλασιασμού (δεδομένα δείχνονται τώρα). SAHA ήταν η μόνη ένωση που έδειξε με συνέπεια συνέργεια σε συνδυασμό με mIκBα και μελετήθηκε περαιτέρω.

Η

Η ενίσχυση της SAHA κυτταροτοξικών /αντι-πολλαπλασιαστική από mIκBα επιβεβαιώθηκε σε μία δοκιμασία SRB 12-συγκέντρωση στην BCPAP κύτταρα αλλά όχι σε 8505C ή THJ16T κύτταρα (Σχήμα 6). Η συνέργεια αποδείχθηκε επίσης με άμεση καταμέτρηση των βιώσιμων κυττάρων μετά από 3 ημέρες έκθεσης σε 500 ηΜ του SAHA (ΒΙ = 0,69 και 1,18 για BCPAP και 8505C κύτταρα, αντίστοιχα).

Η διαφορική απόκριση σε SAHA σε κύτταρα BCPAP ήταν σημαντική σε ρ & lt?. 0.0001 (αμφίδρομη ANOVA)

η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να καθορίσει εάν η αναστολή του μονοπατιού NF-κΒ θα μπορούσε συνεργικά αναστέλλουν θυρεοειδούς την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση

in vitro

μοντέλα καρκίνου του θυρεοειδούς. Docetaxel και η ακτινοβολία ενεργοποιούν το μονοπάτι NF-κΒ στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα επιβεβαιώνοντας προηγούμενες παρατηρήσεις [19,20,29]. Ωστόσο, παρά τη μέτρηση κυτταροτοξικότητας /πολλαπλασιασμού, βιωσιμότητα καθώς και εισβολή καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα, χρησιμοποιώντας τόσο φαρμακολογικών και γενετικών ΝΡ-κΒ αναστολής οδού και χρησιμοποιεί δύο αλγορίθμους για τον υπολογισμό του αποτελέσματος συνδυασμού, οι ενδείξεις για συνεργιστική δράση ήταν περιορισμένη. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι η docetaxel και bortezomib μειώθηκε συνεργικά

in vitro

εισβολής μόνο σε κύτταρα 8505C. Από τα 16 φάρμακα (συμπεριλαμβανομένης της docetaxel και 15 άλλα φάρμακα κατά τον έλεγχο) μόνο SAHA συνεργικά μειωμένη κυτταρική ανάπτυξη, όταν η οδός NF-κΒ έχει αποκλειστεί, και το αποτέλεσμα αυτό περιορίζεται σε μία κυτταρική σειρά (BCPAP).

η προφανής διαφορά μεταξύ της τρέχουσας ευρήματά μας και προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες της docetaxel [19] και

131 [20,21] είναι πιθανόν εξηγείται από τις διαφορές στη μεθοδολογία της για την ίδρυση της συνεργιστική δράση. Αληθινή συνέργεια συμβαίνει όταν το αποτέλεσμα της θεραπείας συνδυασμού

υπερβαίνει

ότι το

άθροισμα

των αποτελεσμάτων της κάθε θεραπείας και αυτό πρέπει να αποδεικνύεται ποσοτικά. Απ ‘όσο γνωρίζουμε καμία από τις προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες ασχολήθηκε με το θέμα της συνέργειας με ΝΡ-κΒ αναστολή σηματοδότησης χρησιμοποιώντας την ίδια ποσοτική προσέγγιση όπως σε αυτή τη μελέτη.

Αυξημένη σηματοδότηση ΝΡ-κΒ σε καρκινικά κύτταρα είναι γνωστό να μπλοκάρει την απόπτωση [ ,,,0],30]. ΝΡ-κΒ αναστολή μονοπάτι έχει αποδειχθεί ότι ευαισθητοποιεί τα κύτταρα προς το προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα του ΤΝΡα [24]. Υποθέτουμε ότι η υψηλή δραστικότητα του SAHA σε δοκιμασία συνέργεια είναι αποτέλεσμα της προ-αποπτωτική δραστικότητα αποακετυλάσης ιστόνης αναστολέων [31]. Η έλλειψη επαγωγής απόπτωσης από docetaxel και η κακή απόδοση αυτού του παράγοντα σε αυτή τη μελέτη συνέργεια παρέχουν περαιτέρω στοιχεία που να υποστηρίζουν αυτή την υπόθεση. Ωστόσο, μια λεπτομερής πειραματική διερεύνηση του ρόλου της απόπτωσης στο φάρμακο /NF-κΒ συνέργεια αναστολή οδός είναι πέρα ​​από το πεδίο αυτού του έργου επικεντρώθηκε. Το αποτέλεσμα δυναμικοποίησης SAHA από ΝΡ-κΒ αναστολή μονοπάτι μπορεί να είναι κλινικής ενδιαφέροντος. Ωστόσο, ο ενθουσιασμός μειώνεται από το γεγονός ότι παρατηρήθηκε το αποτέλεσμα αυτό σε μόνο ένα από τα τρία

in vitro

μοντέλα καρκίνου του θυρεοειδούς (και οι μηχανισμοί που ευθύνονται για αυτή την επιλεκτικότητα είναι ασαφείς). Επιπλέον, η μονοθεραπεία SAHA δεν ήταν αποτελεσματική σε μια μελέτη φάσης ΙΙ σε ασθενείς με μεταστατικό ραδιενεργό ιώδιο-πυρίμαχων καρκίνωμα του θυρεοειδούς [32].

Αυτή η μελέτη διερεύνησε διάφορες πτυχές της βιολογίας των όγκων όπως την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή που μπορεί να να μετρηθεί εύκολα

in vitro

. Παραμένει πιθανό ότι το όφελος κατά του όγκου του NF-κΒ αναστολή οδού μπορεί να προκαλείται από πιο πολύπλοκες διαδικασίες που είναι δύσκολο να μελετηθούν σε κυτταρικές γραμμές, όπως η αγγειογένεση, η ανοσολογική απόκριση και άλλα. Επίσης, ο καρκίνος του θυρεοειδούς τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν

in vitro

είναι αποδιαφοροποιημένα [33] και μπορεί να στερούνται φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που είναι σημαντικά για την συνεργιστική δράση των αναστολέων σηματοδότησης ΝΡ-κΒ.

απέδειξε συνεργική δράση του docetaxel και bortezomib για τον καρκίνο του θυρεοειδούς κυττάρων εισβολής, αλλά αυτό περιορίζεται σε μία μόνο κυτταρική σειρά (8505C), το οποίο κάνει και πάλι κάθε εξέταση αυτού του συνδυασμού θεραπείας με προχωρημένο καρκίνο του θυρεοειδούς λιγότερο ελκυστική.

Εν κατακλείδι, διαπιστώθηκε ότι θεραπεία συνδυασμού που περιλαμβάνει αναστολείς μονοπατιού ΝΡ-κΒ είναι περιορισμένο όφελος στον καρκίνο του θυρεοειδούς. Μπορεί να υπάρχουν μέχρι τώρα άγνωστα περιπτώσεις όπου οι αναστολείς του ΝΡ-κΒ μπορεί να θεωρηθεί σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη για τη μείωση εισβολή όγκου ή σε συνδυασμό με αναστολείς HDAC να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου, αλλά αυτό δεν φαίνεται να είναι μια θεραπεία συνδυασμού που θα μπορούσε να εφαρμοστεί ευρέως για να ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του θυρεοειδούς. Περαιτέρω έρευνα μπορεί να προσδιορίσει ποια υποσύνολα των ασθενών /όγκοι μπορεί να ανταποκριθεί σε αυτή την θεραπευτική προσέγγιση.