Αφηρημένο

Η χημειοθεραπεία είναι μια βασική θεραπεία για τον καρκίνο, αλλά η αποτελεσματικότητά του είναι συχνά περιορίζεται από τις δυσμενείς επιπτώσεις της κυτταροτοξικών παραγόντων. Η στοχευμένη παροχή φαρμάκου μπορεί να μειώσει την μη ειδική τοξικότητα της χημειοθεραπείας με επιλεκτική κατεύθυνση αντικαρκινικά φάρμακα σε καρκινικά κύτταρα. MUC 1 πρωτεΐνη είναι ένας ελκυστικός στόχος για ογκο-ειδικά ιδιοκτήτρια χορήγησης φαρμάκου για υπερέκφραση της στα περισσότερα αδενοκαρκινώματα. Σε αυτή τη μελέτη, ένας νέος MUC1 απταμερές αξιοποιείται ως τον συνδέτη στόχευσης για τη διεξαγωγή δοξορουβικίνη (Dox) προς τα καρκινικά κύτταρα. Έχουμε αναπτύξει ένα απταμερές DNA 86-βάσης (MA3), που συνδέεται με ένα πεπτίδιο επίτοπο MUC 1 με ένα

K

δ 38,3 ηΜ και ελάχιστη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με την αλβουμίνη. Χρησιμοποιώντας τον καρκίνο του πνεύμονα Α549 και MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού ως μοντέλα MUC1 εκφράζουν, MA3 βρέθηκε να συνδέεται κατά προτίμηση προς MUC1-θετικά αλλά όχι MUC1-αρνητικά κύτταρα. Ένα απταμερές-δοξορουβικίνη συγκρότημα (Apt-Dox) διατυπώθηκε από παρεμβαλλόμενα δοξορουβικίνη στη δομή του DNA του MA3. Apt-Dox βρέθηκε ικανό να μεταφέρει doxorubicin σε καρκινικά κύτταρα MUC1-θετικά, ενώ μειώνει σημαντικά την λήψη του φαρμάκου από MUC1-αρνητικά κύτταρα. Επιπλέον, Apt-Dox διατήρησε την αποτελεσματικότητα της δοξορουβικίνης έναντι κυττάρων όγκου MUC1-θετικό, αλλά μείωσε την τοξικότητα σε MUC1-αρνητικά κύτταρα (Ρ & lt? 0,01). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η απταμερές MUC1 μπορεί να έχει πιθανή χρησιμότητα ως συνδέτης στόχευσης για επιλεκτική διανομή του κυτταροτοξικού παράγοντα σε όγκους MUC 1 που εκφράζουν

Παράθεση:. Hu Υ, Duan J, Zhan Q, Wang F, Lu Χ, Yang XD (2012) Μυθιστόρημα MUC1 απταμερές εκδίδει Επιλεκτικά κυτταροτοξικός παράγοντας σε καρκινικά κύτταρα in vitro. PLoS ONE 7 (2): e31970. doi: 10.1371 /journal.pone.0031970

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Σεπτεμβρίου του 2011? Αποδεκτές: 19 του Ιανουαρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 22 Φεβρουαρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από το κινεζικό υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας (2011CB933504, 2011CB911004, 2011CB911003) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81.071.870)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

η χημειοθεραπεία είναι μια αναγκαία θεραπεία για τον καρκίνο, ειδικά για τα τέλη του σταδίου μεταστατική νόσο. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας περιορίζεται συχνά από τις δυσμενείς επιπτώσεις των κυτταροτοξικών παραγόντων που χρησιμοποιούνται στις περισσότερες θεραπευτικές αγωγές. Ένα σημαντικό πρόβλημα που σχετίζεται με κυτταροτοξικά φάρμακα είναι ότι προκαλούν βλάβες στα δύο καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικό ιστό, δημιουργώντας σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες που συχνά περιορίζουν την ένταση και τη διάρκεια της χημειοθεραπείας. Κατά συνέπεια, είναι συχνά δύσκολο για τα κυτταροτοξικά φάρμακα για την εξάλειψη όλων των καρκινικών κυττάρων εντός του σώματος, με αποτέλεσμα την αποτυχία της θεραπείας και πτωχή πρόγνωση. Η παράλειψη αυτή υπογραμμίζει την ανάγκη για την ανάπτυξη ολοένα και πιο ισχυρή θεραπεία με μειωμένη τοξικότητα. Μία προσέγγιση για την επίτευξη του στόχου είναι στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου, στο οποίο αντικαρκινικά φάρμακα επιλεκτικά παραδίδονται σε καρκινικά κύτταρα, έτσι ώστε η κυτταροτοξικότητα εναντίον του όγκου ενισχύεται ενώ οι ανεπιθύμητες ενέργειες μειώνονται. Στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου κατέχει υπόσχεση για τη βελτίωση αντικαρκινική αποτελεσματικότητα. Έχει αναφερθεί ότι απταμερούς κατευθυνόμενων μεταφορέων που περιέχει πακλιταξέλη μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την αποτελεσματικότητα κατά του καρκίνου του προστάτη σε ζωικά μοντέλα [1]. Τα μονοκλωνικά αντισώματα έχουν επίσης ομοιοπολικά συνδεδεμένο με φάρμακα για στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου [2]. Μια μελέτη του trastuzumab emtansine (T-DM1), ένα συζυγές του εξανθρωπισμένου αντισώματος αντι-ΗΕΚ2 και ένα χημικό φάρμακο, είναι σήμερα στην ΙΙΙ κλινική δοκιμή φάσης [3].

Ένα τυπικό σύστημα παροχής φάρμακο που στοχεύει συνήθως συνίσταται ενός αντικαρκινικού φαρμάκου και ενός συνδετήρα στόχευσης, το οποίο μπορεί να δεσμεύεται ειδικά σε δείκτες όγκου που εκφράζουν άφθονα σε καρκινικά κύτταρα [4]. Ένα ιδανικό καρκινικού δείκτη για στοχευμένη θεραπεία θα πρέπει να είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης η οποία υπερεκφράζεται στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, με σχετικά χαμηλή έκφραση σε φυσιολογικό ιστό. MUC 1 είναι μία καλά χαρακτηρισμένη μεγάλο διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που δυνητικά μπορεί να χρησιμεύσει ως στόχος για αντικαρκινική θεραπεία. Η έκφρασή του αυξάνεται κατά τουλάχιστον 10 φορές στα περισσότερα κακοήθη αδενοκαρκινώματα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, καρκίνο του πνεύμονα, και καρκίνο του παχέος εντέρου, καθιστώντας το ένα ελκυστικό δείκτης όγκου για στοχευμένη θεραπεία [5]. Εκτός από το δείκτη όγκου, ο συνδετήρας όγκο στόχευσης είναι επίσης ένα σημαντικό στοιχείο για την στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου. Ένα ιδανικό συνδέτη στόχευσης θα πρέπει να έχουν υψηλή συγγένεια πρόσδεσης για το δείκτη όγκου, με καλή ειδικότητα και χαμηλή ανοσογονικότητα [6]. Τον τελευταίο καιρό, νέους παράγοντες στόχευσης, συμπεριλαμβανομένης απταμερή [7], βραχέα πεπτίδια [8] και άλλα μικρά μόρια [9], έχουν γίνει η νέα γενιά μορίων στόχευσης. Τα απταμερή είναι μονής έλικας ολιγονουκλεοτίδια τα οποία μπορεί να συνδέονται προς μόρια στόχους με υψηλή συγγένεια και εξειδίκευση. Συγκρίνοντας με μονοκλωνικά αντισώματα, απταμερή έχουν διακριτικό πλεονεκτήματα ως συνδετήρας στοχοθέτησης: υψηλή συγγένεια για σύνδεση με τα περισσότερα μόρια, περιορισμένο κόστος σύνθεσης, χαμηλής ανοσογονικότητας, και το μικρό μέγεθος που του επιτρέπει να διεισδύσει στερεούς όγκους [10]. Λόγω αυτών των πλεονεκτημάτων, έχουν απταμερή έχουν χρησιμοποιηθεί ως νέα συνδεσμικά στόχευση σε συστήματα χορήγησης φαρμάκων κατά του καρκίνου του προστάτη [11], [12], [13] και της λευχαιμίας [14]. Για τον δείκτη όγκου του MUC1, Ferreira et al έχουν αναπτύξει διάφορα απταμερή, τα οποία θα μπορούσαν να δεσμεύονται με τα καρκινικά κύτταρα MUC1-θετικών [15]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι τα απταμερή MUC1 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να παραδώσει επιλεκτικά παράγοντα φωτοθεραπεία σε καρκινικά κύτταρα

in vitro

[16].

Τα κυτταροτοξικά φάρμακα είναι τα κύρια συστατικά των περισσότερων χημειοθεραπευτικά σχήματα για τον καρκίνο θεραπεία. Επομένως, είναι σημαντικό να διερευνηθεί κατά πόσον MUC1 απταμερούς μπορεί να χρησιμοποιηθεί άμεσα για να παραδώσει επιλεκτικά κυτταροτοξικό παράγοντα για τα καρκινικά κύτταρα. Μέχρι στιγμής, ωστόσο, κανένα τέτοιο μελέτη έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία. Εδώ σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει μια νέα MUC1 απταμερούς, και αξιολογήθηκαν την ικανότητά της για την παράδοση δοξορουβικίνη σε κύτταρα καρκίνου

in vitro

. Συγκεκριμένα, επιλέγεται ένα απταμερές DNA 86-βάσης (που ονομάζεται MA3) έναντι ενός πεπτιδίου επίτοπο MUC 1, και αξιολογήθηκαν συγγένεια δέσμευσης της προς MUC1-θετικών και -αρνητική κύτταρα. Για να διερευνήσουν την ειδικότητα πρόσδεσης του απταμερούς, αξιολογήσαμε επίσης τη δέσμευση του σε λευκωματίνη, η οποία είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη στο πλάσμα και μπορεί να συνδέονται μη-ειδικά με απταμερή και να παρεμβαίνει με τη λειτουργία στόχευσης τους. Η δοξορουβικίνη είναι ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα αντικαρκινικά φάρμακα, και μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω παρεμβολής στη δομή του DNA σε πυρήνες κυττάρων. Ένα απταμερές-δοξορουβικίνη συγκρότημα (Apt-Dox) διαμορφώθηκε με την ενσωμάτωση δοξορουβικίνη στη δομή απταμερούς της MA3. Τώρα αναφέρουν ότι Apt-Dox μπορεί να προσφέρει επιλεκτικά δοξορουβικίνη σε MUC1-θετικά κύτταρα

in vitro

.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

εναύσματα ολιγονουκλεοτιδίων συντίθεται από Invitrogen (Σαγκάη της Κίνας). Τα πεπτίδια τουλάχιστον 95% καθαρότητα συντέθηκαν με SBS Genetech (Πεκίνο Κίνα). λευκωματίνη βόειου ορού (BSA) αγοράστηκε από Tbdscience (Tianjin της Κίνας). Μονοδιασπαρμένη μικροσφαιρίδια μαγνητική ουρίας-φορμαλδεΰδης αγοράστηκαν από την Έναρξη Chromtech (Tianjin της Κίνας). Η θρυψίνη αγοράστηκε από Amresco (ΗΠΑ). Επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια αγοράστηκαν από την Promega (US). 1-αιθυλ-3- (3-dimethyllaminopropyl) καρβοδιϊμίδιο (EDC) αγοράστηκε από την Sigma (US).

Οι κυτταρικές σειρές

ανθρώπινου καρκίνου του μαστού (MCF-7), ανθρώπινη καρκίνο του ήπατος (HepG2), ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα (Α549), και φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινου ήπατος (L02) ελήφθησαν από το Κέντρο κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και ένα μίγμα από πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα στην εκθετική φάση ανάπτυξης.

Ακινητοποίηση στόχου σε μαγνητικά σφαιρίδια

Ο στόχος για την επιλογή απταμερές είναι ένα 9-AA πεπτίδια (peptide1) με την αλληλουχία του APDTRPAPG. Η σύζευξη του στόχου σε μαγνητικά σφαιρίδια επιτεύχθηκε μέσω εγκάρσιας σύνδεσης του -COOH και -ΝΗ2. Δύο μα peptide1 αναμίχθηκε με 5 × 10∧5 καρβοξυλιωμένων μαγνητικά σφαιρίδια, και επωάστηκαν με 200 μΙ EDC (40 mM) σε θερμοκρασία δωματίου με ήπια ανάδευση για 2 ώρες. Τα μαγνητικά σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό Hanks, και αποθηκεύεται στους 4 ° C. Παρόμοια μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τη σύζευξη των σφαιριδίων με άλλες ουσίες, συμπεριλαμβανομένων των BSA και ένα 29-ΑΑ long πεπτίδια με την αλληλουχία του GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (peptide2).

βιβλιοθήκη SELEX και εκκινητές

Μια αρχική βιβλιοθήκη DNA που αποτελείται από 86-μερή ολιγονουκλεοτίδια με κεντρική 40-βάσεων μακρύ τυχαίες αλληλουχίες συνετέθη. Η αλληλουχία του βιβλιοθήκη είναι 5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-N40-CACAGACACACTACACACGCACA3 ‘, όπου το Ν παριστά μία τυχαιοποιημένη νουκλεοτιδίων είτε Α, G, C ή Τ Ένα FITC-επισημασμένο 5′ εκκινητής (5’-FITC-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3 ‘) και ένα βιοτίνη-επισημασμένη 3 ‘εναρκτήρα (5′-Β-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’) χρησιμοποιήθηκαν στην PCR για τη σύνθεση του διπλά επισημασμένου, δίκλωνα μόρια DNA, το οποίο στη συνέχεια αναμίχθηκε με επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τη μετουσίωση σε αλκαλικές συνθήκες (0,1 Μ ΝαΟΗ), το συζευγμένο με FITC αίσθηση μονού κλώνου DNA (ssDNA) διαχωρίστηκε από το επισημασμένο με βιοτίνη αντιπληροφοριακό κλώνο ssDNA με επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια και να χρησιμοποιηθούν για την επιλογή απταμερές.

η in vitro επιλογή απταμερών στόχου δέσμευσης

Οι διαδικασίες επιλογής ήταν ως ακολούθως. Η πισίνα ssDNA (200 pmol) θερμάνθηκε πρώτα στους 95 ° C για 5 λεπτά και στη συνέχεια ψύχεται αμέσως σε 0 ° C σε ρυθμιστικό (ρυθμιστικό διάλυμα Hanks) σύνδεση για 15 λεπτά πριν δέσμευσης για στόχευση. Για τη μείωση παρεμβολής υποβάθρου, 0,1 mg /ml DNA σπέρματος σολωμού και 1 mg /ml του BSA προστέθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης. Στον αρχικό γύρο επιλογής, τα σφαιρίδια επικαλυμμένα με peptide1 εναιωρήθηκαν σε 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης που περιέχει 200 ​​pmol τυχαίων ssDNA. Μετά από επώαση του μίγματος στους 37 ° C για 30 λεπτά με ήπια ανακίνηση, τα μη δεσμευμένα ολιγονουκλεοτίδια απομακρύνθηκαν με πλύση τέσσερις φορές με 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Στη συνέχεια, τα μίγματα σφαιριδίων δεσμευμένο ολιγονουκλεοτιδίων ενισχύονται με PCR με FITC- ή επισημασμένο με βιοτίνη εκκινητές (25 κύκλοι των 40 sec στους 94 ° C, 30 sec στους 65 ° C, 40 sec στους 72 ° C, ακολουθούμενο από 10 min στους 72 ° C, η πολυμεράση Taq και dNTPs αποκτήθηκαν από την Takara). Η επακόλουθη dsDNA από την PCR διαχωρίστηκε σε ssDNA μέσω της διαδικασίας που περιγράφεται παραπάνω. Η επιλεγμένη έννοια ssDNA διαχωρίζεται από το βιοτινυλιωμένο αντινοηματικό κλώνο DNA με επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκε για τον επόμενο γύρο του SELEX. Μετά από αρκετούς γύρους επιλογής, το επιλεγμένο πισίνα ssDNA ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές μη τροποποιημένων και κλωνοποιήθηκε σε Escherichia Coli με το κιτ κλωνοποίησης ΤΑ για αλληλούχιση του DNA.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για την παρακολούθηση της εμπλουτισμού υποψηφίων απταμερούς μετά την επιλογή, το FITC-επισημασμένο πισίνα ssDNA επωάστηκε με peptide1 επικαλυμμένα μαγνητικά σφαιρίδια σε 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος επιλογής που περιείχε 10% FBS στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με 0.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης και στη συνέχεια αιωρήθηκε σε 0.2 ml ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης. Ο φθορισμός FITC προσδιορίστηκε με FACScalibur κυτταρόμετρο (Accuri C6, ΗΠΑ). Η FITC-επισημασμένο τυχαιοποιημένη βιβλιοθήκη ssDNA χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του σήματος ελέγχου.

Η συγγένεια δέσμευσης απταμερών προσδιορίστηκε με επώαση peptide1 επικαλυμμένα μαγνητικά σφαιρίδια με διάφορες συγκεντρώσεις FITC-επισημασμένο απταμερές σε 200 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης σε 37 ° C για 30 λεπτά. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με 0.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης, αιωρήθηκε σε 0.2 ml ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης, και υποβλήθηκε σε κυτταρομετρίας ροής ανάλυση. Η FITC-επισημασμένο μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη ssDNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος για τον προσδιορισμό μη ειδικής σύνδεσης. Όλα τα πειράματα για προσδιορισμό δέσμευσης επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Η μέση ένταση φθορισμού του στόχου επισημασμένου με απταμερή χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί για σύνδεση με την αφαίρεση της μέση ένταση φθορισμού των μη ειδική σύνδεση από μη επιλεγμένα DNA βιβλιοθήκη [17] ειδικό. Οι σταθερές διάστασης ισορροπίας (

K

δ) της αλληλεπίδρασης απταμερούς-peptide1 ελήφθησαν με την τοποθέτηση του εξάρτηση της έντασης φθορισμού του ειδικής δέσμευσης από τη συγκέντρωση των απταμερών με την εξίσωση Y = Β max X /(Kd + Χ).

για την αξιολόγηση της ειδικής σύνδεσης της απταμερών να στοχεύσει, το ΡΙΤΟ-επισημασμένο απταμερές χωριστά επωάστηκε με peptide1-, peptied2-, ή BSA επικαλυμμένα μαγνητικά σφαιρίδια. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με 0.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης, αιωρήθηκε σε 0.2 ml ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Για την αξιολόγηση της δέσμευσης σε κύτταρα απταμερές, τα κύτταρα αποξέστηκαν από την φιάλη καλλιέργειας και πλένεται με ρυθμιστικό Hanks. Η FITC-επισημασμένο απταμερές επωάστηκε με 10∧5 είτε MCF-7, Α549, HepG2 ή L02 κύτταρα σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό Hanks και αναλύθηκαν με cytometrey ροής.

Cells και siRNA διαμόλυνση

Α549 κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 1-3 × 10

5cells /καλά, που καλλιεργούνται σε μέσα χωρίς αντιβιοτικά όλη τη νύκτα, και επιμολύνθηκαν με MUC1 siRNA ή ελέγχουν siRNA [18] χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 σε Ορίί-ΜΕΜ Ι ελαττωμένη ορό μέσο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen Technology Life, Inc.). Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υπέστησαν χρώση με FITC επισημασμένο απταμερούς για κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας, και κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν για ανάλυση ανοσοστυπώματος.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα λύματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα υποσυρρέοντα. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Τα ανοσοαποτυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντι-MUC 1 αντισωμάτων. Τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο και ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL).

Φόρτωση του απταμερούς με δοξορουβικίνη

Τα απταμερή πρώτα θερμαίνεται στους 95 ° C για 5 λεπτά και στη συνέχεια ψύχεται αμέσως στους 0 ° C σε νερό για 15 λεπτά. Τα απταμερή επωάστηκαν σε ένα υδατικό διάλυμα ντοξορουμπικίνης (3 ηΜ) για 1 ώρα σε μια μαύρη πλάκα 96-φρεατίων σε διάφορες απταμερούς /DOX μοριακές αναλογίες. Το φάσμα φθορισμού του doxorubicin εξετάστηκε στη συνέχεια με έναν αναλυτή Synergy4 (λεΧ = 488 nm, λε ™ = 500-700 nm). FITC-επισημασμένο Apt-Dox ή Αερ-Dox επωάστηκαν με κύτταρα Α549 σε ρυθμιστικό σύνδεσης σε 37 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό Hanks και αναλύθηκαν με cytometrey ροής.

Κυτταρική πρόσληψη ντοξορουμπικίνης

Η συγκεκριμένη κυτταρική πρόσληψη Apt-Dox με MUC1-θετικού κυττάρου Α549 μελετήθηκε με ομοεστιακό σαρώσεως φθορισμού μικροσκοπία (Perkin Elmer Ultraview, ΗΠΑ) και κυτταρομετρία ροής. HepG2 κύτταρο χρησιμοποιήθηκε ως MUC1-αρνητικό έλεγχο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν σε μια γυάλινη καλυπτρίδα για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 1.5 μΜ της Dox ή απταμερές-Dox για 2 ώρες στους 37 ° C. Αφού πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό Hanks, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης φθορισμού.

Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα κύτταρα αποξέονται από την φιάλη καλλιέργειας και πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό Hanks. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 1,5 μΜ Dox ή απταμερές-Dox για 4 ώρες στους 37 ° C, και πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό Hanks. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά και αναλύθηκε με cytometriy ροής.

MTS δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα της Apt-Dox ή Dox έναντι Α549 και κύτταρα HepG2, και οι δύο κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν πρώτα σε πλάκες 96-φρεατίων και στη συνέχεια συν-επωάζονται στους 37 ° C με Apt-Dox, Dox, ή απταμερές σε συγκέντρωση 3 μΜ για 4 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό Hanks για δύο φορές, και καλλιεργήθηκαν για περαιτέρω 48 ώρες. Στη συνέχεια, δοκιμασία MTS (Promega, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων ανά πρότυπο πρωτόκολλο που περιγράφεται από την κατασκευή.

Στατιστικά

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Συστήματος Στατιστικής Ανάλυσης (SAS, έκδοση 9.2 ). Μονόδρομη ANOVA με ελάχιστη σημαντική διαφορά του Fisher (LSD) post hoc συγκρίσεις σε διάστημα εμπιστοσύνης 99% χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές συγκρίσεις. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται ως μέση τιμή με την τυπική απόκλιση που αναφέρεται (μέση τιμή ± SD).

Αποτελέσματα

επιλογή Απταμερές και χαρακτηρισμός

Η εξωκυττάρια πρωτεΐνη πυρήνα της MUC1 γίνεται επάνω από μεταβλητό αριθμό μιας εξαιρετικά διατηρημένη αλληλουχία διαδοχικών επαναλήψεων οποία απαρτίζεται από 20 αμινοξέα (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) [19]. Μεταξύ των διαδοχική επανάληψη, η APDTRPAPG αλληλουχία είχε αναγνωριστεί ως η πλέον ανοσοκυρίαρχο πεπτιδικό επίτοπο [20], και χρησιμοποιήθηκε ως στόχος για την επιλογή απταμερές MUC1 σε προηγούμενη έρευνα [15]. Εδώ σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε επίσης αυτήν την πεπτίδια ως στόχος στη μέθοδο μας SELEX. Οι στόχοι πεπτίδια ομοιοπολικά συζευγμένο σε μαγνητικά σφαιρίδια χρησιμοποιώντας EDC ως καταλύτη. Κατά τη διάρκεια κάθε γύρο επιλογής, τα σφαιρίδια επωάστηκαν με FITC-επισημασμένο πισίνα ssDNA, και ο εμπλουτισμός των απταμερών παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Σε σύγκριση με την τυχαία DNA από την πισίνα βιβλιοθήκη, έναν αυξανόμενο όγκο ssDNA δεσμεύεται με στόχο-επικαλυμμένα μαγνητικά σφαιρίδια μετά από κάθε γύρο επιλογής (Εικ. 1). Τα απταμερή στην συνέχεια κλωνοποιήθηκαν, και 50 κλώνοι αναλύθηκαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό. Μεταξύ αυτών των κλώνων, ένας apatmer ονομάζονται MA3 έδειξαν σχετικά υψηλή σύνδεση προς τα πεπτίδια MUC 1-στόχο. Η αλληλουχία DNA του MA3 απταμερούς είναι 5′AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3′.

Compared με το αρχικό πισίνα τυχαίου DNA (σκιασμένο ιστόγραμμα), κυτταρομετρία ροής αποκάλυψε μια αύξηση στην ένταση φθορισμού των απταμερών δεσμευμένο στο πεπτίδιο MUC 1 (APDTRPAPG) μετά την τρίτη (το γκρι καμπύλη) και πίσω (η μαύρη καμπύλη) γύρους επιλογής.

Βιβλιοδεσία ειδικότητα είναι σημαντική για την αξιολόγηση των επιδόσεων απταμερούς. Από αλβουμίνη είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη στο αίμα, εξετάσαμε την σύνδεση του απταμερούς MA3 με την αλβουμίνη. Λευκωματίνη ή MUC1 πεπτίδια επικαλυμμένα σφαιρίδια επωάστηκαν με FITC-επισημασμένο MA3, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Μη επιλεγμένο τυχαία DNA από την πισίνα βιβλιοθήκη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 2, ο απταμερές MA3 δημιουργείται μια σημαντική δέσμευση σε MUC1 πεπτιδίων (Σχ. 2Α), αλλά ένας σχετικά ασθενής σύνδεση σε BSA παρόμοια με αυτή που δημιουργείται από τυχαία DNA (Σχ. 2Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, μεταξύ των πεπτιδίων MUC1 και λευκωματίνη, το απταμερές MA3 εμφάνισε εξειδίκευση στόχευσης έναντι της πρώτης. Ως σύγκριση, παρόμοια πειράματα διεξήχθησαν για άλλη απταμερές MUC1, S2.2, η οποία είχε το χαμηλότερο

K

d μεταξύ όλων των δημοσιευμένων απταμερή MUC1 [15], [16]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ S2.2 μπορούσε να συνδεθεί με MUC1 πεπτιδίων (Σχ. 2C), το δεσμευμένο και με τη λευκωματίνη σε ένα βαθμό (Σχ. 2D). Τα δεδομένα έδειξαν ότι, σε σύγκριση με S2.2, MA3 είχε μια χαμηλότερη εγκάρσια αντιδραστικότητα με την αλβουμίνη.

(Α) MUC1-πεπτιδίου χάντρες σε κατεργασία με MA3. σφαιρίδια (Β) BSA σε επεξεργασία με MA3. (C) MUC1-πεπτιδίου χάντρες σε κατεργασία με S2.2. σφαιρίδια (D) BSA σε επεξεργασία με S2.2. Τα γεμάτα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τα σήματα φθορισμού ελέγχου που παράγονται από FITC-επισημασμένο τυχαία DNA από την πισίνα βιβλιοθήκη.

Η

Για να αξιολογηθεί ποσοτικά την συγγένεια δέσμευσης του απταμερούς να MUC1, σφαιρίδια επικαλυμμένα με MUC1 πεπτίδια επωάστηκαν με FITC -επισημασμένο MA3 διαφόρων συγκεντρώσεων (Εικ. 3Α). Χρησιμοποιώντας την ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης, η απταμερές βρέθηκε να έχει ένα

K

δ 38,3 ηΜ. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω κατά πόσον το απταμερές MA3 θα δεσμεύεται με δομή MUC1, εξετάσαμε επίσης συνδεθεί με μια 29-ΑΑ πεπτιδίων (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP) που περιέχει ολόκληρη την αλληλουχία διαδοχική επανάληψη (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS), που αποτελείται από την εξωκυτταρική πρωτεΐνη πυρήνα MUC1. Τα πεπτίδια 29-ΑΑ ομοιοπολικά συζευγμένο με μαγνητικά σφαιρίδια, τα οποία επωάστηκαν με FITC-επισημασμένο MA3 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. FITC-επισημασμένο τυχαία DNA από την πισίνα βιβλιοθήκη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, MA3 παράγεται ένα σήμα φθορισμού που ήταν σημαντικά πιο ισχυρή από τυχαία DNA, υποδεικνύοντας ότι η απταμερές θα μπορούσε επίσης να συνδεθεί με μια δομή που περιέχει ολόκληρη την αλληλουχία επανάληψης MUC1 tandem. Δεδομένου ότι η εξωκυτταρική περιοχή της πρωτεΐνης πυρήνα MUC1 αποτελείται κυρίως από τις διαδοχικές επαναλήψεις, είναι πιθανό ότι ο απταμερές MA3 μπορεί να αναγνωρίζει τη δομή MUC1 εκτίθεται στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν MUC1-.

(Α) Ποσοτική δοκιμασία της συγγένειας μεταξύ FITC-επισημασμένο MA3 και το επιτόπιο MUC 1 (APDTRPAPG). (Β) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της πρόσδεσης μεταξύ FITC-επισημασμένο MA3 και το πεπτίδιο MUC 1 26-ΑΑ (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP). Το γεμάτο ιστόγραμμα είναι το υπόβαθρο φθορισμού ελέγχου που παράγονται από FITC-επισημασμένο τυχαία DNA από την πισίνα βιβλιοθήκη.

Η

MA3 απταμερές δεσμεύει επιλεκτικά σε καρκινικά κύτταρα MUC1 εκφράζουν

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον απταμερούς MA3 θα δεσμεύονται σε MUC1-καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν, FITC-επισημασμένο MA3 επωάστηκε είτε με το MUC 1-θετικής (Α549 ή MCF7) [21], [22] ή το MUC 1-αρνητικά (HepG2 ή L02) κυτταρικές γραμμές [21], [23]. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας τα κύτταρα επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο τυχαία DNA ως έλεγχο. Τα προφίλ κυτταρομετρίας ροής που παρουσιάζονται στο Σχήμα 4. Για MUC1-θετικές κυτταρικές σειρές Α549 και θεραπεία MCF7, MA3 σήματα που παράγονται φθορισμού που ήταν σημαντικά πιο ισχυρή από εκείνη των τυχαίων θεραπεία DNA (Σχ. 4Α και Β). Ωστόσο, για MUC1-αρνητικές κυτταρικές γραμμές HepG2 και L02, θεραπεία MA3 οδήγησε σε σήματα φθορισμού που ήταν παρόμοια με εκείνη των τυχαίων θεραπεία DNA (Σχ. 4C και D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο απταμερές MA3 μπορούσε κατά προτίμηση συνδέονται προς MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα και ότι το απταμερές θα μπορούσε να αναγνωρίσει τη δομή MUC1 επί αυτών των κυττάρων.

Τα ιστογράμματα παρήχθησαν μετά από επώαση με FITC-επισημασμένο MA3 με Α549 (Α ), κύτταρα MCF7 (Β), HepG2 (C), και L02 (D), αντίστοιχα. Τα γεμάτα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τα σήματα φθορισμού ελέγχου που παράγονται από FITC-επισημασμένο τυχαία DNA από την βιβλιοθήκη της πισίνας.

Η

έκφραση MUC1 επηρεάζει τη δέσμευση του απταμερούς σε κύτταρα όγκου

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η δέσμευση του απταμερούς σε κύτταρα όγκου MUC1-θετικό, η έκφραση της MUC 1 πρωτεΐνης σε Α549 και κύτταρα HepG2 αξιολογήθηκαν με στύπωμα western με αντι-MUC 1 αντισωμάτων. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 5Α, ενώ τα κύτταρα Α549 που εκφράζονται MUC1 πρωτεΐνη σε άφθονη ποσότητα, κύτταρα HepG2 δεν το έκανε, γεγονός που υποδηλώνει ότι Α549 ήταν πράγματι MUC1-θετική κυτταρική σειρά και ότι HepG2 ήταν ένα MUC1-αρνητική κυτταρική σειρά. Τα αποτελέσματα είναι σε συμφωνία με πολλαπλές δημοσιευμένες μελέτες, οι οποίες αναλύονται διεξοδικά την έκφραση της MUC 1 σε διάφορες κυτταρικές γραμμές και προσδιορίζονται σαφώς Α549 ως MUC1-θετικών και HepG2 ως κυτταρική σειρά MUC1-αρνητικά [18], [24].

(Α) κηλίδες Western εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από κύτταρα Α549, κύτταρα HepG2, κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με έλεγχο siRNA, και τα κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με MUC1 siRNA, αντίστοιχα. Η ακτίνη επίσης κηλιδώθηκε για να χρησιμεύσει ως μάρτυρας. (Β και Γ) Η κυτταρομετρία ροής αξιολόγηση της apatamer για σύνδεση σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με MUC1 siRNA (Β) ή ελέγχου siRNA (C). Τα γεμάτα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τα σήματα φθορισμού ελέγχου που παράγονται από FITC-επισημασμένο τυχαία DNA από την πισίνα βιβλιοθήκη.

Η

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της έκφρασης MUC 1 επί του απταμερούς για δέσμευση σε MUC1-θετικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε MUC1 siRNA που είχε προηγουμένως δείξει ικανή να χτυπήσει κάτω την έκφραση MUC1 [18]. Το siRNA επιμολύνθηκε στα MUC1-θετικών κυττάρων Α549, και επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western που θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση MUC 1 (Σχ. 5Α). Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με MUC 1 siRNA ή όργανα ελέγχου siRNA, επωάστηκαν με FITC-επισημασμένο απταμερούς, και αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 5Β και C, η σύνδεση με τα κύτταρα απταμερές ήταν σημαντικά μειωμένη μετά προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης MUC 1 (Εικ. 5Β), ενώ η σύνδεση προς κύτταρα που κατεργάζονται με siRNA ελέγχου δεν επηρεάστηκαν (Εικ. 5C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση MUC1 στα κύτταρα στόχους επηρεάζεται συγγένεια του απταμερούς να αυτά τα κύτταρα, και ότι η απώλεια της MUC1 πρωτεΐνη θα μπορούσε να μειώσει την significantl δεσμευτικός απταμερούς

y

.

Φόρτωση απταμερούς με Dox

για να παραδώσει Dox σε καρκινικά κύτταρα MUC1-θετικό, ένα απταμερές-δοξορουβικίνη συγκρότημα (Apt-Dox) διαμορφώθηκε από παρεμβαλλόμενα δοξορουβικίνη στη δομή του DNA του απταμερούς MA3. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον Dox ήταν πράγματι ενσωματωθεί MA3, κάναμε χρήση του φαινομένου που ο φθορισμός από Dox θα σβήνεται μετά παρεμβολής σε DNA [25]. Συγκεκριμένα, διεξάγονται μελέτες σύνδεσης μεταξύ MA3 και Dox, και φασματοσκοπία φθορισμού στους μη να εκτιμηθεί το φθορίζον σήμα που παράγεται από δοξορουβικίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, διαδοχική μειώσεις στη μητρική φάσμα φθορισμού του Dox παρατηρήθηκαν όταν μια σταθερή συγκέντρωση του Dox επωάστηκε με αυξανόμενη μοριακή αναλογία του απταμερούς MA3. Όταν το απταμερές /DOX μοριακή αναλογία έφθασε 0.1, το φάσμα φθορισμού της Dox ήταν στο χαμηλότερο επίπεδο και δεν άλλαξε περαιτέρω, υποδεικνύοντας ότι οι περισσότεροι DOX είχε ενσωματώσει στη δομή του DNA του MA3 σε αυτήν την αναλογία απταμερούς /DOX.

(Α) φθορισμού φάσματα διαλύματος ντοξορουμπικίνης αναμιγνύονται με αυξανόμενες μοριακές αναλογίες του απταμερούς MA3 (από πάνω προς τα κάτω: 0, 0.001, 0.003, 0.005, 0.01, 0.03, 0.1, και 1). κύτταρα (Β) Α549 σε επεξεργασία με FITC-επισημασμένο MA3 απταμερές. κύτταρα (C) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Α549 FITC-επισημασμένο Apt-Dox. Τα γεμισμένα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τα σήματα φθορισμού ελέγχου που παράγονται από FITC-επισημασμένο τυχαία DNA από την πισίνα βιβλιοθήκη.

Η

Για να διερευνηθεί αν η παρεμβολή της doxorubicin σε απταμερούς θα παρεμβαίνει με συγγένεια του απταμερούς να MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα , η σύνδεση του Apt-Dox συγκρότημα σε κύτταρα Α549 αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής, και σε σύγκριση με εκείνη του μόνος MUC1 απταμερούς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β και C, Apt-Dox σύμπλοκο (Εικ. 6C) είχε μια συγγένεια με Α549 κύτταρα που ήταν παρόμοια με μόνη MUC1 απταμερές (Εικ. 6Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρεμβολή της doxorubicin σε MUC1 απταμερές δεν παρεμβαίνει σημαντικά με την δέσμευση του απταμερούς σε κύτταρα όγκου MUC1-θετική.

απταμερή ως οχήματα για την επιλεκτική διανομή της δοξορουβικίνης σε MUC1 θετικά καρκινικά κύτταρα

Η μη εκλεκτικό πρόσληψη της ελεύθερης Dox τόσο από καρκίνο και τα φυσιολογικά κύτταρα είναι πρωταρχική αιτία για ανεπιθύμητες δράσεις της έναντι του φυσιολογικού ιστού. Όταν Dox έχει παρεμβάλλεται στη δομή του DNA του απταμερούς MUC1 (ΑΡΤ-Dox), το σύμπλοκο μπορεί κατά προτίμηση δεσμεύονται με MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα. Για να ελεγχθεί αυτή αξίωμα, οι ιδιότητες φθορισμού του doxorubicin χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η πρόσληψη φαρμάκου από τα κύτταρα είτε MUC1-θετικό (Α549) ή MUC1-αρνητικό (HepG2). Τα κύτταρα επωάστηκαν ξεχωριστά με ελεύθερη Dox ή Apt-Dox και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ερυθρός φθορισμός από το φάρμακο ήταν εξίσου ισχυρή στις δύο κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με ελεύθερη Dox (Σχ. 7Α και Β), υποδεικνύοντας ότι η πρόσληψη των ελεύθερων Dox από αυτά τα κύτταρα ήταν μη-επιλεκτική. Σε αντίθεση, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Apt-Dox, το φθορισμού σε MUC1-θετικών κυττάρων Α549 ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε MUC1-αρνητικά HepG2 κύτταρα (Σχ. 7C και D), και ότι η πρόσληψη του φαρμάκου από τα κύτταρα HepG2 ήταν σημαντικά μειωμένη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Apt-Dox παρουσίασαν κυτταρική ειδικότητα και θα μπορούσε να ληφθεί επιλεκτικά από MUC1-θετικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ενδοκυτταρική κατανομή του φαρμάκου σε κύτταρα Α549 ήταν περιορισμένη κυρίως στους πυρήνες με δωρεάν Dox, αλλά επεκτείνεται σε κυτταρόπλασμα στη ρύθμιση του Apt-Dox, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μηχανισμοί για την πρόσληψη των ελεύθερων Dox και Apt-Dox μπορεί να είναι διαφορετική.

(Α-Δ) ομοεστιακή λέιζερ εικόνων μικροσκοπίας σάρωσης του Α549 και κύτταρα HepG2 μετά την επώαση με ελεύθερη δοξορουβικίνη (Α και Β) ή Apt-Dox (C και D) για 2 ώρες. (Ε και F) Η κυτταρομετρία ροής προφίλ ιστόγραμμα του Α549 (Ε) και τα κύτταρα HepG2 (F) μετά από επώαση με είτε ελεύθερης δοξορουβικίνης (μαύρο καμπύλες) ή Apt-Dox (γκρι καμπύλες). Τα γεμάτα ιστογράμματα είναι τα σήματα ελέγχου που παράγονται από μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Για να μελετηθεί περαιτέρω εάν Apt-Dox θα μπορούσε να ληφθεί επιλεκτικά από MUC1 θετικά κύτταρα, κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε επίσης για την παρακολούθηση του φθορισμού που παράγεται από δοξορουβικίνη μετά από επώαση των δυο κυτταρικών γραμμών με δωρεάν Dox ή Apt-Dox. Για κύτταρα Α549 MUC1-θετικό, τα φθορίζοντα σήματα που παράγονται από τις ελεύθερες Dox ή Apt-Dox ήταν παρόμοια (Σχήμα 7Ε.)? ενώ για τα κύτταρα HepG2 MUC1-αρνητικό, το φθορίζον σήμα που παράγεται από Apt-Dox ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη που παράγεται από ελεύθερα Dox (Σχ. 7F). Τα αποτελέσματα και πάλι πρότειναν ότι Apt-Dox θα μπορούσε να ληφθεί επιλεκτικά από MUC1 θετικά καρκινικά κύτταρα. Στο σύνολό τους, μικροσκοπία μας και κυτταρομετρία ροής τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο απταμερές MA3 μπορεί να χρησιμεύσει ως όχημα για την στοχευμένη παροχή Dox να MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα.

Apt-Dox εκλεκτικά ελαττωμένη κυτταροτοξικότητα σε MUC1-αρνητικά καρκινικά κύτταρα

Δεδομένου ότι η πρόσληψη της doxorubicin μειώθηκε σε MUC1-αρνητικά κύτταρα κατεργασμένα με Apt-Dox, είναι πιθανό ότι η κυτταροτοξικότητα σε αυτά τα κύτταρα θα μπορούσε επίσης να μειωθεί. Για να ελέγξετε το αξίωμα,

in vitro

κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από Apt-Dox ή χωρίς Dox συγκρίθηκε σε HepG2 και κυτταρικές σειρές Α549. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 8Α, για τα κύτταρα HepG2 MUC1-αρνητικό, η κυτταροτοξικότητα που παράγεται από Apt-Dox ήταν πράγματι μειώθηκε σε σύγκριση με εκείνη που παράγεται από ελεύθερα Dox (Ρ & lt? 0,01). Ωστόσο, για τα κύτταρα Α549 MUC1-θετικά, δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές μεταξύ της κυτταροτοξικότητας που παράγεται από Apt-Dox ή ελεύθερης Dox (Εικ. 8Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Apt-Dox τείνει να μειώσει τη ζημία να MUC1-αρνητικά κύτταρα ενώ διατηρεί την αποτελεσματικότητα του doxorubicin έναντι MUC1-θετικά κύτταρα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι απταμερές μόνη ήταν μη τοξική προς αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, υποδεικνύοντας ότι η ίδια η απταμερές ήταν σχετικά ασφαλής στα κύτταρα και ότι η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται κυρίως από δοξορουβικίνη.

Ο HepG2 (Α) και Α549 (Β κύτταρα) αξιολογήθηκαν με μία πρότυπη δοκιμασία MTS μετά από 48 ώρες από περαιτέρω επώαση (μέση ± SD, η = 6).

η

Συζήτηση

η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας περιορίζεται συχνά από το δυσμενείς επιδράσεις των κυτταροτοξικών παραγόντων που βλάπτουν τόσο την καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα. Μία στρατηγική για τη μείωση των δυσμενών επιπτώσεων της χημειοθεραπείας στοχευμένη χορήγηση φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα. MUC1 θεωρείται πολύτιμη στόχο για συνδετήρα-καθοδηγούμενη αντικαρκινικής χημειοθεραπείας λόγω υπερ-έκφραση της στα περισσότερα αδενοκαρκινώματα. Εδώ σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας την τεχνική SELEX και ένα πεπτίδιο επίτοπο MUC 1 ως στόχος, έχουμε αναπτύξει μια νέα MUC1 απταμερούς (MA3) με ένα

K

δ 38,3 ηΜ. Βρήκαμε ότι MA3 μπορούσε δεσμεύονται ειδικά σε MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα, με ελάχιστη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με την αλβουμίνη (Εικ. 1,2,3,4). Επιπλέον, ένα σύμπλεγμα απταμερές-φαρμάκου (ΑΡΤ-Dox) σχηματίστηκε μέσω παρεμβολής doxorubicin μέσα στη δομή του DNA του MA3 απταμερούς (Εικ. 6).