Αφηρημένο

β-κατενίνης διαδραματίζει διττό ρόλο στο σχηματισμό πολύπλοκων πρόσφυση και το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt . Αν και φαίνεται να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση β-κατενίνης και μονοπάτι Wnt σηματοδότηση ενεργοποιείται στην πλειονότητα των καρκίνων, το επίπεδο έκφρασης του φαίνεται να χάνεται σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Αναφέραμε προηγουμένως ότι ο υποκινητής του β-κατενίνης είχε υπερμεθυλίωση σε δύο κυτταρικές σειρές NSCLC. Στην παρούσα μελέτη, επεκτείναμε την ανάλυσή μας για την κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή β περιοχή-κατενίνης και η έκφραση πρωτεΐνης σε επτά κυτταρικές σειρές NSCLC και μια σειρά από 143 περιπτώσεις πρωτογενούς ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα με παρακείμενες μη νεοπλασματικών ιστών. Ποσοτική ανάλυση μεθυλίωσης ειδική PCR (qMSP) έδειξε μεθυλίωση περιοχής υποκινητή β-κατενίνης σε πέντε κυτταρικές γραμμές NSCLC, με αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης β-κατενίνης κατά 5′-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) θεραπεία. Η κατάσταση μεθυλίωσης στο SPC (μεθυλιωμένη) και Α549 (μη μεθυλιωμένο) επιβεβαιώθηκε με όξινο θειώδες αλληλουχίας PCR. θεραπεία 5-Αζα-άΟ ανέστειλε διεισδυτικότητα του SPC αλλά όχι Α549. Ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε μεμβρανώδη έκφραση της β-κατενίνης χάθηκε στο SPC και θα μπορούσε να αποκατασταθεί με 5-αζα-dC, ενώ η θεραπεία Wnt3A οδήγησε στην πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης στα δύο SPC και Α549. δοκιμασίες διπλής λουσιφεράσης έδειξε ότι η 5-αζα-dC αγωγή δεν προκάλεσε σημαντική αύξηση της δραστηριότητας σηματοδότηση Wnt σε σύγκριση με τη θεραπεία Wnt3A. Η επίδραση του παράγοντα απομεθυλίωσης σε SPC μπορεί να αντιστραφεί με εξάντληση β-κατενίνης, αλλά όχι εξάντληση E-cadherin που έδειξε ότι η μεσολάβηση μεθυλίωση β-κατενίνης σίγηση μπορούσε να ενισχύσει NSCLC εισβολή και τη μετάσταση κατά τρόπο ανεξάρτητο της Ε-καδερίνης. Μεταγενέστερες αποτελέσματα ανοσοϊστοχημείας επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι υπερμεθυλίωση προαγωγού β-κατενίνης συσχετίζεται με απώλεια της ανοσοδραστικών έκφρασης πρωτεΐνης, θετικός λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες, υψηλό στάδιο TNM και φτωχή πρόγνωση. Η παρούσα μελέτη εμπλέκει υπερμεθυλίωση προαγωγού β-κατενίνης στον μηχανισμό του επιγενετικές μεταβολές υποκειμένων NSCLC μετάσταση και την εξέλιξη, υποδεικνύοντας έτσι την πιθανή της β-κατενίνης ως νέου επιγενετικών στόχος για τη θεραπεία των ασθενών με NSCLC

Παράθεση:. Miao Υ, Wang L, Zhang Χ, Xu Χ, Jiang G, Fan C, et al. (2014) Ανάδοχος μεθυλίωση Μεσολαβεί κατασιγάσει της β-κατενίνης Ενισχύει εισβολής μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και προβλέπει κακή πρόγνωση. PLoS ONE 9 (11): e112258. doi: 10.1371 /journal.pone.0112258

Επιμέλεια: Pier Giorgio Petronini, Πανεπιστήμιο της Πάρμα, Ιταλία

Ελήφθη: 17 Απριλίου, 2014? Αποδεκτές: ένατης Οκτώβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Νοεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Miao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81000942 έως Yuan Miao και Νο 30900562 έως Yang Liu) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει μια σημαντική κλινική πρόκληση, λόγω της κακής επιλογές πρόγνωση και περιορισμένες θεραπεία της [1]. Η υψηλή θνησιμότητα του καρκίνου του πνεύμονα οφείλεται στην αποτυχία της έγκαιρης διάγνωσης και της μετάστασης που παρατηρείται συχνά κατά τη στιγμή της διάγνωσης [2] σε μεγάλο βαθμό. Ανάλυση των βιολογικών αλλαγών βασίζεται η παθογένεση αυτής της κακοήθειας, ταύτιση στα πρώτα στάδια, και η πρόληψη των μεταστάσεων, ως εκ τούτου, μπορεί να είναι οι πρωτογενείς επιλογές για τη βελτίωση της συνολικής μελαγχολική πρόγνωση αυτού του καρκίνου.

Tumor εισβολή και μετάσταση συμβαίνουν όταν τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν την ικανότητα να αποκολληθούν από τον πρωτογενή όγκο και να τεθεί σε περιβάλλοντα ιστό ή lymphovascular κανάλια, μια διαδικασία που εξαρτάται καθοριστικά από την διακοπή των συνδέσεων πρόσφυση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων [3]. β-κατενίνη είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας καθώς συμμετέχει όχι μόνο σε αυτό το συγκρότημα πρόσφυσης, αλλά επίσης αναπόσπαστο μέρος της Wnt μονοπάτι σηματοδότησης [4] – [6]. Η συντριπτική πλειονότητα των καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου, ηπατοκυτταρικού, του θυρεοειδούς, και των ωοθηκών, λιμάνι μεταλλάξεις β-κατενίνης και οι αλλαγές σε άλλα γονίδια, όπως το γονίδιο APC, η οποία οδηγεί σε πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης και ενεργοποίηση της οδού σηματοδότηση Wnt [ ,,,0],4], [7], [8]. Ωστόσο, τα στοιχεία δείχνουν ότι η πυρηνική έκφραση της β-κατενίνης είναι σπάνιο και δραστικότητα σηματοδότηση Wnt ρυθμίζεται μειωτικά στον καρκίνο του πνεύμονα [5], [9] – [11]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν περιγράψει και να αναλύσει τη σχέση μεταξύ της απώλειας της έκφρασης της β-κατενίνης και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [9], [11]. Παρ ‘όλα αυτά, οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν αμφιλεγόμενα. Μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης β-κατενίνης δεν επηρεάστηκε από εξάντληση E-cadherin [12]. Ως εκ τούτου, πρέπει να υπάρχουν και άλλοι μηχανισμοί που ευθύνονται για την έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω β-κατενίνης σε NSCLC.

Η ανώμαλη μεθυλίωση προαγωγού θα μπορούσε να οδηγήσει σε γονιδιακή σίγηση σε διάφορους κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του πνεύμονα [13], [14]. Αν και η σηματοδότηση Wnt ενεργοποιήθηκε και η έκφραση β-κατενίνης ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε πρωτογενή γαστρικό καρκίνωμα, Ebert

et al.

Έδειξε ότι ο υποκινητής του β-κατενίνης ήταν υπερμεθυλίωση που οδήγησε σε απώλεια της έκφρασης β-κατενίνης στο κύτταρο σειρά που προέρχεται από μετάσταση στο ήπαρ του καρκίνου του στομάχου, αλλά όχι εκείνες οι πρωτογενείς καρκίνους [15]. Στο σύνολό τους, εμείς εικάζουν ότι η μεθυλίωση υποκινητών β-κατενίνης μπορεί να παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων. πιο πρόσφατη έκθεσή μας διαπίστωσε ότι υπερμεθυλίωση των υποκινητών της β-κατενίνης παρατηρήθηκαν σε δύο πρωτογενείς κυτταρικές σειρές NSCLC, η οποία διέφερε από εκείνη του γαστρικού καρκίνου [16]. Δεδομένου ότι οι δραστηριότητες του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt ήταν χαμηλότερη σε NSCLC από ό, τι σε άλλους καρκίνους, υποθέσαμε ότι υπερμεθυλίωση υποκινητών β-κατενίνης σε NSCLC μπορεί να ευθύνεται για την υψηλή συχνότητα της μετάστασης και την κακή πρόγνωση σε ασθενείς με NSCLC.

Εδώ, μελετήσαμε την επίδραση της β-κατενίνης μεθυλίωση προαγωγού εξέλιξης statuson όγκου και εισβολή, αξιοποιώντας τόσο κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και τα δείγματα των ασθενών ως πειραματικά μοντέλα μας.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ανθρώπινου ιστού και κυτταρικές σειρές

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση του διοικητικού συμβουλίου θεσμικής αναθεώρησης σε Κίνα Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Shenyang, Κίνα). Γραπτή συγκατάθεση δόθηκε από τους συμμετέχοντες για τις πληροφορίες τους να αποθηκεύονται στη βάση δεδομένων του νοσοκομείου για τα δείγματα τους για να χρησιμοποιηθούν σε αυτή τη μελέτη. Όλα κλινική έρευνα έχει διεξαχθεί σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Εκατόν σαράντα τρεις περιπτώσεις πρωτογενούς ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα με αντίστοιχα γειτονικά μη νεοπλασματικών ιστών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή με θεραπευτική πρόθεση, συλλέχθηκαν από το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου μεταξύ Οκτωβρίου 2004 και Ιουλίου 2006. επιβίωση των ασθενών ορίστηκε ως ο χρόνος από την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης στο τέλος της παρακολούθησης ή ημερών θανάτου από υποτροπή ή μετάσταση. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν ραδιοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική εκτομή, και όλοι οι ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ρουτίνα μετά την επέμβαση. Ο πληθυσμός των ασθενών μελέτη έχει αναφερθεί σε προηγούμενη βιβλιογραφία μας [17]. Η ιστολογική διάγνωση και η διαφοροποίηση βαθμό αξιολογήθηκαν σε αιματοξυλίνη και εοσίνη χρωματισμένο τμήματα, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για την ταξινόμηση του ΠΟΥ του 2004 [18]. Όλα τα 143 δείγματα επαναξιολογείται σε σχέση με την ιστολογική υπότυπο, διαφοροποίηση, και το στάδιο του όγκου. Όγκου στάσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με την έβδομη έκδοση της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου του Συστήματος (UICC) ΤΝΜ σταδιοποίηση του καρκίνου του πνεύμονα [19]. Τα δείγματα περιλάμβαναν 44 περιπτώσεις πλακώδους καρκινώματος του πνεύμονα και 99 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Πενήντα ένα όγκοι εξαιρετικά διαφοροποιημένες και 92 όγκοι μέτρια ή κακώς διαφοροποιημένα. Λεμφαδενικές μεταστάσεις ήταν παρόντες σε 70 περιπτώσεις και απουσιάζει σε 73 περιπτώσεις. Οι όγκοι περιλαμβάνονται 81 περιπτώσεις στάδιο της νόσου Ι-ΙΙ και 62 περιπτώσεις III

A-III

νόσο σταδίου Β.

κυτταρικές σειρές Επτά NSCLC, που χρησιμοποιούνται συνήθως στο εργαστήριο μας, επιλέχθηκαν για την κυτταρική πειράματα. Οι κυτταρικές σειρές HBE, Α549 και Η1299 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Η PG-BE1 (BE1), PG-LH7 (LH7), SPC-Α-1 (SPC), και LTEP-Α-2 (LTE) κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από τη Σαγκάη Τράπεζας Κυττάρων (Σαγκάη, Κίνα). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen), 100 IU /ml πενικιλλίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA), και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη ( Sigma). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας αποστειρωμένου και περάστηκαν κάθε 2 ημέρες χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη (Invitrogen).

εξαγωγή DNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου μεθυλίωσης-ειδική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από κυτταρικές σειρές και 10 μm πάχους τομές του 10%, μπλοκ ιστού του όγκου ουδέτερο σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη με χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). Γονιδιωματικό DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες νάτριο χρησιμοποιώντας ένα κιτ μεθυλίωσης DNA EZ (D5005, Zymo Research, Orange, CA, USA). σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) δοκιμασίες μεθυλίωσης-ειδική διεξήχθησαν στο Fast σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο ΑΒΙ 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ζεύγη εκκινητών ήταν ως εξής: β-κατενίνης εμπρός, 5′-GGAAAGGCGCGTCGAGT-3 ‘και αντίστροφος, 5′-TCCCCTATCCCAAACCCG-3′, με τον ανιχνευτή TaqMan 5’-6FAM- CGCGCGTTTCCCGAACCG-TAMRA-3 ‘? β-ακτίνης προς τα εμπρός, 5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3 ‘και αντίστροφος, 5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′, με τον ανιχνευτή TaqMan 5’-6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA-3 ‘. Η υπηρεσία καθαρισμού γονιδίου β-ακτίνης (ACTB) χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την μεθυλίωση ανεξάρτητη αντίδραση ελέγχου. Για σχετική ποσοτικοποίηση, τα ποσά του μεθυλιωμένου DNA (ποσοστό μεθυλιωμένου αναφοράς) σε μια περιοχή υποκινητή β-κατενίνης κανονικοποιήθηκαν στην τιμή μεθυλίωση του βαθμονομητή, η οποία ορίστηκε ως 100%. Καθολική μεθυλιωμένο DNA (QIAGEN) χρησιμοποιήθηκε ως το βαθμονομητή. Το ποσοστό των μεθυλιωμένων αναφοράς ορίστηκε ως 100 × 2

(sampleACTB (ct) – sampleβ-κατενίνης (ct)) /2

(calibratorACTB (ct) – calibratorβ-κατενίνης (ct)) [20]. Για να διακρίνουν μεταξύ των επιμέρους επίπεδα μεθυλίωσης, μια τιμή αποκοπής του 4% ή μεγαλύτερη ορίστηκε ως «μεθυλιωμένο» και μία τιμή αποκοπής μικρότερη από 4% ως «μη μεθυλιωμένη» βασίζεται σε προηγούμενη μελέτη [21].

Bisulfite αλληλουχίας PCR (BSP) των υποκινητών της β-κατενίνης

Έχουμε χρησιμοποιήσει το λογισμικό v1.0 Methyl Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) για να αναλύσει το

CTNNB1

περιοχή του υποκινητή του γονιδίου -1,124-11,114 bp. DNA από καρκινικά κύτταρα πνεύμονα εκχυλίστηκε και στη συνέχεια κατεργάζεται με όξινο θειώδες νάτριο χρησιμοποιώντας ένα κιτ μεθυλίωσης DNA EZ (Zymo Research) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές υποκινητή ειδικά β-κατενίνης για διθειώδες αλληλούχιση κατασκευάσθηκαν με τη χρήση των δεδομένων ακολουθίας υποκινητή και εκκινητή λογισμικό σχεδιασμού (Primer Premier 5? Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA)? οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 1. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν ένα CpG πλούσια περιοχή του υποκινητή εκτείνεται 189 CpG θέσεις (19 θέσεις CpGCpG). Τα προϊόντα της PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης πολυλειτουργικό καθαρισμού DNA (DP1501, BioTeke Corporation, Πεκίνο, Κίνα) και συνδέθηκε στο απλό φορέα pum-T (DP6803, BioTeke Corporation, Πεκίνο, Κίνα), και τουλάχιστον πέντε ξεχωριστές κλώνους η κάθε μία επιλέγονται για ανάλυση αλληλουχίας με BIQ Analyzer.

η

η θεραπεία με 5-αζα-dC και Wnt3A

Καλλιεργείται καρκινικά κύτταρα πνεύμονα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) (Sigma) διαλύθηκε σε μέσο καλλιέργειας κάθε 24 ώρες. Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες q-MSP και ΜΤΤ, επελέγη η συγκέντρωση του φαρμάκου που απαιτείται για την β-κατενίνης προαγωγού CpG νησιού απομεθυλίωση χωρίς σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων (7 μΜ) και τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από συνεχή καλλιέργεια για 48 ώρες (Εικόνα S1).

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 ng /ml ανασυνδυασμένης Wnt3A (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA).. για 48 ώρες

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA θεραπεία

οι κυτταρικές σειρές ήταν τοποθετήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων με φρέσκα μέσα χωρίς αντιβιοτικά επί 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με β-κατενίνης siRNA (SC-29209, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), E-cadherin siRNA (SC-35242, Santa Cruz) και τον έλεγχο siRNA (SC-37007, Santa Cruz Biotechnology), χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα siRNAs αποτελούνταν από μια δεξαμενή δύο ειδικού στόχου 19-25 nt siRNAs, τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

ανάλυση κηλίδος Western.

Η ολική πρωτεΐνη από κύτταρα εκχυλίζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Pierce) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες (50 μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (12%) και μεταφέρθηκε σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης (sc-8426, 1: 200? Santa Cruz Biotechnology), β-κατενίνης (610.154, 1: 500? BD Transduction Laboratories, Lexington, ΚΥ, ΗΠΑ ) ή GAPDH (SC-365062, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology). Μετά από επώαση με υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-ποντικού IgG (Santa Cruz Biotechnology) στους 37 ° C για 2 ώρες, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ECL (Pierce) και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης υπολογίστηκαν με βάση πρωτεΐνη GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης.

δοκιμασία εισβολή Matrigel.

προσδιορισμοί κυττάρων εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 24 φρεατίων transwell θάλαμο με μέγεθος πόρων 8 μm (Corning Costar Transwell, Cambridge, MA, USA), και τα ένθετα επικαλύφθηκαν με 20 μΙ Matrigel (1:03 αραίωση, BD Biosciences). Στη συνέχεια, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα σε επεξεργασία με θρυψίνη και μεταφέρθηκαν στον άνω θάλαμο Matrigel σε 100 μΐ μέσου άνευ ορού που περιέχει 3 χ 10

5 κύτταρα και επωάστηκαν για 16 ώρες. Μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. Οι αριθμοί της εισβολής κύτταρα μετρήθηκαν σε 10 τυχαίως επιλεγμένα πεδία μικροσκοπίου υψηλής ισχύος. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

χρώση ανοσοφθορισμού.

Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, δεσμεύτηκαν με 1% BSA και στη συνέχεια επωάζονται με το β-κατενίνης μονοκλωνικό αντίσωμα (610.154, 1 : 400? BD Transduction Laboratories) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (1: 200, Zhongshan Χρυσή Γέφυρα, Beijing, China) στους 37 ° C. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ). Επιφθορισμού μικροσκοπία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon TE300 (Melville, ΝΥ, USA) και συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Radiance 2000 σάρωσης με λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Thornwood, ΝΥ, USA).

Dual-λουσιφεράσης δοκιμασίες.

οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων για 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση με τα πλασμίδια γονίδιο αναφοράς pGL3-ΟΤ ή pGL3-OF (0,5 mg), μαζί με το πλασμίδιο ελέγχου ρΡΙ_-ΤΚ (50 ng). Μετά από επώαση για 30 ώρες στους 37 ° C, η έκφραση του γονιδίου αναφοράς ανιχνεύθηκε με την Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). δραστικότητα γονιδιακής μεταγραφής από TCF μεσολάβηση προσδιορίσθηκε από την αναλογία του pGL3-ΟΤ σε pGL3-λουσιφεράσης δραστηριότητα, η οποία κανονικοποιήθηκε σε δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla από το πλασμίδιο ελέγχου ρΡΙ_-ΤΚ. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν, τουλάχιστον τρεις φορές. Για να αναλυθούν οι επιδράσεις των 5-αζα-DC και β-κατενίνης siRNA επί σηματοδότηση Wnt, 5-αζα-άΟ προστέθηκε και β-κατενίνης siRNA συν-επιμολυσμένα με pGL3-ΟΤ ή pGL3-OF για προσδιορισμούς λουσιφεράσης.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης β-κατενίνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα β-κατενίνης ειδική (610.154, 1: 200? BD Transduction Laboratories) όπως περιγράφηκε προηγουμένως και αξιολογήθηκε σύμφωνα με προηγούμενη έκθεσή μας [17], [22].

Στατιστική ανάλυση.

SPSS έκδοση 13.0 για Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις. Οι δοκιμές chi-square και συσχέτιση Spearman είχαν χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει πιθανές συσχετίσεις της κατάστασης μεθυλίωσης β-κατενίνης σε NSCLC με την κατάσταση μεθυλίωσης του σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστό των πνευμόνων και κλινικοπαθολογική παράγοντες. Το Mann-Whitney U-test χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα αποτελέσματα των q-MSP, στύπωμα Western, Matrigel επεμβατικές δοκιμασίες και δοκιμασίες Dual-λουσιφεράσης. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η πιθανότητα επιβίωσης του ασθενούς, καθώς και οι διαφορές στην επιβίωση των υποομάδων των ασθενών συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank Mantel του. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

P

& lt?. 0,05 θεωρήθηκε να αναφέρει στατιστικά σημαντικές διαφορές

Αποτελέσματα

Ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης της περιοχής προαγωγού του γονιδίου β-κατενίνης στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

Τα επίπεδα μεθυλίωσης υποκινητή β-κατενίνης ελέγχθηκαν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, πέντε κυτταρικές γραμμές (LH7, BE1, SPC, LTE και Η1299) επέδειξαν υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης, ενώ δύο κυτταρικές γραμμές (ΗΒΕ και Α549) ήταν μη μεθυλιωμένη. Ανάλυση της περιοχής υποκινητή του γονιδίου CTNNB1 -1124 – 11.114 bp σε κυτταρικές σειρές NSCLC αποκάλυψε την παρουσία δύο CpG νησίδων στις θέσεις -1124 – 876 και 10 676 – 11 114, αντίστοιχα. Αυτές οι αλληλουχίες περιείχαν 189 απλές θέσεις CG, 19 εκ των οποίων ήταν CG-δινουκλεοτίδια. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο όξινο θειώδες νάτριο γονιδιωματική αλληλούχιση, σχεδιάσαμε εναύσματα για να αναλύσει τα πρώτα νησιά CpG σε μια περιοχή ζευγών 1331 βάσεων (-614 έως 717) που περιέχει μέρος της περιοχής του υποκινητή β-κατενίνης σε όλη την ιστοσελίδα του ξεκίνημα της μεταγραφής στην ΠΧΠ και Α549 κυτταρικές γραμμές . Πολλαπλές θέσεις μεθυλίωσης ταυτοποιήθηκαν σε κύτταρα SPC, ενώ παρατηρήθηκαν μόνο μερικά υπολείμματα 5-μεθυλκυτοσίνη σε αρκετές αλληλουχία κλώνων που προέρχονται από κύτταρα Α549 (Εικ. 1Β και 1Γ).

(Α) ανάλυση Ποσοτική MSP της β περιοχή κατενίνης υποκινητή σε κυτταρικές σειρές NSCLC. (Β) Ανάδοχος περιοχή του γονιδίου της β-κατενίνης: Θέση των CpG νησίδων και το σχεδιασμό αστάρι υποδεικνύονται από τις γραμμές και βέλη. (Γ) Μεθυλίωση ενός από τα 19 CG-δινουκλεοτίδια στην περιοχή -614 bp έως -270 bp τόσο Α549 και SPC. Μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν μετουσιωμένο τοποθεσίες CG, κενές κύκλοι αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένα τοποθεσίες CG.

Η

Θεραπεία κυττάρων με 5-αζα-dC ανακατασκευασμένη έκφραση της β-κατενίνης και ανέστειλε εισβολής των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα μέσω της αποκαταστάσεως μεμβρανώδη β-κατενίνης έκφραση και όχι από την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Wnt

Η χημική 5-αζα-άΟ έχει χρησιμοποιηθεί τόσο in vitro και in νίνο για να αναστείλουν DNA μεθυλίωση. Σε αυτή τη μελέτη, όλοι οι επτά κυτταρικές γραμμές (ΗΒΕ, LH7, BE1, SPC, Α549, LTE και Η1299) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5-αζα-dC (Σχ. 2Α, 2Β). Έκφραση της β-κατενίνης αποκαταστάθηκε στις πέντε κυτταρικές σειρές (LH7, BE1, SPC, LTE και Η1299), στο οποίο μεθυλίωση υποκινητή β-κατενίνης είχε επιβεβαιωθεί προηγουμένως. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές αλλαγές παρατηρήθηκαν στις ΗΒΕ και Α549 κυτταρικές γραμμές (μη μεθυλιωμένη). Ερευνήσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα του 5-αζα-dC θεραπεία για την ικανότητα εισβολής των πνευμόνων κυτταρικές σειρές. Όπως φαίνεται στα σχήματα 2Γ και 2Δ, 5-αζα-dC θεραπεία οδήγησε σε σημαντική αναστολή της διηθητικότητας σε κύτταρα SPC, ενώ δεν υπήρξε καμία μετρήσιμη επίδραση στα κύτταρα Α549 (Βλέπε Σχήμα S2 για matrigel αποτελέσματα σε άλλες κυτταρικές γραμμές). Στη συνέχεια, η ικανότητα των 5-αζα-άΟ για την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Wnt διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα Wnt3A πρωτεΐνη προσομοιώνεται ως θετικός έλεγχος. Σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα Wnt3A, dual-λουσιφεράση δοκιμασίες αποκάλυψαν ότι η 5-αζα-dC θεραπεία δεν οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στις δραστηριότητες σηματοδότηση Wnt (Σχ. 2Ε). Ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι η θεραπεία με 5-αζα-άΟ αποκατασταθεί μεμβρανώδη έκφραση β-κατενίνης σε SPC, αλλά όχι τα κύτταρα Α549. Επιπλέον, η έκφραση β-κατενίνης ανιχνεύθηκε στον πυρήνα σε Wnt3A-επεξεργασμένα κύτταρα, ενώ, ένα μεμβρανώδη διανομή παρατηρήθηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2F). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι, σε αντίθεση με άλλα καρκινώματα, μεθυλίωση του υποκινητή β-κατενίνης ήταν ένα κοινό φαινόμενο σε NSCLC, και μπορεί να είναι υπεύθυνη για την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης β-κατενίνης ενίσχυση της ικανότητας εισβολής του καρκίνου του πνεύμονα.

επίπεδα (Α) Protein του β-κατενίνης μετά την κατεργασία 5-αζα-dC (7 μΜ) σε κυτταρικές σειρές NSCLC. (Β) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεΐνης μετά από αγωγή 5-αζα-DC. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων στον πυθμένα των μεμβρανών Transwell δείχνουν τις αλλαγές στην επεμβατική αριθμούς κυττάρων (× 400, bar Κλίμακα = 50 μm). (Δ) Αριθμός κυττάρων που εισβάλλουν στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκε, το καθένα πραγματοποιείται εις τριπλούν. (Ράβδοι αντιπροσωπεύουν SD *

P

& lt?. 0.05, σε σύγκριση με τον έλεγχο). (Ε) αποτελέσματα της ανάλυσης Dual-λουσιφεράσης δείχνουν ότι η 5-αζα-dC θεραπεία δεν οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στις δραστηριότητες Wnt σηματοδότηση σε σύγκριση με Wnt3A επεξεργασμένα κύτταρα. Κάθε ένα από τα πειράματα επαναλήφθηκε εις τριπλούν. (D) χρώση ανοσοφθορισμού δείχνουν ότι η β-κατενίνη είναι κατά κύριο λόγο εντοπισμένο στην μεμβράνη σε SPC και κυτταρικές Α549 γραμμές. Η θεραπεία με 5-αζα-άΟ μετέβαλε τα ποσά των μεμβρανώδη έκφρασης β-κατενίνης. Ωστόσο, β-κατενίνης είχε μετατοπίζεται στον πυρήνα μετά από αγωγή Wnt3A (Κλίμακα ράβδου = 20 μm, αντίσωμα β-κατενίνης αντικαταστάθηκε με κανονικό IgG ποντικού ως αρνητικός μάρτυρας).

Η

5-Αζα-dC επεξεργασία αποκατασταθεί η έκφραση της β-κατενίνης σε E-cadherin ανεξάρτητο τρόπο

για την περαιτέρω επιβεβαίωση της λειτουργίας της μεθυλίωσης υποκινητή της β-κατενίνης, β-κατενίνης ειδικό siRNA εισήχθη SPC και τα κύτταρα Α549. Σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο έλεγχο siRNA, κύτταρα επιμολυσμένα με β-κατενίνης siRNA παρουσίασαν μειωμένη β-κατενίνης και της έκφρασης Ε-καδερίνης, η οποία δεν μπορεί να αποκατασταθεί με 5-αζα-dC θεραπεία (Εικ. 3Α, Β). Στη συνέχεια, θα χτυπηθεί κάτω Ε-καδερίνης με Ε-καδερίνης ειδικό siRNA σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. έκφραση Ε-καδερίνης μειώθηκε στις δύο κύτταρα SPC και Α549, ενώ η έκφραση β-κατενίνης δεν ήταν εμφανώς μειώθηκε κατά εξάντληση Ε-καδερίνης σε σύγκριση με τον έλεγχο. Με 5-αζα-dC θεραπεία, η έκφραση β-κατενίνης ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύτταρα SPC ανεξάρτητα την έκφραση της Ε-καδερίνης (Εικ. 3C, D). Ερευνήσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα του 5-αζα-άΟ θεραπεία όταν εισάγεται με β-κατενίνης siRNA και Ε-καντερίνης-siRNA στην ικανότητα εισβολής των πνευμόνων κυτταρικές σειρές. Όπως φαίνεται στα σχήματα 3Ε και 3F, είτε β-κατενίνης ή εξάντληση Ε-καδερίνης οδήγησε σε σημαντική αύξηση της διεισδυτικής ικανότητας των δύο κυττάρων SPC και Α549. Με 5-αζα-dC θεραπεία, ο αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα SPC Ε-καδερίνης-εξαντλημένο, η οποία δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549. Ωστόσο, οι επεμβατικές ικανότητες των β-κατενίνης εξαντλημένο SPC και Α549 κύτταρα δεν ήταν προφανώς αναστέλλονται από θεραπεία 5-αζα-DC. Επιπλέον, dual-λουσιφεράση δοκιμασίες αποκάλυψαν ότι ούτε 5-αζα-άΟ θεραπεία ούτε β-κατενίνης εξάντληση οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στις δραστηριότητες Wnt σηματοδότηση σε σύγκριση με Wnt3A επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 3G). Κατά συνέπεια, η αναστολή της έκφρασης β-κατενίνης με μεθυλίωση του υποκινητή φαίνεται να προς τα κάτω ρύθμιση της ικανότητας εισβολής του καρκίνου του πνεύμονα κατά τρόπο ανεξάρτητο της Ε-καδερίνης. χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι η μεμβρανώδη β-κατενίνης ενισχύεται από θεραπεία 5-αζα-dC μόνο στην κυτταρική σειρά SPC, αλλά όχι στην κυτταρική γραμμή Α549. Η εξάντληση των β-κατενίνης εξασθενεί μεμβρανώδη β-κατενίνης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές SPC και Α549, αλλά εξάντληση της Ε-καδερίνης έχει καμία επίδραση στην μεμβρανώδη έκφραση της β-κατενίνης σε είτε SPC ή Α549 κυτταρική γραμμή. Η θεραπεία με 5-αζα-άΟ τροποποιηθεί ελαφρώς τα ποσά των μεμβρανώδη έκφρασης β-κατενίνης μετά β-κατενίνης ή εξάντληση Ε-καδερίνης σε κυτταρική σειρά SPC αλλά όχι στην κυτταρική γραμμή Α549.

Μετά την knockdown του β-κατενίνης ( Α) ή της Ε-καδερίνης (C), πρωτεΐνη έκφραση του SPC και κυτταρικές γραμμές Α549 εξετάστηκαν 48 ώρες μετά την αγωγή 5-αζα-άΟ χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β, D) Διαγράμματα δείχνουν την ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεΐνης μετά από αγωγή 5-αζα-DC και siRNA διαμόλυνση. GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων στον πυθμένα των μεμβρανών Transwell δείχνουν τις αλλαγές στην επεμβατική αριθμούς κυττάρων (× 400, bar Κλίμακα = 50 μm). (F) Αριθμός κυττάρων που εισβάλλουν στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκε, το καθένα πραγματοποιείται εις τριπλούν. (Ράβδοι αντιπροσωπεύουν SD *

P

& lt?. 0.05, σε σύγκριση με τον έλεγχο). (G) Dual-λουσιφεράσης αποτελέσματα της ανάλυσης δείχνουν ότι τόσο θεραπεία και β-κατενίνης εξάντληση 5-αζα-dC δεν οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στις δραστηριότητες Wnt σηματοδότηση σε σύγκριση με Wnt3A επεξεργασμένα κύτταρα. Κάθε ένα από τα πειράματα επαναλήφθηκε εις τριπλούν. χρώσης (H) ανοσοφθορισμού δείχνουν ότι η μεμβρανώδη β-κατενίνης ενισχύεται με 5-αζα-dC θεραπεία μόνο στην κυτταρική σειρά SPC, αλλά όχι στην κυτταρική γραμμή Α549. Η εξάντληση των β-κατενίνης εξασθενεί μεμβρανώδη β-κατενίνης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές SPC και Α549, αλλά εξάντληση της Ε-καδερίνης έχει καμία επίδραση στην μεμβρανώδη έκφραση της β-κατενίνης σε είτε SPC ή Α549 κυτταρική γραμμή. Η θεραπεία με 5-αζα-άΟ ελαφρώς παραλλαγμένη των ποσών των μεμβρανώδη έκφρασης β-κατενίνης μετά β-κατενίνης ή εξάντληση Ε-καδερίνης σε κυτταρική σειρά SPC αλλά όχι στην Α549 κυτταρική γραμμή. (Κλίμακα ράβδου = 20 μm, αντίσωμα β-κατενίνης αντικαταστάθηκε με κανονικό IgG ποντικού ως αρνητικός μάρτυρας).

Η

υπερμεθυλίωση του προαγωγού β-κατενίνης συσχετίζεται με απώλεια της μεμβρανώδη έκφρασης σε δείγμα NSCLC

επόμενο διερευνήθηκε η κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή β-κατενίνης σε κλινικά δείγματα ιστών. Η β-κατενίνη εκφράστηκε κυρίως στην κυτταρική μεμβράνη σε δείγματα ιστών φυσιολογικού πνεύμονα (83.9%, 120/143? Σχ. 4Α), με μειωμένη μεμβρανώδη έκφραση σε ιστούς NSCLC (18,9%? 27/143? Σχ. 4Β, C). Στη συνέχεια, τα επίπεδα μεθυλίωσης β-κατενίνης υποκινητή ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου μεθυλίωσης-ειδική PCR. Χρησιμοποιώντας μια τιμή υπερμεθυλίωση μεγαλύτερη από 4% ως αποκοπής, υπερμεθυλίωση β-κατενίνης (μέση ± SD, 8.60% ± 11,41%? Εύρος, 0-100%) βρέθηκε σε 74 (51,7%) των δειγμάτων 143 NSCLC, η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε γειτονικό φυσιολογικό ιστό των πνευμόνων (13,3%, 19/143? μέσος όρος ± SD, 2,66% ± 2,63%? εύρος, 0-100%?

P

& lt? 0.001? Σχ. 4D ). Στο σύνολό τους, η μελέτη μας προτείνει ότι η β-κατενίνης μεθυλίωσης συσχετίζεται σημαντικά με την απώλεια της μεμβρανώδη έκφρασης της β-κατενίνης (

P

= 0,001).

(Α) έκφραση της β-κατενίνης σε φυσιολογικό επιθήλιο του πνεύμονα με ισχυρή μεμβρανώδη χρώση. Μεμβρανώδη έκφραση β-κατενίνης είχε χαθεί σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα (Β) και το αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (C). μπαρ κλίμακας = 20 μm. (D) Ποσοτικά αποτελέσματα μεθυλίωση της Q-MSP. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. Το Mann-Whitney U-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα. **

P

& lt? 0.001. καμπύλες (Ε) επιβίωση των ασθενών με ή χωρίς μεθυλίωση προαγωγού β-κατενίνης. δοκιμασία log-rank Mantel χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα.

Η

Η συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης β-κατενίνης υποκινητή και κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες

Κλινική και παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών με NSCLC αναλύθηκαν σύμφωνα με κατάσταση μεθυλίωσης τους. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, β-κατενίνης υπερμεθυλίωση συσχετίζεται θετικά με μετάσταση λεμφαδένα και το στάδιο ΤΝΜ στις 143 περιπτώσεις NSCLC (

P

= 0.001 και

P

= 0.046, αντίστοιχα). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ β-κατενίνης μεθυλίωση και το φύλο, την ηλικία, ιστολογικό τύπο, ή διαφοροποίηση σε NSCLC. Η δοκιμή Kaplan-Meier έδειξε ότι ο συνολικός χρόνος επιβίωσης των ασθενών με NSCLC ήταν βραχύτερη σε ασθενείς με όγκους β-κατενίνης μεθυλιωμένη σχέση με εκείνους με τους β-κατενίνης μη μεθυλιωμένο όγκους (

P

& lt? 0.001, Σχ. 4Ε).

η

Συζήτηση

β-κατενίνης, καθώς ένα σημαντικό συστατικό των δύο ενώσεις προσφύσεως και σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt, πιστεύεται ότι πρέπει να μετατοπισθεί σε πυρήνα από το εξόνιο μετάλλαξη και /ή APC μετάλλαξη σε διάφορους τύπους όγκων εκτός καρκίνου του πνεύμονα [4], [7], [8]. Ωστόσο, η συσσωρευμένη αποδείξεις δείχνουν ότι, σε καρκίνο του πνεύμονα, β-κατενίνης χάνεται και δραστικότητα σηματοδότηση Wnt ρυθμίζεται προς τα κάτω. Ο υποκείμενος μηχανισμός παραμένει unelucidated [5], [9] – [11]. πιο πρόσφατη μελέτη μας διαπίστωσε ότι ο υποκινητής του γονιδίου β-κατενίνης ήταν πάντα μεθυλιώθηκε σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα [16]. Προκειμένου να διευκρινιστούν οι λειτουργίες της β-κατενίνης σε NSCLC, επεκτείναμε την έρευνά μας για την κατάσταση μεθυλίωσης υποκινητή σε επτά πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε ότι ο παράγοντας απομεθυλιώσεως 5-αζα-άΟ αποκατασταθεί επίπεδα πρωτεΐνης β-κατενίνης σε πέντε από τις επτά κυτταρικές σειρές που είχαν επιβεβαιωθεί να μεθυλιωθεί στην παρούσα μελέτη. Μεταξύ αυτών, η κατάσταση μεθυλίωσης του ΕΣΠ και Α549 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με όξινο θειώδες γονιδιωματικής αλληλουχίας. Είναι καλά αναγνωρισμένο ότι η είσοδος της β-κατενίνης στον πυρήνα θα μπορούσε να ενισχύσει Wnt δραστικότητα σηματοδότησης, προάγοντας έτσι την ικανότητα εισβολής των πολλαπλών ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, η έκφραση β-κατενίνης είχε χαθεί σε απομακρυσμένες μεταστάσεις του γαστρικού καρκινώματος και την απώλεια έκφρασης β-κατενίνης μπορεί να οφείλεται σε υπερμεθυλίωση του προαγωγού β-κατενίνης, παρά ότι η έκφραση β-κατενίνης ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω και το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt ενεργοποιήθηκε σε το μεγαλύτερο μέρος του πρωτογενούς γαστρικού καρκίνου [15]. Έχουμε σκεφτεί ότι η απώλεια του β-κατενίνης μπορεί να πυροδοτήσει άλλη καταρράκτη (ες) σηματοδότησης Wnt ισχυρότερη από την ενεργοποίηση σηματοδότησης στον έλεγχο της ικανότητας εισβολής των καρκινικών κυττάρων. Δεδομένου ότι ο καρκίνος του πνεύμονα δείχνει χαμηλότερα αρχικά δραστηριότητας σηματοδότησης Wnt από καρκίνο του στομάχου, ο κύριος μηχανισμός για τη ρύθμιση διεισδυτικότητα μπορεί να είναι ανεξάρτητη από Wnt μονοπατιού σηματοδότησης. ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt, της ικανότητας εισβολής, και τη διανομή του subcelluar β-κατενίνης στον πνεύμονα κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απομεθυλίωση από 5-αζα-άΟ μπορούσε αποκατασταθεί έκφραση β-κατενίνης και ανέστειλε την διεισδυτικότητα κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μέσω μεμβρανώδη έκφραση β-κατενίνης αποκαταστάσεως, και όχι από την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Wnt. Η παρούσα μελέτη προσέφερε μια νέα εξήγηση για το γιατί η έκφραση β-κατενίνης ήταν προς τα κάτω σε NSCLC και έδειξαν ότι η μεθυλίωση προαγωγού του β-κατενίνης μπορεί να ρυθμίζει διεισδυτικότητα μέσω ενός μονοπατιού ανεξάρτητο από σηματοδότηση Wnt σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Όπως κατενίνες μαζί με καντερινών και σχηματίζονται ενώσεις προσφύσεως, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η απώλεια της έκφρασης β-κατενίνης θα μπορούσε να καταστρέψει ενώσεις προσφύσεως με μειωμένη μεμβρανώδη έκφρασή του.

Ε-καδερίνης διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ενώσεων προσφύσεως. Μέσω ενδοκυτταρικό τομέα του, Ε-καδερίνης συνδέθηκε με β-κατενίνης. Αν και η μεθυλίωση του γονιδίου μεθυλίωσης Ε-καδερίνης διαπιστώθηκε σε διάφορους καρκίνους, παραμένει αμφιλεγόμενη, όπως στο καρκίνο του πνεύμονα [23] – [25]. Russo

et al

.