Τα κύτταρα

Αφηρημένο

πλευρά του Καρκίνου του πληθυσμού (SP), τα οποία συχνά αναφέρονται ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα, πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για τον καρκίνο του πνεύμονα αντίσταση χημειοθεραπεία, και επί του παρόντος δεν υπάρχει φάρμακο μπορεί να στοχεύουν ειδικά αυτά τα κύτταρα. Υποθέτουμε ηπαρίνη χαμηλού μοριακού βάρους (LMWH) ενδέχεται να επηρεάσουν τις βιολογικές ιδιότητες των κυττάρων SP και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να στοχεύσουν κλινικά αυτά τα κύτταρα. Για να ελεγχθεί αυτό, κύτταρα SP απομονώθηκαν από σισπλατίνη (DDP) ανθεκτικών αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα Α549 κύτταρα /DDP με κυτταρομετρία ροής διαλογής. Σε σύγκριση με κύτταρα μη-SP, SP κύτταρα σχηματίστηκε αυξημένους αριθμούς αποικιών

in vitro

, και είχε ένα 1000-πλάσια αύξηση στην ογκογονικότητας

in vivo

. δοκιμασίες πολλαπλασιασμό και την απόπτωση καταδεικνύεται LMWH δεν είχε σημαντική επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού του πνεύμονα SP ή απόπτωση. Ωστόσο, LMWH μειωμένη πνευμονική SP ικανότητα αποικία κυττάρων σχηματισμού και πρωτεΐνη έκφραση του μεταφορέα πολλαπλών φαρμάκων, ABCG2, με FACS και αναλύσεις στυπωμάτων western χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα του mRNA με RT-PCR. Σταθερά, χρώσεις ανοσοϊστοχημείας του ABCG2 σε ιστούς όγκων LMWH αγωγή ήταν σημαντικά μειωμένες σε σύγκριση με εκείνες των ελέγχων. Περαιτέρω, βρήκαμε αναστολέας του πρωτεασώματος MG132, αλλά δεν λυσοσωμική αναστολείς λευπεπτίνη και πεπστατίνη Α, θα μπορούσε να αποκαταστήσει τα επίπεδα της πρωτεΐνης ABCG2 στα κύτταρα SP LMWH-θεραπεία. Αυτά δείχνουν LMWH αφαιρεί πνεύμονα SP χημειοαντίσταση κυττάρων από πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης ABCG2 χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα του mRNA. Έχουμε καθορίζεται επίσης χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη σε συνδυασμό με σισπλατίνη θα μπορούσε να ξεπεράσει σισπλατίνη αντίσταση και προκαλείται από κύτταρα του πνεύμονα SP απόπτωση τόσο

in vitro

και

in vivo

. Αυτή η μελέτη παρέχει μια πειραματική βάση για τη χρήση ενός συνδυασμού ηπαρίνης χαμηλού μοριακού βάρους, που στοχεύει τα κύτταρα SP πνεύμονα, με τη χημειοθεραπεία για τη βελτίωση της επιβίωσης του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Niu Q, Γουάνγκ W, Li Υ, Ruden DM, Wang F, Li Υ, et al. (2012) χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη αφαιρεί τον Καρκίνο του Πνεύμονα Cisplatin-Αντίσταση επάγοντας πρωτεασώματος διαμεσολαβείται Υποβάθμιση ABCG2 πρωτεΐνη. PLoS ONE 7 (7): e41035. doi: 10.1371 /journal.pone.0041035

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: 12 Μαρτίου, 2012? Αποδεκτές: 17 του Ιουνίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούλ 2012

Copyright: © 2012 Niu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Επιστημονικής Έρευνας για το επιστρεφόμενο Overseas κινέζικα Υποτρόφων, η Κίνα μέλος του Υπουργείου Παιδείας (αρ 2007-1108) για να QN και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγούν ES012933 να DMR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Επί του παρόντος, τα ποσοστά επιβίωσης του καρκίνου του πνεύμονα είναι φτωχό, με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 15% [1].

Ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων (CSC) θεωρία αναφέρει ότι οι όγκοι οργανώνονται σε μια ιεραρχική τρόπο παρόμοιο με φυσιολογικούς ιστούς , με ένα υπο-πληθυσμό ογκογόνο στέλεχος-όπως τα κύτταρα που είναι στη χημειοθεραπεία και παράγουν τα διαφοροποιημένα κύτταρα του όγκου [2]. Side πληθυσμού (SP) κυττάρων με CSC-όπως ιδιότητες εντοπίστηκε για πρώτη φορά στη λευχαιμία και στη συνέχεια απομονώνονται από συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του εγκεφάλου, των πνευμόνων, του ήπατος, του προστάτη, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος, και κεφαλής και καρκίνους του αυχένα [3] – [9] . κύτταρα SP εκφράζουν υψηλά επίπεδα δέσμευσης ΑΤΡ κασέτας (ABC) πρωτεΐνες μεταφορέα πολλαπλών φαρμάκων τα οποία πιστεύεται ότι είναι η βάση της αντίστασης χημειοθεραπείας και αποτυχία της θεραπείας. Μαστού πρωτεΐνη αντίστασης καρκίνου (BRCP /ABCG2), ένα μέλος της ABC οικογένειας πρωτεϊνών, είναι ένας σημαντικός μεταφορέας ναρκωτικών που θεωρείται ότι διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην προστασία των κυττάρων SP από κυτταροτοξικών παραγόντων, όπως η σισπλατίνη, και συμμετέχει στην αντίσταση σε πολλά φάρμακα [10 ] – [12]

Παρά το γεγονός ότι πολλοί παράγοντες οι οποίοι στοχεύουν κύτταρα CSC έχουν ταυτοποιηθεί, αυτές οι πιθανές παράγοντες είναι μακριά από τη χρήση στην κλινική.. μόρια που στοχεύουν υποψήφιος CSC κυττάρων επηρεάζουν Wnt, EpCAM, σκαντζόχοιρος, και σηματοδότηση Delta /Notch, ενώ άλλες προσεγγίσεις, συμπεριλαμβανομένων των αντι-Delta-σαν 4 συνδέτη έχουν (DLL4) αντίσωμα, σαλινομυκίνη, η μετφορμίνη, TGFβ, σουλφοραφάνη, και άλλοι έχουν δοκιμαστεί για την τροποποίηση CSC ιδιότητες της ανθεκτικότητας στα φάρμακα [13] – [17]. Παρά το γεγονός ότι πολλοί από αυτούς τους παράγοντες φαίνεται πολλά υποσχόμενο, ιδιαίτερα

in vitro

, το μείζον πρόβλημα της συγκεκριμένης στόχευσης στα κύτταρα ΚΕΠ και αποφυγή

in vivo

τοξικότητα παραμένει.

χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη (LMWH), εγκρίθηκε από το FDA το 1998 για την αντιπηκτική θεραπεία και έχει χορηγείται με ασφάλεια για πάνω από 13 χρόνια [18]. Μελέτες έδειξαν ότι χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη θεραπεία μειωμένη θνησιμότητα από καρκίνο σε ασθενείς με βαθιά φλεβική θρόμβωση σε διάφορους καρκίνους, η οποία δεν έχει σχέση με τις διαφορές στα ποσοστά θανάτου θρομβοεμβολής [19] – [21]. Παρά το γεγονός ότι αρκετές κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η μείωση της θνησιμότητας LMWH και παρατεταμένη επιβίωση σε ασθενείς με προχωρημένους συμπαγείς κακοήθεια, ο μηχανισμός μέσω του οποίου LMWH ασκεί μια αντικαρκινική επίδραση παραμένει απροσδιόριστη [22] – [25].

Υποθέτουμε LMWH μπορεί να είναι είναι σε θέση να τροποποιήσει τις βιολογικές ιδιότητες των κυττάρων του πνεύμονα SP με CSC-όπως ιδιότητες. Επομένως, αυτή η μελέτη διερευνά εάν LMWH επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των πνευμόνων SP κυττάρου, απόπτωση, και χημειοαντίσταση καθώς και την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

και του οποίου ο μηχανισμός LMWH παίρνει αποτελέσματα. Οι μελέτες μας δείχνουν χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη θα μπορούσε να είναι ένα ασφαλές φάρμακο που στοχεύουν πνεύμονα SP κυττάρων τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν άμεσα στην κλινική για να ξεπεράσει την αντίσταση χημειοθεραπεία και βελτίωση της επιβίωσης του καρκίνου του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

Side Πληθυσμός Ταξινόμηση

η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με χρώση Hoechst33342 απέδειξαν ότι ένα SP 10% -17% των κυττάρων υπήρχε σε Α549 κύτταρα /DDP. Ως θετικός έλεγχος, οι αριθμοί των κυττάρων SP είχαν μειωθεί με την παρουσία του Verapamil, ένα φάρμακο που είναι γνωστό ότι αναστέλλουν την αντλία trasporter ABC υπεύθυνο για τον φαινότυπο πλευρά πληθυσμού. Η καθαρότητα των κυττάρων SP ήταν & gt? 95% (μέσος όρος 97%) και η καθαρότητα των κυττάρων μη-SP ήταν 95%. SP και μη-SP Α549 /DDP κύτταρα ταξινομήθηκαν χωριστά και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα (Σχήμα 1).

(Α) Α549 /κύτταρα επωάζονται με DDP Hoechst 33342, χωρίς βεραπαμίλη, και η εγκλωβιστούμε περιοχή δείχνει την SP για FACS. (Β) Α549 DDP κύτταρα /επωάζονται με Hoechst 33342 παρουσία βεραπαμίλη, ένας έλεγχος για να προσδιοριστεί η περιοχή SP επί FACS. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα του Α549 DDP αποικίες /σχηματίστηκε μετά από 10 ημέρες από την (C) κύτταρα SP και (D) κύτταρα μη-SP αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού και (Ε) κύτταρα SP (F) κύτταρα μη-SP που έλαβαν θεραπεία με LMWH, ράβδος κλίμακας = 50 μm. (G) Σύνδεση αποτελεσματικότητας σχηματισμού αποικίας (CFE) του SP και μη SP κύτταρα αναπτύσσονται σε μέσο απαλλαγμένο από ορό,

ρ

& lt? 0.05. (H) Όγκοι που σχηματίζονται μετά τον εμβολιασμό των διαφορετικών αριθμών Α549 /DDP πλευρά πληθυσμού (SP) και μη-SP κυττάρων σε NOD /SCID ποντίκια μετά από 14 ημέρες.

Η

LMWH Μειώνει SP Κυττάρου Σχηματισμού Αποικίας Ικανότητα

Η ικανότητα των SP και μη SP κύτταρα να σχηματίσουν αποικίες ελέγχθηκε

in vitro

. Οι αποικίες του δύο τύπους κυττάρων ήταν ορατές μετά από 10 ημέρες? Ωστόσο, ο αριθμός των αποικιών ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα SP συγκριτικά με κύτταρα μη-SP. Η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας Log10 (CFE) κυττάρων SP ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι τα κύτταρα μη-SP (1.544 ± 0.150 έναντι 0.301 ± 0.082,

ρ

& lt? 0,05, Εικόνα 1). LMWH μειωθεί σημαντικά CFE στα κύτταρα SP (1,544 ± 0,150 έναντι 0,812 ± 0,082,

σ

& lt? 0,05) σε σύγκριση με κύτταρα μη-SP (0,301 ± 0,082 έναντι 0,295 ± 0,053, p & gt? 0.05).

SP κύτταρα έχουν αυξηθεί κατά

in vivo

ογκογονικότητα

Το

in vivo

ογκογόνο δοκιμασία έδειξε ότι το 5 × 10

3 SP κύτταρα ήταν επαρκή για τον σχηματισμό όγκων

in vivo

, ενώ περισσότερα από 5 × 10

6 κύτταρα μη-SP ήταν αναγκαίες για την έναρξη των όγκων (Σχήμα 1). Οι όγκοι βρέθηκαν σε όλες τις έξι ποντικούς που έχουν εγχυθεί με 5 × 10

5 και 5 × 10

4 SP κύτταρα, αλλά κανένας όγκος δεν βρέθηκε σε ποντίκια που ενέθηκαν με τον ίδιο αριθμό κυττάρων μη-SP. Δεν παρατηρήθηκαν όγκοι όταν 1 × 10

6 κύτταρα μη-SP εμβολιάστηκαν. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι υπήρχε μεγαλύτερη από 1.000 φορές διαφορά στην ογκογενετικότητας μεταξύ SP και μη-SP κύτταρα.

χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη δεν επηρεάζει διάδοσης SP κυττάρων

Η επίδραση του χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SP ήταν προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. LMWH δεν είχε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SP σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SP (το ποσοστό αναστολής των κυττάρων SP LMWH που έλαβαν ήταν 3,11% ± 0,20%,

σ

& gt? 0.05, Σχήμα 2).

αννεξίνης V χρώση στα κύτταρα (Α) έλεγχος SP κύτταρα (Β) SP αγωγή με κύτταρα LMWH (C) SP αγωγή με σισπλατίνη και (D) SP κύτταρα επεξεργασμένα με LMWH συν σισπλατίνη. (Ε) Ποσοτικοποίηση των ποσοστών απόπτωσης στα Α549 /κύτταρα DDP SP προκαλείται από χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη και DDP. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε στον έλεγχο και LMWH-επεξεργασμένα κύτταρα SP. Απόπτωση που προκαλείται από LMWH συν DDP ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι DDP μόνο (

σ

& lt? 0,05). (F) Το ποσοστό αναστολής της LMWH επεξεργασμένα κύτταρα Α549 /DDP SP σε δοκιμασία ΜΤΤ. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο ποσοστό αναστολής του ελέγχου και της LMWH επεξεργασμένα κύτταρα SP.

Η

LMWH Αυξάνει Cisplatin (DDP) απόπτωση που επάγεται SP κύτταρα

Η επίδραση της LMWH στην απόπτωση κύτταρα SP αναλύθηκε με FACS. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό της απόπτωσης σε κύτταρα SP αντιμετωπίζονται χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη και τα κύτταρα SP ελέγχου (7,21% ± 0,81% έναντι 8,01% ± 0,91%,

σ

& gt? 0,05)? Ωστόσο, ο ρυθμός της απόπτωσης στην LMWH συν DDP κατεργασμένα κύτταρα SP (65,89% ± 5,98%) ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό, τι τα κύτταρα SP σε επεξεργασία με DDP μόνο (45,74% ± 4,12%,

ρ

& lt? 0,05) και κύτταρα ελέγχου SP (8,01% ± 0,91%,

σ

& lt? 0.05, Σχήμα 2).

χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη μειώνει την έκφραση της SP κυττάρων Surface δείκτης ABCG2

Α549 /DDP κύτταρα SP εκφράζουν ABCG2, CD243 (p-gp) και CD24 σε υψηλά επίπεδα. Μετά την επώαση με LMWH για 36 ώρες, η έκφραση πρωτεΐνης ABCG2 μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα SP: ABCG2 κύτταρα που εκφράζουν μειώθηκε από 42,25% ± 4,11% έως 9,92% ± 4,08%, (

ρ

& lt? 0,05, Εικόνα 3) . Καμία σημαντική μεταβολή δεν παρατηρήθηκε στην έκφραση της Ρ-§ρ και Oct-4 μετά από επώαση με LMWH (Σχήμα 3).

(Α) Εκφραση του ABCG2 (CD338) σε κύτταρα SP ελέγχου και (Β) που προκαλείται από LMWH σε Α549 κύτταρα /DDP SP. (Γ) έκφραση του ABCG2 (CD338) σε ελέγχους καρκινικά κύτταρα και (D) που προκαλείται από LMWH σε Α549 κύτταρα ξενομοσχεύματος όγκου /DDP SP. (Ε) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης της έκφρασης δείκτη CSC που προκαλείται από LMWH σε κύτταρα SP και κυττάρων ξενομοσχεύματος όγκου. LMWH μειωτικά σημαντικά την έκφραση του ABCG2 με FACS (

ρ

& lt? 0,05).

Η

FACS Ανάλυση ABCG2 Έκφραση σε Κύτταρα Όγκου

κύτταρα που λαμβάνονται από τον όγκο ξενομόσχευμα ιστούς εξέφρασε ABCG2, CD243 (p-gp) και CD24. Η έκφραση της πρωτεΐνης του ABCG2 σε ιστούς όγκων των ποντικών που έλαβαν LMWH ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες στα ποντίκια ελέγχου (30,38% ± 2,13% έναντι 20,22% ± 2,01%,

ρ

& lt? 0,05, Σχήμα 3). Καμία σημαντική μεταβολή δεν παρατηρήθηκε στην έκφραση της Ρ-§ρ και Oct-4 μετά από επώαση με LMWH (Σχήμα 3).

LMWH δεν επηρεάζουν την έκφραση mRNA σε ABCG2 SP Κύτταρα και καρκινικών κυττάρων με RT-PCR

για να καθοριστεί εάν LMWH affets έκφραση ABCG2 σε επίπεδο mRNA, πραγματοποιήσαμε ανάλυση qRT-PCR των κυττάρων SP θεραπεία με χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη για 16 ώρες και τα καρκινικά κύτταρα από ποντίκια LMWH επεξεργασία και έλεγχο. Καμία σημαντική αλλαγή βρέθηκε σε επίπεδο ABCG2 mRNA μετά από αγωγή LMWH (Σχήμα 4). Έτσι, LMWH επηρεάζει απίθανο έκφραση ABCG2 στο επίπεδο του mRNA της.

(Α) ABCG2 αλλαγές έκφρασης mRNA σε καρκινικά κύτταρα αντιμετωπίζονται χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη και τα κύτταρα SP αντιμετωπίζονται LMWH. Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR δείχνει ότι οι εκφράσεις του ABCG2 mRNA δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά σε καρκινικά κύτταρα αντιμετωπίζονται χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη ή τα κύτταρα SP αγωγή LMWH σε σύγκριση με εκείνους στους ελέγχους (

σ

& gt? 0,05). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά. (Β) Ανάλυση στυπώματος Western των εκφράσεων ABCG2 σε κύτταρα SP σε επεξεργασία με LMWH, LMWH + MG123, LMWH + πεπστατίνη Α + λευπεπτίνη και ελέγχου. κύτταρα SP έλαβαν αρχικά θεραπεία με LMWH ή έλεγχο για 10 ώρες, και στη συνέχεια, MG132 (10 μΜ), πεπστατίνη Α + λευπεπτίνη (κάθε 100 μg /ml), ή έλεγχος προστέθηκαν αντίστοιχα και επωάστηκαν για 6 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι πυκνότητες των πρωτεϊνικών ABCG2 ζώνες σε αποτύπωμα western ποσοτικοποιήθηκαν με το πρόγραμμα Quantity One-4.6.2. (C) εκφράσεις ABCG2 σε ιστούς όγκων LMWH θεραπεία και τον έλεγχο (IHC, SP × 200). Ο μέσος όρος SI έκφρασης ABCG2 σε ιστούς όγκων αγωγή LMWH ήταν 3,63 σε σύγκριση με το μέσο όρο της βαθμολογίας SI από 9,13 σε ιστούς όγκων ελέγχου (3.63 ± 1.69 έναντι 9.13 ± 2.03,

σ

& lt? 0,05).

ABCG2 έκφρασης της πρωτεΐνης μπορεί να αποκατασταθεί με την πρωτεασώματος Αναστολέας MG132 σε LMWH επεξεργασμένο SP κύτταρα

από τη στιγμή που δεν βρήκε σημαντική μεταβολή των επιπέδων ABCG2 mRNA σε SP και καρκινικά κύτταρα, ελέγξαμε αν LMWH προκαλούμενη μείωση ABCG2 προκαλείται από ουμπικουϊτίνη μεσολάβηση πρωτόλυσης ή από το λυσόσωμα. Για να δοκιμάσετε αυτό, τα κύτταρα SP υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη, χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη + MG132 και LMWH + πεπστατίνη Α + λευπεπτίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα. 4, η έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα ABCG2 SP αγωγή LMWH ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την εν λόγω θεραπεία στον έλεγχο μετά από 16 ώρες. Η μείωση θα μπορούσε να αποκατασταθεί με αγωγή MG132 αναστολέας του πρωτεασώματος while λυσοσωμικών αναστολέων pepstatin ένα συν λευπεπτίνη δεν είχε καμία επίδραση. Αυτά δείχνουν ότι η προκαλούμενη LMWH πρωτεϊνικής αποδόμησης ABCG2 μέσω του μονοπατιού πρωτεασώματος.

LMWH Θεραπεία Μειώνει ABCG2 Πρωτεΐνη Εκφραση σε όγκων ιστού με ανοσοϊστοχημεία

έκφραση ABCG2 ήταν παρούσα σε διαφορετικές εντάσεις και διαφορετικές κατανομές των κυττάρων με χρώση ανοσοϊστοχημείας . Σημαντικά χαμηλό επίπεδο έκφρασης του ABCG2 παρατηρήθηκε σε ιστούς όγκων αγωγή LMWH σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Σύμφωνα με τα κριτήρια σταδιοποίηση της έντασης κηλίδας (SI), τη μέση βαθμολογία SI έκφρασης ABCG2 σε ιστούς όγκων αγωγή LMWH ήταν 3,63 σε σύγκριση με το μέσο όρο της βαθμολογίας SI από 9,13 σε ιστούς όγκων ελέγχου (3.63 ± 1.69 έναντι 9.13 ± 2.03,

p

& lt?. 0.05, Σχήμα 4)

η σισπλατίνη ξενομοσχεύματος ανάπτυξης Καθυστέρηση αυξάνεται κατά LMWH

Διοίκηση της LWMH συν DDP να Α549 /DDP ποντίκια που φέρουν όγκο οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με DDP μόνο (0,17 ± 0,05 εκατοστά

3 vs 0,29 ± 0,06 εκατοστά

3

σ

& lt? 0,05) ή ποντίκια ελέγχου (0.44 ± 0,09 εκατοστά

3

σ

& lt? 0,05) μετά από 30 ημέρες. Σε Α549 /DDP φέρουν όγκο γυμνά ποντίκια, οι διαφορές στις LMWH σε συνδυασμό με σισπλατίνη και σισπλατίνη αντιμετωπίζονται οι όγκοι ήταν σημαντική μετά από 25 ημέρες (0,17 ± 0,03 εκατοστά

3 vs 0,24 ± 0,08 εκατοστά

3

p

& lt? 0,05) και μέσα σε 23 ημέρες σε ζώα μάρτυρες (0,16 ± 0,09 εκατοστά

3 vs 0,27 ± 0,09 εκατοστά

3

σ

& lt? 0.05, Σχήμα 5). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο μέγεθος του όγκου των ομάδων LMWH και DDP βρέθηκε από την ημέρα 8-30 (Σχήμα 5).

Α549 κύτταρα /DDP SP εμβολιάσθηκαν σε ποντικούς Balb /C γυμνούς ποντικούς και οι όγκοι των όγκων καταγράφηκαν αρχίζοντας ημέρες 1 της θεραπείας με έλεγχο φυσιολογικού ορού, χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη, DDP και DPP συν LWMH. Οι διαφορές του μεγέθους του όγκου σε χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη σε συνδυασμό με σισπλατίνη και σισπλατίνη αντιμετωπίζονται οι όγκοι ήταν σημαντική μετά από 25 ημέρες (0,17 ± 0,03 εκατοστά

3 vs 0,24 ± 0,08 εκατοστά

3

σ

& lt? 0,05) και μέσα σε 23 ημέρες σε ζώα μάρτυρες (0,16 ± 0,09 εκατοστά

3 vs 0,27 ± 0,09 εκατοστά

3

σ

& lt? 0,05). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο μέγεθος του όγκου των ομάδων χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη και DDP βρέθηκε από την ημέρα 8-30.

Η

Συζήτηση

Η απομόνωση των κυττάρων του πνεύμονα SP με CSC-όπως ιδιότητες και προσδιορισμός των υφιστάμενων φάρμακα που τροποποιούν τα κύτταρα του πνεύμονα SP και να ξεπεράσουν χημειοαντίσταση τους μπορούν να παρέχουν καινοτόμες στρατηγικές για τη βελτίωση της κλινικής έκβασης στον καρκίνο του πνεύμονα. Αποδείξαμε ότι τα κύτταρα SP από Α549 DDP κύτταρα αδενοκαρκινώματος /σισπλατίνη ανθεκτικά ανθρώπινου πνεύμονα είναι εμπλουτισμένα σε CSC-όπως ιδιότητες, καθώς έχουν αυξηθεί σημαντικά το σχηματισμό αποικιών

in vitro

και ογκογενετικότητας

in vivo

, αναφέροντας ότι τα κύτταρα Α549 /DPP SP παρέχει ένα καλό μοντέλο για τη μελέτη των κυττάρων SP πνεύμονα και ένα νέο σύστημα για τη μελέτη χημειοαντίσταση.

η μελέτη μας δείχνει ότι LMWH δεν σκοτώνει άμεσα κύτταρα SP πνεύμονα ή επάγουν SP κυτταρική απόπτωση

στο vitro

. Ωστόσο, LMWH ευαισθητοποιεί σισπλατίνη-ανθεκτικά κύτταρα SP με σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται

in vitro

.

In vivo

πειράματα δείχνουν ότι η χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη σε συνδυασμό με σισπλατίνη αναστέλλει σημαντικά σισπλατίνη ανθεκτική ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου. Περαιτέρω μελέτες δείχνουν ότι LMWH μειώνει σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης ABCG2, με FACS και αναλύσεις western blot. Yoh διαπίστωσε ότι η έκφραση του ABCG2, αλλά όχι PGP, MRP1, MRP2 και MRP3, ήταν ένας προγνωστικός παράγοντας κακής κλινικής έκβασης ασθενών με προχωρημένο NSCLC, ακόμη και αν ο ρόλος της ABCG2 ως μεταφορέας των συζυγών πλατίνα είναι ακόμα αμφιλεγόμενη [12]. Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με τις διαπιστώσεις του και όλα αυτά δείχνουν σαφώς ABCG2 είναι ένας μεταφορέας φάρμακο που παίζει σημαντικό ρόλο στην σισπλατίνη αντίσταση στα κύτταρα SP. Ανοσοϊστοχημεία αναλύσεις έδειξαν ότι με συνέπεια LMWH μειώνει σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης ABCG2 σε ιστούς όγκων LMWH αγωγή σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Όλα αυτά δείχνουν ότι η χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη μπορεί να αποτρέψει χημειοαντίσταση των κυττάρων SP μειώνοντας την έκφραση της πρωτεΐνης ABCG2 χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα του mRNA.

Περαιτέρω μελέτες αποκαλύπτουν ότι η μείωση της πρωτεΐνης ABCG2 στα κύτταρα SP οφειλόταν σε αποικοδόμηση προκαλούμενη από LMWH μέσω της ουβικουιτίνης μονοπάτι πρωτεασώματος γιατί πρωτεασώματος αναστολέα-MG132, αλλά δεν λυσοσωμική αναστολείς λευπεπτίνη και πεπστατίνη Α, αποκαθιστά την έκφραση της πρωτεΐνης ABCG2 στα κύτταρα SP LMWH-θεραπεία. Υποθέτουμε ότι LMWH μπορεί να δεσμεύονται να ABCG2 σε κυτταρικές μεμβράνες SP και επάγουν ubiquitinization και αποδόμησης, η οποία μειώνει χημειοαντίσταση των κυττάρων του πνεύμονα SP.

LMWH είναι ένα ασφαλές αντιπηκτικό παράγοντα που χρησιμοποιείται στην θρομβωτικό και μη-πηκτικού συνθήκες, η οποία έχει που χρησιμοποιείται στη θεραπεία του καρκίνου για περισσότερο από μια δεκαετία [18]. Η αναδρομική δεδομένα δείχνουν ότι θα μπορούσε να βελτιώσει την επιβίωση σε ορισμένους ασθενείς με καρκίνο, αλλά ο ακριβής μηχανισμός παραμένει ασαφής [26]. Πειραματικά μοντέλα προτείνουν LMWH είναι ικανή να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, μετάσταση, η αγγειογένεση, ο σχηματισμός μήτρας και αντίστροφη αντοχής πολυφαρμάκου [27] – [31]. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι οι χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη και μόνο θα μπορούσε να μειώσει ελαφρώς την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

έστω και αν δεν θα μπορούσε να επάγει απόπτωση καρκινικών κυττάρων απευθείας

in vitro

. Ο λόγος θα μπορούσε να είναι ότι η χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη ασκεί ανασταλτική όγκου δράση του μέσω παρεμβολής με καρκινικών κυττάρων προσκόλληση, εισβολή, την αγγειογένεση, ή microenvironement [32], [33].

Για τις γνώσεις μας, η μελέτη αυτή είναι η πρώτη έκθεση που LMWH μπορεί να αποτρέψει χημειοαντίσταση των κυττάρων του πνεύμονα SP μειώνοντας ABCG2 εκφράσεις πρωτεϊνών μέσω του πρωτεασώματος εξαρτώμενη από την υποβάθμιση. Η ικανότητα των LMWH να ευαισθητοποιήσει κύτταρα SP στη χημειοθεραπεία με την πρόκληση της υποβάθμισης ABCG2 μέσω του μονοπατιού πρωτεασώματος μπορεί να παρέχει μια εξήγηση για το άγνωστο μηχανισμό με τον οποίο LMWH βελτιώνει την απόκριση χημειοθεραπεία και την επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο [28], [34].

Εν κατακλείδι, οι μελέτες μας δείχνουν ότι η χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη μειώνει πνεύμονα χημειοαντίσταση καρκίνου μέσω επαγωγής αποικοδόμησης των πρωτεϊνών ABCG2 μέσω του μονοπατιού πρωτεασώματος. Ο συνδυασμός του χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη με σισπλατίνη θα μπορούσαν να στοχεύουν τόσο στη χημειοθεραπεία κύτταρα του πνεύμονα SP και χημειοευαίσθητων καρκινικά κύτταρα μη-SP, παρέχοντας ένα αποτελεσματικό νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Όπως LMWH μπορεί να χρησιμοποιηθεί ανεξάρτητα από hypercoagulant συνθήκες και τα αποτελέσματα είναι πλευρικά καλά ανεκτή, η κλινική εφαρμογή των LMWH στον καρκίνο του πνεύμονα έχει μεγάλες δυνατότητες. Σαφώς, απαιτούνται περαιτέρω κλινικές μελέτες του χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία σε καρκίνο του πνεύμονα που χρειάζονται, και θα αξίζει τον κόπο να διερευνηθεί κατά πόσον LMWH μπορεί να τροποποιήσει τα κύτταρα SP από άλλους τύπους καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cancer Cell Culture και Αντιδραστήρια

Η σισπλατίνη ανθεκτική ανθρώπινου πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος /DDP ελήφθη από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) και συνήθως καλλιεργούνται σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% ανθρώπινο ΑΒ ορό και 2 σισπλατίνη μmol (Qilu Pharmaceutical Co, Ltd, Shandong, Κίνα). Α549 κύτταρα /DDP καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI χωρίς σισπλατίνης για 3 ημέρες πριν να χρησιμοποιηθούν σε πειράματα. Λευπεπτίνη, πεπστατίνη Α, και MG132 αγοράστηκαν από Sigma (St Louis, MO, USA).

Side Πληθυσμός Διαλογής και Ανάλυση

Α549 /κύτταρα DDP ανεστάλησαν σε 1 × 10

6 κύτταρα /ml σε PBS που περιείχε 4% FBS, επωάζονται στους 37 ° C για 60 λεπτά με 5 μg /ml Hoechst 33342 (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) είτε μόνο του ή σε παρουσία 500 μmol βεραπαμίλη (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA). Μετά την επώαση, 1 μg ml ιωδιούχου προπιδίου /προστέθηκε και στη συνέχεια το αιώρημα διηθήθηκε μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 40 μm (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) για να ληφθεί ένα εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Ροή cytometery ανάλυση και διαλογή διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας FACS Vantage SE (BD Bioscience). Hoechst 33342 ήταν ενθουσιασμένος με το λέιζερ UV στα 350 nm και η εκπομπή φθορισμού μετρήθηκε με 405 /BP30 (Hoechst μπλε) και 570 /BP20 (Hoechst κόκκινο) οπτικά φίλτρα. Η καθαρότητα των κυττάρων SP και κυττάρων μη-SP ελέγχθηκε και πάλι με τη χρήση FACS. Μετά διαλογή FACS, έχουν SP και μη-SP Α549 /DDP κύτταρα διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI, και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα εντός 2 ωρών.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας ήταν για την εκτίμηση της κλωνογονική ικανότητα των SP και μη-SP κύτταρα. Μετά τη διαλογή, 100 SP ή 100 κύτταρα μη-SP Α549 /DDP απλώθηκαν σε RPMI 1640/10% επί 6 φρεατίων εις τριπλούν. Το μέσο αλλάχθηκε δύο φορές την εβδομάδα και μετά από 10 ημέρες, ο αριθμός των αποικιών σε κάθε φρεάτιο προσδιορίσθηκε υπό ένα μικροσκόπιο και αντιπροσωπευτικά πεδία φωτογραφήθηκαν. υπολογίστηκε τοις εκατό σχηματισμού αποικιών απόδοση (% CFE) ως = (αριθμός των αποικιών που λαμβάνονται /Αριθμός καλλιεργημένα κύτταρα) × 100 και οι μετατραπεί τιμές log υπολογίστηκαν [35], [36].

Σε vivo

ογκογονικότητα Πείραμα

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν με την έγκριση της Επιτροπής Θεσμικών Animal Care και τη χρήση του 304 PLA Νοσοκομείο Ινστιτούτο Βιολογικών Επιστημών. Είκοσι τέσσερις πέντε εβδομάδων μη-παχύσαρκους διαβητικούς /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID) αρσενικά ποντίκια είχαν αγοραστεί από την Κινεζική Ένωση για Εργαστήριο Επιστήμης των Ζώων (CALAS? Πεκίνο, Κίνα) και στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων, με ελεγχόμενο θερμοκρασία και υγρασία περιβάλλοντος με 12 h φως σκοτάδι κύκλους /. Ποντικοί έλαβαν υποδόρια ένεση στη μία πλευρά με 5 × 10

5, 1 × 10

5, 5 × 10

4 ή 5 × 10

3 SP κύτταρα ή 1 × 10

7, 5 × 10

6, 5 × 10

5 ή 5 × 10

4 κύτταρα μη-SP 100 αναστολές μl και την ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε. 0,3 mg /ml 0,20 LMWH εγχύθηκε υποδορίως σε ομάδα θεραπείας LMWH την ημέρα -1. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 60 ή όταν οι όγκοι έφθασαν ένα μέγιστο όγκο 1.000 mm

3. Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε με τη χρήση (πλάτος

2 χ μήκος) /2. Πλάσια διαφορά σε ογκογονικότητας υπολογίστηκε ως ελάχιστος αριθμός των μη SP κυττάρων που απαιτούνται για τη δημιουργία ενός όγκου /ελάχιστο αριθμό SP κυττάρων που απαιτούνται για την παραγωγή ενός όγκου.

ΜΤΤ Δοκιμασία

Α549 /DDP SP ταξινομημένο κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 7.5 × 10

3 ανά φρεάτιο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 5 IU /ml LMWH (χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη ασβέστιο? Bopuqin, Tianjing Chase Sun Pharmaceutical Co, Ltd, Tianjing, Κίνα) εις τριπλούν. Τρία φρεάτια που περιέχουν κύτταρα όγκου εναιωρούνται σε πλήρες μέσο χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες για την κυτταρική βιωσιμότητα και τριών φρεάτια που περιέχουν μόνο πλήρες μέσο χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για μη ειδική μείωση χρωστικής. Μετά από 48 ώρες, το διάλυμα χρωστικής ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες, το προϊόν φορμαζάνης διαλύθηκε με προσθήκη 100 μΐ DMSO σε κάθε φρεάτιο και η απορρόφηση (Α) αναγνώστηκαν στα 570 nm χρησιμοποιώντας μία ELISA αναγνώστης (Anthos 2020, Salzbrug, Αυστραλία) Το ποσοστό αναστολής (%) υπολογίστηκε ως 100% (τιμές Μία ομάδα ελέγχου πειραματικές τιμές ομάδα Α) × /τιμές Μία ομάδα ελέγχου.

Δοκιμασία απόπτωση και SP κυττάρων Marker Ανάλυση έκφρασης

Α549 /κύτταρα DDP SP (1 × 10

6/96 πλάκα φρεάτιο) χωρίς αγωγή (έλεγχος), ή σε επεξεργασία με 5 IU /ml LMWH, LMWH συν 2,2 μg /ml σισπλατίνης (DDP ), ή DDP μόνος επί 36 ώρες και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ αννεξίνης V-FITC ανίχνευσης απόπτωσης (BioVision, Mountain View, CA, USA) και αναλύθηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Bioscience). Για την ανάλυση κυτταρικό δείκτη SP, κύτταρα Α549 /DDP SP επωάστηκαν με LMWH για 36 ώρες, στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της P-gp (Abcam, το Χονγκ Κονγκ Science Park, New Εδάφη, Χονγκ Κονγκ), ABCG2 (Abcam, το Χονγκ Κονγκ Επιστημονικό Πάρκο, Νέα Εδάφη, Χονγκ Κονγκ), CD24 (Biolegend, Roselle Street, San Diego, CA, USA), και Oct-4 (Biolegend, Roselle Street, San Diego, CA, USA) σε συνδυασμό με FITC ή ΡΕ (Biolegend, San Diego, CA, USA) στη συγκέντρωση που συνιστάται από τον κατασκευαστή και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. δοκιμασία Απόπτωση και ανάλυση έκφρασης κυτταρικό δείκτη SP επαναλήφθηκαν 3 φορές.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Α549 /κυττάρων DDP SP της LMWH επεξεργασμένα ή μη επεξεργασμένα και καρκινικά κύτταρα συλλέγονται από LMWH αγωγή ή χωρίς θεραπεία ποντικούς αιωρήθηκαν σε 1 × 10

6 κύτταρα /ml σε 5 ml PBS ως δείγμα αντίστοιχα. Στη συνέχεια, η απομόνωση του ολικού RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου TriPure Απομόνωση (Roche Diagnostics GmbH. Γερμανία) ή RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Τα επίπεδα mRNA αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT- PCR χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA). Τα mRNAs ήταν μεταγραφεί αντίστροφα σε οϋΝΑ με τη χρησιμοποίηση ενός κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιείται σε πραγματικό χρόνο RT-PCR είναι: 5′-GGGTAATCCCCAGGCCTCTA-3 ‘(νοηματικό εκκινητή του γονιδίου της ανθρώπινης ABCG2), 5′-CCAGCTCTGTTCTGGATTCCA-3′ (αντινοηματικό εκκινητή του γονιδίου της ανθρώπινης ABCG2), 5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT- 3 ‘(νοηματικό εκκινητή του ανθρώπινου γονιδίου β-ακτίνης), και 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’ (αντινοηματικό εκκινητή του ανθρώπινου γονιδίου β-ακτίνης). Η αντίδραση διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες: ένας κύκλος στους 48 ° C για 45 λεπτά? 95 ° C για 2 λεπτά? 40 κύκλους στους 95 ° C για 30 s, 55 ° C για 1 λεπτό, και 68 ° C για 2 λεπτά. Κάθε ενίσχυση RT-PCR επαναλήφθηκε εις τριπλούν. Η αποτελεσματικότητα της PCR εξετάστηκε με διαδοχική αραίωση το cDNA εκμαγείο και τα δεδομένα της καμπύλης τήξης συλλέχθηκαν για να ελεγχθεί η ειδικότητα της PCR. Κάθε δείγμα έγινε εις τριπλούν cDNA και η αντίστοιχη δείγμα μη-RT mRNA συμπεριλήφθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Η β-ακτίνης εκκινητή συμπεριλήφθηκε σε κάθε πλάκα για να αποφευχθούν διακυμάνσεις δείγμα. Το επίπεδο του mRNA του κάθε δείγματος κανονικοποιήθηκε με εκείνο του mRNA β-ακτίνης. Σχετικό επίπεδο mRNA παρουσιάστηκε ως 2

– [(CT /ABCG2- Ct /β-ακτίνη) LMWH – (Ct /ABCG2- Ct /β-ακτίνης) ελέγχου]. Όλα τα δεδομένα εμφανίζονται ήταν ο μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Μελέτη ξενομοσχεύματος Ανάπτυξης Όγκου

Έξι εβδομάδων Αρσενικοί ενδογαμικοί Balb /C γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από το Institute of κινεζική ένωση για εργαστήριο Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής (CALAS). Α549 /DDP κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (5 × 10

6) υποδορίως εμβολιάσθηκαν σε πλευρό άνω αριστερό την ημέρα 1. Όταν οι διάμετροι των όγκων ήταν & gt? 5 mm και οι ποντικοί χωρίστηκαν σε ομάδες ελέγχου, DDP, και LMWH με ομάδες DDP (n = 10 το καθένα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ip ένεση 8 mg /kg DDP ή ίσο όγκο αλατούχου διαλύματος μία φορά την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. LMWH (0,3 mg /0,20 ml) ή αλατούχο διάλυμα χορηγήθηκε υποδορίως κάθε ημέρα από την ημέρα 8 έως την ημέρα 30. Ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε τρεις φορές την εβδομάδα όπως περιγράφηκε προηγουμένως και οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 30.

SP κυττάρων Marker Έκφραση σε Μοσχεύματα Tumor

δείγματα όγκων ήταν αποκόπηκαν από ποντικούς, ξεπλένονται, μηχανικά κιμά, και υπέστη πέψη για 4 ώρες στους 37 ° C σε επωαστή ανακίνησης με 0,1 μονάδες Wünsch /ml κολλαγενάση Ι (Roche Diagnostics) σε DMEM. Το προϊόν πέψης αναλύονται με χρήση βελόνας διαμετρήματος 18,5, κοσκινίζεται μέσω ενός 100 μm κύτταρο σουρωτήρι και προετοιμάστηκαν για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης δείκτη SP κύτταρο όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Western Blot

SP κύτταρα ήταν αρχικά σε επεξεργασία με LMWH ή έλεγχο για 10 ώρες, και στη συνέχεια, MG132 (10 μΜ), πεπστατίνη Α + λευπεπτίνη (κάθε 100 μg /ml), ή έλεγχος προστέθηκαν αντίστοιχα και επωάστηκαν για 6 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος western. επώαση πρωτογενές αντίσωμα διεξήχθη στους 4 ° C για 16 ώρες με αντι-ABCG2 αντίσωμα ποντικού (Biolegend, San Diego, CA, USA) σε αραίωση σε 1:300 σε 3% αλβουμίνη βόειου ορού, ακολουθούμενη από επώαση με συζευγμένο με horseradishperoxidase άλογο αντι-ποντικού δευτερογενές αντίσωμα, και αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Αντι-β-ακτίνης αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

Η ανοσοϊστοχημεία χρώση των ABCG2 σε όγκων ιστών

Οι ιστοί σε παραφίνη ενσωματωμένο ήταν κομμένο σε 4 μm διαφάνειες και ψήθηκε στους 60 ° C για 60 λεπτά. Οι τομές-παραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν. Στη συνέχεια, οι τομές βυθισμένος σε ΕϋΤΑ ρυθμιστικό αντιγονική ανάκτηση σε μια χύτρα ταχύτητας για 10 λεπτά και στη συνέχεια ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε μεθανόλη για να αποσβεστεί η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης, που ακολουθείται από επώαση με φυσιολογικό ορό για να εμποδίσει μη ειδική σύνδεση. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν με καθαρισμένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ABCG2 (Abcam, το Χονγκ Κονγκ Science Park, New Εδάφη, Χονγκ Κονγκ, Κίνα) με αραίωση 1:20 σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Το δεύτερο αντίσωμα ήταν από ένα σετ αντιδραστηρίων SP (Zhongshan Biotechnology Company, Πεκίνο, Κίνα). Μετά την πλύση, οι τομές ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού, που ακολουθείται από περαιτέρω επώαση με σύμπλεγμα στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης αρμορακίας για 20 λεπτά. Βάφονται με διαμινοβενζιδίνη (DAB), τα τμήματα κηλιδώνονται αντιθέτως με αιματοξυλίνη. Το γνωστό θετικό ιστός χρησιμοποιήθηκε για θετικοί έλεγχοι. Το πρωτογενές αντίσωμα παραλείφθηκε για τους αρνητικούς μάρτυρες. Μια Ολύμπου (Olympus, Tokyo, Japan) μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τη χρώση των στοχευμένων πρωτεϊνών.

Οι βάφονται διαφάνειες εξετάστηκαν και βαθμολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο παρατηρητές και οι βαθμολογίες που καθορίζεται από το συνδυασμό του ποσοστού των θετικά χρωματισμένο όγκου κύτταρα και η ένταση της χρώσης. Καρκινικών κυττάρων αναλογία βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 (κανένα θετικά καρκινικά κύτταρα)? 1 (≤30% θετικά κύτταρα όγκου)? 2 (31-50% θετικά κύτταρα όγκου)? 3 (51-80% θετικών καρκινικών κυττάρων) και 4 (& gt? 80% θετικά καρκινικά κύτταρα). Ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε σύμφωνα με τα ακόλουθα κριτήρια: 0 (-, όχι χρώση)? 1 (+, ασθενής χρώση = ανοιχτό κίτρινο)? 2 (++, μέτρια χρώση = κίτρινο καφέ) και 3 (+++, ισχυρή χρώση = καφέ). δείκτης χρώσης (SI) υπολογίστηκε ως το γινόμενο της βαθμολογίας ένταση χρώσης και το ποσοστό των θετικών κυττάρων όγκου. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο αξιολόγησης, αξιολογήσαμε έκφραση ABCG2 σε ιστούς όγκων με προσδιορισμό της SI, με τα αποτελέσματα των 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 ή 12.

Στατιστική Ανάλυση

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD