Αφηρημένο

Η κλινική εμπειρία των αναστολέων δεακετυλάσης ιστόνης (HDACIs) σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους υπήρξε απογοητευτική? Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός αποτυχίας της θεραπείας δεν είναι γνωστή. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να διερευνηθεί η μοριακή μηχανισμός αποτυχίας της θεραπείας του HDACIs στην παρούσα μελέτη. Βρήκαμε ότι HDACIs Τριχοστατίνη Α (TSA) και το σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) θα μπορούσε να επάγει επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) φαινότυπο στον καρκίνο του προστάτη (PCA) κύτταρα, τα οποία σχετίστηκε με αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία συνεπές με αυξημένη έκφραση της μεταγραφής παράγοντες ZEB1, ZEB2 και Slug και δείκτες μεσεγχυματικών όπως vimentin, Ν-cadherin και Ινονεκτίνης. δοκιμασία CHIP έδειξε ακετυλίωση της ιστόνης 3 στις εγγύς υποστηρικτές των επιλεγμένων γονιδίων, τα οποία ήταν εν μέρει υπεύθυνη για την αυξημένη έκφραση των δεικτών EMT. Επιπλέον, η θεραπεία TSA οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση στην έκφραση του Sox2 και Nanog σε κύτταρα προστάτη με EMT φαινότυπο, η οποία συνδέεται με τον καρκίνο αρχέγονων κυττάρων όπως (CSLC) τα χαρακτηριστικά συνεπή με αυξημένη κινητικότητα κυττάρου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι από μόνη HDACIs θα οδηγούσε σε επιθετικότητα του όγκου, και έτσι οι στρατηγικές για την επιστροφή ΕΜΤ-φαινότυπο σε μεσεγχυματικά-to-επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ) φαινότυπο ή την αναστροφή της CSLC χαρακτηριστικά πριν από την χρήση του HDACIs θα ήταν ευεργετικό να συνειδητοποιήσουμε την αξία της HDACIs για τη θεραπεία των συμπαγών όγκων, ιδίως του προστάτη

Παράθεση:. Κονγκ D, Ahmad A, Bao Β, Li Υ, Banerjee S, Sarkar FH (2012) Αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης Προκαλέστε Τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση σε κυττάρων καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (9): e45045. doi: 10.1371 /journal.pone.0045045

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 του Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 11 Αύγ. του 2012? Δημοσιεύθηκε: 14 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Κονγκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (5R01CA108535-06 και 5R01CA083695-09) απονέμεται σε FHS (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm? new=1 icde=4342569 loc=2 CFID=28929570 CFTOKEN=80568291). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια ευρεία ποικιλία γενετικών και γονιδιωματικών μεταβολών όπως ενισχύσεις, μεταθέσεις, εξαλείψεις, και σημειακές μεταλλάξεις έχει πιστεύεται ότι συνδέονται με την ανάπτυξη του καρκίνου. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι επιγενετικές μεταβολές συμμετέχουν επίσης στην ανάπτυξη του καρκίνου [1]. Οι κύριες τροποποιήσεις στον άνθρωπο είναι η μεθυλίωση του DNA και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών συμπεριλαμβανομένων ακετυλίωση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, κλπ, τα οποία εμπλέκονται στην απορυθμισμένη έκφραση των γονιδίων που διαμεσολαβείται από μεταγραφική ρύθμιση [1], [2]. Ακετυλίωση και αποακετυλίωση ιστονών παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής γονιδίων στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η κατάσταση της ακετυλίωσης ιστόνης εξαρτάται από την ισορροπία των δραστηριοτήτων της ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης (ΗΑΤ) και αποακετυλασών των ιστονών (HDAC). HDACs απομάκρυνση των ομάδων ακετυλίου από λυσίνη στην ουρά των ιστονών, η οποία προωθεί την πιο συμπυκνωμένη δομή χρωματίνης, έχοντας ως αποτέλεσμα την καταστολή της γονιδιακής μεταγραφής, περιορίζοντας τη δυνατότητα πρόσβασης των παραγόντων μεταγραφής [3]. Αυξημένη έκφραση και τη δραστηριότητα των HDACs σε ιστούς του καρκίνου οδήγησε στο ορθολογικό σχεδιασμό αναστολέων αποακετυλάσης ιστόνης (HDACIs) ως πιθανοί θεραπευτικοί παράγοντες για τη θεραπεία του καρκίνου. Αρκετές HDACIs έχουν χρησιμοποιηθεί στη φάση Ι και II κλινική δοκιμή για τη θεραπεία ενός αριθμού αιματολογικών κακοηθειών και στερεών όγκων επίσης [4]. Οι περισσότερες από τις θετικές αποκρίσεις σε HDACIs βρέθηκαν να είναι σε ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες συμπεριλαμβανομένης δερματικό Τ-κυτταρικό λέμφωμα και περιφερικό λέμφωμα Τ-κυττάρων. Ωστόσο, τα αποτελέσματα σε συμπαγείς όγκους, μέχρι στιγμής, υπήρξαν απογοητευτικά. Μέχρι σήμερα, αρκετές μηχανισμοί με τους οποίους η αντίσταση επάγονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας των συμπαγών όγκων με HDACIs έχουν διευκρινιστεί, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης έκφρασης του γονιδίου με αντοχή πολυφαρμάκου, MDR1 (ABCB1), αυξημένη αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και ενεργοποίηση μονοπατιού κυτταρικής επιβίωσης [3] και αυτές οι διαπιστώσεις δεν έχουν ακόμη μεταφραστεί σε κλινική ιατρική. Ως εκ τούτου, η καλύτερη κατανόηση των μοριακών καθοριστικών παραγόντων της αντίστασης στη HDACIs θα μπορούσε να παράσχει τη βάση για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών που θα μπορούσαν να βελτιώσουν την έκβαση της θεραπείας των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με συμπαγείς όγκους.

Τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά Μετάβασης (ΕΜΤ ) πιστεύεται ότι σχετίζεται με φαρμακο-αντίστασης [5], [6]. Η βιολογία του ΕΜΤ είναι μια κρίσιμη διαδικασία trans-διαφοροποίηση, η οποία εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και σε ώριμους ιστούς μετά από επισκευή πληγής και αναδιαμόρφωση όργανο σε απόκριση σε τραυματισμό, και επίσης εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του [7], [8]. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, τα επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν κυτταρική μορφολογία μεσεγχυματικά μέσω προς τα κάτω ρύθμιση των επιθηλιακών δεικτών και ανιούσα ρύθμιση των δεικτών μεσεγχυματικών, έτσι οδηγεί σε αύξηση των μεταναστευτικών ικανότητα, διεισδυτικότητα και αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία, και όλα εκ των οποίων εμπλέκονται στον καρκίνο εξέλιξης [ ,,,0],7] – [15]. Επιπλέον, τα κύτταρα με EMT χαρακτηριστικά μερίδιο φαινότυπο με καρκινικά βλαστικά-όπως κυττάρων (CSLC), το οποίο προσδίδει αντίσταση στο φάρμακο σε αυτά τα κύτταρα και συμβάλλει στην υποτροπή του καρκίνου και μετάσταση [10], [11], [16], [17]. Kong et al., Βρήκαν ότι η υπερ-έκφραση του PDGF-D οδήγησαν στην επαγωγή της ΕΜΤ φαινοτύπου σε καρκίνο προστάτη PC3 (PCA) κύτταρα, τα οποία συσχετίστηκε με την απώλεια των επιθηλιακών δεικτών και κέρδος της έκφρασης των δεικτών μεσεγχυματικών όπως Ν-καδερίνης , vimentin καθώς και up-ρύθμιση των παραγόντων μεταγραφής συμπεριλαμβανομένων ZEB1, ZEB2 και Slug, με αποτέλεσμα την αυξημένη κυτταρική μετανάστευση, εισβολή i

n vitro

και ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[9 ]

, [18],

[19]

. Επιπλέον, PDGF-D υπερεκφράζουν κύτταρα PC3 (κύτταρα PC3 PDGF-D) με EMT φαινότυπο εμφανίζεται CSLC υπογραφές, η οποία ήταν σύμφωνη με αυξημένη έκφραση του Oct4. Nanog, Sox2 και Lin28B, με αποτέλεσμα την αυξημένη κλωνογονικού ικανότητα και την ικανότητα αυτο-ανανέωσης [10].

Klarmann et al. έδειξαν ότι επεμβατική κυττάρων μέσω Matrigel υποβλήθηκαν σε ΕΜΤ μετατροπή φαινοτυπική και εμφανίζεται αυξημένη έκφραση του CD44 και μειωμένη έκφραση του CD24, και την αύξηση της Hedgehog σηματοδότηση. Επιπλέον, μεταστατικών κυττάρων από κύτταρα DU145 και κυττάρων από ανθρώπινα πρωτογενή προστάτη είναι πιο ογκογονικά σε ποντίκια NOD /SCID συγκριτικά με μη-επεμβατικές κύτταρα [20]. Μηχανιστικά, η συνεργασία μεταξύ της ενεργοποίησης RAS και η απώλεια της PTEN οδήγησε στην απόκτηση των βλαστικών /προγονικών υποπληθυσμό με χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά, και αυτά τα κύτταρα ήταν άκρως μεταστατικά μετά από ορθοτοπική μεταμόσχευση [21]. Χαμηλή έκφραση του παράγοντα μεταγραφής ETS ESE3 /EHF αποδείχθηκε ότι συνδέεται με αυξημένη βιοχημική υποτροπή και μειωμένη συνολική επιβίωση των ασθενών προστάτη μετά από ριζική προστατεκτομή, η οποία βρέθηκε να είναι συνεπής με την επαγωγή της ΕΜΤ και την απόκτηση CSLC υπογραφές που οδήγησαν σε ογκογενή και μεταστατικές ιδιότητες των κυττάρων προστάτη [22]. θεραπεία στέρηση ανδρογόνου (ADT) χρησιμοποιείται συνήθως για τη θεραπεία του μεταστατικού προστάτη, και Jennbacken et al. έδειξε ότι ADT θα μπορούσε να ενισχύσει την έκφραση Ν-cadherin, ένα σήμα κατατεθέν για την EMT, η οποία συνδέεται με αυξημένη μετάστασης [23]. Αυξημένη έκφραση Ν-καδερίνης σε μη μεταστατικό, εξαρτώμενων από ανδρογόνα PCA σε ζωικό μοντέλο οδήγησε σε αντίσταση ευνουχισμό, αυξημένη εισβολή και μετάσταση, η οποία ήταν σύμφωνη με τα ευρήματα που δείχνουν αυξημένη έκφραση της Ν-καδερίνης σε πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους ασθενών με ανθεκτική ευνουχισμό προστάτη (CRPC) [24]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ADT θα μπορούσε να προκαλέσει EMT και οδηγεί στην απόκτηση CSLC υπογραφές τόσο φυσιολογικό προστατικό ιστό του ποντικιού και μοσχεύματα όγκου ανθρώπινου LuCaP35 προστάτη. Παρόμοιες μεταβολές στα χαρακτηριστικά γνωρίσματα μεσεγχυματικά παρατηρήθηκαν επίσης σε όγκους του προστάτη από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ADT [25]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επαγωγή της EMT και CSLC υπογραφές οδηγεί σε θεραπευτικές αντίσταση και οδηγεί στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία των κυττάρων του προστάτη με TSA ή SAHA που προκαλείται φαινότυπο EMT μεσολάβηση μέχρι -Κανονισμός των μεταγραφικών παραγόντων και των δεικτών μεσεγχυματικά μέσω προώθηση ακετυλίωση της ιστόνης 3 στις εγγύς υποστηρικτές των συγκεκριμένων γονιδίων. Επιπλέον, η θεραπεία TSA οδήγησε επίσης σε περαιτέρω αύξηση στην έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων σε κύτταρα EMT φαινοτυπική ΣΕΣΣ. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν συνεπή με αυξημένη κινητικότητα κυττάρου του TSA ή SAHA επεξεργασμένα κύτταρα PCa. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια μηχανιστική βάση για το απογοητευτικό αποτέλεσμα της HDACIs στη θεραπεία των στερεών όγκων, και περαιτέρω προτείνουν ότι η αντιστροφή του ΕΜΤ φαινοτύπου ή CSLC χαρακτηριστικά με νέα προσέγγιση πριν HDACIs μπορούσε να γίνει μια ορθολογική στρατηγική για τη θεραπεία των στερεών όγκων, ιδίως PCa.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμού Κατάσταση

LNCaP και PC3 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και διατηρούνται σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 10 mmol /L Hepes, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη. Σταθερές κυτταρικές γραμμές που υπερεκφράζουν PDGF-D (που αναφέρεται PC3 PDGF-D) δημιουργήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένου με 5% ορό εμβρύου βοός (FBS), 2 mmol /L γλουταμίνη, 10 μmol /L Hepes, 50 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2-υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C και γονοτυπικά χαρακτηριζόμενη να υποστηρίξει την αυθεντικότητα αυτών των κυττάρων, η οποία ήταν σύμφωνη με την προέλευσή του.

αντιδραστήρια έρευνας και Αντισώματα

Τριχοστατίνη Α (TSA) ελήφθη από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ) και σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) αγοράστηκε από Aton Pharma, Inc, (Lawrenceville, NJ). Αντισώματα έναντι ακετυλο-ιστόνης Η3 (Lys9), HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, Slug, Sox2 και Nanog αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι Ν-καντερίνης και βιμεντίνης αγοράστηκαν από την BD Biosciences (Bedford, ΜΑ) και Abcam (Cambridge ΜΑ), αντίστοιχα. Αντισώματα έναντι ZEB1, ινονεκτίνη και Ε-καδερίνης ελήφθησαν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Goat αντι-κουνελιού IgG (H + L) προϊόν σύζευξης -HRP και κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Η + L) προϊόν σύζευξης -HRP αγοράσθηκαν από την Bio-Rad (Reinach, BL). Αντίσωμα προς γλυκεραλδεϋδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH) ελήφθη από Affinity Bioreagents (Χρυσή, CO). Alex Fluro 594 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG ή Alex Fluro αντι-ποντικού IgG και Alexa Fluor 594 φαλλοϊδίνη για χρώση F-ακτίνης αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA).

(Α και Β) PC3 κύτταρα 594 κατσίκα κατεργάζεται με TSA και SAHA για 24 ώρες σε ενδεικνυόμενες δόσεις. Οι μικροφωτογραφίες των κυττάρων PC3 σε επεξεργασία με TSA και SAHA παρουσίασαν φαινότυπο ινοβλαστική-τύπου, ενώ κύτταρα κατεργασμένα με έλεγχο DMAO εμφανίζονται στρογγυλεμένα επιθηλιακή μορφολογία κυττάρων (αρχική μεγέθυνση, χ 100). (C) κύτταρα PC3 σπάρθηκαν στο θάλαμο. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 400 ηΜ TSA ή 5 μΜ SAHA για άλλες 24 ώρες. Τα αποτελέσματα από χρώση ανοσοφθορισμού για βιμεντίνη και ZEB1 (Κόκκινο) έδειξε ότι η θεραπεία των PC3 κυττάρων με TSA και SAHA αύξησε την έκφραση της βιμεντίνης και ZEB1 (μεσαία και δεξιά πάνελ) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (αριστερό πάνελ). χρώση phalloidin έδειξε F-ακτίνης (Κόκκινο) αναδιοργάνωση σε TSA και SAHA επεξεργασμένα κύτταρα PC3. Πυρηνικό DNA χρωματίσθηκε με DAPI (μπλε, αρχική μεγέθυνση, χ 200).

Η

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα PC3 επεξεργασία με 200 nm και 400 nm TSA (Α) ή 2,5 μΜ και 5 μΜ SAHA (Β) για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα από πραγματικού χρόνου RT-PCR έδειξε ότι η σχετική έκφραση του mRNA του ZEB1, ZEB2, Slug, Twist, Ν-καδερίνης βιμεντίνη και ΜΜΡ2 αυξήθηκε μετά από θεραπεία σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO (η τιμή του ελέγχου σχεδιάστηκε ως 1, * ρ & lt ? 0,05, ** p & lt?. 0.01)

η

Κυττάρου μετανάστευση δοκιμασία

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 24 και Transwell Διαπερατοί υποστηρίζει με 8 μm πόρους (Corning, Lowell, MA) σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, PC3 κύτταρα κατεργασμένα με TSA, SAHA ή DMSO ελέγχου για 6 ώρες συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο RPMI 1640 ορού και 1 × 10

5 κύτταρα σε κάθε φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε ενθέτων Transwell. Κάτω φρεάτια πληρώθηκε με 0,5 ml μέσου που περιείχε 10% FBS. Μετά από 24 ώρες επώασης, κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9].

Ανάλυση Western Blot

Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με λύση των κυττάρων σε ρυθμιστικό RIPA. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ανάλυσης πρωτεϊνών (Pierce, Rockford, IL). Οι πρωτεΐνες με ίση ποσότητα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE για το διαχωρισμό και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά από αποκλεισμό με 3% γάλα, η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με επώαση με τους αντίστοιχους πρωτογενή αντισώματα ακολουθούμενη από επώαση με τους αντίστοιχους δευτερογενή αντισώματα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Η ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Valencia, CA). Το υπολειμματικό DNA απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας μια RNase-free kit NDase (Qiagen). High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Fostor, CA) χρησιμοποιήθηκε για αντίστροφη μεταγραφή Ένα μικρογραμμάριο RNA σε cDNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου με τη χρήση SYBR® Πράσινο RT-PCR Αντιδραστήρια (Applied Biosystems). Η σχετική ποσότητα του mRNA κανονικοποιήθηκε στην έκφραση του GAPDH. Οι αλληλουχίες εκκινητή φαίνονται στον πίνακα 1.

CHIP Δοκιμασία

Κιτ SimpleChIP® ενζυματική χρωματίνης IP (Μαγνητικά σφαιρίδια) και 6-Tube Μαγνητικού Διαχωρισμού Rack αγοράστηκαν από την κυτταρική σηματοδότηση και χρησιμοποιείται για την εκτέλεση CHIP δοκιμασίας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα PC3 σε επεξεργασία με 400 ηΜ TSA και 5 μΜ SAHA ή ελέγχου DMSO για 16 ώρες και 37% φορμαλδεΰδη προστέθηκε (Τελική συγκέντρωση φορμαλδεΰδης ήταν 1%) για τη διασύνδεση των πρωτεϊνών στο DNA και αναμειγνύονται, και στη συνέχεια επωάζονται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου . Προστέθηκε γλυκίνη σε πιάτα και τα κύτταρα επωάστηκαν για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με παγωμένο PBS, τα πυρηνικά εκχυλίσματα από τα κύτταρα που παρασκευάζονται wee. Για την παρασκευή σταυροδεσμούς χρωματίνη, το πυρηνικό εναιώρημα προστέθηκε σε μικρόκοκκη νουκλεάση για την πέψη του DNA σε μήκος περίπου 150-900 bp και μικρόκοκκη νουκλεάση αδρανοποιήθηκε με EDTA, και στη συνέχεια σε υπερήχους με αρκετές παλμούς για να σπάσει την πυρηνική μεμβράνη. Μετά τον καθαρισμό, το DNA μέγεθος θραύσματος προσδιορίσθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι εύρη μεγέθους DNA ήταν περίπου 150-900 μήκος bp. Για χρωματίνη ανοσοκατακρήμνιση, 15 μg χρωματίνης DNA σε ρυθμιστικό CHIP (για κάθε ανοσοκαταβύθιση) επωάστηκε με το αντίσωμα ανοσοκαταβύθιση: Ac-Η3, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, και του αρνητικού ελέγχου (Normal Rabbit IgG) στους 4 ° C με περιστροφή. Μετά την επώαση όλη τη νύκτα, προστέθηκαν 30 μΙ ChIP Grade Πρωτεΐνης G Μαγνητική Χάντρες και επωάστηκαν για 2 ώρες στους 4 ° C με περιστροφή χρωματίνης εκλούστηκε από αντισώματος /πρωτεΐνης G Χάντρες και διασυνδέσεις αναστράφηκε με επώαση με πρωτεϊνάση Κ 2 ώρες στους 65 ΝΤΟ. DNA καθαρίστηκε με χρήση στηλών Spin. Η ποσοτικοποίηση του DNA πραγματοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για το γονίδιο υποκινητή της βιμεντίνης, ZEB2, Slug και ΜΜΡ2. Οι Primer αλληλουχίες για αυτούς τους προαγωγούς γονιδίων που παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Η σχετική ποσότητα του υποκινητή DNA κανονικοποιήθηκε στην είσοδο. IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς και υπολογίζεται ως μονάδα αξία 1,0.

(Α) Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα LNCaP επεξεργασία με 200 nm και 400 nm TSA για 8, 16 και 24 ώρες. Η σχετική έκφραση του mRNA της ZEB1, Slug, βιμεντίνη και Ν-cadherin αυξήθηκε μετά από θεραπεία TSA σε σχέση με τον έλεγχο DMSO (η αξία του ελέγχου σχεδιάστηκε ως 1, *, p & lt? 0,05? **, P & lt? 0,01). (Β) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 400 ηΜ TSA για 8 ώρες έως 72 ώρες. Ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει ότι η θεραπεία TSA προωθείται ακετυλίωση histone3 (Ac-Η3) στις 8 ώρες και 16 ώρες της θεραπείας. Η έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών όπως ινονεκτίνη (Fibron) και βιμεντίνης ανυψώθηκε μετά από 24 ώρες αγωγή με TSA. (C) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 400 ηΜ TSA για 4 ώρες έως 32 ώρες. Hyper-ακετυλίωση ιστόνης 3 παρατηρήθηκε σε 4 ώρες έως 32 ώρες αγωγή με συνακόλουθη αυξημένη έκφραση ZEB1 σε κάθε χρονικό σημείο της θεραπείας. Ενισχυμένη έκφραση του βιμεντίνης παρατηρήθηκε μετά από 16 ώρες της θεραπείας με TSA.

Η

(Α) Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με 2,5 μΜ και 5 μΜ SAHA για 8, 16 και 24 ώρες. Τα αποτελέσματα από πραγματικού χρόνου RT-PCR έδειξε ότι η σχετική έκφραση του mRNA των παραγόντων μεταγραφής όπως ZEB1 και Slug ήταν πάνω ρυθμισμένα ήδη από 8 ώρες της θεραπείας με SAHA, ενώ βιμεντίνη και Ν-καδερίνης αυξήθηκε μετά από 16 ώρες της θεραπείας σε σύγκριση για τον έλεγχο DMSO (η αξία του ελέγχου σχεδιάστηκε ως 1, *, p & lt? 0,05? **, p & lt? 0,01). (Β) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ SAHA επί 8 ώρες έως 72 ώρες. Western blot που δείχνει ανάλυση που αγωγή SAHA προωθείται ακετυλίωση histone3 (Ac-Η3) στις 8 ώρες έως 72 ώρες θεραπείας. Η ινωδονεκτίνη (Fibron) αυξήθηκαν σημαντικά μετά από 24 ώρες της θεραπείας και βιμεντίνης ήταν δραματικά αυξημένα μετά από 16 ώρες της θεραπείας με SAHA. (C) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ SAHA επί 4 ώρες έως 32 ώρες. και αυξημένη έκφραση του ZEB1 παρατηρήθηκε στις 4 ώρες έως 32 θεραπεία h, η οποία συνδέθηκε με Hyper-ακετυλίωση ιστόνης 3. Ενισχυμένη έκφραση του βιμεντίνης παρατηρήθηκε σε 32 ώρες της θεραπείας με SAHA.

Η

Immuno -fluorescence Μικροσκοπία

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως από το εργαστήριο μας [18]. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Μετά από πλύση 3 φορές με PBS, τα κύτταρα διαπερατά σε 0.5% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά, και στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 10% ορό κατσίκας. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 40 λεπτά με αντισώματα έναντι βιμεντίνης (προ-αραιωμένο) και ZEB1 (1:50) σε 5% ορό κατσίκας, πλύθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν για άλλα 40 λεπτά με τον Alex Fluro 594 συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (1:250) σε θερμοκρασία δωματίου. Για χρώση F-ακτίνης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά σε 0.5% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά, και στη συνέχεια επωάζονται με 0,33 μΜ Alexa Fluor 594 φαλλοϊδίνη για 40 λεπτά στους 4 ° C . Μετά την πλύση, τα πλακίδια τοποθετημένα με μέσο στερέωσης περιέχει αντιδραστήριο αντι-ξεθωριάζει και DAPI. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού. Οι εικόνες συλλήφθηκαν και αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού για προχωρημένους Αθλητισμού (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

τηλέφωνα Απόσπασμα Δοκιμασία

Για την ανίχνευση των κυττάρων αποκόλληση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 8 ώρες επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 400 ηΜ TSA και 5 μΜ SAHA ή ελέγχου DMSO για 20 ώρες. Για την αποκόλληση των κυττάρων από τις πλάκες καλλιέργειας, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 0.125% θρυψίνη ΕϋΤΑ σε RT για 3 λεπτά. Μετά την αδρανοποίηση της θρυψίνης με την προσθήκη του μέσου που περιέχει 5% FBS στα φρεάτια, τα αποκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωλήνες. Τα υπόλοιπα κύτταρα επωάστηκαν με 0,25% θρυψίνη ΕϋΤΑ επί 5 λεπτά στους 37 ° C για να αποκολληθούν όλα τα κύτταρα από τις πλάκες καλλιέργειας και τα κυτταρικά αιωρήματα συλλέχθηκαν σε νέους σωλήνες. Τα κύτταρα μετρήθηκαν και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως ποσοστό των αποσπασμένων κυττάρων (επώαση με 0.125% θρυψίνη EDTA) προς το σύνολο των κυττάρων.

Ανάλυση Δεδομένων

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τρεις ή περισσότερες διαφορετικές επαναλήψεις. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SE.

t

δοκιμάσει ένα two-tailed φοιτητή χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων. ANOVA χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις περισσοτέρων των δύο ομάδων. Οι τιμές των p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

HDACIs Induced EMT φαινότυπο σε κύτταρα του προστάτη Καρκίνος

Για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της HDACIs στη μορφολογία των κυττάρων, εμείς. επεξεργασμένα κύτταρα PC3 με TSA ή SAHA, και βρήκαμε ότι τα κύτταρα PC3 αντιμετωπίζονται με TSA ή SAHA εμφανίζεται επίμηκες /ακανόνιστη ινοβλαστοειδούς μορφολογία. Σε αντίθεση, PC3 κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO εμφάνισαν εμφάνιση μωσαϊκού, χαρακτηριστική μορφολογία των επιθηλιακών κυττάρων (Εικ. 1Α και Β). DU145 και ARCaPE κύτταρα κατεργασμένα με TSA ή SAHA εμφανίζονται επίσης επίμηκες /ακανόνιστη ινοβλαστοειδή μορφολογία (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κυττάρων με HDACIs οδηγεί στην επαγωγή της ΕΜΤ φαινότυπο. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αν HDACIs θα μπορούσε πραγματικά να προκαλέσει EMT σε κύτταρα PC3, προσδιορίσαμε την έκφραση της βιμεντίνης και ZEB1 χρησιμοποιώντας χρώσης ανοσο-φθορισμού. TSA και SAHA επάγεται φαινότυπο EMT ήταν συνεπές με αυξημένη έκφραση του βιμεντίνη και ZEB1 (Εικ. 1 C, άνω και μεσαίο πλαίσιο). Επιπλέον, F-ακτίνη αναδιοργάνωση και ένα διάχυτο πρότυπο παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα PC3 που έλαβαν θεραπεία με TSA και SAHA (Εικ. 1 C, κάτω πλαίσιο), τα οποία συσχετίζονται με EMT φαινότυπο.

(Α) και PC3 LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TSA ή SAHA σε διάφορες δόσεις για 48 ώρες. Ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την έκφραση των δεικτών των επιθηλιακών και meshenchymal καθώς και ακετυλίωση κατάσταση. (Β) κατεργασία TSA για 48 ώρες αύξησε την έκφραση του Sox2 και Nanog κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο σε κύτταρα PC3 PDGF-D. Up-ρύθμιση του βιμεντίνης παρατηρήθηκε ακόμη και μετά από 50 ηΜ TSA της θεραπείας. (Γ) δοκιμασία κυττάρων απόσπαση πραγματοποιήθηκε μετά από 400 ηΜ TSA ή 5 μΜ SAHA θεραπεία για 20 ώρες. TSA και SAHA προώθησε σημαντικά PC3 κυττάρων αποκόλληση από τις επιφάνειες του πολιτισμού (**, p & lt? 0,01). (D) Εμφάνιση αυξημένη τάσεις κυττάρου μετανάστευση των κυττάρων PC3 σε επεξεργασία με TSA και SAHA.

Η

(Α) δοκιμασία CHIP διεξήχθη για να προσδιοριστεί η δέσμευση του HDACs και το καθεστώς ακετυλίωση της ιστόνης 3 για τους φορείς του παράγοντες που σχετίζονται με EMT συμπεριλαμβανομένων vimentin, ZEB1, Slug και ΜΜΡ2 στα κύτταρα PC3 αντιμετωπίζονται με TSA και SAHA για 16 ώρες με τη χρήση HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6 και Ac-Η3 αντίσωμα (*, p & lt? 0,05? **, p & lt ? 0,01). (Β) και (C) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TSA και SAHA, και επακόλουθη ανάλυση κηλίδος Western έδειξε ότι η έκφραση του HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4 και HDAC6 δεν άλλαξε στα 16 θεραπεία h με TSA ή SAHA. (C: DMSO ελέγχου? T: TSA? S: SAHA).

Η

HDACIs αυξημένη έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων και μεσεγχυματικά Μαρκαδόροι

μεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται με EMT παίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης των δεικτών των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών. PC3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με TSA σημαντικά επάνω ρυθμισμένη έκφραση mRNA του ZEB1, ZEB2, Slug, Twist και snail1 μετά από 24 ώρες θεραπείας (Εικ. 2Α), οι οποίες συνδέονται με την αυξημένη έκφραση του Ν-καδερίνης και βιμεντίνη. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα με φαινότυπο EMT αποκτούν αυξημένη κινητικότητα κυττάρου, και βρήκαμε ότι η θεραπεία TSA οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του ΜΜΡ2 (Εικ. 2Α), η οποία συνδέεται με αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Για να επιβεβαιώσετε εάν η λειτουργία HDACIs ως επαγωγείς της EMT, επιλέγουμε ένα άλλο HDACi, SAHA, το οποίο έχει εγκριθεί από το FDA για την κλινική χρησιμότητα της. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία SAHA οδήγησε επίσης στην απόκτηση της EMT φαινότυπο σύμφωνο με αυξημένη έκφραση δείκτη EMT (Εικ. 2Β). κύτταρα PC3 είναι ανδρογόνων υποδοχέων (AR) αρνητική κυτταρική σειρά του προστάτη. Προκειμένου να εκτιμηθεί κατά πόσον HDACIs μπορούσε επίσης να επάγει EMT στο AR θετικά κύτταρα προστάτη (όπως κύτταρα LNCaP), υποβάλλαμε σε αγωγή τα κύτταρα LNCaP με SAHA και βρήκαμε αυξημένη έκφραση ZEB1 και Slug mRNA ήδη 8 ώρες της θεραπείας και ήταν περαιτέρω αυξήθηκε μετά από 16 ώρες της θεραπείας. Η έκφραση ήταν ελαφρά μειωμένη αλλά και πάλι ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα που έλαβε αγωγή 400 ηΜ TSA σύγκριση με τον έλεγχο (σχ. 3Α, άνω πίνακας). Η έκφραση του mRNA βιμεντίνης ήταν επίσης αυξημένη μετά από 16 ώρες αγωγής και παρατεταμένης υψηλό επίπεδο στις 24 ώρες, η οποία ήταν σύμφωνη με αυξημένο επίπεδο πρωτεΐνης μετά από 24 ώρες αγωγή με TSA (Σχ. 3Β). Ωστόσο, τα επίπεδα Ν-cadherin mRNA αυξήθηκαν συντομότερο θεραπεία 8 ώρες. Για να καθοριστεί εάν μεταβάλλεται η έκφραση του mRNA σχετίζεται με την κατάσταση της χρωματίνης ακετυλίωση, εξετάσαμε τα επίπεδα του ακετυλιωμένης ιστόνης 3 (Ac-Η3) σε κύτταρα κατεργασμένα με 400 ηΜ TSA. LNCaP κύτταρα κατεργασμένα με TSA έδειξαν σημαντικά αυξημένη Ac-Η3 εντός 8 h της θεραπείας, αλλά μειώθηκε ελαφρά μετά από 16 ώρες (Σχ. 3Β), η οποία είναι συνεπής με την έκφραση του ZEB1 και Slug, ενώ αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης του vimetin και φιμπρονεκτίνη παρατηρήθηκε μετά από 24 ώρες αγωγής (Σχ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ZEB1 και Slug εμπλέκονται στη ρύθμιση της vimetin και ινονεκτίνη. Σε αντίθεση, PC3 κύτταρα κατεργασμένα με TSA εμφανίζονται υψηλά επίπεδα Ac-Η3 από 4 h σε θεραπεία ταυτόχρονη 32 ώρες με αυξημένη έκφραση του ZEB1, ενώ αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης βιμεντίνης παρατηρήθηκε μετά από 16 ώρες αγωγή με TSA (Σχ. 3C). παρατηρήθηκαν επίσης σε SAHA Παρόμοια αποτελέσματα αντιμετωπίζονται LNCaP και PC3 κυττάρων (Σχ. 4Α, Β και C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι HDACIs είναι ισχυροί επαγωγείς της ΕΜΤ λόγω αλλαγμένη κατάσταση ακετυλίωση, συνεπής με αυξημένη έκφραση των δεικτών EMT.

Πρόσληψη HDACs από διαφορετικούς παράγοντες οδηγεί σε αποακετυλίωση ιστόνης, που οδηγεί σε γονίδιο σιωπή συμπεριλαμβανομένης της σίγηση της EMT που σχετίζονται με τα γονίδια. Χορήγηση HDACIs επάγουν ακετυλίωση των ιστονών, η οποία θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την έκφραση του γονιδίου μεσεγχυματικά που σχετίζονται, με αποτέλεσμα την απόκτηση της EMT.

Η

HDACIs επαγόμενη έκφραση του Μαρκαδόροι βλαστικών κυττάρων και την αυξημένη κυτταρική κινητικότητα

Τα αποτελέσματα από την ανάλυση κηλίδος Western έδειξε ότι οι υψηλότερες δόσεις TSA (400 nm) και SAHA (5 μΜ) θα μπορούσαν να προωθήσουν την ακετυλίωση της ιστόνης και με αυτόν τον τρόπο ρυθμίζει την έκφραση των συγγενικών EMT παραγόντων (σχήμα 3Β και C:. Σχ. 4Β και C). Μία κινητική μελέτη δόσεων έδειξαν ότι τόσο λίγο όσο 0.1 μΜ TSA ή SAHA θα μπορούσε να προκαλέσει ακετυλίωση της ιστόνης 3 (αυξημένη Ac-Η3) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα PC3, η οποία ήταν σύμφωνη με ενισχυμένη έκφραση του βιμεντίνη και Ν-καδερίνης (Εικ . 5Α). Ωστόσο, η έκφραση Ε-καδερίνης δεν άλλαξε σημαντικά. Τα κύτταρα με φαινότυπο EMT έχει αποδειχθεί ότι είναι η πηγή του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν CSLCs) [10], [11], [16]. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, PC3 PDGF-D κύτταρα με χαρακτηριστικά EMT υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TSA σε χαμηλότερη δόση κυμαίνεται από 50 nM έως 200 nm. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι η επεξεργασία των κυττάρων με TSA οδήγησε σε αυξημένη έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων όπως Sox2 και Nanog κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο (Σχ. 5Β). Αν και τα κύτταρα PC3 PDGF-D εμφανίζεται υψηλά επίπεδα βιμεντίνης, η έκφραση του βιμεντίνης αυξήθηκε περαιτέρω σε TSA επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 5Β). Κύτταρα με EMT ή /και CSLC υπογραφές έδειξαν αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων. Κυττάρων απόσπαση από την πρωτογενή θέση αποτελεί προϋπόθεση για την κυτταρική μετανάστευση, και έχει ενδιαφέρον, TSA ή θεραπεία SAHA προωθούνται σημαντικά αποκόλληση των PC3 κυττάρων από την επιφάνεια πλάκα καλλιέργειας (Σχ. 5C), η οποία ήταν σύμφωνη με αυξημένη τάσεις της κυτταρικής μετανάστευσης (Εικ. 5D) .

Hyper-ακετυλίωση υποψήφιοι από HDACIs ήταν υπεύθυνος για τον κανονισμό της EMT συναφών παραγόντων

Τα επίπεδα ακετυλίωσης ιστόνης παίζουν κρίσιμο ρόλο στη χρωματίνη αναδιαμόρφωση οδηγεί στην ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής. Ακετυλίωση της λυσίνης στον ιστόνης ουρές σχετίζεται με την ενεργοποίηση του γονιδίου-μεταγραφή λόγω σε μια πιο χαλαρή χρωματίνη κατάσταση, η οποία προωθεί την προσβασιμότητα των συμπλόκων μεταγραφής με τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Προκειμένου να αξιολογηθεί κατά πόσο TSA και θεραπεία SAHA θα μπορούσαν να επηρεάσουν την κατάσταση των ακετυλίωση ιστονών σε 3 σχετικά με τους υποστηρικτές του που σχετίζονται με EMT παραγόντων, πραγματοποιήθηκε ανάλυση CHIP. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, η ποσότητα του Ac-Η3 σχετίζονται με την κεντρική υποκινητές της βιμεντίνης, ZEB2, Slug και ΜΜΡ2 αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα PC3 που έλαβαν θεραπεία με TSA και SAHA σε σύγκριση με DMSO επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι HDACIs που προκαλείται από υπερ-ακετυλίωση των ιστονών σε 3 για τους δικαιούχους της βιμεντίνης, ZEB2, Slug και ΜΜΡ2 είναι μηχανιστικά υπεύθυνη για ενισχυμένη έκφραση αυτών των παραγόντων. κατάσταση ακετυλίωση είναι εξαρτάται από την δραστηριότητα των HDACs και τα επίπεδα έκφρασής τους. Έτσι, τα επίπεδα του HDACs εξετάστηκαν σε κύτταρα κατεργασμένα με TSA ή SAHA με ανάλυση στυπώματος Western, και όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β και C, ούτε TSA ούτε SAHA θεραπεία για 16 ώρες έδειξε οποιαδήποτε αλλαγή στην έκφραση του HDACs. Ωστόσο, βρήκαμε ότι η ποσότητα του HDAC1 σχετίζεται με προαγωγέα βιμεντίνης και Slug ήταν υψηλότερη σε κύτταρα κατεργασμένα TSA σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, η ποσότητα του HDAC2 συνδέεται με τον υποκινητή του βιμεντίνη, ZEB1 και Slug ήταν υψηλότερη στις δύο TSA και SAHA κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 6Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι HDAC inhibiters να οδηγήσει σε υπερ-ακετυλίωση σε ιστόνης 3 σε υποκινητές γονιδίων από την καταστολή της δραστηριότητας, αλλά όχι μείωση του ποσού των HDAC με υποκινητή των γονιδίων-στόχων, όπως η βιμεντίνη, ZEB1, Slug και ΜΜΡ2, με αποτέλεσμα EMT υπογραφές στο κελί του καρκίνου του προστάτη γραμμές (Εικ. 7). Έτσι, υπερ-ακετυλίωση υποκινητών από HDACIs θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση συναφών EMT παράγοντες.

Συζήτηση

Οι αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACIs) έχει αποδειχθεί ότι είναι πολλά υποσχόμενη αντιδραστήρια για τη θεραπεία της ένας αριθμός αιματολογικών κακοηθειών περιλαμβανομένων των Τ-κυττάρων λεμφώματος δερματικών [27] – [29] και περιφερικό λέμφωμα Τ-κυττάρων σε κλινικές δοκιμές [30]. Ωστόσο, κλινικές δοκιμές με τις HDACIs σε συμπαγείς όγκους ήταν απογοητευτικά, η οποία είναι εν μέρει θα μπορούσε να οφείλεται στην απόκτηση αντίστασης σε HDACIs [3]. Επιπλέον, οι μηχανισμοί αντίστασης δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι HDACIs όπως TSA και SAHA θα μπορούσε να επάγει επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) φαινότυπο και απέκτησε καρκινικά βλαστικά-όπως κυττάρων (CSLC) χαρακτηριστικά, τα οποία είναι γνωστό ότι συμβάλλουν στη ανθεκτικών στα φάρμακα, ο καρκίνος υποτροπής και μετάσταση [16], [17]. Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με τα ευρήματα που δείχνουν ότι η θεραπεία TSA οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του vementin, η οποία διαμεσολαβείται μέσω της προώθησης ακετυλίωση της περιοχής εγγύς υποκινητή του γονιδίου βιμεντίνης μέσω ανακούφιση του συμπλόκου καταστολή συμπεριλαμβανομένων ZBP-89 και HDAC1 [31]. Η αναστολή της έκφρασης βιμεντίνης έχει δειχθεί να αλλάξει μορφολογία των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη που οδηγεί σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[32], και έτσι η αυξημένη έκφραση του βιμεντίνης αναμένεται να έχει επιθετική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων, όπως υποστηρίζεται από τα αποτελέσματα μας παρουσιάζονται