Αφηρημένο

Ιστορικό

χημειοθεραπείες αντίσταση στη θεραπεία με σισπλατίνη επίκεντρο του καρκίνου αποτελεί σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου στον άνθρωπο ωοθηκών. Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι το τριοξείδιο του αρσενικού (ATO) επάγει κυτταρική απόπτωση στα δύο φάρμακα ευαίσθητα και ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε το μοριακό μηχανισμό της ATO- επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ΑΤΟ επαγωγή απόπτωσης με μείωση των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ (ΑΚΤ-ρ) και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και κασπάσης-9. Είναι σημαντικό ότι, BIM έπαιξε ένα κρίσιμο ρόλο στην ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση. Η αναστολή της έκφρασης BIM εμπόδισε ΑΚΤ αποφωσφορυλίωση και ανέστειλε την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 κατά τη διάρκεια της κυτταρικής απόπτωσης. Ωστόσο, αναπάντεχα, γονιδιακή σίγηση του ΑΚΤ ή FOXO3a είχαν μικρή επίδραση στην έκφραση BIM και φωσφορυλίωση. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 με επεξεργασία ΑΤΟ βελτιωθεί ΑΚΤ αποφωσφορυλίωση, όχι μόνο με διάσπαση του ρυθμιστικού Α υπομονάδα της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (ΡΡ2Α), αλλά και με την αύξηση της ενεργοποίησης του. Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι οι c-Jun Ν-τερματικές κινάσες (JNK) μονοπάτι εμπλέκεται στην ρύθμιση της έκφρασης BIM.

Συμπεράσματα

Δείξαμε τους ρόλους των ΒΙΜ σε ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση και οι μοριακοί μηχανισμοί της έκφρασης BIM ρυθμίζονται από ΕΦΕ κατά τη διάρκεια των καρκινικών κυττάρων απόπτωση των ωοθηκών. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι BIM παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της π-AKT με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και ότι BIM μεσολαβεί το επίπεδο της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ να καθορίσει το όριο για την υπέρβαση αντίσταση σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Παράθεση:. Yuan Ζ, Wang F, Zhao Z, Zhao Χ, Qiu J, Nie C, et al. (2011) ΒΙΜ-Mediated ΑΚΤ φωσφορυλίωσης είναι ένα κλειδί διαμορφωτής τριοξείδιο του αρσενικού απόπτωση σε Cisplatin-Sensitive και -Ανθεκτικό καρκίνου των ωοθηκών Cells. PLoS ONE 6 (5): e20586. doi: 10.1371 /journal.pone.0020586

Επιμέλεια: Pierre Bobe, Institut Jacques Monod, Γαλλία

Ελήφθη: 20 Οκτωβρίου, 2010? Αποδεκτές: 6 Μαΐου 2011? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαΐου, 2011

Copyright: © 2011 Yuan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NSFC) -81071817 /H1609, (NSFC) -30.800.581 και (NSFC) -30.900.744. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο από γυναικολογικούς όγκους [1]. Η σισπλατίνη και τα ανάλογά της είναι τα βασικά ενώσεις της χημειοθεραπείας για ανθρώπινους καρκίνους των ωοθηκών, αλλά χημειο-αντίσταση αποτελεί σημαντικό εμπόδιο εμποδίζουν την επιτυχή θεραπεία των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [2], [3]. Έτσι, θα ήταν μια σημαντική εξέλιξη στην συνέχισε προκλινικές μελέτες για να βρουν μια νέα, χαμηλής τοξικότητας, αλλά αποτελεσματικό φάρμακο για την αντιμετώπιση της σισπλατίνης αντίσταση.

ΑΤΟ, η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα αποτελεσματικό χημειοθεραπευτικό φάρμακο για την θεραπεία της υποτροπιάζουσα /δυσίατη προμυελοκυτταρική λευχαιμία (APL) στη δεκαετία του 1990 [4], έχει εγκριθεί από το FDA (Federal Drug Administration) για την αντιμετώπιση all-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) ανθεκτικών APL [5]. Η αξιοσημείωτη αποτελεσματικότητα του ΑΤΟ στη θεραπεία της APL έχει οδηγήσει στη διερεύνηση των αντικαρκινική δράση της και υποκείμενο μηχανισμό σε άλλες κακοήθειες. Υπήρξαν ελπιδοφόρες μελέτες που δείχνουν ότι ΑΤΟ κατέχει όχι μόνο εγγενή δραστικότητα ογκοκτόνο μονού παράγοντα έναντι κυτταρικών γραμμών ωοθηκών-καρκίνου, αλλά επίσης μπορεί να προκαλέσει απόπτωση σε σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα [6] – [10]. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους ΑΤΟ υπερνικά χημειο-αντίσταση και επάγει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών είναι ελάχιστα κατανοητές.

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η αποτυχία του φαρμάκου που προκαλείται από απόπτωση μπορεί να είναι μία βασική αιτία της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Μερικές μελέτες έχουν εντοπίσει μια σειρά βασικών διαμεσολαβητών της απόπτωσης που μεταβάλλονται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χημειο-ανθεκτικά [10] – [13]. Τα επίπεδα της έκφρασης και την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 συχνά παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο αποπτωτικών αποκρίσεις σε φαρμακευτικές αγωγές, διαμορφώνοντας έτσι την χημειο-ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων [14] – [16]. Η υπερέκφραση του Bcl-2 και Bcl-XL γονίδια συμβάλλουν στην αποπτωτική αναστολή και την ανάπτυξη της πολυφαρμακευτικής ανθεκτικότητας των ανθρώπινων καρκίνων των ωοθηκών. Η πρωτεΐνη ρ53 είναι επίσης ένας ρυθμιστής κλειδί της χημειο-ευαισθησία στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και ταχέως ρυθμίζεται αυξητικά σε απόκριση σε παράγοντες που βλάπτουν το DNA, όπως η σισπλατίνη. Επιπλέον, ρ53 προκαλεί απόπτωση και ρυθμίζει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

, όχι μόνο από τη διαμόρφωση της μεταγραφής του ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη (π.χ., PUMA και NOXA), αλλά και μέσω ενός μηχανισμού μεταγραφής-ανεξάρτητο συνεπάγονται την άμεση μετατόπιση της πρωτεΐνης ρ53 στα μιτοχόνδρια που ακολουθείται από την ανασταλτική αλληλεπιδράσεις με BCL-2 και Bcl-XL [13], [17], [18].

BIM είναι επίσης μέλος της BH3-μόνο οικογένεια του προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών και εκφράζεται σε μια ευρεία ποικιλία ιστών [19], [20]. Όπως προσδιορίζεται με ανάλυση κηλίδος western, οι περισσότεροι ιστοί εκφράζουν μία επικρατούσα ισομορφή του BIM, που ονομάζεται ΒΙΜ-EL [21]. Μετά από εκδήλωση αποπτωτικό στρες, ΒΙΜ μετατοπίζεται στα μιτοχόνδρια και ενεργοποιεί το μιτοχονδριακό μονοπάτι κυτταρικού θανάτου από είτε άμεσα ενεργοποιώντας ΒΑΧ-όπως πρωτεΐνες ή έμμεσα δεσμευτικές προ-επιβίωσης μέλη οικογένειας Bcl-2, απελευθερώνοντας έτσι το ΒΑΧ-όπως πρωτεΐνες [22], [23]. Η πρωτεΐνη ΒΑΧ έχει καταδειχθεί ότι διαμορφώνουν την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [2], [13]. Ωστόσο, η επίδραση του BIM για σισπλατίνης ευαίσθητα και ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών δεν έχει καλά διευκρινιστεί.

Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν ότι AKT είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της ευαισθησίας σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. ΑΚΤ προάγει κυτταρική επιβίωση, καταστέλλει την απόπτωση, και ρυθμίζει την ευαισθησία σισπλατίνη σε ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων [10] – [13]. Επιπλέον, ΑΚΤ, επίσης γνωστό ως πρωτεΐνη κινάση Β ή Rac [11], είναι ένας ανενεργός κυτοσολική πρωτεΐνη. ΑΚΤ προσλαμβάνεται στην μεμβράνη πλάσματος και ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 308 και σερίνη 473 σε απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες ή κυτοκίνες [2], [10], [11], [24]. Το μόριο υπεύθυνο για την πρόσληψη ΑΚΤ στην κυτταρική μεμβράνη, καθώς και την ενεργοποίηση της, είναι η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ-3Κ) [2], [11]. Τόσο ΡΙ-3Κ και ΑΚΤ συχνά ενεργοποιούνται και /ή υπερεκφράζεται σε καρκίνους των ωοθηκών [2], [11], [13], [25]. Κατά την ενεργοποίηση, ΑΚΤ φωσφορυλιώνει πολλά μόρια που εμπλέκονται στην ρύθμιση της απόπτωσης, όπως η προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών BAD, ΒΙΜ και της κασπάσης-9 και του παράγοντα μεταγραφής FOXO3a. Στη συνέχεια, ρ-ΑΚΤ δεσμεύει τη σύνδεση του BAD ή ΒΙΜ να BCL-XL, αναστέλλει τη κασπάση-9 δραστηριότητα πρωτεάσης, η λειτουργία μπλοκ FOXO3a και μειώνει την μεταγραφή συνδέτη Fas [19], [26] – [28].

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επίσης διαμόρφωσης ρόλο της ΡΙ-3Κ σηματοδότησης /AKT στην έκφραση BIM. Ο αναστολέας ΡΙ-3Κ LY294002 αυξάνει την έκφραση BIM σε κύτταρα ταυτόχρονα με μία αύξηση σε κυτταρικό θάνατο [19]. Ωστόσο, προτείνεται ότι ένα σημαντικό κατάντη επίδραση του LY294002 είναι να μειώσει το ποσό της ΑΚΤ σε ενεργή, φωσφορυλιωμένη μορφή της [2], [19]. Η σχέση μεταξύ μειωμένη δραστηριότητα ΑΚΤ και αυξημένα επίπεδα έκφρασης BIM είναι FOXO3a, ένα μέλος της οικογένειας forkhead του μετεγγραφικών ρυθμιστών που μπορούν άμεσα να αυξήσουν τα επίπεδα έκφρασης BIM και επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα όταν υπερεκφράζεται [19], [29], [30]. Έτσι, η προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης BIM, όπως αυτή ρυθμίζεται από LY294002, συνδέεται με μια απώλεια δραστηριότητας ΑΚΤ και φωσφορυλίωση και την αύξηση της ενεργού μορφής της FOXO3a.

Αν και η οδός ΑΚΤ BIM είναι σημαντική στην χημειο -sensitivity και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, είτε ΑΚΤ ρυθμίζει δραστικότητα BIM σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της θεραπείας ΑΤΟ παραμένει ασαφής. Στην έκθεσή μας, δείξαμε ότι το επίπεδο έκφρασης του BIM αυξήθηκε και ότι η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ μειώθηκε κατά τη διάρκεια της απόπτωσης της σισπλατίνης ευαίσθητα και ανθεκτικών κυττάρων μετά κατεργασία ΕΦΕ. Επιπλέον, η ρύθμιση προς τα κάτω της ΑΚΤ με siRNA δεν θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση BIM και φωσφορυλίωση που προκαλείται από ΑΤΟ, ενώ ο knockdown του BIM εμπόδισε ΑΚΤ αποφωσφορυλίωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ΑΤΟ επαγόμενη ΑΚΤ αποφωσφορυλίωση εξαρτάται από την ενεργοποίηση της κασπάσης ΡΡ2Α-3 με τη μεσολάβηση, η οποία ρυθμίζεται από την έκφραση BIM. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ αρνητικά διαμορφώνεται από BIM και ότι το ΒΙΜ-διαμεσολαβούμενη ΑΚΤ φωσφορυλίωσης είναι ένα σημαντικό μοριακό γεγονός στη μεσολάβηση ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση σε χημειο-ευαίσθητο και ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

ΑΤΟ επάγει απόπτωση σε σισπλατίνη ευαίσθητα και ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Προσδιορίσαμε πρώτα την ανάπτυξη ανασταλτική δράση της σισπλατίνης σε διάφορες σισπλατίνη ευαίσθητα (COC1 και Α2780) και ανθεκτικών (COC1 /CP, Α2780 /CP και OVCAR-3) ανθρώπινες κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 72 ώρες της θεραπείας. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1Α, η σισπλατίνη προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε COC1 και Α2780 κύτταρα, ενώ COC1 /CP, Α2780 /CP και κυττάρων OVCAR-3 αποδεδειγμένα επέδειξε αντοχή στη σισπλατίνη. Για να εξεταστεί η σισπλατίνη απόπτωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ σισπλατίνη. Στη συνέχεια, η απόπτωση επιβεβαιώθηκε με κατάτμηση DNA δοκιμασία ELISA σε διάφορα χρονικά σημεία. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι αποτελεσματικά επάγεται σισπλατίνη απόπτωση σε κύτταρα ωοθηκών σισπλατίνη ευαίσθητα, αλλά όχι σε σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα (Εικόνα 1Β). Για να διερευνηθούν οι επιδράσεις του ΑΤΟ στην απόπτωση σε όλα τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, υποβάλλαμε σε αγωγή ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με ΑΤΟ και ανέλυσε τη διαδικασία της απόπτωσης των κυττάρων με μια δοκιμασία ELISA κατάτμησης DNA. Τα δεδομένα μας πρότεινε ότι ΑΤΟ επάγεται κυτταρικής απόπτωσης σε όλα τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, ανεξάρτητα από τις διαφορές τους στην χημειο-ευαισθησία (Σχήμα 1 C). ανάλυση κυτταρομετρία ροής με χρώση αννεξίνης V αποκάλυψε περαιτέρω ότι δεν υπήρχε διαφορά στην ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση μεταξύ cisplatin ευαίσθητα και ανθεκτικών κυττάρων (Σχήμα 1 D).

A. Δοσοεξαρτώμενες επιδράσεις της σισπλατίνης σε κυτταρικές γραμμές ωοθηκών. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε σισπλατίνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σε DMEM ή RPMI-1640 με 10% FBS σε πλάκα 96 φρεατίων για 72 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Γραφικές παραστάσεις που δείχνουν τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ΜΤΤ. Όλα τα δεδομένα απεικονίζονται γραφικά ως τα μέσα ± τυπική απόκλιση σφάλματα των μέσων για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. B. Ανάλυση της κυτταρικής απόπτωσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη (5 μΜ) για διάφορες χρονικές περιόδους. Κυτταρικής απόπτωσης ποσοτικά ανιχνεύεται από έναν κυτταρικό θάνατο κιτ ELISA. Γραφικές παραστάσεις που δείχνουν τα αποτελέσματα των ποσοτικών αναλύσεων. Όλα τα δεδομένα απεικονίζονται γραφικά ως τα μέσα ± τυπική απόκλιση σφάλματα των μέσων για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *,

P

& lt? 0,05, **,

P

& lt? 0,01. Γ Επίδραση της ΑΤΟ σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε σισπλατίνη ευαίσθητα και ανθεκτικών κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία του ΑΤΟ (2 μΜ) για διάφορες χρονικές περιόδους, τότε κυτταρικής απόπτωσης μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα απεικονίζονται γραφικά ως τα μέσα ± τυπική απόκλιση σφάλματα των μέσων για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *,

P

& lt? 0,05, **,

P

& lt? 0,01. D. Ανίχνευση της κυτταρικής απόπτωσης με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. COC1 και COC1 /κύτταρα CP υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΑΤΟ (2 μΜ) για 48 ώρες, στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Annexin V και εξετάστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ε και ΣΤ Αναλύσεις cyt

γ

απελευθέρωση. Μετά τη θεραπεία με ΑΤΟ για διαφορετικές χρονικές περιόδους, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε υποκυτταρική κλασματοποίηση. Το κυτοσολικό ή μιτοχονδριακό κλάσματα ανοσοστυπώθηκαν (30 μg πρωτεΐνης /λωρίδα) με αντίσωμα ειδικό για cyt

γ

. β-ακτίνης και Cox IV χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. Η πυκνομετρική ανάλυση των κηλίδων Western διεξήχθη και η ποσότητα του cyt

γ

συγκρίθηκε με τον έλεγχο φόρτωσης πρωτεΐνης. Για κυτταρο cyt

γ

, σε σχέση με το ποσό των cyt

γ

από επεξεργασμένα κύτταρα (72 ώρες) ορίστηκε ως 1, ενώ η σχετική ποσότητα από μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 h) καθορίστηκε σε 1 για Μίτο cyt

γ

. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να καθοριστεί εάν τα μιτοχόνδρια παίζουν σημαντικό ρόλο στην ATO-επαγόμενη κυτταρική απόπτωση, την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

ανιχνεύτηκε με κυτταρική κλασματοποίηση ανάλυση. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι ΑΤΟ προκάλεσε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε χημειο-ευαίσθητο και ανθεκτικών κυττάρων (Σχήμα 1Ε, F), γεγονός που υποδηλώνει ότι ΑΤΟ εκκινεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μέσω μιτοχονδριακή δυσλειτουργία.

BIM είναι σημαντική για την ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση σε χημειο-ευαίσθητο και ανθεκτικών ωοθηκών κύτταρα

Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην απόπτωση σε κύτταρα των ωοθηκών. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι αλλαγές στο γονίδιο έκφραση του BCL-2-οικογένεια πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ΑΤΟ-επαγόμενη απόπτωση [32] και ότι οι ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες ήταν απαραίτητες για ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα μυελώματος. Ωστόσο, δεν είναι σαφές αν οι πρωτεΐνες ΒΗ3 θα μπορούσε να λειτουργήσει σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών εξής ΑΤΟ θεραπεία. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την έκφραση του BCL-2-οικογένεια πρωτεϊνών σε σισπλατίνη ευαίσθητα και ανθεκτικών κυττάρων μετά κατεργασία ΕΦΕ. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 2Α, προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως ΒΑΧ, PUMA και NOXA, δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά σε κύτταρα COC1 σε διάφορα χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία ΕΦΕ. πρωτεΐνες αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και Bcl-XL παρουσίασε επίσης κανένα σημαντικές μετατροπές. Ωστόσο, σε αντίθεση με άλλες πρωτεΐνες, το επίπεδο έκφρασης του BIM ήταν σημαντικά αυξημένη μετά τη θεραπεία ΑΤΟ, παρέχοντας απόδειξη ότι BIM είχε εμπλακεί σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Εν τω μεταξύ, ΑΤΟ επαγόμενη έκφραση BIM εξίσου σε COC1 /κύτταρα CP (Σχήμα 2Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε άλλες κυτταρικές γραμμές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι BIM παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Α και κηλίδες ανάλυση Β Western του επιπέδου έκφρασης του BCL-2 οικογένειας πρωτεϊνών. Εξαρτώμενη από το χρόνο ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του μέλους BCL-2 στην COC1 /CP και COC1 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΑΤΟ (2 μΜ) σε προκαθορισμένο χρόνο, τότε λύθηκαν σε ρυθμιστικό ΝΡ40 για ανίχνευση. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. Μεμονωμένα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση των στυπωμάτων Western και συγκρίθηκαν με τα επίπεδα της ακτίνης. Σχετική ποσό της μεμονωμένης πρωτεΐνης από επεξεργασμένα κύτταρα (72 ώρες) ορίστηκε ως 1. C. Επίδραση της BIM shRNA στην κυτταρική απόπτωση. Υπό τις ίδιες συνθήκες με το Α, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΒΙΜ ή Ctrl shRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς ΑΤΟ για 48 ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και προσδιορίστηκαν για ΒΙΜ, κασπάσης-9 και διασπασμένη κασπάση 3 με κηλίδα western. CF αναφέρεται διασπασμένη κασπάση-9. Σχετική φορές σημαίνει ποσότητα BIM σε σύγκριση με ακτίνη και Ctrl κατάσταση θεωρήθηκε ως 1. D. Ανίχνευση την επίδραση του BIM shRNA στο θάνατο των κυττάρων με πυρηνική χρώση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΒΙΜ ή Ctrl shRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΑΤΟ για 48 ώρες. Ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με μέτρηση κυττάρων με συνοπτικές και αποσπασματικές πυρηνικών από μικροσκόπιο. Τα βέλη δείχνουν τις συνοπτικές, κατακερματισμένη, λαμπρά χρωματισμένο πυρήνες, που είναι το σήμα κατατεθέν της απόπτωσης. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα της BIM στην απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, πραγματοποιήσαμε πειράματα γονιδίου-αποσιώπηση χρησιμοποιώντας ένα shRNA ειδικά για BIM που στοχεύουν όλες τις γνωστές ισομορφές της αντίγραφο. Παρόμοια με το αποτέλεσμα που απεικονίζεται στο σχήμα 2Α, το επίπεδο έκφρασης του BIM ήταν υψηλή στο φορέα-επιμολυσμένα ελέγχου COC1 και κύτταρα /CP COC1 μετά τη θεραπεία ΑΤΟ, ενώ BIM επίπεδα έκφρασης σε κύτταρα επιμολυσμένα με ένα ΒΙΜ shRNA ήταν σχετικά χαμηλές (Σχήμα 2C) . Επιπλέον, η προς τα κάτω ρύθμιση των ΒΙΜ ανέστειλε κασπάσης-9 και κασπάσης-3 διάσπαση που προκαλείται από την ATO. Ομοίως, ΑΤΟ που προκαλείται πυρηνική κατάτμηση και η συμπύκνωση στον έλεγχο των φορέων-επιμολυσμένα Α2780 και τα κύτταρα OVCAR-3, αλλά όχι σε ΒΙΜ shRNA-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2D). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν περαιτέρω αποδείξεις ότι η έκφραση BIM είναι απαραίτητη για ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

σηματοδότηση ΑΚΤ εμπλέκεται σε κυτταρικό θάνατο

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ΑΚΤ ρυθμίζει ενεργοποίηση BIM είτε άμεσα ή έμμεσα [19], [33]. Επιπλέον, ΑΤΟ επάγει απόπτωση σε κύτταρα μυελώματος με τη μείωση δραστηριότητα ΑΚΤ και έκφραση σε κύτταρα [34]. Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις, θα εικάζουν ότι η ΑΚΤ πιθανώς εμπλέκονται στην ΑΤΟ-επαγόμενη απόπτωση ρυθμίζοντας BIM έκφρασης. Συνεπώς, μετρήσαμε πρώτα εάν ΑΚΤ εμπλέκεται στην ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, ΑΤΟ επήγαγε την προς τα κάτω ρύθμιση του ρ-ΑΚΤ στο Ser473 σε σισπλατίνη ευαίσθητα COC1 κύτταρα σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο, αν και το επίπεδο έκφρασης της συνολικής πρωτεΐνης ΑΚΤ δεν παρουσίασαν μεταβολή. Προς τα κάτω ρύθμιση του π-ΑΚΤ επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-9 σε ευαίσθητα κύτταρα COC1. Ομοίως, ΑΤΟ επαγόμενη τη μείωση του ρ-ΑΚΤ και την διάσπαση της κασπάσης-9 και σε άλλα καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, παρά τις διαφορές τους στην χημειο-ευαισθησία.

A. Ανίχνευση φωσφορυλίωσης ΑΚΤ, της έκφρασης και την ενεργοποίηση της κασπάσης-9. Η ανάλυση στυπώματος Western των συνολικών ΑΚΤ, ρ-ΑΚΤ (

473 Ser) επίπεδα και διάσπαση της κασπάσης-9 σε κύτταρα COC1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΑΤΟ (2 μΜ) σε διαφορετικές χρονικές και λύθηκαν σε ρυθμιστικό ΝΡ40 για ανίχνευση. CF αναφέρεται διασπασμένη κασπάση-9. Η ίδια ανίχνευση χρησιμοποιήθηκε σε COC1 /CP, Α2780 και OVCAR-3. Αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 72 ώρες, στη συνέχεια λύθηκαν και αναλύθηκαν για τα μεμονωμένα επίπεδα πρωτεΐνης με στύπωμα Western. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. επίπεδα ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ μετρήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση των στυπωμάτων Western και συγκρίθηκαν με τα επίπεδα της ακτίνης. Σχετική ποσότητα ρ-ΑΚΤ ή ΑΚΤ από μη επεξεργασμένα κύτταρα θεωρήθηκε ως 1. Τα επίπεδα Β Πρωτεΐνης του μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ-3Κ σε ΑΤΟ-επεξεργασμένα κύτταρα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν στο φάρμακο για διάφορες χρονικές περιόδους. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και προσδιορίστηκαν για τα μεμονωμένα επίπεδα πρωτεΐνης με στύπωμα Western. Μεμονωμένα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση των στυπωμάτων Western και συγκρίθηκαν με τα επίπεδα της ακτίνης. Σχετική ποσό της μεμονωμένης πρωτεΐνης από μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 h) ορίστηκε ως 1. Γ Επιδράσεις της ΕΦΕ σχετικά με τα επίπεδα της πρωτεΐνης του mTOR2, συμπεριλαμβανομένων π-mTOR (Ser

2448and

2481), mTOR, RICTOR, SIN1, σε Α2780 κύτταρα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν στο φάρμακο, όπως περιγράφεται στο Β, και στη συνέχεια κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Σχετική ποσότητα των επιπέδων της πρωτεΐνης καθορίστηκαν όπως περιγράφεται στο Β κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδα western. Σχετική ποσότητα των επιπέδων της πρωτεΐνης καθορίστηκαν όπως περιγράφεται στο Β D. Προστατευτική επίδραση της συστατικής ΑΚΤ επί ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα των ωοθηκών. OVCAR-3 και Α2780 κύτταρα επιμολύνθηκαν με συστατική ΑΚΤ1 και επιλέχθηκαν για 8 εβδομάδες από την G-418 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΤΟ για 72 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για τα μεμονωμένα επίπεδα πρωτεΐνης με στύπωμα Western. OVCAR-3 και Α2780 κύτταρα

Αριστερά,

επίπεδα πρωτεΐνης p-ΑΚΤ (Ser

473) και AKT (ΑΚΤ1) και στα δύο Ctrl ή ΑΚΤ φορέα επιμολυσμένα εντοπίστηκαν. Σχετική ποσό των επιπέδων της πρωτεΐνης είχαν καθοριστεί όπως περιγράφεται στα επίπεδα Β ρ-ΑΚΤ και AKT των ΑΚΤ1 επιμολυσμένα κύτταρα Α2780 θεωρήθηκαν ως 1.

δεξιά,

ανάλυση της απόπτωσης στο πλήκτρο Ctrl ή φορέα ΑΚΤ1 επιμολυσμένα OVCAR-3 και Α2780 κύτταρα. Κυτταρικής απόπτωσης ποσοτικά ανιχνεύεται από έναν κυτταρικό θάνατο κιτ ELISA όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα απεικονίζονται γραφικά ως τα μέσα ± τυπική απόκλιση σφάλματα των μέσων για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01. Ε Ανίχνευση του ρόλου της LY294002 στην απόπτωση των κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΑΤΟ και /ή 25 μΜ LY294002 για 72 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για τα μεμονωμένα επίπεδα πρωτεΐνης με στύπωμα Western.

Αριστερά,

επίπεδα πρωτεΐνης p-ΑΚΤ (Ser

473) και η συνολική ΑΚΤ στα κύτταρα COC1 ανιχνεύθηκαν. Κυτταρικής απόπτωσης ποσοτικά ανιχνεύεται από έναν κυτταρικό θάνατο κιτ ELISA. Σχετική ποσότητα των επιπέδων της πρωτεΐνης καθορίστηκαν όπως περιγράφεται στο Β ρ-ΑΚΤ και τα επίπεδα ΑΚΤ από μη επεξεργασμένα κύτταρα τέθηκαν ως 1.

Δεξιά,

ανάλυση των αποπτωτικών κυττάρων όπως περιγράφηκε στο Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα απεικονίζονται γραφικά ως τα μέσα ± τυπική απόκλιση σφάλματα των μέσων για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt?. 0.01

Η

Στη συνέχεια, αναλύονται τα επίπεδα έκφρασης των ανάντη πρωτεϊνών PI-3K σηματοδότησης, οι οποίες θα μπορούσαν να επηρεάσουν π-ΑΚΤ επίπεδα στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3Β, τα επίπεδα των πρωτεϊνών οδού ΡΙ-3Κ, συμπεριλαμβανομένης ρ85 (το ρυθμιστική υπομονάδα του ΡΙ-3Κ), ΡΤΕΝ και ΡϋΚ1 είχαν δεν μεταβάλλονται σημαντικά μετά από θεραπεία ΑΤΟ για διάφορες χρονικές περιόδους σε κύτταρα COC1 /CP. Πρόσφατες μελέτες πρότειναν ότι ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά 2 (mTORC2) ή την πρωτεΐνη Rictor ήταν υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του ρ-ΑΚΤ σε Ser473 [35], [36], και η εξάντληση των υπομονάδων των ανέπαφων mTORC2, όπως SIN1, κατάργησε φωσφορυλίωση ΑΚΤ σε Ser473. Επιπλέον, Ser2448 για mTOR ήταν μια θέση φωσφορυλίωσης ΑΚΤ, και φωσφο-Ser2481 ήταν ένας δείκτης των συγκροτημάτων mTORC2 [35], [37]. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης mTOR συμπλόκου 2, συμπεριλαμβανομένων των φωσφο-mTOR (σε Ser 2481 και 2448), mTOR, RICTOR και SIN1 δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά σε Α2780 κύτταρα μετά από έκθεση σε ΑΤΟ σε διάφορες χρονικές περιόδους (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αυτές οι πρωτεΐνες δεν έχουν καμία επίδραση στην ρ-ΑΚΤ επίπεδο.

Για την επικύρωση εάν σηματοδότησης ΑΚΤ αποτελεί μείζονα μοριακός στόχος υπεύθυνος για την ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση, επιμολύναμε ένα ιδιοσυστατικά ενεργό γονίδιο ΑΚΤ1 σε OVCAR-3 και τα κύτταρα Α2780 και εξέτασε την ανταπόκρισή τους στη θεραπεία ATO. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 3D, OVCAR-3 και τα κύτταρα Α2780 επιμολυσμένα με ΑΚΤ1 παρουσίασαν προφανή αντίσταση στην ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση.

Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε LY294002, ένας αναστολέας ΡΙ-3Κ, να αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση των ΑΚΤ με ανάντη μόρια σηματοδότησης και εξέτασαν την προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα ΑΤΟ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι ΑΤΟ μόνος εξαλειφθεί ρ-ΑΚΤ και απόπτωση που επάγεται ενώ LY294002 από μόνη της δεν ήταν αρκετή για να επάγει απόπτωση, αν και μερικώς μειωμένα ρ-ΑΚΤ. Περαιτέρω πειράματα απέδειξαν ότι ο συνδυασμός της LY294002 και ΑΤΟ εξαλειφθεί εντελώς ρ-ΑΚΤ και την ενισχυμένη επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα COC1 (Σχήμα 3Ε). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η επίδραση του συνδυασμού της LY294002 και ΑΤΟ επί π-ΑΚΤ και την απόπτωση είναι περισσότερο σημαντική από εκείνη της LY294002 και μόνο, και ότι η οδός σηματοδότησης ΑΚΤ εμπλέκεται σε ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

ΒΙΜ-ρυθμίζονται ΑΚΤ φωσφορυλίωση σε απόπτωση των κυττάρων

ΑΚΤ διαμεσολαβεί ενεργοποίηση BIM μέσω δύο κύριες οδοί: (1) ΑΚΤ φωσφορυλιώνει BIM άμεσα και αναστέλλει την ενεργοποίηση BIM [19], [33], ή (2) ΑΚΤ φωσφορυλιώνει FOXO3a , που οδηγεί σε κυτταροπλασματική κατακράτηση του από πρωτεΐνες 14-3-3. Με αυτόν τον τρόπο, δεν θα μπορούσε να ΑΚΤ μετατοπίζονται μέσα στον πυρήνα για να επάγει μεταγραφή ΒΙΜ, που σημαίνει ότι η ΑΚΤ ρυθμίζει την ενεργοποίηση BIM έμμεσα. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, αποφασίσαμε να εξετάσουμε αν ΑΚΤ επηρεάζει ενεργοποίηση BIM σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Εμείς μειωτικά πρώτα την έκφραση ΑΚΤ1 με siRNA σε ΑΤΟ επεξεργασμένου Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα και διαπίστωσε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της ΑΚΤ αυξημένη κασπάσης-3 και PARP διάσπαση κατά την διάρκεια της θεραπείας ΕΦΕ. Ωστόσο, ΑΚΤ μειορρύθμιση είχε μικρή επίδραση στην έκφραση BIM, αν και ΑΚΤ μειορρύθμιση αυξημένη, σε κάποιο βαθμό, ΑΤΟ που προκαλείται πυρηνική κατάτμηση και ακολούθησε κυτταρικής απόπτωσης (Εικόνα 4Α). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και στην ATO-θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα όταν η έκφραση FOXO3a ήταν μειωτικά χρησιμοποιώντας siRNAs που στοχεύουν FOXO3a (Εικόνα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η οδός ΑΚΤ δεν μπορεί να εμπλέκεται στην ρύθμιση της έκφρασης ΒΙΜ κατά την διάρκεια της ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση.

A. Επίδραση της ΑΚΤ siRNA για την έκφραση BIM. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με έλεγχο siRNA ή ΑΚΤ1 siRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε ΑΤΟ για 72 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για τα μεμονωμένα επίπεδα πρωτεΐνης με στύπωμα Western. CF αναφέρεται διασπασμένη PARP. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης.

Up,

επίπεδα πρωτεΐνης του ΑΚΤ, BIM, διασπασμένη κασπάση 3, και PARP ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western. Σχετική ποσό της μεμονωμένης επίπεδο πρωτεΐνης καθορίστηκε όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3Β. p-ΑΚΤ και AKT επίπεδα Ctrl siRNA επιμολυσμένα και τα επεξεργασμένα κύτταρα Α2780 θεωρήθηκαν ως 1.

Down,

ανάλυση των αποπτωτικών κυττάρων. όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα απεικονίζονται γραφικά ως τα μέσα ± τυπική απόκλιση σφάλματα των μέσων για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

P

& gt? 0,05 (μη σημαντική). B. Επίδραση της FOXO3a siRNA για την έκφραση BIM και την κυτταρική απόπτωση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με έλεγχο siRNA ή FOXO3a siRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε ΑΤΟ για 72 ώρες.

Up,

Μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες, Ανοσοστύπωμα για BIM και πρωτεΐνη FOXO3a έκφραση πραγματοποιήθηκε σε λύματα ολόκληρων κυττάρων. Σχετική ποσό της μεμονωμένης επίπεδο πρωτεΐνης καθορίστηκε όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3Β. επίπεδα FOXO3a και ΒΙΜ του Ctrl siRNA επιμολυσμένα κύτταρα COC1 θεωρήθηκαν ως 1.

Down,

επίπεδα πρωτεΐνης του BIM, κυτοσολίου cyt

γ

και PARP αναλύθηκαν με κηλίδα Western σε FOXO3a siRNA OVCAR-3 κύτταρα. Για cyt

γ

ανίχνευση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία μετά από το σχήμα 1Ε. Όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3Β, η σχετική ποσότητα του BIM και cyt

γ

σε κύτταρα κατεργασμένα ΑΤΟ (72 ώρες) θεωρήθηκαν ως 1. C. Επίδραση της ΑΚΤ φωσφορυλίωσης επί BIM. Τα κύτταρα σημάνθηκαν μεταβολικά με [

32Ρ] ορθοφωσφορικό οξύ και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΤΟ (2 μΜ) για 48 ώρες, και ΒΙΜ ανοσοκατακρημνίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αγαρόζης-συζευγμένο αντίσωμα BIM, τότε η ανίχνευση της φωσφορυλίωσης του BIM. Η φωσφορυλίωση του BIM προσδιορίστηκε με αυτοραδιογραφία (άνω πάνελ). Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε για να επιβεβαιωθεί και να ποσοτικοποιηθούν πρωτεΐνη ΒΙΜ (κάτω πίνακας).

Αριστερά,

την επίδραση της LY294002 στην φωσφορυλίωση BIM. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΑΤΟ και /ή LY294002 (25 μΜ), τότε η ανίχνευση της έκφρασης BIM και φωσφορυλίωση. Όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3Β, η σχετική ποσότητα του

32Ρ-BIM και ΒΙΜ σε κύτταρα κατεργασμένα ΑΤΟ θεωρήθηκαν ως 1.

Δεξιά,

την επίδραση της ΑΚΤ siRNA επί της φωσφορυλίωσης BIM. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με έλεγχο siRNA ή ΑΚΤ1 siRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε ΑΤΟ για 48 ώρες. Ανίχνευση έκφρασης BIM και φωσφορυλίωση όπως περιγράφηκε. Σχετική ποσότητα

32Ρ-BIM και BIM στην ΑΚΤ επιμολυσμένα και τα κύτταρα αντιμετωπίζονται ATO ορίστηκαν ως 1. D. Επίδραση της BIM shRNA για φωσφορυλίωση ΑΚΤ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με έλεγχο shRNA ή BIM shRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε ΑΤΟ για 48 ώρες. κηλίδα Western έκφρασης εξετάστηκαν ΒΙΜ, κασπάσης-3 διάσπαση, τα επίπεδα πρωτεΐνης του ρ-ΑΚΤ (Ser

473) και ΑΚΤ σε κύτταρα. Σχετική ποσότητα ρ-ΑΚΤ, ΑΚΤ και BIM στο Ctrl shRNA επιμολυσμένα και τα κύτταρα αντιμετωπίζονται ATO ορίστηκαν ως 1. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για την ανίχνευση φωσφορυλίωσης BIM κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, Α2780 και COC1 κύτταρα /CP σημάνθηκαν μεταβολικά με [

32Ρ] ορθοφωσφορικό οξύ και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΤΟ για 48 ώρες, και η φωσφορυλίωση του BIM αναλύθηκε με αυτοραδιογραφία. Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι η επαγωγή BIM και φωσφορυλίωση αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της απόπτωσης [38]. Οι μελέτες μας επίσης έχουν εξετάσει φωσφορυλίωση BIM και αυξημένη έκφραση BIM μετά τη θεραπεία ATO. Τα στοιχεία μας αποκάλυψε, επίσης, ότι η ΑΚΤ ρύθμιση προς τα κάτω από siRNA ή έναν αναστολέα ΑΚΤ (LY294002) δεν θα μπορούσε να μειώσει φωσφορυλίωση BIM στην χημειο-ευαίσθητη και ανθεκτικών κυττάρων μετά τη θεραπεία ATO (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΑΚΤ απενεργοποίηση είχε μικρή ή καθόλου επίδραση στην φωσφορυλίωση BIM και πρότεινε ότι ΑΚΤ δεν θα μπορούσε να ρυθμίζουν την ενεργοποίηση BIM και ότι άλλες πιθανούς μηχανισμούς όσον αφορά τη ρύθμιση της ενεργοποίησης BIM μπορεί να υπάρχουν.

Ωστόσο, περαιτέρω στοιχεία μας έδειξαν ότι knockdown του BIM ανέστειλε ΑΚΤ αποφωσφορυλίωση και διάσπαση της κασπάσης-3 σε κύτταρα καρκίνου ωοθηκών χημειο-ευαίσθητα και ανθεκτικά (Σχήμα 4D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ATO που προκαλείται από την έκφραση BIM εμποδίζει την φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, υποδεικνύοντας ότι BIM ρυθμίζει την ενεργοποίηση ΑΚΤ κατά τη διάρκεια της ATO διέγερση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

BIM ρυθμίζει ΑΚΤ αποφωσφορυλίωση από κασπάσης-3 δραστηριότητα

Προηγούμενες αναφορές έδειξαν ότι η ΑΚΤ αποφωσφορυλιώθηκε στα δύο Thr308 και Ser473 και αδρανοποιημένο in vitro από την πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α (ΡΡ2Α), που σχημάτισε σύμπλοκο με ΑΚΤ. ΑΚΤ ενεργοποιήθηκε σε κύτταρα κατά την κατεργασία με τους αναστολείς ΡΡ2Α, όπως οκαδαϊκό οξύ (ΟΑ) [39], [40]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι κασπάσης-3 ρυθμίζεται η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ μέσω της διάσπασης της ρυθμιστικής υπομονάδας Α της ΡΡ2Α (ΡΡ2Α /Α), η οποία αυξήθηκε δραστηριότητα ΡΡ2Α [39]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι BIM εμπλέκεται στη ρύθμιση της κασπάσης-3 και ΑΚΤ ενεργοποίησης (Εικόνα 4D). Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι BIM μπορεί να ρυθμίζει την φωσφορυλίωση της ΑΚΤ από κασπάσης-3-μεσολαβητική ενεργοποίηση ΡΡ2Α στα κύτταρα των ωοθηκών.

Για να επικυρώσετε την υπόθεσή μας, πρέπει πρώτα καθοριστεί αν ΡΡ2Α μεσολάβηση φωσφορυλίωση της ΑΚΤ στη μελέτη μας. Προκατεργασία των κυττάρων με ΟΑ, έναν αναστολέα της ΡΡ2Α, οδήγησε σε μια σταδιακή αναστροφή του ΑΤΟ που προκαλείται αποφωσφορυλίωση ΑΚΤ σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε COC1 /κύτταρα CP (Σχήμα 5Α). Την ίδια στιγμή, η ΟΑ διασώθηκε επίσης φωσφορυλίωση ΑΚΤ στο Α2780 και τα κύτταρα OVCAR-3 κατά τη διάρκεια της θεραπείας ATO.

Α. Διαφορετικά κύτταρα προ-επωάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του ΟΑ για 1 ώρα και εκτέθηκε σε ΑΤΟ για 48 ώρες, στη συνέχεια υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό ΝΡ40 για ανίχνευση. Η ανάλυση στυπώματος Western των συνολικών ΑΚΤ και ρ-ΑΚΤ (Ser

473) επίπεδα δείχθηκε. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. Σχετική ποσότητα ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ σε ακατέργαστα κύτταρα τέθηκαν ως 1. Β Ανάλυση της επίδρασης της κασπάσης-3 στην ενεργοποίηση ΡΡ2Α.

Up

, τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις DEVD-CHO για 1 ώρα και εκτέθηκε σε ΑΤΟ για 48 ώρες, στη συνέχεια υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό ΝΡ40 για ανίχνευση. Η ανάλυση στυπώματος Western των συνολικών ΑΚΤ και ρ-ΑΚΤ (Ser

473) επίπεδα δείχθηκε. Σχετική ποσότητα ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ σε ακατέργαστα κύτταρα τέθηκαν ως 1.

Μέση

, τα επεξεργασμένα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και υποβάλλεται σε προσδιορισμό ανοσοστυπώματος με ένα Α υπομονάδα-ειδικά αντι-ΡΡ2Α /αντίσωμα. CF αναφέρεται διασπάται ΡΡ2Α /Α. Η μεμβράνη στη συνέχεια απογυμνώνεται και ξαναϊχνηθετούνται με C υπομονάδα-ειδικό αντίσωμα αντι-ΡΡ2Α /C. Σχετική ποσότητα ΡΡ2Α /C σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 h) καθορίστηκαν ως 1.

Down

, ανάλυση στυπώματος Western της επίδρασης DEVD-CHO (100 μΜ) σε διάσπαση ΡΡ2Α. C. Ανίχνευση της δραστηριότητας ΡΡ2Α. Τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με ή χωρίς 0,2 μΜ ΟΑ ή 100 μΜ DEVD-CHO για 1 ώρα και εκτέθηκε σε φάρμακο για 48 ώρες. δραστηριότητα ΡΡ2Α με τις κυτταρικές πρωτεΐνες που προέρχονται από το ρυθμιστικό RIPA-λυμένα κύτταρα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας φωσφοπεπτιδίου KIpTIRR ως υπόστρωμα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.