Αφηρημένο

Stathmin1 (STMN1) είναι υποψήφια ογκοπρωτεΐνη και δείκτη πρόγνωσης σε διάφορα είδη καρκίνων. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να αναλύσουν έκφραση και βιολογικές λειτουργίες του σε καρκίνο του στομάχου. Η έκφραση του STMN1 αξιολογήθηκε με qRT-PCR, στύπωμα Western και ανοσοϊστοχημεία. Η βιολογική λειτουργία του STMN1 προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ πολλαπλασιασμού, σχηματισμό αποικίας μονοστιβάδας και προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής χρησιμοποιώντας μικρές τεχνική παρεμβολή RNA σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Έχουμε διερευνηθούν επίσης τη ρύθμιση της έκφρασης STMN1 από microRNA-223. STMN1 ρυθμίζεται αυξητικά σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και πρωτογενών γαστρική αδενοκαρκινώματα. STMN1-θετικούς όγκους ήταν πιο πιθανό να βρεθεί στην ηλικιακή ομάδα και σχετίζεται με p53 πυρηνική έκφραση. Σε διάχυτη τύπου γαστρική αδενοκαρκινώματα, έκφραση STMN1 συσχετίστηκε με την ηλικία (

σ

= 0,043), το στάδιο Τ (

σ

= 0,004) και λεμφαδένα μετάσταση (

p =

0.046). Έκφραση των STMN1 στο αδενοκαρκίνωμα στομάχου διάχυτη τύπου συσχετίστηκε με κακή συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωσης από μονοπαραγοντική ανάλυση (

σ

= 0,01). STMN1 νοκ ντάουν σε κυτταρικές σειρές AGS και ΜΚΝ7 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό (

σ

& lt? 0.001), μείωσε το σχηματισμό αποικιών μονοστρωματική (

σ

& lt? 0.001), ανέστειλε την εισβολή των κυττάρων και την ικανότητα μετανάστευσης (

σ

& lt? 0.001) και προκαλείται από τη σύλληψη φάση G1. siSTMN1 θα μπορούσε επίσης να καταστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων

in vivo

(

σ

& lt?. 0 01). Τελικά επιβεβαιώθηκε ότι STMN1 είναι μια υποθετική προς τα κάτω στόχος του miR-223 σε καρκίνο του στομάχου. Τα ευρήματά μας υποστήριξε την ογκογόνο ρόλο της STMN1 σε γαστρικό καρκίνο. STMN1 θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Kang W, Tong JHM, Chan AWH, Πνευμόνων ΠΔΜ, Chau SL, Wong QWL, et al. (2012) Stathmin1 Παίζει Ογκογόνες Ρόλος και είναι ένας στόχος του microRNA-223 σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10.1371 /journal.pone.0033919

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Οκτώβρη 2011? Αποδεκτές: 19 Φεβ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 Μαρτίου 2012

Copyright: © 2012 Kang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίζεται από UGC Συνεργαζόμενες Ταμείου Έρευνας (CUHK04 /CRF /08) και στην ιστοσελίδα της χρηματοδότη είναι https://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικό καρκίνο είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες και η δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Έχει την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης στην Κίνα, την Ιαπωνία, την Κορέα και την Ανατολική Ασία. Η συνολική πρόγνωση είναι φτωχή με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών κάτω από 30% στις περισσότερες χώρες [1]. Διάφοροι πιθανοί παράγοντες κινδύνου περιλαμβάνουν δίαιτα υψηλή σε αλάτι, το κάπνισμα, η χαμηλή πρόσληψη φρούτων και λαχανικών, η χρόνια γαστρίτιδα με glandularatrophy και εντερική μεταπλασία, και

ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (H. pylori)

λοίμωξη. Η κλινική έκβαση της

H. pylori

λοίμωξη έχει δειχθεί να επηρεάζεται από διάφορους γενετικούς παράγοντες, κυρίως

H. πυλωρού

-virulence σχετίζεται γονίδια, όπως

CAG

Α,

VAC

Α,

πάγο

Α και

Bab

A [2].

Η. pylori

λοίμωξη είναι επίσης γνωστό ότι επάγουν την έκφραση των προ-φλεγμονωδών ένζυμο κυκλοοξυγενάση (COX-2) η οποία δείχνει υπερέκφραση σε καρκίνο του στομάχου [3]. Προηγούμενες μελέτες έχουν τεκμηριώσει τη σημασία των γενετικών και επιγενετικών αλλοιώσεις των ογκογονιδίων, ογκοκατασταλτικών γονιδίων και των γονιδίων επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων για την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Πρωτοκαδερίνη 10 [4], ο θάνατος που σχετίζεται με κινάση πρωτεΐνης [5], που εκκρίνεται κατσαρωμένα πρωτεΐνη που σχετίζεται με [6] και ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γάμμα [7] έχουν δείξει να έχουν μειωμένη έκφραση και η λειτουργία καταστολέα όγκου σε γαστρική καρκινογένεση. Από την άλλη πλευρά, το ρετινοϊκό πυρηνική πρωτεΐνη μήτρας που σχετίζονται με οξύ-ρυθμίζονται [8] και ναι σχετιζόμενη πρωτεΐνη 1 [9] ήταν τόσο απορυθμίζεται και ασκούν ογκογόνο λειτουργία στην ανάπτυξη του όγκου.

Stathmin1 (STMN1), γνωστή επίσης και ως ογκοπρωτεΐνη 18, είναι μια σημαντική κυτοσολική πρωτεΐνη μικροσωληνίσκων-αποσταθεροποιούν οποία παίζει κρίσιμο ρόλο στη διαδικασία της μίτωσης μέσω της ρύθμισης της δυναμικής των μικροσωληνίσκων, και μία ποικιλία άλλων βιολογικών διαδικασιών [10]. Υψηλό επίπεδο έκφρασης STMN1 σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού [11], [12], του καρκίνου του προστάτη [13], κακόηθες μεσοθηλίωμα [14], ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας [15], και οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [16] . Το 2010, Jeon et al. αναφέρθηκε για πρώτη φορά ότι STMN1 υπερ-έκφραση συσχετίστηκε θετικά με μετάσταση στους λεμφαδένες και προηγμένες στάσης και αγγειακή εισβολή, και αρνητικά με ελεύθερη υποτροπής επιβίωση σε διάχυτη τύπου γαστρικού καρκινώματος [17]. Η ίδια ομάδα κατέδειξε την ογκογόνο ρόλο της STMN1 σε καρκίνο του στομάχου από το

in vitro

αναστολή του πολλαπλασιασμού, τη μετανάστευση και την εισβολή στο γαστρικό κυτταρικές σειρές με να χτυπήσει STMN1 κάτω χρησιμοποιώντας siRNA, και

in vivo

αναστολή της ανάπτυξης όγκου ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια με siRNA διαμόλυνση.

κανονισμός έκφρασης STMN1 με miR-223 έχει αποδειχθεί σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα με προηγούμενη μελέτη μας [18]. Μικρο-RNAs είναι μια κατηγορία μορίων μονόκλωνου RNA 21-23 ζευγών βάσεων σε μήκος και ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων μέσω ειδικών αλληλεπιδράσεων ζευγαρώματος βάσεων μεταξύ miRNA και αμετάφραστες περιοχές των στοχευμένων mRNAs [19]. MiRNAs θα λειτουργούσε ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων σε ανθρώπινους καρκίνους και δυνητικά χρησιμοποιούνται ως νέα διαγνωστική και προγνωστική βιοδείκτες, και θεραπευτικοί στόχοι. Σε γαστρικού καρκίνου, αρκετές miRNAs συμπεριλαμβανομένων των miR-143 και -145 [20], miR-141 [21], miR-31 [22] και miR-106 [23] Τα μειωτικά, ενώ κάποιοι ογκογένεση miRNAs όπως miR-21 και miR-27a [24] είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω.

Αυτή η μελέτη έχει ως στόχο να διερευνήσει το λειτουργικό ρόλο της STMN1 στο γαστρικό την ανάπτυξη του καρκίνου και των μηχανισμών ρύθμισης της STMN1 σε γαστρικό καρκίνο.

Αποτελέσματα

Up-ρύθμιση του STMN1 σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και πρωτογενών γαστρικό καρκίνο δείγματα

Η έκφραση του mRNA STMN1 ήταν υψηλότερη σε όλες τις 9 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου από το κανονικό γαστρικό ιστό όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε την ανιούσα ρύθμιση των STMN1 πρωτεΐνης σε 11 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (Εικ. 1Β). Παρατηρήθηκε επάνω ρυθμισμένη έκφραση πρωτεΐνης STMN1 σε 4 από τα 5 πρωτογενούς γαστρικής αδενοκαρκινώματα σύγκριση με το αντίστοιχο μη-οιδηματώδης γαστρικό βλεννογόνο (Εικ. 1 C). QRT-PCR διεξήχθη για να διερευνηθεί το επίπεδο έκφρασης STMN1 mRNA. Στην πρωτοβάθμια αδενοκαρκίνωμα στομάχου, 28 50 περιπτώσεις (56%) έδειξαν περισσότερο από 1,5 φορές τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης STMN1 mRNA σε ιστό όγκου σε σύγκριση με το αντίστοιχο μη-οιδηματώδης βλεννογόνο. Το μέσο επίπεδο της έκφρασης mRNA STMN1 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε δείγματα όγκων από ότι στα μη καρκινικά ομολόγους (

σ

= 0,040, σχ. 1D).

έκφραση (Α) STMN1 mRNA σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου σε σύγκριση με την κανονική γαστρικό mRNA εμπορικά διαθέσιμο από την Ambion (AM7996). έκφρασης (Β) πρωτεΐνη STMN1 αξιολογήθηκε με στύπωμα Western σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο από ασθενείς υποβλήθηκαν σε μείωση του βάρους γαστρική χειρουργική επέμβαση. (Γ) Western στύπωμα της STMN1 σε ζεύγη γαστρικό καρκίνο (Τ) και των παρακείμενων μη ογκογόνους ιστούς του βλεννογόνου (Ν). (Δ) της έκφρασης STMN1 mRNA σε 50 ζεύγη αδενοκαρκίνωμα στομάχου και των παρακείμενων μη-νεοπλασματικές βλεννογόνου (

σ

= 0,040).

Η

έκφραση STMN1 συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάχυτο τύπο καρκίνο του στομάχου

η ανοσοϊστοχημεία έγινε για να εκτιμηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης STMN1 σε 111 στοιχειώδη δείγματα γαστρικό αδενοκαρκίνωμα. Η έκφραση της πρωτεΐνης STMN1 εντοπίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων του όγκου (Σχ. 2Α). Θετική ανοσοαντιδραστικότητα παρατηρήθηκε σε 96 γαστρική αδενοκαρκινώματα (86,5%). Μεταξύ αυτών STMN1-θετικούς όγκους, 40 εμφάνισαν ισχυρή (3+), 37 έδειξε ενδιάμεσο (2+) και 19 έδειξαν ασθενή (1+) STMN1 χρώση. Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η έκφραση STMN1 αρνητικά ρυθμίζεται από ογκοκατασταλτικό γονίδιο ΤΡ53 [25]. Ως εκ τούτου, εκτίμησε την έκφραση της πρωτεΐνης p53 με ανοσοϊστοχημεία και να διερευνηθεί η συσχέτισή του με το επίπεδο έκφρασης STMN1. Παρεκκλίνουσα έκφραση των πυρηνικών p53 βρέθηκε σε 51 (45,9%) του γαστρικού αδενοκαρκινώματος και πιο συχνά σε STMN1 θετικών όγκων (50,0%) από ό, τι STMN1 αρνητικά όγκου (20,0%) (

σ

= 0,03). Τα κλινικοπαθολογικοί χαρακτηριστικά των 111 ασθενών με αδενοκαρκίνωμα στομάχου και τη σύνδεση με την έκφραση STMN1 φαίνονται στον Πίνακα 1. STMN1-θετικούς όγκους ήταν πιο πιθανό να βρεθεί στην ηλικιακή ομάδα (

σ

= 0,07) και συνδέονται με την p53 πυρηνική έκφραση (

σ

= 0,03), μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι το γήρας (

σ

& lt? 0.036), ιστολογία με διάχυτη συνιστώσα (

σ

= 0.012), το στάδιο (

σ

& lt? 0,0001), Τ στάδιο (

σ

= 0,012), Ν στάδιο (

σ

& lt? 0,0001), Μ φάση (

p

& lt? 0,0001) και η παρουσία της μετάστασης λεμφαδένα (

ρ

& lt? 0,0001) συσχετίζεται με φτωχή συγκεκριμένες νόσους επιβίωση. Με πολυμεταβλητή ανάλυση Cox παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου, μόνο η ηλικία (

σ

& lt? 0,0001) και το στάδιο (

σ

& lt? 0.0001) συσχετίστηκαν ανεξάρτητα με την επιβίωση συγκεκριμένες νόσους (Πίνακας 2). Σε διάχυτη τύπου αδενοκαρκίνωμα στομάχου, η έκφραση STMN1 συνδέθηκε με το γήρας (

σ

= 0,043), Τ στάδιο (

σ

= 0,004) και η παρουσία των λεμφαδένων μεταστάσεων (

p

= 0,046). Έκφραση των STMN1 στο αδενοκαρκίνωμα στομάχου διάχυτη τύπου συνδέθηκε με φτωχότερες συγκεκριμένες νόσους επιβίωσης από μονοπαραγοντική ανάλυση (

σ

= 0.01, Εικ. 2Β).

(Α) Εκπρόσωπος φωτογραφίες του STMN1 ανοσοϊστοχημεία σε καρκίνο του στομάχου, περίπτωση 37, του εντέρου είδος και την περίπτωση 112, διάχυτη τύπου (αρχική μεγέθυνση × 100, εισαγωγή × 400). (Β) κατά Kaplan-Meier οικόπεδο συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση ανάλογα με την κατάσταση της έκφρασης STMN1 στο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα διάχυτο τύπο.

Η

Η

Σίγαση STMN1 αναστέλλει το επιθετικό φαινότυπο

in vitro

Η

Η συχνή ρύθμιση προς τα άνω του STMN1 mRNA και πρωτεΐνης σε γαστρικών όγκων έδειξε ένα δυναμικό ογκογόνο ρόλο αυτού του γονιδίου. Εξόντωση STMN1 από παρεμβολή μικρά RNA (siRNA) ελάττωσε σημαντικά mRNA και το επίπεδο πρωτεΐνης (σχήμα 3Α). Και μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα AGS και ΜΚΝ7 όπως αποδεικνύεται από δοκιμασίες ΜΤΤ (

ρ

& lt? 0.001, Σχ. 3Β). STMN1 siRNA μεσολάβηση δράση καταστολής ανάπτυξης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας μονοστιβάδας αγκύρωση-εξαρτώμενη. Μια σημαντική μείωση του αριθμού των αποικιών παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με STMN1 siRNA, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αγωνίζομαι σε μονοστρωματική καλλιέργεια (μειώνεται στο 49,2% και το 68,4% των ελέγχων αγώνα στην ΕΕΑ και ΜΚΝ7 αντίστοιχα?

σ

& lt? 0.001, . Σχ. 3C)

(Α) Η επιμόλυνση των STMN1 siRNA μείωσε με επιτυχία STMN1 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης στο AGS και ΜΚΝ7 κύτταρα (**,

σ

& lt? 0.001). (Β) δοκιμασίες ΜΤΤ πρότεινε νοκ ντάουν STMN1 σημαντικά κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό στο AGS και ΜΚΝ7 (**,

σ

& lt? 0.001). αναλύσεις σχηματισμού αποικιών (C) μονόφυλλο πρότεινε επιμόλυνση με siSTMN1 θα μπορούσε να μειώσει το σχηματισμό αποικιών εξαρτάται από την αγκύρωση στο AGS και ΜΚΝ7 κυττάρων (**,

σ

& lt? 0.001). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. (D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων εισέβαλαν μέσω του Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη στην κάτω πλευρά των μικροπόρων δείχνονται. Σημαντική μείωση στην επεμβατική ικανότητα παρουσιάστηκε στο STMN1 νοκ ντάουν (**,

σ

& lt? 0.001). Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε σε 5 τυχαία πεδία όψη και οι ράβδοι σφάλματος εκπροσωπούνται τυπικές αποκλίσεις.

Η

Σε αναλύσεις κυτταρικής κινητικότητας, μια σημαντική μείωση στην επεμβατική φαινότυπο μέσω της Matrigel επικαλυμμένα θαλάμου Boyden (

σ

& lt?. 0,001, σχήμα 3D) αποδείχθηκε σε STMN1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα AGS και ΜΚΝ7 (μειώνεται στο 51,6% και το 46,8% των ελέγχων αγώνα στην ΕΕΑ και ΜΚΝ7 αντίστοιχα). Σε δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης χρησιμοποιώντας Transwell Διαπερατοί στηρίζει, μια σημαντική μείωση στον αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν διαμέσου της μικροπορώδους μεμβράνης (

ρ

& lt? 0.001, Εικόνα S1) βρέθηκε σε STMN1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα AGS και ΜΚΝ7 (μειώνεται σε 65,9% και το 42,7% των ελέγχων αγώνα στην ΕΕΑ και ΜΚΝ7, αντίστοιχα), γεγονός που υποδηλώνει siSTMN1 θα μπορούσε να αναστείλει την ικανότητα μετανάστευσης των γαστρικών καρκινικών κυττάρων.

Δεδομένου ότι ένα ανασταλτικό της ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε siSTMN1 επιμολυσμένα κύτταρα, αναλύσαμε το επιμολύνσεις για τις παραμέτρους του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, συσσώρευση κυττάρων G1 παρατηρήθηκε σε siSTMN1 μορφομετατροπείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες σκαρφάλωμα siRNA (Σχ. 4Α). Τα κύτταρα στην G1 φάση αυξήθηκαν από 47,5% σε 53,7% στο AGS, 38,0% σε 43,4% το ΜΚΝ7, και 30,1% σε 40,1% το SGC7901 κύτταρα. Και αυτό συνοδεύτηκε με μείωση των κυττάρων φάσης S. Σύμφωνα με την διακοπή του κυτταρικού κύκλου που βρέθηκαν στην ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της φωσφο-Rb (S807 /811) σε siSTMN1 μορφομετατροπείς (Εικ. 4Β). Επιπλέον, θα μπορούσε να προκαλέσει siSTMN1 αργά απόπτωση σε τέσσερα γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, AGS, MKN1, BGC823 και SGC7901, η οποία αντιπροσωπεύεται από μία αύξηση του διασπασμένης PARP (Εικ. 4Β). Ωστόσο, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στο επίπεδο της ρ-ΑΚΤ (S473) και ρ-Stat3 (T705) μεταξύ siSTMN1 και αρνητικού ελέγχου επιμολυσμένα.

(Α) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε την συσσώρευση των κυττάρων στο G1 φάση 24 ώρες μετά την αγωγή siSTMN1. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα δείχθηκε. (Β) Ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ρ-Rb (S807 /811) μείωση και αύξηση του διασπασμένης PARP μετά STMN1 knockdown. ρ-ΑΚΤ (S473) και ρ-Stat3 (T705) έδειξε καμία διαφορά. (C) siSTMN1-SGC7901 σχηματίζεται μικρότερους όγκους ξενομοσχεύματος από siScramble-SGC7901 3 εβδομάδες μετά την έγχυση (

σ

& lt? 0,01).

Η

siSTMN1 αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου του στομάχου

in vivo

η

για να διερευνήσει περαιτέρω την επίδραση της STMN1 στο

in vivo

ανάπτυξη του όγκου του στομάχου, siSTMN1 και αγωνίζομαι-επιμολυσμένα γαστρικά καρκινικά κύτταρα εγχύθηκαν υποδόρια στα δεξιά και αριστερά ραχιαία πλευρά γυμνών ποντικών, αντίστοιχα. Από AGS και ΜΚΝ7 κύτταρα δεν σχηματίζουν ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια, χρησιμοποιήσαμε SGC7901 κύτταρα για

in vivo

μελέτη. siSTMN1-επιμόλυνσης σχηματίζεται μικρότερους όγκους στο πλευρό δεξιά ραχιαία από τους ελέγχους που αγωνίζομαι στην αριστερή ραχιαία πλευρά 3 εβδομάδες μετά την έγχυση (

σ

& lt?. 0.01, Σχήμα 4C).

STMN1 είναι μεταγενέστερος στόχος του miR-223 στο γαστρικό καρκίνο

Όπως προβλέπεται από Targetscan, εν δυνάμει θέση πρόσδεσης miR-223 βρέθηκε στην STMN1 3’UTR (θέση 12-18 του STMN1 3’UTR). Η έκφραση του miR-223 ήταν μειωτικά σε 9 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου σε σύγκριση με φυσιολογικό γαστρικό επιθήλιο ιστό (Εικ. 5Α). Έκφραση του miR-223 ήταν αρνητική συσχέτιση με την έκφραση STMN1 πρωτεΐνη (

σ

= 0,05). Έχουμε αξιολογηθεί περαιτέρω η έκφραση της πρωτεΐνης STMN1 με ανοσοϊστοχημεία και το επίπεδο του miR-223 από qRT-PCR σε 31 δημοτικά γαστρικό δείγματα καρκίνου. Όγκων με υψηλότερα STMN1 ανοσολογική αντίδραση (2+ και 3+) έδειξε μια μη σημαντική τάση προς ένα χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης του miR-223 (

σ

= 0.137, Σχ. 5Β).

( Α) επίπεδο έκφρασης MiR-223 σε 9 γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές όπως προσδιορίζεται με qRT-PCR. Μια οριακή συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του επιπέδου της πρωτεΐνης STMN1 και μειωμένη miR-223 έκφρασης (

σ

= 0,05). (Β) έκφραση MiR-223 σε 31 πρωτοβάθμια γαστρική αδενοκαρκινώματα στρωματοποιημένη από το επίπεδο της πρωτεΐνης STMN1. (C) MiR-223 κάτω-ρυθμίζονται ενδογενούς STMN1 mRNA και την έκφραση της πρωτεΐνης (**,

σ

& lt? 0.001) σε κύτταρα AGS και ΜΚΝ7. (D) προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης STMN1 από miR-223, ανακουφίστηκε από miR-223 blocker στο ΜΚΝ7. δοκιμασίες δημοσιογράφος (Ε) λουσιφεράση πρότεινε STMN1 ήταν ένας πιθανός στόχος του miR-223 (**,

σ

& lt? 0.001). Άγριου τύπου: λουσιφεράσης κατασκεύασμα που περιέχει άγριου τύπου αλληλουχία σπόρων STMN1 3’UTR? Μεταλλαγμένα 1: η ακολουθία σπόρος είχε διαγραφεί? Μεταλλαγμένα 2: μεταλλάξεις 4-νουκλεοτιδίων εισήχθησαν στην ακολουθία σπόρων

Η

Για να αποδείξει το ενδεχόμενο κατασταλτική δράση του miR-223 στην έκφραση STMN1, εμείς επιμολυσμένα miR-223 στο γαστρικό γραμμές AGS καρκινικών κυττάρων και ΜΚΝ7. . MiR-223 κατέστειλε STMN1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (

ρ

& lt? 0.001, Σχ 5C.). Προσθέτοντας miR-223 blocker έσωσαν την έκφραση της πρωτεΐνης STMN1 στο ΜΚΝ7 κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει η κατασταλτική επίδραση που προκαλείται ειδικά από miR-223 (Εικ. 5D). Διπλή δοκιμασίες λουσιφεράσης έγιναν για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ miR-223 και STMN1 3’UTR (Σχ. 5Ε). Τα κατασκευάσματα ανταποκριτής που περιέχει προβλεπόμενη ή μεταλλαγμένες θέσεις πρόσδεσης συν-επιμολύνθηκαν με miR-223 μιμητικό να ΜΚΝ28 κύτταρα, γαστρικό καρκίνο κυτταρικής γραμμής με σχετικά χαμηλή έκφραση ενδογενούς STMN1. MiR-223 που ασκείται ισχυρή ανασταλτική επίδραση στην STMN1 3’ΙΙΤΡ (49,7%,

σ

& lt? 0.001). Η ανασταλτική επίδραση εξαλείφθηκε όταν η περιοχή σπόρος διεγράφη (Mutant 1), ή ανακουφίζεται όταν μεταλλάχθηκαν 4 νουκλεοτίδια με την περιοχή του σπόρου. (67.6%,

ρ

& lt? 0.001, Mutant 2)

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, έχουμε αποδείξει την προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης STMN1 τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης στο γαστρικό αδενοκαρκινώματα σύγκριση με το κανονικό γαστρικό επιθήλιο. Το αποτέλεσμα πρότεινε ότι STMN1 θα μπορούσαν να έχουν ογκογόνο λειτουργία σε γαστρική καρκινογένεση. STMN1 έχει αναφερθεί ότι είναι ένας προγνωστικός βιοδείκτη σε αρκετούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού καρκίνου [26], οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [16], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [27], [28], [29], [30] και του στόματος ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα [31]. Δείξαμε ότι η έκφραση STMN1 που σχετίζονται με το γήρας ομάδα, προχωρημένο στάδιο Τ, παρουσία μεταστάσεων λεμφαδένων, και ένα μικρότερο ασθένεια-συγκεκριμένο χρόνο επιβίωσης σε αδενοκαρκίνωμα στομάχου διάχυτη τύπου. Σύμφωνα με αυτό το εύρημα, Jeon et al. ανέφεραν ότι STMN1 θα μπορούσε να προβλέψει φτωχή πρόγνωση στη διάχυτη τύπο του καρκίνου του στομάχου και συσχετίζονται με αγγειακές εισβολή [17].

STMN1 ρυθμίζει δυναμική των μικροσωληνίσκων προωθώντας αποπολυμερισμού των μικροσωληνίσκων και την πρόληψη του πολυμερισμού της τουμπουλίνης. Η αναστολή της έκφρασης STMN1 οδηγεί σε συσσώρευση των κυττάρων στο G2 /M φάσεις και συνδέεται με σοβαρές ανωμαλίες μιτωτικής ατράκτου και δυσκολία στην έξοδο από την μίτωση [10]. STMN1 μεσολαβεί επίσης τα αποτελέσματα της ρ27 (Kip1) στην κυτταρική κινητικότητα [32]. Σε κύτταρα σαρκώματος [33] και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [34], STMN1 διεγείρεται κυτταρική κινητικότητα εντός και μέσω της εξωκυττάριας μήτρας

in vitro

και αύξησε το μεταστατικό δυναμικό

in vivo

. Σε ελάχιστα διαφοροποιημένες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SNU638 και SNU 16, siRNA που προκαλείται STMN1 καταστολή θα μπορούσε να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

in vitro

και

in vivo

[17]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι siRNA knockdown του STMN1 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών εξαρτώμενα από αγκίστρωση, μειωμένη εισβολή και την ικανότητα της μετανάστευσης, που προκαλείται από τη σύλληψη G1 και αργά απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Δείξαμε επίσης ότι siSTMN1 ανέστειλε

in vivo

αύξηση του γαστρικού καρκίνου SGC7901 κυτταρική σειρά. Η λειτουργική αναστολή του STMN1 μειώθηκαν άμεσα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επεμβατική φαινότυπο, προτείνοντας ένα protumorigenic ρόλος του STMN1 σε γαστρικό καρκίνο.

MiR-223 είναι μια εξελικτικά συντηρημένη miRNA οποία αρχικά αναφέρθηκαν σε κοκκιοκυτταροποίηση και μυελοειδή διαφοροποίηση [35]. Η έκφραση του miR-233 θα μπορούσε να καθοδηγείται από τα μυελοειδή παράγοντες μεταγραφής, PU.1 και C /EBPs [36]. Θα μπορούσε να ρυθμίσει διάφορα γονίδια-στόχους, όπως MEF2C [37], μια αντιγραφικός παράγοντας που προάγει μυελοειδή πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων. Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια των οστεοκλαστών διαφοροποίηση [38], και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια πιθανή βιοδείκτη για υποτροπιάζοντα καρκίνο των ωοθηκών [39] και σήψη [40]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι STMN1 είναι μια υποθετική προς τα κάτω στόχος του miR-223 σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [18]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ένα χαμηλό επίπεδο έκφρασης miR-223 στο γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές και μια αντίστροφη σχέση μεταξύ miR-223 και η έκφραση πρωτεΐνης STMN1. Με λουσιφεράσης ρεπόρτερ, εμείς επιβεβαίωσε την ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ των miR-223 και STMN1 3’ΙΙΤΡ στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Η αρνητική επίδραση της διαφοροποίησης από miR-223 τεκμηριώθηκε περαιτέρω με σημαντικά μειωμένο επίπεδο πρωτεΐνης STMN1 σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου μετά miR-223 επανέκφραση. Τα αποτελέσματα υποστήριξαν ότι STMN1 είναι ένας υποθετικός στόχος του miR-223 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Περιέργως, η υπερέκφραση του miR-223 δεν μετέβαλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση (Σχήμα S2A & amp? 2Β) αλλά σημαντικά επαγόμενη κυτταρική κινητικότητα σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα (Σχήμα S2C). Σύμφωνα με αυτό το εύρημα, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι το miR-223 προωθείται κυτταρική κινητικότητα μέσω μετα-μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω των ογκοκατασταλτικό EPB41L3 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα [41]. Ενώ ένα ενιαίο miRNA μπορούν να στοχεύσουν πολλαπλά γονίδια, πολλαπλές miRNA μπορεί να ρυθμίσει ένα μόνο γονίδιο. Η ακριβής μοριακή μηχανιστική αναγνώριση του πόσο ένα δεδομένο miRNA συμβάλλει στις φαινοτυπικές αλλαγές παραμένει αόριστη.

Η απενεργοποίηση του γονιδίου καταστολής όγκου ΤΡ53 είναι οι πιο κοινές και πιο συχνά μελετηθεί μοριακά γεγονότα στον ανθρώπινο καρκίνο. Έχει αναφερθεί ότι η ρ53 μεσολαβεί την καταστολή της δραστηριότητας προαγωγού STMN1, με αποτέλεσμα την αρνητική ρύθμιση της έκφρασης STMN1 και G2 /M σύλληψη στον κυτταρικό κύκλο [25], [42]. Έχει γενικά αποδεκτό ότι τα άγρια ​​πρωτεΐνη τύπου ρ53 δεν είναι ανιχνεύσιμο με ανοσοϊστοχημεία επειδή είναι ασταθής και έχει ένα σχετικά μικρότερο χρόνο ημίσειας ζωής. Μεταλλαγμένα πρωτεΐνη ρ53 συσσωρευτεί στον πυρήνα είναι σχετικά σταθερός και έχει μια μεγαλύτερη ημιζωή, η οποία καθιστά ανιχνεύσιμη με ανοσοϊστοχημεία. Ως εκ τούτου, μια ισχυρή και διάχυτη ανοσοαντιδραστικότητα είναι γενικά ενδεικτική της μεταλλαγμένης ρ53 [43]. Εκτιμήσαμε την κατάσταση p53 σε γαστρικό αδενοκαρκίνωμα με ανοσοϊστοχημεία και διαπίστωσε ότι η παρεκκλίνουσα ανοσολογική p53 που συνδέεται με υψηλότερη έκφραση STMN1. Συνεπώς, είναι εύλογο ότι η υπερέκφραση του STMN1 μπορούσε εν μέρει λόγω της αδρανοποίησης του γονιδίου καταστολής όγκου ρ53 σε γαστρικούς καρκίνους.

Εν κατακλείδι, αποδείξαμε την αυξητική ρύθμιση του STMN1 σε αδενοκαρκίνωμα στομάχου και η έκφραση συσχετίστηκε με κακή συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση σε διάχυτο τύπο καρκίνο του στομάχου. Το ογκογόνο ιδιότητα του STMN1 στο γαστρικό ογκογένεση επιβεβαιώθηκε από λειτουργικές μελέτες. Δείξαμε επίσης ότι η έκφραση του STMN1 αρνητικά ρυθμίζεται από miR-223 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. εύρημα μας πρότεινε ότι STMN1 θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για το αδενοκαρκίνωμα στομάχου διάχυτη τύπου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική σειρά και κυτταρική καλλιέργεια

Έντεκα γαστρικό κυτταρικές σειρές καρκίνου, ΜΚΝ28, ΚΑΤΟ-ΙΙΙ, ΜΚΝ45, SNU 16, SNU 1, ΜΚΝ7, MKN1, ΝΟΙ-Ν87, AGS, BGC823, SGC7901, ελήφθησαν από είτε το American Type Collection Culture (Rockville, MD, USA), RIKEN Τράπεζας κυττάρων (Tsukuba, Ιαπωνία) ή ως δώρο από το Ινστιτούτο Digestive Disease (ΔΑΚ) του Πρίγκιπα της Ουαλίας Νοσοκομείου. Αυτές οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (GIBCO) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, GIBCO ΕΕ), 100 U /ml πενικιλλίνη και 10 μg /ml στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

Κλινικά δείγματα αδενοκαρκινώματος στομάχου

Ένα σύνολο 111 δειγμάτων γαστρικού αδενοκαρκινώματος ανακτήθηκαν από την τράπεζα ιστών των ανατομικών και κυτταρικής παθολογίας, Prince of Wales Hospital, Shatin, το Χονγκ Κονγκ. Άλλες 5 ζεύγη των πρωτοπαθών όγκων και των παρακείμενων μη ογκογόνους ιστούς συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης από ασθενείς χωρίς εισαγωγική θεραπεία. Τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως σε -80 ° C για περαιτέρω μοριακή ανάλυση. Βιοψία δείγματα από 50 ζευγάρια του γαστρικού καρκίνου και της αντίστοιχης μη-καρκινικές βλεννογόνου ευγενώς από IDD του Πρίγκιπα Wales Hospital. Η μελέτη έχει εγκριθεί από την κοινή Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Νέα Εδάφη Ανατολή Cluster Κλινική Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας, το Χονγκ Κονγκ (CREC Κωδ. Αρ 2009.521) και όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση για τη συλλογή των δειγμάτων και η επακόλουθη ανάλυση.

εκχύλιση RNA, qRT-PCR και microRNA qRT-PCR

Σύνολο εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε με NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση cDNA. Για την ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR), Taqman Οικουμενική PCR Master Mix (Applied Biosystems) εφαρμόστηκε για STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG? Φοράς: CTGACCACACTCTGAGCACCAA? Probe: Applied Biosystems, 185.528.556 – 1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). Το σχετικό επίπεδο έκφρασης ομαλοποιήθηκε με αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH) και υπολογίζεται με τη μέθοδο 2∧ (-Delta Delta CT). Taqman miRNA δοκιμασίες (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης του ώριμου miR-223. Ολικό RNA μεταγράφηκε ανάστροφα με MultiScribe (Applied Biosystems) σε μείγμα αντίδρασης που περιέχει miR-ειδική stem-loop αντίστροφη αντιγραφικός εκκινητή. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα κενά του νερού συμπεριλήφθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι.

κηλίδος Western και ανοσοϊστοχημεία

Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και αντιστοιχισμένο πρωτεύοντες ιστούς χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως με πρωτεϊνάση απαγορευτής. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη μέθοδο του Bradford (Δ.Σ.-Rad) και 20 μg πρωτεΐνης αναμιγνύεται με 2 χ SDS ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης φορτώθηκε ανά λωρίδα, διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου. STMN1 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-STMN1 (Cell Signaling, # 3352, 1:1000). Άλλα αντισώματα είναι από την Cell Signaling εμπορικά, διασπασμένη PARP (Asp214) (# 9541, 1:1000), φωσφο-Rb (Ser807 /811) (# 9308, 1:1000), φωσφο-ΑΚΤ (S473) (# 9271, 1 :1000) και φωσφο-Stat3 (T705) (# 9145, 1:2000).

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε 4 μm πάχους τομές από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα. Μετά de-αποτρίχωση σε ξυλόλιο και διαβαθμισμένη αιθανόλη, οι τομές επωάστηκαν σε 3% Η

2O

2 διάλυμα για 25 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης και ακολούθως υποβλήθηκε σε φούρνο μικροκυμάτων σε κιτρικό ρυθμιστικό για ανάκτηση αντιγόνου. Τα πρωτογενή αντισώματα (1:25 για STMN1 από τη Cell Signaling και 1:100 για ρ53 από ϋΑΚΟ) επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα και ανάπτυξης χρωμογόνο εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα EnVision (ϋΑΚΟ). Η κυτταροπλασματική έκφραση της STMN1 εκτιμήθηκε εκχωρώντας ένα σκορ αναλογία και μία βαθμολογία έντασης. Το σκορ αναλογία ήταν σύμφωνα με την αναλογία των κυττάρων όγκου με θετική κυτταροπλασματική χρώση (0, κανένας? 1, & lt? = 10%? 2, 10 στο & lt? = 25%? 3, & gt? 25 έως 50%? 4, & gt? 50%). Η βαθμολογία της έντασης ανατέθηκε για τη μέση ένταση των θετικών καρκινικών κυττάρων (0, κανένας? 1, αδύναμη? 2, ενδιάμεσο? 3, ισχυρή). Η κυτταροπλασματική βαθμολογία STMN1 ήταν το προϊόν της αναλογίας και της έντασης βαθμολογίες, που κυμαίνονται από 0 έως 12. Η κυτταροπλασματική έκφραση κατηγοριοποιήθηκε σε αρνητικό (βαθμός 0), 1+ (βαθμολογία 1 έως 3), 2 + (στείλει 4-6) και 3+ (βαθμολογία 7-12). έκφραση των πυρηνικών p53 σε & gt? 10% των κυττάρων του όγκου βαθμολογήθηκε ως παρεκκλίνουσα υπερέκφραση

STMN1 λειτουργικές δοκιμασίες

Η επιμόλυνση των STMN1 siRNA και ελέγχου αγωνίζομαι (QIAGEN) πραγματοποιήθηκε με χρήση αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (. Invitrogen). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού CellTiter 96 μη ραδιενεργού Κυττάρου (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας σε καλλιέργειες μονοστιβάδας, κύτταρα μετεμβολιασμένα με STMN1 siRNA ή τον έλεγχο σκαρφάλωμα καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη για 15 λεπτά και χρωματίστηκαν με 2% κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες με περισσότερα από 50 κύτταρα ανά αποικία μετρήθηκαν. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν.

Το κύτταρο δοκιμασίες εισβολή διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας BD Biocoat Matrigel εισβολής Chambers (BD Biosciences). Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν στην κορυφή του θαλάμου στο μέσο καλλιέργειας που περιέχει 1% FBS, με πλήρες μέσο (που περιέχει 10% FBS) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα που εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης Matrigel σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη για 2 λεπτά και βάφονται με 1% μπλε τολουϊδίνης για άλλα 2 λεπτά. Για τις στατιστικές αναλύσεις, τα κύτταρα στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκαν από 5 τυχαία μικροσκοπικά πεδία (αρχική μεγέθυνση χ 400). Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν, και η μέση τιμή εκφράστηκε από 2 ανεξάρτητα πειράματα.

Το κύτταρο δοκιμασίες μετανάστευσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Transwell Permeable υποστηρίζει (Corning, ΝΥ). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν από τρυβλία καλλιέργειας 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, πλύθηκαν τρεις φορές με μέσο καλλιέργειας και επαναιωρήθηκαν. Στη συνέχεια, 300 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος (5 × 10

4 κύτταρα) προστέθηκαν στα transwells, με 500 υΐ μέσου καλλιέργειας που περιέχει 10% FBS στον κατώτερο θάλαμο. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα που θα μπορούσαν να μεταναστεύουν διαμέσου της μικροπορώδους μεμβράνης σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη για 2 λεπτά και βάφονται με 1% μπλε τολουϊδίνης για άλλα 2 λεπτά. Για τις στατιστικές αναλύσεις, μετρήσαμε το συνημμένο αριθμό των κυττάρων σε 3 τομείς ενόψει της κάθε θάλαμο τυχαία και πήρε το μέσο αριθμό των κυττάρων του κάθε πεδίου.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την αναστολή του κυτταρικού κύκλου

Για του κυτταρικού κύκλου ανάλυση, AGS, ΜΚΝ7 και SGC7901 κύτταρα συλλογή κατά το χρόνο 24 ώρες μετά την επιμόλυνση σε πλάκες 6 cm. Πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ασιτία για 12 ώρες για το συγχρονισμό. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ψυχρό PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 70% ψυχρή αιθανόλη για όλη τη νύχτα σε 4 ° C και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 ng /ml ΚΝάση Α για 10 λεπτά στους 37 ° C. Cellular DNA χρωματίστηκε με 15 ng /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια ταξινομήθηκαν με FACS Calibur κυτταρομετρητή ροής (Becton Dickinson, CA) και τα προφίλ του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFitLT (Becton Dickinson, San Diego, CA). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν για δύο ξεχωριστές φορές.

In vivo

ογκογονικότητα μελέτη

SGC7901 κύτταρα (2 χ 10

6cells αιωρήθηκε σε 0.1 ml PBS) παροδικά επιμολυσμένα με siScramble και siSTMN1 εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό ραχιαία εννέα 4-εβδομάδων αρσενικών Balb /c γυμνών ποντικών (siSTMN1 στη δεξιά πλευρά και τα κύτταρα αρνητικού ελέγχου στα αριστερά). Τα ξενομοσχεύματα ελήφθησαν έξω και διάμετρος του όγκου μετρήθηκε και τεκμηριώνονται στο τέλος της εβδομάδας 3. Ο όγκος του όγκου (mm

3) εκτιμήθηκε με μέτρηση της μακρύτερης και συντομότερης διάμετρος του όγκου και τον υπολογισμό ως εξής: όγκος = (μικρότερη διάμετρος )

2 × (μεγαλύτερη διάμετρος) × 0.5.