Αφηρημένο

Αυτή η μελέτη εξέτασε το ρόλο που διαδραματίζει η υποξία παράγοντες (HIFs) σε κακοήθη συντήρησης φαινότυπο και κανονική σηματοδότηση Wnt. Κάτω από νορμοξία, διαπιστώσαμε ότι και οι δύο HIF-1α και HIF-2α εκφράζονται σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κόλου, αλλά όχι σε μη κακοήθεις αντίστοιχά τους. Η σταθερή knockdown του HIF-1α ή HIF-2α έκφραση επάγεται αρνητικές επιπτώσεις στην κακοήθη φαινότυπο του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, με παραγωγή γαλακτικού, ο ρυθμός της απόπτωσης, της μετανάστευσης, CXCR4-χημειόταξη, και ογκογόνο δραστικότητα όλες επηρεάζεται σημαντικά από HIF knockdown και με HIF-1α εξάντληση ασκώντας μεγαλύτερη αποτελέσματα. Knockdown αυτών των δύο μεταγραφημάτων HIF επάγεται διαφορετικά και ακόμη και αντίθετα αποτελέσματα επί β-κατενίνης μεταγραφική δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα κόλου με διαφορετικές οδούς σηματοδότησης Wnt γενετική. Σε κύτταρα SW480, HIF-2α knockdown δεν επηρέασε τα επίπεδα β-κατενίνης, αυξάνοντας την μεταγραφική δραστικότητα της β-κατενίνης με επαγωγή πυρηνική συσσώρευση της, ενώ HIF-1α φίμωση αρνητικά επηρεάζεται η σταθερότητα και η μεταγραφική δραστικότητα του β-κατενίνης, προκαλώντας την έξοδο του από τους πυρήνες και πρόσληψης στην κυτταρική μεμβράνη από την E-cadherin. Επιπλέον, αν και η εξάντληση HIF-1α προκάλεσε αντιστροφή της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), HIF-2α σίγηση μετέβαλε την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων CD44, Oct4, και CD24 και του δείκτη διαφοροποίησης ΟΚ20 στην αντίθετη κατεύθυνση όπως HIF-1α σίγηση. Αξιοσημείωτα, HIF-2α knockdown ενισχυμένη επίσης β-κατενίνης μεταγραφική δραστηριότητα υπό υποξία σε κύτταρα που εμφανίζεται κανονική σηματοδότηση Wnt, γεγονός που υποδηλώνει ότι το γονίδιο ρυθμίζει αρνητικά κανονική σηματοδότηση Wnt σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HIFs παίζουν αντίθετους ρόλους σε κανονική σηματοδότηση Wnt και είναι απαραίτητα για τη βλαστική ικανότητα και την κακοήθεια συντήρηση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Santoyo-Ramos P, Likhatcheva Μ, García-Zepeda ΕΑ, Castañeda-Patlán MC, Robles-Φλόρες Μ (2014) υποξία παραγόντων διαμορφώνουν τη βλαστική ικανότητα και την κακοήθεια των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου από Παίζοντας Απέναντι ρόλοι σε κανονική σηματοδότηση Wnt. PLoS ONE 9 (11): e112580. doi: 10.1371 /journal.pone.0112580

Επιμέλεια: Γρηγόρης Μ Kelly, Western University, Καναδάς

Ελήφθη: 2 Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 8 Οκτώβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Νοεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Santoyo-Ramos et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι, για τις εγκεκριμένες λόγους, ορισμένοι περιορισμοί πρόσβασης ισχύει για τα στοιχεία στα οποία βασίστηκαν τα συμπεράσματα. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM IN226111 και IN215514) και Consejo Nacional de Επιστήμης και Tecnología (CONACYT CB2011-151731). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σηματοδότηση Wnt έχει καλώς χαρακτηριστεί ως ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες για την ογκογένεση σε πολλούς τύπους συμπαγών όγκων. Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση Wnt κανονικός είναι γνωστό ότι συμβάλλουν στην πρόωρη εξέλιξη στην πλειονότητα των καρκίνων του παχέος. Πράγματι, μία μεγάλη ποσότητα πειραματικές αποδείξεις έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις στο γονίδιο πράξη αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) ως ελεγκτές εισόδου στη μοριακή παθογένεση της πλειονότητας των σποραδικών και κληρονομικές μορφές ορθοκολικό καρκίνωμα [1], [2]. Η οδός Wnt έχει επίσης καταδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και τη ρύθμιση των συστημάτων ενήλικων βλαστικών κυττάρων, και κανονική σηματοδότηση Wnt στηρίζει το σχηματισμό και την διατήρηση και των δύο βλαστικών και καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) [3].

η Canonical σηματοδότηση Wnt λειτουργεί μέσω της ρύθμισης της φωσφορυλίωσης και της υποβάθμισης της μεταγραφής συν-ενεργοποιητής της β-κατενίνης. Χωρίς διέγερση με Wnt, β-κατενίνης συναρμολογείται μέσα στο λεγόμενο συγκρότημα καταστροφή, στην οποία APC διαδραματίζει κεντρικό ρόλο, και αυτό το συγκρότημα περιλαμβάνει επίσης αξίνη, GSK-3β και κινάση καζεΐνης 1. Αυτό το συγκρότημα κατευθύνει μια σειρά γεγονότων φωσφορυλίωσης σε η β-κατενίνη που ένας στόχος για ουβικιτινίωση και την επακόλουθη πρωτεόλυση μέσω του πρωτεασώματος [4] κάνει. Διέγερση από Wnt οδηγεί στην αναστολή της διάσπασης β-κατενίνης, επιτρέποντας β-κατενίνης να συσσωρεύονται, εισάγετε τον πυρήνα, και να ενεργοποιήσει γονίδια στόχους Wnt όπως

κυκλίνη D1,

και

C-MYC

πρωτο -oncogenes, που προωθεί την είσοδο του κυττάρου στη φάση S του κυτταρικού κύκλου [5].

Tumor υποξία και οι κρίσιμες διαμεσολαβητές της κυτταρικής σηματοδότησης οδό οξυγόνο, δηλαδή τα υποξία παραγόντων (HIFs) , είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν πολλαπλές βαθμίδες της ογκογένεσης και τυπικά σχετίζονται με αλλαγές στον μεταβολισμό, νεο-αγγείωσης, εισβολή, μετάσταση, αντοχή φαρμάκου, και, τελικά, η κακή κλινική έκβαση [6]. HIFs είναι ετεροδιμερείς παράγοντες μεταγραφής που αποτελείται από HIF-α και HIF-β (ή ARNT) που εκφράζονται ιδιοσυστατικά στο μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. HIF-1α και HIF-2α (επίσης γνωστή ως EPAS1) είναι οι δύο καλύτερα μελετημένα μέλη της οικογένειας HIF-α. Υπό ορθοξικές συνθήκες, οι υπομονάδες HIF-α υδροξυλιώνεται στο κλειδί υπολείμματα προλίνης, η οποία τους επιτρέπει να αναγνωρίζεται από το ογκοκατασταλτικό νοη Hippel-Lindau (pVHL), η συνιστώσα αναγνώρισης υποστρώματος μιας ουμπικουϊτίνης συμπλόκου λιγάση Ε3 που στοχεύει HIF-α για πρωτεασώματος υποβάθμιση. Υποξική σηματοδότηση σταθεροποιεί HIF-α με την αναστολή της προλυλ υδροξυλίωση, και με τη σειρά της υποβάθμισης ουβικιτίνη πρωτεασωμική, καθιστώντας HIF-α ικανό διμερισμού με ARNT, σύνδεση προς το στοιχείο DNA υποξία ανταποκρίνεται, και η πρόσληψη του p300 συνενεργοποιητή μεταγραφής /CBP για τη μεταγραφική ενεργοποίηση του ένα πλήθος γονιδίων υποξίας-απόκρισης [7].

Με δεδομένες τις δομικές ομοιότητες των HIF-1α και HIF-2α, είχαν σκεφτεί να δράσουν πλεονασμό στην κυτταρική απόκριση σε υποξία. Ωστόσο, ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι HIF-1α και HIF-2α επάγουν την έκφραση των διαφορετικών συνόλων γονιδίων. Αν και HIF-1α και HIF-2α έχουν μοιραστεί στόχους όπως αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), που επίσης ρυθμίζουν μοναδική στόχων γονίδιο? HIF-1α ρυθμίζει γλυκολυτικά ένζυμα [8] και HIF-2α ενεργοποιεί τον παράγοντα βλαστοκυττάρων Oct4 [9]. Συνεπής με αυτή τη διαπίστωση, Imamura et al. προσδιορίζονται ξεχωριστές δέσμες HIF-1α και HIF-2α γονιδίων-στόχων σε SW480 κύτταρα καρκίνου κόλου με ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών [10].

Παρεμβολή έχει αναφερθεί μεταξύ κανονικών σηματοδότηση Wnt και σηματοδότηση HIF στην πρόοδο του όγκου και τη μετάσταση. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτή στιχομυθία παραμένουν ελάχιστα κατανοητή. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι οι δραστηριότητες των παραγόντων μεταγραφής ρυθμίζεται από υποξία παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των βλαστικών κυττάρων ηρεμία [9], και ότι HIF-1α μεσολάβηση Wnt ενεργοποίησης προωθεί τη διατήρηση της δραστηριότητας των βλαστικών κυττάρων [11]. Μαζουμντάρ et al. έδειξαν ότι HIF-1α ρυθμίζει Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση σε υποξικά εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ενισχύοντας την ενεργοποίηση β-κατενίνης και την έκφραση του κατάντη επενεργητές LEF-1 και TCF-1 [11]. Επιπλέον, υπάρχει πειραματική απόδειξη που υποστηρίζουν την υπόθεση ότι και οι δύο συνθήκες υποξίας και κανονική ενεργοποίηση Wnt εμπλέκονται στην ενεργοποίηση ενός προγράμματος ΕΜΤ σε πολλά καρκινικά κύτταρα [12], [13]. Επιπλέον, στιχομυθία έχει δειχθεί ότι υπάρχουν μεταξύ κανονική σηματοδότηση Wnt και σηματοδότηση HIF στην πρόοδο του όγκου και τη μετάσταση μέσω του συνεργική αλληλεπίδραση του γονιδίου στόχου Wnt

c-MYC

με HIF-1α [14], [15]. Από την άποψη αυτή, αν και κανονική φυσιολογική HIF-1α αποκρίσεις σε μη-κακοήθη κύτταρα μπορεί να αναστέλλει την δραστικότητα των κανονικών c-Myc, παραδόξως, η απορυθμισμένη έκφραση των ογκογόνων c-Myc που υπάρχει σε πολλούς καρκίνους όπως καρκίνωμα του παχέος συνεργάζεται με HIF- 1α για την απόκτηση του όγκου του μεταβολισμού φαινότυπο που περιγράφεται ως το αποτέλεσμα Warburg ή αερόβια γλυκόλυση, καθώς και για την προώθηση της αγγειογένεσης [14].

η τρέχουσα γνώση των ομοιοστατικών μηχανισμών που ρυθμίζουν την επιθηλιακά βλαστική ικανότητα του παχέος εντέρου και κακοήθεια παραμένει ατελής, την πρόληψη σημαντικών προόδους στη θεραπεία του καρκινώματος του κόλου. Αυτή η μελέτη εξέτασε τα αποτελέσματα της σταθερής HIF-1α και HIF-2α siRNA knockdown σε κακοήθη φαινότυπο συντήρηση και στην μεταγραφική δραστηριότητα που προκαλείται από β-κατενίνης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, παρόλο που και οι δύο HIF-1α και HIF-2α είναι απαραίτητα για βλαστική ικανότητα και κακοήθεια συντήρηση, αυτές οι δύο πρωτεΐνες εξασκούν διαφορετικά αποτελέσματα και παίζουν αντίθετους ρόλους σε κανονική σηματοδότηση Wnt.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα πειράματα: αλλοφυκοκυανίνη-συζευγμένο αντι-CD44, αντι-CD44, και αντι-CD24 από την BD Biosciences (San Jose, CA, USA)? φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντι-CD133 από τη Miltenyi Biotec (Auburn, CA, USA)? ποντικού αντι-HIF-1α, αντι-HIF-2α ποντικού, κουνελιού αντι-Oct4, Alexa 647-συζευγμένη αντι-ποντικού κουνελιού, Cy3-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού και αντι-λαμίνη ποντίκι A /C από την Millipore (Billerica, ΜΑ )? κουνελιού αντι-β-τουμπουλίνης από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA)? βιοτίνη-συζευγμένο αντι-ποντικού CXCR4 από την Κ & amp? D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA)? ποντικού αντι-β-κατενίνης, αντι-κυτοκερατίνης ποντικού 20 (ΟΚ20), αντι-Ε-καδερίνης κουνέλι, κουνέλι αντι-Σαλιγκάρι 1, ποντικού αντι-βιμεντίνη, αντι-GSK-3β κουνέλι, κατσίκα και αντι- (ρ-Ser9) -GSK-3β από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)? Alexa647-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού από την Molecular Probes, Inc., (Eugene, OR, USA)? και αλλοφυκοκυανίνη στρεπταβιδίνη συζευγμένη από Biolegend (San Diego, CA, USA). Mouse IgG1 και IgG2b από την US Biologicals (Massachusetts, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν στην ίδια συγκέντρωση όπως το πρωτογενές αντίσωμα, όπως ήταν το ισότυπο ελέγχου στην χρώση ανοσοφθορισμού και κυτταρομετρία ροής πειράματα. Η αννεξίνη V FLUOS χρώσης κιτ από την Roche Applied Science (Mannheim, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων. Η αφυδρογονάση πουρομυκίνη αντιβιοτικό και L-γαλακτικό ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Μια αυξητικού παράγοντα-μήτρας μειωμένου Matrigel αγοράστηκε από την BD Biosciences. Όλα τα άλλα χημικά ήταν βαθμού αντιδραστηρίου.

πλασμίδια

Τα πλασμίδια δημοσιογράφος pTOPFlash και pFOPFlash λήφθηκαν από Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Ο δημοσιογράφος HRE-Luc αποκτήθηκε από Addgene (πλασμίδιο 26731: HRE-λουσιφεράσης), μια μη-κερδοσκοπική οργάνωση αφιερωμένη στην διευκόλυνση καταμερισμού του πλασμιδίου μεταξύ των επιστημόνων. Οι πλασμίδιο ελέγχου το οποίο κωδικοποιεί ένα κωδικοποιημένο ακολουθία shRNA λήφθηκε από την Santa Cruz Biotechnology. Ο έλεγχος (κενό πλασμίδιο pSuper), HIF-1α και HIF-2α RNAi πλασμίδια ήταν πλούσια δώρα από τον Δρ Ντάνιελ Chung, και την κατασκευή και την αποτελεσματικότητά τους περιγράφηκαν σε προηγούμενη έκθεση [10].

καλλιέργειας κυττάρων

Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου και η μη κακοήθων 112CoN κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται εδώ αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές επικυρώνονται τον Ιανουάριο του 2012 από Short Tandem Repeat προφίλ DNA που εκτελούνται στο Instituto Nacional de Medicina Genómica (INMEGEN) στην Πόλη του Μεξικού.

κηλίδωση Western

Δείγματα πρωτεΐνης (50 μα) διαχωρίστηκαν με 10% δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου-(SDS-PAGE) ακολουθούμενη από ηλεκτροφορητική μεταφορά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) όπως περιγράφεται σε προηγούμενη έκθεση [14]. Ένα ακτίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο για ίση φόρτωση.

Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα πλύθηκαν και ομογενοποιήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 7,5 λύσης που περιέχει 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Triton Χ-100 και ένα μίγμα από αναστολείς πρωτεάσης και αναστολείς πρωτεΐνης φωσφατάσης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης στο υπερκείμενο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτεΐνης συμβατό με το απορρυπαντικό (Bio-Rad). Δείγματα αυτών των εκχυλισμάτων (1 mg /ml) επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με 2 μg /ml πρωτογενούς αντισώματος με ήπια ανακίνηση. Στη συνέχεια, 25 μΙ πρωτεΐνης A-Sepharose (30%, Calbiochem) προστέθηκε και επωάστηκε για 2 ώρες. Τα ανοσοσύμπλοκα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα Α (50 mM Tris-HCI και 0,6 Μ NaCl, ρΗ 8.3) συμπληρωμένο με 0,1 mg /ml αναστολέα θρυψίνης και 1 mM PMSF, και μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα Β (50 mM Tris HCl και 0.15 Μ NaCl, ρΗ 7.5) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης.

HIF-1α ή HIF-2α knockdown

Για να επάγουν την σταθερή αποσιώπηση του HIF-1α ή HIF-2α, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ο pSuper HIF-1α ή HIF-2α RNAi πλασμίδιο, που κατασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με τον Δρ Daniel Chung, όπως περιγράφεται σε προηγούμενη έκθεση [10] ή με το πλασμίδιο ελέγχου (που κωδικοποιεί ένα κωδικοποιημένο αλληλουχία shRNA ή pSuper άκυρα πλασμίδιο) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 . Για την παραγωγή σταθερές επιμολύνσεις, τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν είτε με 1 μg του πλασμιδίου ελέγχου ή 1 μα pSuper HIF-1α RNAi ή HIF-2α πλασμίδια RNAi. Σταθερά επιμολυσμένα επελέγησαν με 3 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma) για τέσσερις εβδομάδες, και επιλέχθηκαν οι κλώνοι και διαλογή για HIF-1α ή HIF-2α σίγηση με κυτταρομετρία ροής.

Ανάλυση

FACS

Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και διαχωρίστηκαν σε 10 mM διαλύματος EDTA. Το κυτταρικό εναιώρημα πλύθηκε, επαναιωρήθηκε σε PBS συμπληρωμένο με 4% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (ρυθμιστικό χρώσης), χρωματίστηκαν με το αντίστοιχο πρωτεύον αντίσωμα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με το δευτερεύον αντίσωμα μόνο χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Για πυρηνική χρώση, πυρήνες καθαρίστηκαν από τα δείγματα κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης πυρήνες (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πυρήνες πλύθηκαν, μονιμοποιήθηκαν, γίνανε διαπερατά, μπλοκάρει, και σημάνθηκαν με αντι β-κατενίνης και αντίσωμα Alexa 647-συζευγμένη αντι-ποντικού κατσίκας σε χρώση ρυθμιστικό. Ως αρνητικός έλεγχος, πυρήνες διατηρούνται σε ξεχωριστούς σωλήνες ανιχνεύθηκαν παράλληλα με Alexa αντίσωμα αντι-ποντικού 647-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας. Μετά από μία τελική πλύση, οι πυρήνες σταθεροποιήθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Lactate μέτρηση

δοκιμασία

Η ποσότητα του γαλακτικού τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ενζυματικής χρησιμοποιώντας L -γαλακτική αφυδρογονάση (Sigma). Σε αυτή τη δοκιμασία, το γαλακτικό εκκρίνεται εντός του δείγματος μέσου καλλιέργειας μειώνεται σε πυροσταφυλικό και NADH παρουσία γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) (Sigma) και περίσσεια NAD. Η ποσότητα του NADH που σχηματίζεται στην αντίδραση, που μετράται από την αλλαγή στην απορρόφηση στα 340 nm, είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση του γαλακτικού που υπάρχει στο δείγμα. Για να αποφευχθεί η παρεμβολή με την LDH που μπορεί να είναι ήδη παρόν στον ορό που χρησιμοποιείται για τη συμπλήρωση του μέσου καλλιέργειας, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε αποπρωτεΐνωση με 8% τριχλωροξικό οξύ (TCA) για να τους καταστήσει ελεύθερο πρωτεΐνης πριν από τη δοκιμασία.

Η απόπτωση

έλεγχος SW480 ή HIF-1α ή HIF-2α-σιγήσει κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1,5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα επωάστηκαν με την απουσία ή παρουσία της απόπτωσης επαγωγέα H

2O

2 (1 mM) για 12 ώρες. Η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το κιτ αννεξίνης V FITC (Roche), όπως συνιστάται από τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η νέκρωση μετρήθηκε με ιωδιούχο προπίδιο διαπερατότητας (ΡΙ) σε απουσία απορρυπαντικού. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίσθηκε με κυτταρομετρία ροής.

επούλωση πληγών

δοκιμασία

Control ή HIF-1α- ή HIF-2α-σιγήσει SW480 κύτταρα σπάρθηκαν προς συρροή σε πολυ-L- λυσίνη πλακίδια σε ϋΜΕΜ F12 συμπληρωμένο με 5% FBS. Μετά από 24 ώρες, μια γρατσουνιά παρήχθη χρησιμοποιώντας αποστειρωμένη πιπέτα. Οι καλλιέργειες πλύθηκαν με PBS. Σε αυτό το χρονικό σημείο (t = 0 h), τα περιθώρια του τραύματος φωτογραφήθηκαν. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με 0.05% FBS για μέχρι 72 ώρες, και τα περιθώρια του τραύματος φωτογραφήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία.

Μετανάστευση δοκιμασία

Η χημειοτακτική απόκριση στο στρωματικό κύτταρο προερχόμενο παράγοντα-1α (SDF-1α) του HIF-1α και HIF-2α-φιμώνονται και τον έλεγχο των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Boyden θαλάμων (μέγεθος 3 μπι πόρου). Ένα σύνολο 1 × 10

5 κύτταρα προστέθηκαν στο άνω μέρος του θαλάμου, και το κάτω μέρος του θαλάμου που περιέχεται SDF-1α (200 ng /ml σε 0.05% FBS). Για να ληφθούν οι απόλυτους αριθμούς των μεταναστευτικών κυττάρων, τη ροή μετράει κυτταρομετρίας για κάθε δείγμα ελήφθησαν για σταθερό, προκαθορισμένο όγκο και στη συνέχεια συγκρίνονται με διπλές μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής που λαμβάνονται από τα φρεάτια ελέγχου.

μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

επιλέχθηκαν επιλεγμένοι κλώνοι των σταθερών ελέγχου-, HIF-1α-, ή κύτταρα HIF-2α-επιμολυσμένα και σε διαλογή με κυτταρομετρία ροής για τον προσδιορισμό της HIF-1α και HIF-2α φίμωση αποτελεσματικότητας σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Τα κύτταρα που εμφανίζουν την υψηλότερη απόδοση knockdown καλλιεργήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για ξενομεταμόσχευση σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια. Για κάθε σημείο της ένεσης, 1 × 10

6 HIF-1α- ή HIF-2α-σιγήσει κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μία υψηλή συγκέντρωση του Matrigel (BD Biosciences), αραιωμένο σε PBS σε μια τελική συγκέντρωση 50% και υποδόρια (sc ) εγχύθηκε στα πλευρά του έξι εβδομάδων γυμνά ποντίκια (η = 5). Κάθε ποντικός εγχύθηκε σε πλευρό επάνω δεξιά με τα κύτταρα ελέγχου, στην κάτω δεξιά πλευρά με κύτταρα HIF-1α-σιγήσει, και πλευρίζουν την κάτω αριστερή με κύτταρα HIF-2α-σιγήσει σε.

Για xenotransplants χρησιμοποιώντας CD44

– /CD133

– ή CD44

+ υποπληθυσμούς, τα κύτταρα ελήφθησαν από SW480 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με το πλασμίδιο pSuper ελέγχου ή με pSuper HIF-1α ή HIF-2α RNAi με διαλογή κυττάρων FACS. Τα καθαρισμένα υποπληθυσμών για κάθε συνθήκη συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση. Στη συνέχεια, 1 × 10

4 κύτταρα ανά θέση ένεσης επαναιωρήθηκαν σε αυξητικό παράγοντα-μήτρας μειωμένου Matrigel, αραιωμένο σε PBS σε μια τελική συγκέντρωση 50% και s.c. εγχέεται στα πλευρά του έξι εβδομάδων γυμνούς ποντικούς. Κάθε ποντίκι (n = 5 για κάθε συνθήκη) εγχύθηκε στην δεξιά πλευρά με CD44

– /CD133

– κύτταρα και σε αριστερό πλευρό με

+ κύτταρα CD44 καθαρίζεται από κάθε συνθήκη (έλεγχος, HIF- 1α νοκ ντάουν, ή HIF-2α νοκ ντάουν). Τέσσερις εβδομάδες (για RKO ή κύτταρα SW480 προερχόμενα) ή δύο εβδομάδες (για τα κύτταρα SW620 προερχόμενα) μετά τον εμβολιασμό, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν.

Επιμόλυνση και προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1.2 – 1.8 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό και επιμολυσμένα με 1 μg ενός πλασμιδίου ανταποκριτή (pTOPFlash) ή το πλασμίδιο ελέγχου (pFOPFlash) και με 0.05 μα του πλασμιδίου λουσιφεράσης pRL ή CMV-GFP πλασμίδιο (διαμόλυνση έλεγχος). Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανταποκριτή στα προϊόντα λύσης κυττάρων μετρήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση του κιτ διπλής λουσιφεράσης Δοκιμασία (Promega, Madison, WI, USA). Η δραστικότητα κανονικοποιήθηκε σε σχέση με την δραστηριότητα του

Renilla

λουσιφεράση ή σε σχέση με την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη σε κάθε δείγμα.

ανοσοφθορισμού ανάλυση

SW480 ελέγχου ή HIF-1α- ή knockdown κυττάρων HIF-2α αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά και συν-ανοσοχρώση με αντισώματα έναντι β-κατενίνης, E-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι 1. Ο φθορισμός αναλύθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία laser όπως περιγράφεται στην προηγούμενη έκθεση [16]. β-κατενίνης και βιμεντίνης απεικονίστηκαν με Alexa αντίσωμα αντι-ποντικού 647-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας, και Ε-καδερίνη και Σαλιγκάρι 1 απεικονίστηκαν με αντίσωμα αντι-κουνελιού Cy3-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας. Ο φθορισμός κυττάρων απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica TCS SP5) με ένα λέιζερ κρυπτόν αργού. Ένα δείγμα ελέγχου των κυττάρων βάφτηκε με το δευτερογενές αντίσωμα μόνο για να επιβεβαιώσει ότι κανένα σήμα φθορισμού ανιχνεύθηκε από αυτά τα κύτταρα.

Ηθική δήλωση

Όλα τα ζώα αντιμετωπίζονται αυστηρά σύμφωνα με τις καλές ζώων πρακτικές, όπως ορίζονται από τις κατευθυντήριες γραμμές Πειραματική ζώων Βιο-Ηθική του Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutrición Σαλβαδόρ Zubirán, Μεξικό. Επιπλέον, όλες οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Πειραματική Επιτροπή Βιοηθικής Ζώων της Ιατρικής Σχολής, Universidad Nacional Autónoma de México. Όταν ενδείκνυται, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση

t

δοκιμή Student ή μια μονόδρομη ANOVA με-τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey. Μια τιμή του ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

HIF-1α και HIF-2α εκφράζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα αλλά όχι σε μη κακοήθη κύτταρα υπό συνθήκες ορθοξικές

.

η υποξία είναι μια κοινή κατάσταση που παρατηρείται σε ένα ευρύ φάσμα συμπαγών όγκων, και HIF υπερέκφραση συχνά συνδέεται με τη μετάσταση και την κακή κλινική έκβαση.

In vivo

, υποξία είναι επίσης πιθανό να είναι ένα λειτουργικό στοιχείο μιας κανονικής κόγχη βλαστοκυττάρων. Ωστόσο, η σημασία της υποξίας στη συντήρηση CSC παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη [17]. Επειδή έκφραση υψηλού HIF έχει ανιχνευθεί σε κύτταρα όγκου σε απουσία υποξίας, συγκρίναμε την έκφραση αυτών των παραγόντων σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα κόλου υπό νορμοξικές και υποξικές συνθήκες με καλλιεργημένα κύτταρα μη κακοήθη 112CoN που επωάστηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες με western blot . Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 1 δείχνουν ότι, όπως αναμενόταν, υποξία (3% O

2) που προκαλείται από την έκφραση τόσο της HIF-1α και HIF2-α τόσο σε φυσιολογικά (112CoN) και καρκινικά κύτταρα? Ωστόσο, κάτω από νορμοξικές συνθήκες καλλιέργειας (20% O

2), μόνο τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου συν-εκφράζεται τόσο HIF-1α και HIF-2α, ενώ τα μη-κακοήθη κύτταρα 112CoN δεν εκφράζουν αυτούς τους παράγοντες υπό ορθοξικές συνθήκες.

Κανονικό κόλον (112CoN) ή του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (20% O

2) ή υποξία (3% O

2) για 12 ώρες. Σύνολο εκχυλίσματα κυττάρων από τις κυτταρικές σειρές του κόλου παρασκευάστηκαν, και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μία ανάλυση ανοσοκηλίδος διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-HIF-1α ή αντισώματα αντι-HIF-2α όπως φαίνεται στο σχήμα, και αναπτύχθηκε με τη χρήση ενός κρένου δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση. Actin αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο για ίση φόρτωση. Μια πυκνομετρική ανάλυση διεξήχθη για την εκτίμηση των επιπέδων του HIF-1α και έκφραση HIF-2α, η οποία κανονικοποιήθηκαν με τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης σε μη κακοήθη κύτταρα 112CoN. Όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν και τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM από τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες. * P & lt?. 0.05

Η

Σταθερή νοκ ντάουν του HIF-1α, αλλά δεν HIF-2α μειώνει την παραγωγή γαλακτικού οξέος από τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου υπό ορθοξικές συνθήκες

Για να κατανοήσουμε τους ρόλους που διαδραματίζουν οι HIFs στον καρκίνο συντήρηση φαινότυπο και πιθανή αλληλεπίδραση τους με κανονική σηματοδότηση Wnt, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της σταθερής knockdown του HIF-1α και HIF-2α με siRNA σε κύτταρα SW480, τα οποία εμφανίζουν ουσιαστικά δραστική κανονική σηματοδότηση Wnt. Τα πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν την μελέτη κατασκευάστηκαν και προηγουμένως ανιχνεύθηκαν επιτυχώς από τον Δρ Daniel C. Chung [10], ο οποίος δώρισε ευγενικά τα πλασμίδια για εμάς. κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο περιπλεγμένο shRNA πλασμίδιο, pSuper HIF-1α RNAi, ή pSuper HIF-2α RNAi. Σταθερά επιμολυσμένα επελέγησαν χρησιμοποιώντας ένα αντιβιοτικό για τέσσερις εβδομάδες, και επιλέχθηκαν οι κλώνοι και υποβλήθηκαν σε διαλογή με κυτταρομετρία ροής για HIF-1α και HIF-2α σίγηση σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ελήφθησαν και επιλέχθηκαν με κυτταρομετρία ροής όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α Σταθερά επιμολυσμένα εμφανίζουν μείωση τουλάχιστον 85% στην έκφραση HIF-1α και μείωση τουλάχιστον 90% στην έκφραση του HIF-2α. Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη γλυκόλυση και γαλακτικό παραγωγή και μειώθηκε O

2 κατανάλωση σε σύγκριση με τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα, ένα φαινόμενο που είναι γνωστό ως το φαινόμενο Warburg [18]. Σύμφωνα με αυτή την έννοια, το Σχήμα 2Β δείχνει ότι μία σημαντική αύξηση στην παραγωγή γαλακτικού ήταν εμφανής στα καρκινικά κύτταρα κόλου SW480 και RKO σε σύγκριση με τα μη-κακοήθη κύτταρα 112CoN κόλον. Στη συνέχεια εξετάστηκαν τα αποτελέσματα της σταθερής φίμωση κάθε HIF για παραγωγή γαλακτικών από SW480 καρκινικά κύτταρα κάτω από νορμοξία ή υποξία. Όπως παρατηρήθηκε στην Εικόνα 2C, η σταθερή knockdown του HIF-1α σε κύτταρα SW480 μείωσε την παραγωγή γαλακτικού κατά τουλάχιστον 50% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου υπό νορμοξικές συνθήκες, ενώ HIF-2α knockdown οδήγησε μόνο σε μείωση κατά 20% σε γαλακτικό έκκριση σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου κάτω από τις ίδιες συνθήκες (Σχήμα 2Β). Μετά από 12 ώρες έκθεσης σε υποξία οξεία, τα επίπεδα των πρωτεϊνών HIF ήταν αυξημένα, και τα επίπεδα παραγωγής γαλακτικού οξέος ανακτάται (Σχήμα 2C). Έτσι, για να αποφευχθεί HIF υπερέκφραση, η οποία θα μπορούσε να παρακάμψει την αποτελεσματικότητα νοκ ντάουν (φαίνεται στο Σχήμα S1) και καθιστούν δύσκολη την αναλύσουμε τον ρόλο που διαδραμάτισε κάθε HIF στη διατήρηση του κακοήθους φαινοτύπου, αποφασίσαμε την πραγματοποίηση αναλύσεων πιο κάτω ορθοξικές συνθήκες.

Α). Σταθερό HIF-1α- ή HIF-2α-knockdown ή ελέγχου (κωδικοποιημένο πλασμίδιο shRNA) μεταγωγικά ελήφθησαν όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Επιλεγμένοι κλώνοι υποβλήθηκαν σε διαλογή με κυτταρομετρία ροής για την αξιολόγηση της αποσιώπηση του HIF-1α και HIF-2α σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. ΣΙ). Γαλακτικό έκκριση ήταν σημαντικά αυξημένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με μη κακοήθη κύτταρα 112CoN. ΝΤΟ). Αλλαγές στο γαλακτικό έκκριση από HIF-1α- ή HIF-2α- σιγήσει SW480 κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Ctr στο σχήμα) καλλιεργείται υπό νορμοξία (20% O

2) ή υποξία (3% O

2) για 24 ώρες. L-γαλακτικό προσδιορίσθηκε με μία δοκιμασία ενζυματικής LDH, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν και τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM από τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες. *: Ρ. & Lt? 0,05

Η

Σταθερό knockdown του HIF-1α ή HIF-2α που παράγεται μια αύξηση στην βασική ή H

2O

2-επαγόμενη απόπτωση σε SW480 καρκινικά κύτταρα κόλου

είναι καλά τεκμηριωμένο ότι HIF-1α προάγει την επιβίωση των κυττάρων και την αντίσταση απόπτωσης σε διάφορα συστήματα κυττάρου υπό υποξία. Εμείς διερευνηθεί αν ο αποκλεισμός του HIF-1α ή έκφραση HIF-2α σε καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν και τις δύο παραγόντων υπό φυσιολογική οξυγόνωση επηρεάζει επίσης την κυτταρική επιβίωση. Χρησιμοποιήσαμε το υπεροξείδιο του υδρογόνου για να προκαλέσει οξεία απόπτωση επειδή έχει αναφερθεί ευρέως ότι είναι ένας ισχυρός επαγωγέας απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα οφείλεται στην παραγωγή σοβαρών οξειδωτικό στρες. SW480 κύτταρα HIF-σιγήσει υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mM H

2O

2 για 12 ώρες, και στη συνέχεια, ο βαθμός της κυτταρικής απόπτωσης προσδιορίστηκε με χρώση Annexin V-ΡΙ που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τόσο απόπτωση και νέκρωση ενισχύθηκαν κάτω από νορμοξία, ως αποτέλεσμα της HIF-1α ή HIF-2α σίγηση σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, ακόμη και εν απουσία του επαγωγέα απόπτωσης (άνω μέρος του σχήματος 3). Ωστόσο, το ποσοστό των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων που λαμβάνονται ως αποτέλεσμα της HIF-1α σίγηση ήταν μεγαλύτερη από αυτή που επάγεται από HIF-2α knockdown σε σχέση με τους ελέγχους, και αυτό το αποτέλεσμα ήταν περισσότερο εμφανής όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 12 ώρες με 1 mM H

2O

2 (Σχήμα 3). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι HIFs, ιδιαίτερα HIF-1α, εμπλέκονται στην προαγωγή της κυτταρικής επιβίωσης και την αντοχή σε απόπτωση.

Η απόπτωση που επάγεται με καλλιέργεια των HIF-σιγήσει ή ελέγχου (επιμολυσμένα με περιπλεγμένο πλασμίδιο shRNA και υποδεικνύεται στην εικόνα ως κύτταρα Ctr) απουσία ή παρουσία 1 mM η

2O

2 για 12 ώρες. κύτταρα SW480 θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και χωρίς θεραπεία (όχημα) ή σε επεξεργασία με H

2O

2 για 12 ώρες. Οι καλλιέργειες χρωματίστηκαν με Annexin V και ΡΙ, όπως περιγράφεται στα «Υλικά και Μέθοδοι», και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (ένα αντιπροσωπευτικό ιστόγραμμα των δεδομένων απεικονίζεται), και το γράφημα παρουσιάζει τα μέσα ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα? *: P & lt? 0,05? **: Ρ. & Lt? 0,01

Η

Σταθερή νοκ ντάουν του HIF-1α ή HIF-2α μείωσε τη μετανάστευση των κυττάρων των καρκινικών κυττάρων SW480, αλλά μόνο HIF-1α νοκ ντάουν σοβαρά πληγείσες CXCR4-χημειόταξη

πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς επούλωση της πληγής να διερευνηθούν οι επιδράσεις αυτών των πρωτεϊνών στην κυτταρική μετανάστευση. Σταθερό HIF-1α- ή HIF-2α-σιγήσει κύτταρα αναπτύχθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση μέχρι συρροής, και στη συνέχεια, γρατσουνιές έγιναν με μονοστιβάδας. Εικόνες από τις γρατσουνιές συνελήφθησαν σε 0 και 48 ώρες, και η περιοχή μηδέν αναλύθηκε σε αυτά τα χρονικά σημεία. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί στο Σχήμα 4Α, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η μετανάστευση έχει αποκλειστεί από το νοκ ντάουν του HIF-1α ή HIF-2α (ανατρέξτε όριο αναφοράς γραμμές που στις φωτογραφίες). Επιπλέον, η αξιολόγηση της κυτταρικής μετανάστευσης βασίζεται στην χημειοτακτική δραστηριότητα προς SDF-1α που διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα CXCR4 αποκάλυψε ότι η έκφραση CXCR4 μειώθηκε ως αποτέλεσμα της HIF-1α, αλλά όχι HIF-2α knockdown (Σχήμα 4Β). Σε συμφωνία με αυτό το εύρημα, η αποσιώπηση της έκφρασης HIF-1α σχεδόν κατάργησε την SDF-1α- CXCR4 μεσολάβηση μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μέσω Transwell θαλάμων, ενώ η σίγηση της έκφρασης HIF-2α μειώθηκε κυτταρική μετανάστευση μόνο κατά 45% σε σχέση με τους ελέγχους (Σχήμα 4C).

Α) Μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αν κυτταρική μετανάστευση εξαρτάται είτε HIF-1α ή έκφραση HIF-2α. SW480 knockdown και ελέγχου (κωδικοποιημένο shRNA πλασμίδιο) κύτταρα αναπτύχθηκαν προς συρροή σε πλάκες καλλιέργειας ιστών 24 φρεατίων, και η δοκιμασία επούλωση πληγών διεξήχθη όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Η γδαρμένο περιοχή απεικονίζεται αμέσως μετά τον τραυματισμό (χρόνος 0) και 48 ώρες μετά τον τραυματισμό. Αυτές οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β) έκφραση CXCR4 μειώθηκε ως αποτέλεσμα της HIF-1α knockdown. έλεγχος SW480 ή σιγήσει κυττάρων, όπως αναφέρεται στο σχήμα, αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας EDTA και πλένεται, και 1 × 10

5 κύτταρα επωάστηκαν με το ποντίκι βιοτίνη-συζευγμένο αντι-CXCR4 και αλλοφυκοκυανίνη αντίσωμα συζευγμένο με στρεπταβιδίνη και εξετάστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα δείχνουν τις διάμεσος εντάσεις φθορισμού της έκφρασης CXCR4 και SSC (side-διάχυτου φωτός, ανάλογη προς κύτταρο granularity), και αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *: P & lt? 0,05? **: P & lt? 0,01. Γ) Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν στο SDF-1α επαγόμενη χημειοτακτική απόκριση. Η χημειοτακτική απόκριση προς SDF-1α των κυττάρων HIF-1α- ή HIF-2α-knockdown ή ελέγχου (Ctr στο σχήμα) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Boyden θαλάμων όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες για να καταστεί δυνατή η μετανάστευση και ανακτήθηκε με χρήση EDTA. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM από τρία πειράματα εκτελέστηκαν εις διπλούν. *: P & lt? 0,05? **: Ρ. & Lt? 0,01

Η

Σταθερό αποσιώπηση του HIF-1α ή HIF-2α μείωσε την in vivo ογκογόνο δραστικότητα μεταμοσχευμένων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου

Η επίδραση του σταθερού siRNA- Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.