Αφηρημένο

Τα microRNAs (Mirs) είναι μια νέα κατηγορία μικρών μορίων RNA, η απορύθμιση των οποίων μπορεί να συμβάλει με τον καρκίνο. Μια συνδυαστική προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει Mirs που προωθούν προστάτη εξέλιξη του καρκίνου σε ένα μοναδικό σύνολο κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη, οι οποίοι προέρχονται από το γονικό ρ69 κυτταρική γραμμή και εκτείνεται σε μια άκρως ογκογονική /μεταστατικό υπογραμμή M12. Μαζί, αυτές οι κυτταρικές γραμμές φαίνεται να μιμούνται εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη

in vivo

. Προηγούμενη ανάλυση του δικτύου και συστοιχίες miR πρότεινε ότι η απώλεια της HSA-miR-125b μαζί με την υπερέκφραση του HSA-miR-22 θα μπορούσε να συμβάλει στην ογκογένεση του προστάτη. Η απορύθμιση των δύο αυτών Mirs επιβεβαιώθηκε σε δείγματα ανθρώπινου όγκου του προστάτη σε σύγκριση με παρακείμενο καλοήθη αδενικό επιθήλιο που συλλέγονται μέσω της δέσμευσης λέιζερ μικροδιατομής από ριζικές προστατεκτομές. Στην πραγματικότητα, οι μεταβολές στην έκφραση HSA-miR-125b φαίνεται να είναι ένα πρώιμο γεγονός στην ογκογένεση. Αντίστροφη microarray φάση πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε ErbB2 /3 και κατάντη μέλη της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και μονοπάτια /ERK ΜΑΡΚ καθώς και ΡΤΕΝ να είναι στόχοι πρωτεΐνη εκφράζονται διαφορικά στο κύτταρο όγκου Μ12 σε σύγκριση με γονική κυτταρική Ρ69 της. Οι σχετικές μελέτες έκφρασης λουσιφεράσης + 3′-UTR επιβεβαίωσε μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ HSA-miR-125b και ErbB2 και μεταξύ HSA-miR-22 και PTEN. Αποκατάσταση της HSA-miR-125b ή αναστολή της HSA-miR-22 έκφρασης μέσω ενός antagomiR είχε ως αποτέλεσμα την αλλοίωση της συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων Μ12

in vitro

. Έτσι, η διπλή δράση της HSA-miR-125b ως ογκοκατασταλτικό και HSA-miR-22 ως oncomiR συνέβαλε στην ογκογένεση του προστάτη κατά διαμορφώσεις σε ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και μονοπατιών σηματοδότησης /ERK ΜΑΡΚ, κλειδί μονοπάτια είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

Παράθεση: Budd WT, Seashols-Williams SJ, Clark GC, Weaver D, Calvert V, Petricoin E, et al. (2015) Διπλής Δράσης του miR-125b ως καταστολέας των όγκων και OncomiR-22 Προωθεί τον καρκίνο του προστάτη Ογκογένεση. PLoS ONE 10 (11): e0142373. doi: 10.1371 /journal.pone.0142373

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 9 Ιουλίου 2015? Αποδεκτές: 21η Οκτωβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου του 2015

Copyright: © 2015 Budd et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Τα δεδομένα από το πλήρη οθόνη σειρά microRNA από αυτές τις κυτταρικές σειρές του προστάτη έχει υποβληθεί από SJS-W ως διδακτορική διατριβή στη βιβλιοθήκη Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο Commonwealth (VCU10886). Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα από γονιδιακής έκφρασης Omnibus NCBI και είναι προσβάσιμο μέσω του GEO, όπως τον αριθμό πρόσβασης GSE49520

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Grant Αριθμός R21CA152349 να ZEZ. Ο χρηματοδότης παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για ΚΟΗ, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι του συγγραφέα αρθρώνεται στην ενότητα «συγγραφέας συνεισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η χρηματοδοτική στήριξη που παρέχεται δεν μετέβαλε την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και Υλικά |

Εισαγωγή

Μετασχηματισμός, την ανάπτυξη και την εξαγγείωση των καρκινικών κυττάρων αποτελέσματα από μια ποικιλία γενετικών και επιγενετικών τροποποιήσεων. Κατά την τελευταία δεκαετία, υπήρξε ένα αυξανόμενο σώμα της βιβλιογραφίας αναφέρουν ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση των microRNAs (Mirs) συμβάλλει στην ανάπτυξη πολλών ανθρώπινων καρκίνων [1-8]. Mirs είναι μία σημαντική κατηγορία των μη-κωδικοποίησης RNAs που επηρεάζουν μετα-μεταγραφικό επίπεδο πρωτεΐνης και, υπό την παρουσία εξωτερικά ερεθίσματα και περιβαλλοντικούς στρεσογόνους, έχουν την ικανότητα να επάγουν ταχείες αλλαγές στην πρωτεώματος επιτρέποντας στο κύτταρο να ανταποκριθεί σε μια πιο ακριβή και ενέργεια αποτελεσματικό τρόπο [2-5]. Πολυάριθμες κυτταρικές διεργασίες που επηρεάζονται από Mirs, συμπεριλαμβανομένων διαφοροποίηση, ανάπτυξη /υπερτροφία, έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [5,6].

έχουν απορρυθμισμένη Mirs δειχθεί ότι συμβάλλουν στην ογκογένεση από την απώλεια της καταστολής όγκων Mirs ή αυξημένη έκφραση oncomiRs [1,9,10]. Είτε απώλεια καταστολείς όγκων ή αυξημένη έκφραση των oncomiRs τελικά οδηγεί σε αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, επιθετικότητα ή μετάσταση. Η ανώμαλη έκφραση ακόμη και ένα μόνο miR έχει τη δυνατότητα να επηρεάσει ένα μεγάλο αριθμό κυτταρικών διαδικασιών, καθώς κάθε miR μπορεί να επηρεάσει εκατοντάδες κατάντη πρωτεϊνών, οι οποίες ρυθμίζουν κατά προτίμηση κόμβους σηματοδότησης σημαντικό κλειδί κυττάρου και παράγοντες μεταγραφής [11]. Ανάλυση δικτύων δείχνει ότι οι στόχοι της Mirs έχουν σημαντικά μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι ο κόμβος επιλέγεται τυχαία γονίδια [11,12]. Διατάραξη αυτών των εξαιρετικά διασυνδεδεμένο υγείας μόρια επιπτώσεις κυττάρων που οδηγεί σε ασθένεια.

Ως εκ τούτου, κρίνεται αναγκαίο να ενσωματωθούν πολλαπλές πηγές βιολογικές πληροφορίες για να κατανοήσουμε τις διαταραχές υποκείμενη σε δεδομένη παθολογία από ένα επίπεδο συστημάτων. Υψηλές τεχνολογίες απόδοσης, όπως μικροσυστοιχίες DNA, αλληλουχίας του γονιδιώματος, πρωτεομική ανάστροφης φάσης, και προφίλ qRT-PCR επιτρέπει την ταυτόχρονη απόκτηση χιλιάδες σημεία δεδομένων. Η διασταύρωση των πολλαπλών πηγών δεδομένων αυξάνει την πιθανότητα τον προσδιορισμό των βασικών οδών που εμπλέκονται στην έναρξη του καρκίνου, εξέλιξη και μετάσταση. Αυτή η εργασία περιγράφει μια μοναδική συνδυαστική προσέγγιση για την κατανόηση του αντίκτυπου των miR απορρύθμισης κατά την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Αν και έχουν Mirs παρατηρηθεί ότι σχετίζεται με τον καρκίνο του προστάτη, δεν υπάρχει σαφής ομοφωνία σχετικά με ειδικές Mirs που συμβάλλουν στην ογκογένεση [7,8].

Ένα νέο μοντέλο ισογονιδιακές εξέλιξης κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιήθηκε σαν το πιστεύεται στενά μιμούνται την εξέλιξη του όγκου, όπως συμβαίνει

in vivo

[13,14,15]. Ένταξη των προφίλ ποσοτικοποίηση miR και πρωτεομική δεδομένων έχει τη δυνατότητα να αυξήσει την επιτυχία του προσδιορισμού νέων Mirs επηρεάζουν ογκογένεση. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα που δημιουργούνται από συστοιχίες miR, Αντίστροφη Φάση μικροσυστοιχιών (RPPA) πρωτεομική, μαζί με τις πληροφορίες από την ανάλυση των προηγούμενων δίκτυα χρησιμοποιήθηκαν για την κατάταξη απορυθμισμένη Mirs στο μοντέλο εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη μας [12,16-18]. Υποθετική δυσρυθμισμένη Mirs περαιτέρω επαληθεύονται σε RNA που απομονώθηκε από δείγματα ριζική προστατεκτομή όγκων των ασθενών με τη χρήση λέιζερ συλλαμβάνει μικροδιατομής [LCM] [19,20]. Αρκετές δυσρυθμισμένη Mirs που δυνητικά οδηγούν την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη εντοπίστηκαν [18,21]. Από αυτά τα Mirs, η σημασία της HSA-miR-125β (miR-125b) και HSA-miR-22 (miR-22) για την ογκογένεση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από

in vitro

πειράματα. miR-125b και miR-22 μπορεί να είναι χρήσιμα ως σχετική βιοδείκτες για τον εντοπισμό και τον καρκίνο του προστάτη σταδίου.

Υλικά και Μέθοδοι

Προέλευση των γραμμών κυττάρων του προστάτη και Cell Culture

Ρ69 , τα κύτταρα M2182, και Μ12 ήταν ένα δώρο από τον Δρ Χαρά Υγιεινής, Πανεπιστήμιο Commonwealth της Βιρτζίνια, Richmond VA, και επικυρώνονται χρησιμοποιώντας την ανάλυση STR [13,14]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές προήλθαν από αθανατοποίηση ενός μη νεοπλασματική επιθήλιο του προστάτη με SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο [13]. Το γονικό (Ρ69) κυτταρική γραμμή είναι ελάχιστα ογκογόνα και μη-μεταστατικών με χαμηλότερο αριθμό τρόπων μεταφοράς χρωμόσωμα από τα περισσότερα άλλα καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές τυπικώς απομονώνονται από μεταστατικές θέσεις (LNCap, DU145, PC3 και). Ένα

in vivo

διαδικασία επιλογής χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία κυττάρων με αυξημένη ογκογονικότητα και μεταστατικό δυναμικό. Μετά από τρεις γύρους υποδόριες ενέσεις σε αρσενικά αθυμικά γυμνά ποντίκια, μια ιδιαίτερα ογκογονική και μεταστατική παραλλαγή (Μ12) απομονώθηκε, το οποίο κάνει μετάσταση συνήθως κατόπιν ενδο-προστατικής ένεση [14]. Η κυτταρική γραμμή M2182 προήλθε μετά από δύο γύρους

in vivo

επιλογής και, ως εκ τούτου αντιπροσωπεύει ένα ενδιάμεσο φαινότυπο που είναι λιγότερο ογκογόνα από τα κύτταρα M12 και είναι μη μεταστατικό. Τα κύτταρα διατηρούνται σε καλλιέργεια στους 37 ° C για λιγότερο από δύο μήνες σε μέσα RPMI1640 με L-γλουταμίνη (Gibco), συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου, 0,05 mg /ml γενταμυκίνη, 5 μg /ml ινσουλίνη, 5 μg /ml τρανσφερίνη, και 5 μg /ml σεληνίου (ITS από Collaborative Research Bedford, μΑ) [13,14,19]. κύτταρα M12 σταθερά μετασχηματισμένα με ένα φορέα πλασμίδιο pSIREN (Clontech) που εκφράζουν miR-125β (M12 + miR-125β) διατηρήθηκαν με πουρομυκίνη (100 ng /ml) [19,22]. κύτταρα M12 σταθερά μετασχηματισμένα με ένα miARREST

™ miR22-3p αναστολέα (M12 + miR-22θ) πλασμίδιο έκφρασης (pEZX-AM03) από GeneCopoeia (HmiR-AN0332-AM03) διατηρήθηκαν με υγρομυκίνη (200 μg /ml). Μετά θρυψινοποίηση (0.25% σε EDTA), τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS, φλας καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθούν.

κυτταρικό ίζημα RNA Extraction

Σύνολο RNA εκχυλίστηκε από κατεψυγμένα σφαιρίδια κυττάρου χρησιμοποιώντας το miRVana

™ miR μέθοδος απομόνωσης (Ambion-Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την απομόνωση, η συγκέντρωση του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Biorad

® Smart Spec

™ 3000 φασματοφωτόμετρο, αραιωμένο σε συγκέντρωση 100 ng /ml και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C.

σφαιρίδιο κυττάρου DNA Extraction

DNA εκχυλίζεται από κατεψυγμένα σφαιρίδια κυττάρου χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp DNA mini από Qiagen (Cat. Νο 51304) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από συμπύκνωση DNA εκχύλιση μετρήθηκε όπως παραπάνω.

Ογκο Βιβλιοθήκης και μέθοδος Sequencing

βιβλιοθήκες DNA παράχθηκαν από τις κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας τον Ion AmpliSeq

™ Βιβλιοθήκη Kit 2.0 και το ιόν AmpliSeq

™ Καρκίνος Hotspot Panel v2 (Cat. Νο 4480441 και 4475346). Ο καρκίνος Hotspot Panel είναι ένα ενιαίο πισίνα amplicon που ενισχύει 207 αμπλικόνια που καλύπτουν πάνω από 2.800 COSMIC μεταλλάξεις από 50 γνωστά ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια. Κάθε δείγμα παρασκευάστηκε με τη χρήση 10 ng του DNA των εισροών, σύμφωνα με το Ion AmpliSeq

™ Βιβλιοθήκη πρωτόκολλο Παρασκευής (Δημοσίευση Κωδικός MAN0006735 Αναθεώρηση A.0). Ion Xpress

™ Barcode Προσαρμογείς 1-16 Kit (Cat. No. 4,471,250) χρησιμοποιήθηκαν για μεμονωμένες barcoding δείγμα και σύνδεση του προσαρμογέα. Agencourt AMPure XP μαγνητικά σφαιρίδια (Cat. No. A63882, Beckman) χρησιμοποιήθηκαν όπως αναφέρεται στο Ion AmpliSeq

™ Βιβλιοθήκη Προετοιμασία Οδηγός χρήσης. βιβλιοθήκες Δείγμα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας του φθοριομέτρου qubit 2.0 και η μεγάλη ευαισθησία dsDNA Assay Kit (Cat. Νο Q32851) και εξομαλύνεται σε μία συγκέντρωση 100 ρΜ. Γαλάκτωμα PCR διεξήχθη στο Ion OneTouch

2 ™ Μέσο (Cat. No. 4,474,778), όπως αναφέρεται στο Ion PGM

™ Πρότυπο OT2 200 Kit (MAN0007220 Δημοσίευση Αριθμός Αναθεώρηση 5.0.) Χρησιμοποιώντας τον Ion PGM

™ πρότυπο OT2 200 Kit (Cat. No. 4,480,974). Κανονικοποιημένη 100 βιβλιοθήκες δείγμα ρΜ συνενώθηκαν και σε συνδυασμό με τα αντιδραστήρια του κιτ OT2 και Ion Σφαίρα Σωματίδια (ISPs). Η αντίδραση διεξήχθη στο OT2 χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο 200 bp. Τα δείγματα στη συνέχεια υπέστησαν επεξεργασία για εμπλουτισμό στο Ion OneTouch

™ ES. Εμπλουτισμός των ISPs επιτεύχθηκε με τη χρήση του Ion PGM

™ Πρότυπο OT2 200 Kit (Cat. No. 4,480,974) και Dynabeads MyOne στρεπταβιδίνη C1 χάντρες (Cat. No. 65001 Life Technologies) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Ion PGM

™ Πρότυπο OT2 200 Kit Οδηγός χρήσης). Τα σφαιρίδια στρεπταβιδίνης C1 δεσμεύονται ειδικά σε εμπλουτισμένο ISP, επιτρέποντας όλοι οι άλλοι να πλυθούν μακριά, που ακολουθείται από έκλουση με υδροξείδιο του νατρίου και Tween λιώσει διάλυμα. Ο Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) προετοιμάστηκε με τη χρήση του Ion PGM

™ αλληλουχίας 200 Kit v2 σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Ion PGM

™ αλληλουχίας 200 Kit v2: Αριθμός Έκδοσης MAN0007273 Αναθεώρηση 3.0). σφαιρίδια ελέγχου εμπλουτίστηκαν στο δείγμα εμπλουτισμένο σφαιρίδιο, εκκινητές αλληλούχισης ανοπτήθηκαν στους ISP και προστίθεται πολυμεράση. ISPs η αλληλουχία χρησιμοποιώντας ένα Ion Torrent Ion 318

™ Chip. Ο Ion Torrent PGM διεξήχθη σύμφωνα με το Ion Torrent προδιαγραφές 200 Kit v2 χρησιμοποιώντας 500 ροές νουκλεοτιδίων, που ακολουθείται από την ευθυγράμμιση με την αναφορά HG19 και αναλύθηκαν από το plugin Ion Torrent παραλλαγή του καλούντος.

TaqMan

® δοκιμασία miR βάση

η επαλήθευση της έκφρασης ώριμου miR επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan

® μεθοδολογία miR (Τεχνολογίες ζωής, Grand Island, Νέα Υόρκη). cDNA συντέθηκε σε έναν όγκο αντίδρασης 25 μΐ από ολικό RNA (20 ng) χρησιμοποιώντας το TaqMan

® kit microRNA ανάστροφη μεταγραφή. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 16 ° C για 30 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά, και αδρανοποιείται στους 85 ° C για 5 λεπτά. Κάθε cDNA αναλύθηκε εις τριπλούν με ποσοτική PCR (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας την ακολουθία ειδικούς εκκινητές HSA-miR-125b-1 (ID 000449), HSA-miR-22-3p (ID 000398) ή RNU48 (ID 001006) σε ένα Applied Biosystems 7300 πραγματικού χρόνου PCR όργανο (Life Technologies). Κάθε επιμέρους προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε σε έναν όγκο αντίδρασης 20 μΙ με 1,33 μΐ cDNA, 1.0 μΐ ειδική δοκιμασία Mir, 10 μΐ TaqMan

™ καθολική PCR Master Mix II χωρίς AmpErase UNG και 7,67 μΙ νερό χωρίς νουκλεάση. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 50 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενο από 10 min στους 95 ° C και 40 κύκλους με αποδιάταξη για 15 δευτερόλεπτα στους 98 ° C, και ανόπτηση /επέκταση για 60 sec στους 60 ° C. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SDS V1.3.1 λογισμικού (Life Technologies). Ρυθμίσεις κατωφλίου και αρχική τιμή ορίστηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του πρωτοκόλλου, με την έναρξη διόρθωσης μεταξύ κύκλων 3 και 12 και ένα αυτόματο όριο.

Στατιστική Ανάλυση qRT-PCR Δεδομένα

προσδιορίστηκαν σχετικές ποσότητες των επιπέδων του miR χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCT μέθοδο Livak κ.ά. μετά από κανονικοποίηση με RNU48 ως πρότυπο αναφοράς [23]. Όλα τα δείγματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και από το όριο μέσο κύκλο (C

Τ) αξία προσδιορίστηκε από C

τιμές Τ στην περιοχή από 25 έως 35. Ο μέσος C

T ομαλοποιήθηκε με αφαίρεση της μέσης C

Τ RNU48 (ΔΟ

T). Όλα τα δείγματα συγκρίθηκαν με το γονικό Ρ69 κυτταρική γραμμή με την αφαίρεση του πειραματικού ΔΟ

T από την ΔΟ

T αξία της ρ69 κυτταρική γραμμή ως το βαθμονομητή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση 3 ανεξάρτητα πειράματα. Στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν στη Microsoft

® πλατφόρμα λογισμικού Excel, χρησιμοποιώντας t-test ανεξάρτητος μαθητής του, υποθέτοντας ίσες διακύμανση μεταξύ των δύο ομάδων. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως p ≦ 0,05.

Capture Laser μικροανατομίας (LCM)

όγκου και της καλοήθους προστάτη ιστοί ελήφθησαν από ριζική προστατεκτομή δείγματα, μετά την έγκριση από το Πανεπιστήμιο της Βιρτζίνια Κοινοπολιτείας (VCU), Γραφείο της έρευνας και της καινοτομίας, επιτροπή δεοντολογίας (IRB), Πίνακας Α τέσσερα δείγματα πάγωσαν ιστού από τον ιστό VCU και δεδομένων και Ανάλυση πυρήνα (TDAAC σε https://www.pathology.vcu.edu/research/TDAAC) και ένα αρχειοθετημένο δείγμα FFPE ήταν από το Τμήμα VCU της Παθολογίας [19,22]. Ανθρώπινους ιστούς, συναινεί ασθενή, και κλινικά δεδομένα δόθηκαν από τον πυρήνα εγκατάσταση VCU TDAAC και το Τμήμα Παθολογίας με συναινέσεις ασθενή. Όλα τα δείγματα ασθενών de-εντοπίστηκαν για την προστασία του απορρήτου των ασθενών. Διαφάνειες (10-20) παρήχθησαν και επανεξετάζονται από μια σκάφους επικυρωμένο παθολόγο (ED) με ειδίκευση στη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη για τον εντοπισμό του προστάτη εστίες αδενοκαρκινώματος σε σχέση με την κανονική αδενικό επιθήλιο, καθώς και υπερπλασίας αδενικό επιθήλιο (ΚΥΠ), προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) και στρώμα από ένα μοναδικό δείγμα του ασθενούς. Προστατικού αδενοκαρκινώματος βαθμολογήθηκε σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης Gleason [24]. Εν συντομία, 8 μm φέτες ιστού τοποθετήθηκαν επί μη φορτισμένες γυάλινες διαφάνειες, αφυδατώνεται με προοδευτικά αυξανόμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης, και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) [19,20,25-29]. LCM εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα Αρκτούρος Veritas

™ σύστημα λέιζερ συλλαμβάνει μικροδιατομής (Life Technologies). Τομείς ενδιαφέροντος (καλοήθης έναντι του όγκου συν στρώμα, ΚΥΠ και PIN από ένα δείγμα FFPE) ατομικά συλληφθεί πάνω CapSure

® Macro καπάκια LCM (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη).

RNA Εξόρυξη LCM δείγματα

το συνολικό RNA εξήχθη από LCM κατέλαβε υλικό χρησιμοποιώντας το Αρκτούρος

® PicoPure

® Απομόνωση RNA Kit (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά την ανατομή του ιστού, τα καπάκια LCM επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 42 ° C σε 50 μΐ ρυθμιστικού εκχύλισης και αποθηκεύεται στους -20 ° C μέχρι να είναι έτοιμο για εξαγωγή RNA. Κυτταρολύματα από διαδοχικές πλάκες συνενώθηκαν σε ένα ενιαίο σωλήνα και αναμίχθηκε με 1 όγκο αιθανόλης (70%). Το διάλυμα λύματος /αιθανόλης φορτώθηκε σε μία υψηλή ανάκτηση MiraCol

™ στήλη και φυγοκεντρήθηκε στα 1000 xg για 2 λεπτά ακολουθούμενο από 16,000 xg για 30 δευτερόλεπτα. RNA ανακτήθηκε σε έναν όγκο 11 μλ. συγκέντρωση του RNA και η ποιότητα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Agilent 6000 RNA Pico τσιπ με την Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) χρησιμοποιώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα δείγματα που χρησιμοποιούνται για qRT-PCR εμφανίζεται RNA καλής ποιότητας, όπως εκτιμάται από τους RNA Ακεραιότητα Αριθμός (RIN) και επαρκούς ποσότητας να μην απαιτούν ένα βήμα προ ενίσχυσης για μετέπειτα ανάλυση PCR. RNA (40 ng) υπέστη αντίστροφη μεταγραφή για ανάλυση miR χρησιμοποιώντας τις συνθήκες qRT-PCR που περιγράφεται παραπάνω.

Luciferase + 3′-UTR Δοκιμασίες Reporter

Το 3′-UTR του γονιδίου της ανθρώπινης ErbB2 (από -1 έως -576 καθοδικά του κωδικονίου τερματισμού) και αναφέρεται ως pErbB2wtUTR παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Christopher C. Benz [30]. Ολόκληρη η 3’UTR (-1 να -576), καθώς και υποπεριοχές από -44 να -576 ή -110 -576 να ανακτήθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας τους κατάλληλους εκκινητές 3′-UTR και το πλασμίδιο pErbB2wtUTR ως εκμαγείο και κλωνοποιήθηκε εντός του θέση Xba της διπλής λουσιφεράσης φορέα έκφρασης pmirGLO (Promega) για να δημιουργήσει pErbB1 /576, pErbB44 /576 και pErbB110 /576, αντίστοιχα. Η αλληλουχία 3′-UTR του άγριου τύπου και διαγράφονται υποκλώνους επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA. κύτταρα Μ12 (200.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε ένα δίσκο 6 φρεατίων επιστρώθηκαν την προηγούμενη ημέρα) επιμολύνθηκαν εις τριπλούν με 1 μg pmirGLO κενού φορέα ή πλασμίδιο που περιέχει τις μεμονωμένες περιοχές 3′-UTR από pErbB2 όπως περιγράφεται παραπάνω. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη διαμετακόμιση

®-LT1 αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Mirus ΒΙΟ LLC), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Ένα μείγμα του αντιδραστηρίου (2 μΙ TransIT

®-LT1 ng DNA /), πλασμίδια, και ελεύθερα μέσα RPMI ορού επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν την προσθήκη στα κύτταρα και επωάστηκαν υπό κανονικές συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας για ακολουθούμενη 48 ώρας με παρασκευή συλλογή και λύματος σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Λουσιφεράσης Renilla και δραστικότητα μετρήθηκαν σε 30 μΐ προϊόντος λύσης κυττάρου χρησιμοποιώντας το σύστημα διπλής Δοκιμασίας Λουσιφεράσης (Promega Corporation) και μια GloMax

® 20/20 φωτόμετρο (Promega Corporation). δραστηριότητα Reporter εκφράζεται ως η αναλογία της πυγολαμπίδας με τη δραστηριότητα της Renilla. Κάθε δοκιμασία επαναλήφθηκε τρεις φορές και η τυπική απόκλιση σε κάθε δείγμα σημειώνεται.

Μια θέση δέσμευσης miR-22 εντός ΡΤΕΝ ταυτοποιήθηκε με Bar et al. [31]. Μια κορυφαία σκέλος (56 βάσεις της αλληλουχίας 5′-CATATTGG

TGCTAGAAAAGGCAGCTAAAG

GAAGTGAATCTGTATTGGGGTACAGGT

) και το κάτω σκέλος (62 βάσεις της αλληλουχίας

5′-(

TCGAGTATAACCACGATCTTTTCCGTCGATTTCCTTCACTTAGACATAACCCCATGTCCAGC

62 βάσεις) με την κεντρική τοποθεσία miR-22 περιοχής στόχου (

με πλάγιους

) συντέθηκε και κατευθυντικά κλωνοποιείται στη θέση Sac /AccI του pmirGLO (Promega). Μία μεταλλαγμένη αλληλουχία ΡΤΕΝ 3′-UTR που περιέχει ένα C (κόκκινο) για μία μετάλλαξη η οποία έχει δειχθεί να καταργήσει ρύθμιση από miR-22 πρόσδεση παρομοίως συντίθεται και κλωνοποιείται [31]. Αμφότερα τα άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων αλληλουχιών ΡΤΕΝ 3′-UTR επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση του DNA. Παροδικές επιμολύνσεις σε ο M12 κυτταρική γραμμή ολοκληρώθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω εκτός 250 ng των διαφόρων pmirGLO πλασμίδια ευρέθη η βέλτιστη για την επιμόλυνση.

Western ανοσοαποτύπωσης

ολόκληρου κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. πρωτεΐνη ( 30 μg) αναλύθηκε σε Novex

® 4-12% Τπδ-δις γέλη κλίση πολυακρυλαμιδίου και ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν β-ακτίνη (1: 200) που παράγεται στο ποντίκι (C4: Santa Cruz Biotechnologies Inc.) και ΡΤΕΝ (1: 1000) που παράγεται σε κουνέλια (D4.3: Cell Signaling). Μετά από επώαση σε πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα, η κηλίδα πλύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32] και επωάστηκαν πρώτα σε δευτερογενή αντι-ποντικού IgG-HRP (1: 1000) που παράγεται σε κατσίκα (Santa Cruz Biotechnologies) και κατόπιν με αντι-κουνελιού IgG-HRP (1: 1000) που παράγεται σε κατσίκα (κυτταρική σηματοδότηση) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά αναπτύχθηκαν ζώνες πλύσιμο χρησιμοποιώντας τα χημειοφωταύγειας αντιδραστηρίων από τη Δυτική Lightning

® (Perkin Elmer, Boston, MA). Western κηλίδες εκτέθηκαν και μπάντες ποσοτικά με τη χρήση της Οδύσσειας

® Σύστημα Fc Imaging (LI-COR Βιοεπιστημών, Lincoln, NE).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των M12 σε σχέση με το σταθερό μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές, M12 + miR125b και M12 + miR-22θ συγκρίθηκε. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν ελεύθερα από θρυψίνη με μέσα που περιέχουν ορό και επιστρώθηκαν εις τριπλούν (20,000 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες 9 φρεατίων. Ο βιώσιμος αριθμός κυττάρων προσδιορίσθηκε ποσοτικά σε 0, 48, και 72 ώρες με ένα Beckman Coulter Vi-CELL-XR Αυτόματος Αναλυτής Κυττάρων Η βιωσιμότητα χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα κυανού του τρυπανίου. Ο μέσος αριθμός βιώσιμων κυττάρων χαράχθηκε σε μια εκθετική καμπύλη με σημειωθεί η τυπική απόκλιση. Η ανάπτυξη των κυττάρων σε σύγκριση με 0, 48 και 72 ώρες χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας ένα φοιτητή t-test αποδίδοντας ένα p-τιμή του 0,11 και 0,009, αντίστοιχα.

Μετανάστευση Δοκιμασία

Μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες ήταν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19,22]. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν από την πλάκα χρησιμοποιώντας 2,0 ml CellStripper

™ (Cellgro

®, Manassas, VA), σφαιροποιήθηκαν, πλύθηκαν σε ελεύθερο ορού RPMI 1640 και επανα-εναιωρούνται σε συγκέντρωση 2,5 χ 10

5 κύτταρα /ml. Ένα αιώρημα κυττάρων (50.000 κύτταρα σε 200 μΐ) προστέθηκε στον άνω θάλαμο με μέγεθος 6,0 μm πόρου ThinCert

™ ενθέτου καλλιέργειας ιστού (Greiner Bio-one BVBA /SPRL, Monroe, NC). Μέσο που περιείχε ορό (O.5 ml) συμπληρωμένο με 10 ng /ml EGF προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 20 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε από δύο θαλάμους και τα κύτταρα που δεν εισβάλλουν (επάνω επιφάνεια) απομακρύνθηκαν με ένα αποστειρωμένο βαμβάκι εφαρμοστή. Τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια σταθεροποιήθηκαν σε 0,025% γλουταραλδεΰδη σε PBS για 20 λεπτά. Μετά την σταθεροποίηση, τα ένθετα βάφτηκαν με 0,1% leucocrystal ιώδες σε 10% αιθανόλη και PBS για 30 λεπτά και πλύθηκαν με αποστειρωμένο απιονισμένο νερό. Οι μεμβράνες αποκόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε μια γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε 10 τυχαία πεδία σε 200 Χ μεγέθυνση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση άθροισμα των μεταναστευτικών κυττάρων σε 10 τυχαία πεδία ± τυπικό σφάλμα.

Εισβολή Δοκιμασία

δοκιμασίες Invasion διεξήχθησαν με τρόπο παρόμοιο με τις δοκιμασίες μετανάστευσης. Τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την εκχύλιση των κυττάρων, 60 μΙ (1:10) από Culturex

® μειωμένη αυξητικός παράγοντας βασικής μεμβράνης (Παράγοντας Ανάπτυξης Μειωμένο) προστέθηκε στην κορυφή του θαλάμου του ThinCert

™ ένθετο καλλιέργειας ιστών και επωάζονται στους 37 ° C για πηκτωματοποίησης. Το υπόλοιπο του πρωτοκόλλου είναι ταυτόσημη με την δοκιμασία μετανάστευσης που περιγράφεται παραπάνω. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση άθροισμα των μεταστατικών κυττάρων σε 10 τυχαία πεδία ± τυπικό σφάλμα.

Αντίστροφη Φάση μικροσυστοιχιών (RPPA)

πειράματα RPPA διεξήχθησαν στο George Mason University Κέντρο Εφαρμοσμένης Πρωτεϊνωματική και μοριακής Ιατρικής υπό την επίβλεψη του Δρ Emanuel Petricoin III [16,17]. Για την ελαχιστοποίηση παραλλαγή διπλούν κυτταρικοί σβώλοι χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση του RNA για miR προφίλ και για πρωτεομική [18]. Για RPPA, κυτταρικά ιζήματα συλλέχθηκαν με διάλυση, πλύθηκαν με PBS, φλας καταψύχθηκαν και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Τα ιζήματα άμεσα σε λύση σε ένα ρυθμιστικό εκχύλισης ιστών και κηλίδα επί νιτροκυτταρίνης επικαλυμμένο γυάλινο πλακίδιο (Grace Bio-labs, Bend OR) σε μία μικρογραφία καμπύλη αραίωσης (1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 8, και 1 : 16) χρησιμοποιώντας ένα Aushon 2470 arrayer (Aushon BioSystems Billerica, ΜΑ) για να εξασφαλίζεται η ακριβής ποσοτικοποίηση της κάθε πρωτεΐνης μετρήθηκε [16]. Τρία διαδοχικά περάσματα για κάθε κυτταρική σειρά αναλύθηκαν με κάθε δείγμα τυπωμένα εις τριπλούν μαζί με πρότυπες καμπύλες για εσωτερικό έλεγχο ποιότητας. Επιλεγμένα συστοιχίες βάφτηκαν με SYPRO Ruby Protein Blot Stain (Molecular Probes, Eugene, OR) ακολουθώντας τις οδηγίες κατασκευής για να ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα της πρωτεΐνης που υπάρχει σε κάθε δείγμα. Πριν από αντίσωμα χρώση των υπόλοιπων συστοιχίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάλυμα Reblot Αντίσωμα απογύμνωσης (Chemicon, Temecula, CA) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν για τουλάχιστον μία ώρα σε I-μπλοκ (Tropix, Bedford, ΜΑ) . Χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σύστημα (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), συστοιχίες πρώτα διερευνήθηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, το σύστημα μπλοκαρίσματος βιοτίνη, και στη συνέχεια ένα επιπλέον ελεύθερο μπλοκ πρωτεΐνη ορού για να μειωθεί η μη ειδική πρόσδεση μεταξύ ενδογενών πρωτεϊνών και του συστήματος ανίχνευσης. Αντισώματα επικυρωθεί για τη χρήση τους στη συστοιχία επαληθεύοντας single-band Western και επαγωγή πεπτίδιο ολοκλήρωση /συνδετήρα. ErbB2 /3, ρΒΑϋ, pERK και ΜΕΤ ήταν μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού, ΡΙ3Κ ένα πολυκλωνικό κουνελιού, όλα παρέχονται από Cell Signaling, Inc. Βιοτινυλιωμένο αντι-κουνελιού (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) ή δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού (CSA? Dako Cytomation Carpinteria, CA) συζευγμένο με καταλυόμενη Signal Amplification System (CSA? Dako Cytomation Carpinteria, CA), ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ ενίσχυσης αβιδίνης /βιοτίνης τυραμιδίου-based, χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν την ανίχνευση του σήματος. Φθορισμού ανίχνευση λήφθηκε με χρήση IRDye 680RD Στρεπταβιδίνη (LI-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Αντισώματος και SYPRO Ruby βάφονται διαφάνειες σαρώθηκαν σε ένα σαρωτή λέιζερ Tecan (TECAN, Mönnedorf, Ελβετία) με τη χρήση του βάρους του καναλιού μήκους 620 nm και 580 nm αντίστοιχα. Εικόνες αναλύθηκαν με MicroVigene έκδοση λογισμικού 5.1.0.0 (Vigenetech, Carlisle, ΜΑ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Συνολικά, το κυτταρικό λύμα κηλίδα επί 111 διαφάνειες και το καθένα επωάζεται με ένα μοναδικό αντίσωμα. Τα δεδομένα επέστρεψε σε ένα υπολογιστικό φύλλο του Microsoft Excel που περιέχει κάθε τύπο κυττάρου αναλύονται με κάθε αντίσωμα που ενδιαφέρει.

Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων RPPA

Microsoft Excel χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει μια δύο-δείγματος ίση διακύμανση Τ -test για να συγκρίνει τα δεδομένα της έκφρασης της πρωτεΐνης μεταξύ των κυτταρικών σειρών Ρ69 M12 και. Ένα σύνολο 45 τιμών ήταν ο μέσος όρος για κάθε δείγμα πρωτεΐνης αντισώματος ανιχνεύθηκαν. Μια αυστηρή τιμή πιθανότητας p & lt? = 0,001 χρησιμοποιήθηκε για να διορθώσει για μεταβολή μεταξύ πολλαπλών δειγμάτων και να εντοπίσει πραγματικά σημαντικές αλλαγές. Οι αναφερόμενες σημαντικές αλλαγές μετατράπηκαν σε πολλαπλές μεταβολές διαιρώντας το μέσο όρο έκφραση της πρωτεΐνης στην κυτταρική γραμμή Μ12 με το μέσο έκφρασης της πρωτεΐνης στη συγκριτική ρ69 κυτταρική γραμμή.

Αποτελέσματα

Επόμενο αλληλουχίας γενιά του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών

Η Ρ69, κυτταρικές σειρές M2182, και Μ12 αντιπροσωπεύουν ένα μοναδικό σύνολο των γενετικά σχετίζονται με κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη προτείνεται ως μοντέλο εξέλιξης διπλασιάζοντας τα μοριακά γεγονότα που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του προστάτη ογκογένεση

in vivo

[13,14,15]. Η κυτταρική γραμμή Μ12 είναι ένα εξαιρετικά ογκογονικό /μεταστατική παραλλαγή που προέρχεται από την γονική ρ69 κυτταρική γραμμή με την κυτταρική σειρά M2182 εμφανίζοντας ένα ενδιάμεσο, αλλά μη μεταστατικό φαινότυπο. Αντίθετα, άλλες καθιερωμένες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του προστάτη, όπως Du145 ή PC3 αντιπροσωπεύουν κυτταρική τελικά σημεία που προέρχονται από δευτερογενείς όγκους και ως εκ τούτου, δεν μπορεί να θεωρηθεί ως ένα μοντέλο εξέλιξης.

αλληλούχισης επόμενης γενιάς ανάλυση (NGS) είχε αναλάβει την υποχρέωση να προσδιορίσει δυνατές παραλλαγές νουκλεοτιδίου σε γονίδια είναι γνωστό ότι σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου που θα μπορούσαν να ευθύνονται για τις φαινοτυπικές διαφορές που εμφανίζονται από αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Πάνω από 200,000 διαβάζει ελήφθησαν για κάθε υποσειρά με μέση διαβάσει μήκος ~ 110 nts σε μήκος (Πίνακας 1). Ο κατάλογος των σωματικών μεταλλάξεων στον Καρκίνο (COSMIC) περιγράφει πάνω από δύο εκατομμύρια κωδικοποίησης σημειακές μεταλλάξεις ακολουθίας εντοπίζονται σε διάφορες μορφές καρκίνου. Ωστόσο, υπήρχαν μόνο τρεις COSMIC γονιδιακές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε όλες τις sublines (STK11-COSM29005, PGFRA- COSM22413 και APC-COSM19099) (Πίνακας 2). Είναι ενδιαφέρον, όλα του κοσμικού μεταλλάξεις συν επιπλέον 11 νέες μεταλλάξεις ήταν συνεπής σε όλα τα μέλη (Ρ69, M2182 και Μ12) του μοντέλου εξέλιξης των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη. Υπήρξε μια ενιαία μετάβαση από μια θυμιδίνη σε μια κυτοσίνη στη STK11 * γονίδιο, το οποίο δεν ήταν παρούσα στην κυτταρική γραμμή Μ12, αλλά δεδομένου ότι αυτό δεν είναι μια μετάλλαξη που είναι γνωστό ότι συσχετίζονται με τον κίνδυνο καρκίνου, είναι απίθανο ότι είναι αποκλειστικά υπεύθυνη για οι μοναδικές ιδιότητες της παρούσας δευτερεύουσας γρα ής. Έτσι, η ανάλυση NGS έδειξε ότι δεν υπήρχαν προηγουμένως γνωστές μεταλλάξεις γονιδίων του καρκίνου που θα μπορούσαν να ευθύνονται για τις τεράστιες διαφορές ογκογονικότητα και τις μεταστάσεις εμφανίζονται από αυτές που σχετίζονται με κυτταρικές σειρές.

Η

Ανάλυση του miR Έκφραση σε προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές

Για την αναγνώριση των γονιδίων που θα μπορούσαν να συμβάλουν στις διάφορες ογκογόνο /μεταστατικό ιδιότητες αυτών των κυττάρων, μια οθόνη συστοιχία miR χρησιμοποιώντας το miRCURY LNA

™ σύστημα Οικουμενική RT microRNA PCR (Exiqon, Δανία) ήταν διεξάγεται εις διπλούν [18,21]. Αν και βρέθηκαν αρκετές Mirs να απορυθμίζεται, πιο αξιοσημείωτη ήταν η διαφορική έκφραση του miR-125b και miR-22 [18,21]. Δεδομένου ότι οι κυτταρικές σειρές προστάτη έγινε πιο ογκογόνα προχωρεί από το γονικό ρ69 στο M2182 και τελικά το κύτταρο M12, το επίπεδο της miR-125b μειώθηκε σημαντικά, ≈ μια 6-πλάσια μείωση της έκφρασης (Σχήμα 1). Σε αντίθεση, miR-22 πιθανόν λειτουργούσε ως oncomiR με το επίπεδο του miR-22 αυξάνοντας 3.5-φορές καθώς τα κύτταρα έγιναν πιο ογκογόνα και τελικά μεταστατικό. Είναι ενδιαφέρον ότι, και στις δύο περιπτώσεις ο κύριος όγκος αύξηση σημειώθηκε κατά τα πρώτα στάδια της ογκογένεσης από Ρ69 έως M2182 με μικρές μόνο πρόσθετες αλλαγές κατά τη μετάβαση από M2182 στα κύτταρα Μ12.

Σύγκριση των miR-125β (γκρι) και miR -22 (μαύρο) επίπεδα σε RNA που εκχυλίζεται από ρ69, κυτταρικές σειρές M2182 και Μ12 με SYBR βασίζεται qRT-PCR όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Πλάσια διαφορά υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που αναλύθηκαν εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς RNU48 (ΔΟ

Τ) ως ένας εσωτερικός έλεγχος και εκφράζεται σε σχέση με το γονικό ρ69 κυτταρική γραμμή χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

μέθοδος T [23] . τεστ ANOVA δείχνει μια σημαντική διαφορά με μια τιμή Ρ & lt? 0.05.

Η

MiR έκφραση σε καρκινικά ιστού RNA που εκχυλίζεται από LCM

Για να επιβεβαιώσετε τις διαπιστώσεις αυτές που παρατηρήθηκαν με κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, του miR απορρύθμισης αξιολογήθηκε σε ανθρώπινους όγκους που λαμβάνεται μετά από ριζική προστατεκτομή. Προσδιορισμός των μοριακών αλλαγών που συμβάλλουν στην παθογένεση του προστάτη περιπλέκεται από την ετερογένεια του ιστού. Συχνά, όγκος ποικίλης Gleason σκορ περιβάλλονται από φυσιολογικό αδενικό ιστό όλα ενσωματωμένα σε στρώμα όπως αναφέρεται (Σχήμα 2). πληθυσμοί Καθαρό κύτταρο μπορεί να ληφθεί μόνο από μια τέτοια ετερογενή ιστού με τεχνικές όπως η LCM [19,20,25-29], το οποίο επιτρέπει την άμεση απεικόνιση και τη συλλογή των επιλεγμένων κυττάρων, αποδίδοντας ένα καθαρό πηγή RNA για μεταγενέστερες αναλύσεις. 0.05. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.