Αφηρημένο

κυττάρων πλαστικότητα ρυθμίζεται από την ισορροπία μεταξύ της μεσεγχυματικών σε επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) και το αντίθετο πρόγραμμα, EMT, είναι κρίσιμη στο μεταστατικό καταρράκτη. Διάφοροι παράγοντες μεταγραφής (ΤΡ) είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν EMT, αν και οι μηχανισμοί του ΚΟΑ παραμένουν ασαφείς. Έχουμε αποδείξει μια νέα λειτουργία των δύο TFs, OVOL1 και OVOL2, ως κρίσιμη επαγωγείς του ΚΟΑ σε ανθρώπινους καρκίνους. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι ο έλεγχος Ovol-ΤΡ υλοποιηθεί μέσω ενός κανονιστικού βρόχο ανάδρασης με EMT-προκαλώντας TF ZEB1, και τη ρύθμιση του ματίσματος mRNA επάγοντας Τα επιθηλιακά Συγκόλληση ρυθμιστική πρωτεΐνη 1 (ESRP1). Χρησιμοποιώντας μοντέλα όγκων του προστάτη ποντικού που δείχνουν ότι η έκφραση του Ovol-ΤΡ σε μεσεγχυματικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη εξασθενεί μεταστατικό δυναμικό τους. Ο ρόλος της Ovol-ΤΡ ως επαγωγείς της ΚΟΑ ενισχύεται περαιτέρω από την έκφραση αναλύσεις σε 917 καρκινικές κυτταρικές σειρές, γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο τους ως ζωτικής σημασίας ρυθμιστές των επιθηλιακών-μεσεγχυματικών κυττάρων πλαστικότητα στον καρκίνο

Παράθεση:. Roca H, J Hernandez , Weidner S, McEachin RC, Fuller D, Sud S, et al. (2013) Μεταγραφή Παράγοντες OVOL1 και OVOL2 Προκαλέστε των μεσεγχυματικών στα επιθηλιακά μετάβαση σε ανθρώπινα καρκινικά. PLoS ONE 8 (10): e76773. doi: 10.1371 /journal.pone.0076773

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12, Απρ, 2013? Αποδεκτές: 28 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Roca et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από U54-CA163124, U01-CA143055, P50-CA69568 και PO1-CA093900 από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. KJP υποστηρίζεται ως Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία Κλινικής Έρευνας καθηγητής και ως Τάουμπμαν Research Scholar του Πανεπιστημίου του Michigan. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περισσότερο από το 90% των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται προκύπτουν από μετάσταση [1]. Κατά συνέπεια, θα πρέπει να συμβάλουν στην κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν την εξέλιξη του καρκίνου και της μετάστασης. Επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT), και το αντίστροφο διαδικασία της ΚΟΑ, είναι ζωτικής σημασίας τα προγράμματα που συμμετέχουν στην επούλωση των πληγών και την πρώιμη ανάπτυξη των οργάνων [2]. ΕΜΤ και ΜΕΤ μπορεί επίσης να παίζουν κρίσιμους ρόλους τόσο εξέλιξης του καρκίνου και την εγκατάσταση των μεταστατικών αποικιών [3]. Όταν τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται EMT, αποκτούν την ικανότητα να αποσυνδεθεί από τον πρωτογενή όγκο και να εισέλθουν στην κυκλοφορία. Αυτά τα κυκλοφορούντα κύτταρα είναι τότε σε θέση να τη διάδοση και υποβάλλονται σε ΚΟΑ, με αποτέλεσμα μεταστατικούς όγκους. Η κατανόηση αυτής της φαινοτυπική πλαστικότητα είναι ένα κλειδί για την παρεμπόδιση εξέλιξης του καρκίνου [4].

EMT συνδέεται με μεταβολές στην έκφραση γονιδίων και μορφολογία και συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω των πρωτεϊνών κυτταρικής προσκόλλησης, όπως Ε-καδερίνης (E-CAD ). Αυτή η διαδικασία επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να διαχωριστούν από τους γείτονές τους, αυξάνοντας παράλληλα την κινητικότητα τους [5]. Έχει προταθεί ότι η EMT ρυθμίζεται από αμοιβαίες αλληλεπιδράσεων μεταξύ ZEB1 /ZEB2 TFs και τα μέλη της οικογένειας microRNA miR-200 [6,7]. Συγκεκριμένα, ZEB1 μπορεί να προκαλέσει EMT από την καταστολή των επιθηλιακών πρωτεΐνες και με ρύθμιση προς τα κάτω τις δικές miR-200 καταστολείς της. Ταυτόχρονα, miR-200S καταστείλει ZEB1 καθώς και παράγοντες των βλαστικών κυττάρων και επιγενετικών ρυθμιστικές αρχές που εμπλέκονται στην EMT. Πιστεύεται ότι αυτά τα αμοιβαία βρόχοι ανάδρασης είναι υπεύθυνοι, εν μέρει, για τη φαινοτυπική πλαστικότητα εκτίθενται στον καρκίνο και μετάσταση [4].

Και άλλες πρωτεΐνες μπορούν να χρησιμεύσουν ως ρυθμιστές /επαγωγείς του EMT ή πιθανών βιοδεικτών για μεσεγχυματικά κύτταρα. Η επαγωγή της ΕΜΤ έχει συσχετιστεί με την έκφραση ΤΟΡβ [8]. Εν μέρει, αυτό συμβαίνει μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του ZEB1 /2, η οποία, με τη σειρά του, αναστέλλει ρυθμιστικές πρωτεΐνες επιθηλιακά splicing (ΕΠΕΑ) [9]. Προς τα κάτω ρύθμιση του ΕΠΕΑ, και η προκύπτουσα καταστολή του εναλλακτικού ματίσματος, έχει δειχθεί ότι είναι κρίσιμη στην EMT. Για παράδειγμα, στον καρκίνο του μαστού, την καταστολή των ΕΠΕΑ οδηγεί σε μια αλλαγή στην έκφραση ισομορφή CD44 που είναι κρίσιμης σημασίας για την επαγωγή της EMT και εξέλιξης του καρκίνου [10].

Παρά την αυξανόμενη γνώση μας σχετικά με EMT, οι μηχανισμοί που μεσολαβούν ΚΟΑ είναι πολύ λιγότερο κατανοητή. Χρησιμοποιώντας δύο μοντέλα του προστάτη και του καρκίνου του μαστού μεσεγχυματικά κύτταρα, ανακαλύψαμε ότι TFs OVOL1 (OVO-όπως 1, Εηίτεζ Gene ID 5017) και OVOL2 (Gene ID 58495) σχετίζονται με το ΚΟΑ στα μοντέλα μας, καθώς και σε άλλες μορφές καρκίνου. OVOLs είναι TFs ψευδαργύρου-δακτύλου που δρουν ως ρυθμιστές της εμβρυογένεσης [11-13]. Πρέπει πρώτα ανέλυσε πώς OVOLs ελέγχουν την έκφραση της EMT-προκαλώντας TFs και ESRPs. Στη συνέχεια, μελέτησαν τον τρόπο ΚΟΑ, που προκαλείται από την Ovol-ΤΡ, συσχετίζεται με τους βασικούς παράγοντες της ανάπτυξης των επιθηλιακών κυττάρων σε κυτταρικές σειρές 917 καρκίνου που συμμορφώνονται με το Human Cancer Cell Εγκυκλοπαίδεια [14], και διερεύνησε τις επιπτώσεις της ΚΟΑ στη ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων εισβολή και τη μετάσταση.

Αποτελέσματα

σταθερή μεσεγχυματικά κύτταρα που απομονώνονται από σταθερό επιθηλιακά κύτταρα καρκίνου του προστάτη συν-καλλιεργημένα με μακροφάγα

Για τη μελέτη των μηχανισμών της EMT στον προστάτη μετάσταση του καρκίνου πρώτα δημιουργείται μια επιθηλιακή μοντέλο κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από λουσιφεράσης θετικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC3 επιθηλιακά. Απομονώσαμε ένα υποπληθυσμό των κυττάρων που εκφράζουν λουσιφεράση που έδειξε ένα σταθερό επιθηλιακά φαινότυπο στον πολιτισμό και έχει οριστεί να τους PC3-Epi. Αυτά τα κύτταρα επιλέχθηκαν με βάση δύο κριτήρια: bioluminescent ένταση και επιθηλιακά κυτταρική μορφολογία. Σύμφωνα με την επιθηλιακά κατάσταση, τα κύτταρα PC3-Epi διατηρείται υψηλή E-cad, χαμηλή βιμεντίνης και μη ανιχνεύσιμη έκφραση της ZEB1 EMT-ενεργοποιητή (Εικόνα 1Α και 1Β)

(Α) Φωτεινό φάσης μικροσκόπιο:. Μορφολογία αλλαγές στα κύτταρα PC3 μεσεγχυματικά-EMT1, PC3-EMT12 και PC3-EMT14 σε σύγκριση με τα επιθηλιακά PC3-Epi καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Ράβδοι κλίμακας είναι 200 ​​μm

(Β) Ανοσοστύπωμα:.. Έκφραση των δεικτών EMT στον καρκίνο μεσεγχυματικά κυτταρικές σειρές PC3-EMT1, -EMT2, -EMT12, -EMT14 και -EMT17 σε σύγκριση με τα επιθηλιακά PC3-Epi

(C) Microarray: Η γονιδιακή έκφραση αναλύσεις συγκρίνοντας μεσεγχυματικών σε επιθηλιακό καρκίνο κυτταρικές γραμμές. Venn διάγραμμα-Ι (VD-Ι) απεικονίζει μια κοινή EMT που σχετίζεται με την υπογραφή εκφράζεται στις γραμμές του καρκίνου μεσεγχυματικά PC3-EMT1, -EMT12 και -EMT14 σε σύγκριση με τα επιθηλιακά PC3-Epi. VD-II -. Gene υπογραφή από VD-Ι διασταυρώνεται με την υπογραφή της ZEB1 σιγήσει κύτταρα PC3-EMT1 και -EMT14 χρησιμοποιώντας το shRNA-SH4, σε σχέση με αγωνίζομαι (SCR) έλεγχος shRNA

(D) Φωτεινότητα μικροσκοπία φάσης: κύτταρα PC3-EMT14 επιμολυσμένα με ZEB1-Τα siRNAs: SH2, SH4, ή Scr. Ράβδοι κλίμακας είναι 100 μm

(Ε) Ανοσοστύπωμα:.. Έκφραση των δεικτών EMT σε PC3-EMT1 και -EMT14 επιμολυσμένα με ZEB1-Τα siRNAs σε σύγκριση με Scr ή μη επιμολυσμένα ελέγχους

(F ) χάρτης θερμότητας: 50 γονίδια υπογραφή προσδιορίζονται στο VD-II (πάνελ C). Ρυθμισμένη προς τα πάνω γονίδια είναι στο κόκκινο, μειωτικά σε μπλε. Πτυχές αλλαγές στα μεσεγχυματικά κύτταρα καρκίνου είναι σχετικές σε επιθηλιακό PC3-Epi, και σε κύτταρα επιμολυσμένα SH4 είναι σχετικές με τον έλεγχο Scr.

Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. Δείτε επίσης το σχήμα S1 και τον πίνακα S1.

Η

επόμενο αναπτύξει ένα μοντέλο μεσεγχυματικά κύτταρα από PC3-Epi, μέσω αλληλεπιδράσεων με τα μακροφάγα. Υποθέσαμε ότι αυτό θα ήταν δυνατό επειδή τα μακροφάγα αντιπροσωπεύουν μία από τις μείζονες φλεγμονωδών κυττάρων-διηθήσεις στο μικροπεριβάλλον του όγκου και έχουν ενοχοποιηθεί σε μετάσταση [15,16]. Συν-καλλιέργεια των IL4 επεξεργασμένου CD14 + μονοκύτταρα (Μ2-μακροφάγα) με PC3-Epi για τέσσερις ημέρες που προκαλείται ισχυρή μορφολογικές αλλοιώσεις συνεπής με EMT, με ταυτόχρονη μείωση της έκφρασης της Ε-CAD και αύξηση της βιμεντίνης (Σχήματα S1A και S1B). Από αυτά τα κύτταρα που απομονώθηκαν μεσεγχυματικά υπο-πληθυσμούς που χαρακτηρίζονται ως PC3-EMT1, PC3-EMT2, PC3-EMT12, PC3-EMT14 και PC3-EMT17. Αυτά τα μεσεγχυματικά κύτταρα επέδειξαν εντυπωσιακή φαινοτυπική μεταβολή και έκφραση ZEB1, ο οποίος διατηρείται σταθερά σε καλλιέργεια (Σχήμα 1Α και 1Β). Σε σύγκριση με τις γονικές επιθηλιακά PC3-Epi τα μεσεγχυματικά κύτταρα εξέφρασαν χαμηλότερα επίπεδα της επιθηλιακής EpCAM μόριο κυτταρικής προσκόλλησης? Ωστόσο, ακόμη περίπου 45% των κυττάρων που εκφράζονται EpCAM στην κυτταρική επιφάνεια όπως αποδεικνύεται με κυτταρομετρία ροής (Εικόνα S1c).

Για να αξιολογηθούν οι αλλαγές γονιδιακή έκφραση που σχετίζονται με EMT πραγματοποιήσαμε τρία μικροσυστοιχιών αναλύσεις, συγκρίνοντας PC3-EMT1, PC3-EMT12 και PC3-EMT14 σε PC3-Epi. Ταυτοποιήσαμε μια υπογραφή 867 γονιδίων που δείχνουν μεταβολές στην έκφραση (κατά 2 φορές ή περισσότερο) σε όλους τους τρεις συγκρίσεις, (VD-I, Σχήμα 1 C). Χρησιμοποιήσαμε Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) να διαπιστώσει τα πιο σημαντικά εμπλουτισμένη μοριακό λειτουργίες που σχετίζονται με αυτή την υπογραφή: «κυψελοειδή κίνηση», «κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό», «κύτταρο-προς-κύτταρο σηματοδότηση και την αλληλεπίδραση ‘ και «κυτταρικό θάνατο» είναι όλοι συνεπείς με EMT (Πίνακας S1). ZEB1, το οποίο ρυθμίζεται αυξητικά στις τρεις συγκρίσεις, έχει ευρέως εμπλακεί σε ΕΜΤ και συντήρηση της κατάστασης μεσεγχυματικών [2,7]. Άλλες ΕΜΤ-επαγωγής παραγόντων μεταγραφής όπως σαλιγκάρι, Slug ή Twist1, συχνά εμπλέκονται στην ογκογένεση και τη μετάσταση [2], δεν είχαν προσδιοριστεί από την κοινή ΕΜΤ υπογραφή του 867 γονίδια που περιγράφονται παραπάνω. Ως εκ τούτου, για την κατανόηση του ρόλου του ZEB1 στο πρόγραμμα ΕΜΤ κύτταρο, επιμολύναμε δύο γραμμές μεσεγχυματικά (PC3-EMT1 και PC3-EMT14) με έναν από τους δύο φορείς λεντοϊών ZEB1-Τα siRNAs: SH2 και SH4, συν το κωδικοποιημένο ελέγχου (SCR). Συνάδουν με το ρόλο ZEB1 στην EMT και τη συντήρηση του κράτους μεσεγχυματικών, αποσιώπηση των ZEB1 που προκαλείται ΚΟΑ σε PC3-EMT1 και PC3-EMT14, με αντίστοιχες αλλαγές στην μορφολογία των κυττάρων (Εικόνα 1D). Επιπλέον, SH2 και SH4 προκάλεσε μια εντυπωσιακή μείωση ZEB1, που αντιστοιχεί σε προς τα πάνω ρύθμιση της Ε-CAD (Σχήμα 1 Ε). Αυτά τα πειράματα υποδεικνύουν έντονα ουσιαστικό ρόλο της ZEB1 στην πολιτεία EMT αυτών των κυττάρων. Όταν το σύνολο των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε κύτταρα επιμολυσμένα SH4 ταιριάστηκε στην υπογραφή EMT (VD-I), βρήκαμε αλλαγές έκφραση σε 50 γονίδια που συσχετίζονται με το ΚΟΑ μετασχηματισμού (VD-ΙΙ, Σχήμα 1 C). Η υπογραφή αυτή έδειξε απέναντι ρύθμιση όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ZEB1-shRNA SH4, σε σχέση με το κωδικοποιημένο ελέγχου (Σχήμα 1 F). Η προσέγγιση αυτή εντοπίστηκαν επίσης ένα σύνολο 4 TFs σημαντικά μειωτικά στα μεσεγχυματικά κύτταρα και υπερεκφράζεται από ZEB1-shRNA:. IRF6, ANKRD22, EHF και OVOL2

OVOL1 και OVOL2 ρυθμίζουν ΚΟΑ στο μοντέλο καρκίνου του προστάτη

Λαμβάνοντας υπόψη τις παρατηρούμενες αλλαγές στην έκφραση των IRF6, ANKRD22, EHF και OVOL2 στο EMT, καθώς και η παρατηρούμενη ανάδρασης μεταξύ ZEB1 και αυτών TFs, εμείς εικάζουν ότι τα σταθερά χαρακτηριστικά EMT διατηρείται κατά τη διάρκεια της διάδοσης των PC3-EMT1 και τα κύτταρα PC3-EMT14 είναι αποτέλεσμα ενός ρυθμιστικού βρόχου ανάδρασης. Επίσης, δεδομένου ότι αυτά τα γονίδια προς τα κάτω σε EMT, που υπερεκφράζουν τους μπορεί να προκαλέσει ΚΟΑ. Αξιολογήσαμε τον ρόλο του καθενός από τα 4 απορυθμίζεται TFs ατομικά μεταγωγή κύτταρα PC3-EMT14 με βραδέος ιού που υπερεκφράζουν κατασκευάσματα. Η έκφραση αυτών των 4 TFs στα κύτταρα ΕΜΤ έδειξε ότι OVOL2 φάνηκε να ρυθμίσει το ΚΟΑ, όπως παρατηρείται από μια αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία. Λαμβάνοντας υπόψη τις ισχυρές ομοιότητες μεταξύ OVOL2 και OVOL1, καθώς και προφανή ρόλο OVOL2 στην ΚΟΑ, έχουμε ακόμη εξεταστεί αν OVOL1 μπορεί να έχει ένα ρόλο στην ΚΟΑ. Αν και OVOL1 δεν πληρούσαν το 2-πλάσιο κατώφλι που πρέπει να περιλαμβάνονται στο γονίδιο μικροσυστοιχιών υπογραφή του ZEB1 knockdown κυττάρων, η ανάλυση έδειξε ότι qPCR είναι ιδιαίτερα ρυθμίζεται αυξητικά στα επιθηλιακά κύτταρα PC3-Epi και ακολουθώντας ZEB1 σίγασης που σε σύγκριση με το μεσεγχυματικά PC3- EMT14 (Σχήμα 2Α και Σχήμα S2A). Επομένως, εξετάσαμε επίσης την έκφραση OVOL1 στα κύτταρα PC3-EMT14 μεσεγχυματικά. Η υπερέκφραση των δύο OVOL1 και OVOL2 προκάλεσε μία αξιοσημείωτη μεταμόρφωση της μορφολογίας των κυττάρων και μια παράλληλη αύξηση στην έκφραση Ε-CAD (Σχήμα 2Β και 2C). Επιπλέον, και οι δύο OVOLs αυξημένη έκφραση του ESRP1 (Σχήμα 2C, αριστερό πάνελ) [17]. Με qPCR εμείς στην συνέχεια αναλύονται οι αλλαγές στην έκφραση αρκετών παραγόντων μεταγραφής ΕΜΤ-επαγωγής: ZEB1, ZEB2, σαλιγκάρι, Slug και Twist1 (Σχήμα 2C, δεξιό πλαίσιο). Μεταξύ αυτών των παραγόντων ZEB1, ZEB2 και Slug αποκάλυψε μια σημαντική μείωση της έκφρασης, η οποία συσχετίζεται με την ΚΟΑ. Επιβεβαιώσαμε ότι οι αλλαγές έκφρασης παρατηρήθηκαν σε OVOL1 και OVOL2 αντιστοιχούν σε αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης με στύπωμα Western (Σχήμα 2D). Στη συνέχεια, σε σύγκριση με κυτταρολύματα από OVOL1 και OVOL2-κύτταρα που υπερεκφράζουν με PC3-Epi, PC3-EMT14-EV, και τα κύτταρα που υπερεκφράζουν το TFs IRF6 και ANKRD22, επίσης ρυθμίζεται από ZEB1 (Σχήμα 1 F). Διάσωση του E-CAD και την απώλεια της βιμεντίνης προκλήθηκαν σε δύο κύτταρα που υπερεκφράζουν Ovol, ενώ καμία σημαντική αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα που εκφράζουν άλλες TFs (IRF6 και ANKRD22) (Σχήμα 2Ε). Παρά το γεγονός ότι qPCR αντανακλούσε μια σημαντική αλλαγή στην έκφραση Slug, η Western δεν δείχνουν μια αλλαγή στο επίπεδο της πρωτεΐνης στα Ovol υπερεκφράζουν κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεταφραστική ρύθμιση μπορεί να διαδραματίσει κάποιο ρόλο στα επίπεδα γυμνοσάλιαγκα. Από τις πέντε TFs ελεγχθεί, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι OVOL1 και OVOL2 είναι το κλειδί επαγωγείς του ΚΟΑ σε αυτά τα κύτταρα

(Α) qPCR:.. Έκφραση mRNA σε PC3-EMT14-SH4 σε σχέση με PC3-EMT14-Scr

(Β) Φωτεινό φάσης μικροσκόπιο: Τα κύτταρα PC3-EMT14 εκφράζουν OVOL1 και OVOL2 επιδεικνύουν μία επιθηλιακά φαινότυπο σε σύγκριση με το γονικό PC3-EMT14. Ράβδοι κλίμακας είναι 100 μm

(C) qPCR:. Έκφραση των δεικτών των επιθηλιακών κυττάρων E-CAD και ESRP1, και οι EMT-προκαλώντας TFs ZEB1, ZEB2, Slug, Snail, και Twist1 σε κύτταρα PC3-EMT14 εκφράζοντας OVOL1 και OVOL2 σε σχέση με τον κενό φορέα-(EV) έλεγχος

(D) Ανοσοστύπωμα:.. πρωτεϊνική έκφραση OVOL1 και OVOL2 σε επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με τη χρήση OVOL1 ή V5-ειδικά αντισώματα, αντίστοιχα

(Ε) Ανοσοστύπωμα: Έκφραση των επιθηλιακών δείκτη E-CAD και δείκτες μεσεγχυματικών ZEB1 και βιμεντίνης. Αλλαγές στην έκφραση Slug ήταν ελάχιστες και δεν σχετίζεται με την ΚΟΑ. κύτταρα PC3-EMT14 εκφράζουν IRF6 ή ANKRD22, EV και επιθηλιακά PC3-Epi είναι οι έλεγχοι

(F) Εισβολή δοκιμασία /μετανάστευση:. Εκπρόσωπος εικόνες και γραφήματα της εισβολής των κυττάρων του καρκίνου χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία θαλάμου Boyden. ιστογράμματα των OVOL1 και OVOL2 κυττάρων που εκφράζουν PC3-EMT14 σχετική EV. Τοις εκατό εισβολή αντιπροσωπεύει την αναλογία εισβολή /μεταναστεύουν κύτταρα. Το γράφημα είναι εκπρόσωπος ενός από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα

(G) qPCR:. Έκφραση των κυττάρων PC3-Epi επιμολυσμένα με OVOL1-Τα siRNAs (α, β, γ) ή OVOL2-Τα siRNAs (δ, ε, στ), σε σχέση με το μη φίμωση έλεγχο PC3-Epi-NS (που αντιπροσωπεύεται από τη διακεκομμένη γραμμή)

(η) Ανοσοστύπωμα:. κύτταρα PC3-Epi επιμολυσμένα με τόσο OVOL1 και OVOL2 Τα siRNAs (sh-OVOL1 /2) δείχνουν μια μείωση στην E-CAD και αύξηση της βιμεντίνης, η οποία προτείνει μια μερική μεταμόρφωση ΕΜΤ

(Ι) Σχηματική:. Ο υποκινητής ZEB1 με δυνητικές θέσεις πρόσδεσης OVOL2 (πορτοκαλί τρίγωνα) σύμφωνα με την γενική συναίνεση: 5′-Α (Α /Τ) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (Τ /Α). έχουν σχεδιαστεί TaqMan ζευγών εκκινητών εμφανίζονται ως μαύρα βέλη. Αρίθμηση είναι σχετική με την θέση μεταγραφικής έναρξης (+1). Η αλληλουχία ενός υποθετική θέση δέσμευσης OVOL2 που αντιστοιχεί στο DNA μάρκα στην κύτταρα που εκφράζουν OVOL2 είναι 320

(J) ChIP qPCR:. (Αριστερά) δείχνει χρωματίνη είσοδο PC3-EMT14-OVOL2 σε σχέση με EV, και καταδεικνύει ότι παρόμοιες ποσότητες DNA χρησιμοποιήθηκαν (δεξιά). απεικονίζει το DNA ChIP χρησιμοποιώντας OVOL2 αντισώματος. Οι εκκινητές που το όνομά του από τα εμπρός αστάρι τους (βλέπε πίνακα Ι). Τα αποτελέσματα ήταν κανονικοποιημένες σε ελέγχους εισόδου. Το γράφημα απεικονίζει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τα τρία με παρόμοια αποτελέσματα.

Αποτελέσματα

qPCR ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Γραφήματα δείχνουν μέση τιμή +/- SEM? Οι τιμές p εκπροσωπήθηκαν ως * ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001. Οι qPCRs και ανοσοκηλιδώσεις είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. Δείτε επίσης το σχήμα S2.

Η

Για να κατανοήσουμε την επίπτωση της Ovol μεσολάβηση ΚΟΑ στην επεμβατική δυναμικό των μεσεγχυματικών κυττάρων PC3-EMT14, χρησιμοποιήσαμε προσδιορισμό θαλάμου Boyden σε κύτταρα που υπερεκφράζουν OVOL1 /2. Και οι δύο OVOLs επηρέασε σημαντικά την ικανότητα εισβολής των PC3-EMT14. Στην περίπτωση της OVOL1, παρατηρήσαμε μειωμένη κυτταρική μετανάστευση, η οποία επηρέασε την αναλογία της εισβολής εναντίον μετανάστευσης (δείκτης εισβολή) (Σχήμα 2F). OVOL2 υπερεκφράζουν κύτταρα παρουσίασαν σημαντική μείωση τόσο εισβολή και τη μετανάστευση, με ένα εξαιρετικά μειωμένο δείκτη εισβολή. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το ρόλο του OVOL1 και OVOL2 στη μείωση της μετανάστευσης και της εισβολής, όπως αναμένεται για ΚΟΑ επαναπρογραμματιστούν κύτταρα.

Χρησιμοποιήσαμε επόμενο Τα siRNAs για OVOL1 (shOVOL1-Α, -Β, -C) και OVOL2 (shOVOL2- d, -Ε, -F), για να μειωθεί η έκφραση τους σε επιθηλιακά κύτταρα PC3-Epi (Σχήμα 2G). Κανένα από τα Τα siRNAs επηρεάζεται η έκφραση Ε-cad. Ωστόσο, σε κύτταρα με μειωμένη έκφραση OVOL2, παρατηρήσαμε μια σημαντική ρύθμιση προς τα άνω (έως 3 φορές) από ZEB1 mRNA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μία 3-φορές μεταβολή στην έκφραση ZEB1 δεν είναι επαρκής για να επάγει ΕΜΤ σε κύτταρα PC3-Epi. Επιπλέον, όπως παρατήρησε qPCR, η έκφραση της ZEB1 είναι πάνω από 20 φορές υψηλότερη σε PC3-EMT14 σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3-Επί (Σχήμα S2A). Επιπλέον, δίνεται η ανάλογη λειτουργία των OVOL1 και OVOL2 στην επαγωγή της ΚΟΑ είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι θα μπορούσαν να υποκαταστήσουν το ένα το άλλο. Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί μια knockdown του μόνο ένα από τα Ovol δεν είναι επαρκής για να προκαλέσει μια σημαντική αλλαγή στην E-cad. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα πραγματοποιήσαμε ένα διπλό νοκ ντάουν με Τα siRNAs για καθένα από τα Ovol-ΤΡ. Παρά το γεγονός ότι δεν γίνεται επιλογή των επιμολυσμένων κυττάρων ήταν δυνατό (και τα δύο shRNA κατασκευάσματα εξέφρασαν GFP), ένας συνολικός πληθυσμός των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με shOVOL1-α και shOVOL2-d (shOVOL1 /2-α /δ) έδειξαν σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της βιμεντίνης και μερική μείωση στην E-cad σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου PC3-Epi-NS (Σχήμα 2Η). Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν έναν κρίσιμο ρόλο των δύο OVOLs στη διατήρηση της επιθηλιακής κατάσταση αυτών των κυττάρων και ως εκ τούτου, θα απαιτείτο ένας διπλός knockdown για να επάγει και να διατηρήσει την κατάσταση μεσεγχυματικά. Κατά συνέπεια, η μεγαλύτερη νοκ ντάουν της OVOL1 και OVOL2 θα προκαλέσει μια πιο πλήρη μετασχηματισμό EMT σε καρκινικά κύτταρα.

Άλλα πειράματα στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη που προκαλείται να υποβληθεί σε EMT οδήγησε σε παρόμοια συμπεράσματα όσον αφορά τη ρύθμιση της Ovol και ZEB1 ΤΡ. Για παράδειγμα, η διαμεμβρανική πρωτεΐνη τετρασπανίνη-8 (TSPAN8) αναγνωρίστηκε στην υπογραφή που φαίνεται στο Σχήμα 1 F ως γονίδιο ρυθμίζεται προς τα πάνω σε κύτταρα ΕΜΤ και ρυθμίζεται προς τα κάτω από ZEB1-shRNA. Η υπερέκφραση του TSPAN8 στα επιθηλιακά κύτταρα PC3-Epi και DU145 οδήγησε σε μερική μεταμόρφωση ΕΜΤ χαρακτηρίζεται από την ρύθμιση προς τα πάνω του ZEB1 και την αρνητική ρύθμιση των Ovol TFs στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα S2B-Ε).

Α μεταγραφικός καταστολέας λειτουργία του OVOL2 δείχθηκε προηγουμένως σε κερατινοκύτταρα, όπου OVOL2 καταστέλλεται c-Myc και Notch 1 [18]. Δεδομένου ότι η έκφραση ZEB1 αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα με μειωμένη OVOL2 (Σχήμα 2G), ελέγξαμε αν OVOL2 αλληλεπιδρά άμεσα με τον υποκινητή ZEB1. Πραγματοποιήσαμε χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα στοχεύουν τον προαγωγό ZEB1 στα κύτταρα ελέγχου PC3-EMT14-OVOL2 και με δύο αντισώματα, αντι-OVOL2 και αντι-V5-tag. Σχεδιάσαμε 7 εκκινητές TaqMan και ανιχνευτές που εκτείνονται τον προαγωγέα από -4848 να +530 bp (Σχήμα 2I) και βρέθηκαν αρκετές πιθανές θέσεις πρόσδεσης OVOL2: 5′-Α (Α /Τ) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (Τ /Α) [18]. Και με τα δύο αντισώματα, παρατηρήσαμε πάνω εμπλουτισμό 50-πλάσια για τον ίδιο /ανιχνευτών-θέση εκκινητή (+ 382 /+ 530), κατά τη σύγκριση OVOL2 εκφράζουν και κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2J και Σχήμα S2B). Σε αντίθεση, χρωματίνη είσοδο και των δύο κυτταρικών τύπων έδειξε παρόμοια ενίσχυση με όλα ζευγών εκκινητών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ειδική σύνδεση του OVOL2 στον υποκινητή ZEB1 στην περιοχή 325, όπου εντοπίστηκε μία συναινετική θέση OVOL2 (Σχήμα 2Θ). Επιπλέον, δεδομένου ότι δεν υπάρχει ειδική χρωματίνη θραύσμα ενισχύθηκε με -115 /+ 29 εκκινητές, είναι απίθανο ότι OVOL2 συνδέεται με τη θέση 115, μία άλλη δυνητική θέση στην εγγύς περιοχή (Σχήμα 2I). Θραύσμα 123 – (- 115) = 238 bp είναι σημαντικά μικρότερο από 530 – (115) = 415 bp? αλλά περίπου το ίδιο μέγεθος με + 530 – (325) = + 205 bp. Ως εκ τούτου, μια σύνδεση προς τη θέση 115 θα συνεπαγόταν μια συγκεκριμένη pull-down ενός χρωματίνης θραύσμα που θα πρέπει να ανιχνευθούν με τους -115 /+ 29 εκκινητές. Μαζί με τα δεδομένα shRNA και της έκφρασης, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι OVOL2 ενεργεί ως άμεσος μεταγραφικός καταστολέας της ZEB1.

Τα μεσεγχυματικά κύτταρα σχηματίζουν όγκους μεσεγχυματικά in vivo

Για να προσδιορίσετε το ογκογόνο δυναμικό των PC3-EMT12 και PC3-EMT14, είμαστε υποδορίως ανοσοκατεσταλμένους NSG ποντίκια. Και οι δύο μεσεγχυματικά καρκινικές κυτταρικές σειρές που σχηματίζονται κυρίως μεσεγχυματικά τύπου όγκοι χαρακτηρίζονται από χαμηλή E-CAD και υψηλής ZEB1, ενώ PC3-Epi όγκων έδειξε υψηλή Ε-CAD και χαμηλή έκφραση ZEB1 (Σχήμα S3A). Είδαμε σημαντικές διαφορές στα ποσοστά ανάπτυξης του όγκου μεταξύ των ομάδων (Σχήμα S3b). Για την εκτίμηση του μεταστατικού δυναμικού των μεσεγχυματικών κυττάρων, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο ποντικού ενδοκαρδιακής ένεσης (ICI) της μετάστασης του καρκίνου [19]. Παρατηρήσαμε περισσότερο ποντικών με μετάσταση σε πολλαπλές θέσεις στις ομάδες ένεση με PC3-EMT12 ή κύτταρα PC3-EMT14 (Σχήμα 3Α). Έδειξαν επίσης υψηλότερη συνολική επιβάρυνση του όγκου (περίπου μία τάξη μεγέθους) και μειωμένη επιβίωση ποντικών, σε σύγκριση με ποντικούς που έχουν εγχυθεί με γονικά κύτταρα PC3-Epi (Σχήμα 3Β και Σχήμα S3C). Ταυτόχρονη χρώση με E-CAD και ZEB1 αντισώματα απέδειξαν ότι μεταστατικό PC3-EMT12 και PC3-EMT14 όγκοι εμφανίζονται τυπικά χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά (χαμηλή E-CAD και υψηλή ZEB1), ενώ οι μεταστατικοί όγκοι από κύτταρα PC3-Epi εμφανίζεται κυρίως επιθηλιακά χαρακτηριστικά (υψηλή Ε- CAD και χαμηλή ZEB1) (Σχήμα 3C και Εικόνα S3D-Ε). Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα (PC3-EMT12 και PC3-EMT14) μορφή μεταστάσεων που διατηρούν το φαινότυπο μεσεγχυματικά. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μερικοί μεταστατικούς όγκους από κύτταρα PC3-Epi εμφάνισαν τόσο μεσεγχυματικών και επιθηλιακών χαρακτηριστικά, αν και η πλειοψηφία των όγκων PC3-Epi κατέδειξαν την επιθηλιακά φαινότυπο (Σχήμα 3C). Το Σχήμα 3C δείχνει ένα ποντίκι ένεση με κύτταρα PC3-Epi, όπου ένας όγκος στον αριστερό μηριαίο οστό ήταν κυρίως μεσεγχυματικά τύπου, ενώ ο όγκος στη δεξιά εμφανίζεται ένα ιδιαίτερα επιθηλιακών φαινότυπο. Είναι σημαντικό, βρήκαμε παρόμοια μεσεγχυματικά-επιθηλιακού κυττάρου πλαστικότητα σε μία μεταστατικού όγκου που απομονώνονται από το μηριαίο οστό ενός ασθενούς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη. IHC χρώση των τμημάτων του όγκου με E-CAD και ZEB1 αντισώματα έδειξαν περιοχές με τόσο υψηλά επιθηλιακά (υψηλής E-cad, χαμηλή ZEB1) και με τα χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών (χαμηλή E-CAD και υψηλή ZEB1) (Σχήμα 3D).

(Α) Μετάσταση:. Το ποσοστό της ICI-εμβολιάζονται ποντίκια με πολλαπλά σήματα λουσιφεράσης σε 21 και 35 ημέρες

(Β) το φορτίο του όγκου: Τα ποντίκια έλαβαν ICI και απεικονίστηκαν εβδομαδιαίως για 35 ημέρες. Η έκφραση λουσιφεράσης αναπαρίσταται ως περιοχές ενδιαφέροντος (ROI-φωτόνια /s)

(C) IHC:. Ταυτόχρονη ZEB1 και χρώση E-CAD μεταστάσεων ανιχνεύονται στο μηριαίο οστό και το ήπαρ των PC3-Epi ή PC3-EMT14 με ένεση ποντικούς. Σημειώστε το μεσεγχυματικά (ZEB1

υψηλής /E-CAD

χαμηλή) (μαύρα βέλη) και επιθηλιακά (ZEB1

χαμηλή /E-CAD

υψηλή) (πράσινα βέλη) καρκινικά κύτταρα, που απεικονίζει την EMT /MET πλαστικότητα των υποπληθυσμών PC3-Epi και PC3-EMT14. Ράβδοι κλίμακας είναι 100 μm (μαύρο) και 20 μm (κόκκινο)

(D) IHC:. ZEB1 ή E-CAD χρώση της μετάστασης από το μηριαίο οστούν ενός ασθενούς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη. Σημειώστε το μεσεγχυματικά-όπως (ZEB1

υψηλή (μαύρα βέλη) /E-CAD

χαμηλή (κίτρινα βέλη)) και επιθηλιακά (ZEB1

χαμηλή /E-CAD

υψηλή (πράσινα βέλη)) καρκίνου κύτταρα. Ράβδοι κλίμακας που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν 100 μm (μαύρη γραμμή) και 50 μm (κόκκινη γραμμή)

(Ε) Μετάσταση:.. Το ποσοστό της ICI-εμβολιάζονται ποντίκια με πολλαπλά σήματα λουσιφεράσης σε 21 και 35 ημέρες

(F) φορτίο όγκου: τα ποντίκια έλαβαν ICI και απεικονίστηκαν εβδομαδιαίως για 35 ημέρες. Η έκφραση λουσιφεράσης απεικονίζεται ως περιοχές ενδιαφέροντος (ROI-φωτόνια /s)

(G) IHC:. ZEB1 ή E-CAD χρώση των μεταστάσεων σε ICI-ποντίκια. Σημειώστε το υψηλότερο E-CAD και χαμηλότερη έκφραση ZEB1 στα μεταστατικά κύτταρα που εκφράζουν OVOL1 ή ZEB1-shRNA (SH4). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 100 μm

Τα διαγράμματα δείχνουν την μέση τιμή +/- SEM.? p-τιμές υπολογίστηκαν και παρουσιάζονται ως * ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0.01. Όλες οι εικόνες IHC είναι αντιπροσωπευτικά του ενός από τα τρία τμήματα που παρουσιάζουν παρόμοια αποτελέσματα. Βλέπε επίσης Σχήμα S3.

Η

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχήμα 2Β-Ε, η επίδραση της υπερέκφρασης OVOL1 είναι παρόμοια με OVOL2. Και οι δύο προκαλέσουν ΚΟΑ και ZEB1 αρνητική ρύθμιση. Επιπλέον ZEB1-shRNA επάγει την έκφραση και των δύο OVOL1 και OVOL2 και ΚΟΑ στο μεσεγχυματικά PC3-EMT14 κύτταρα (Εικόνα 2Α). Για να διευκρινιστεί ο ρόλος του Ovol TFs στο μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων, μπορούμε εμβολιάσθηκαν ποντικοί μέσω ICI με επιθηλιακά κύτταρα που υπερεκφράζουν OVOL1 (PC3-EMT14-OVOL1), ZEB1-shRNA (PC3-EMT14-SH4) ή το περιπλεγμένο ελέγχου (PC3- EMT14-SCR). Εκτιμήσαμε την εξέλιξη του όγκου με βιοφωταύγεια και παρατήρησε ότι η προκαλούμενη ΚΟΑ σε κύτταρα PC3-EMT14 μειωθεί σημαντικά μεταστατικό δυναμικό. Τόσο ZEB1-shRNA και έκφραση OVOL1 μείωσε τον αριθμό των ποντικών με μετάσταση όγκου σε πολλαπλές θέσεις (Σχήμα 3Ε). Επιπλέον, η συνολική επιβάρυνση του όγκου μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τα ποντίκια ένεση με κύτταρα ελέγχου PC3-EMT14-SCR (Σχήμα 3F). IHC χρώση μεταστατικών όγκων με E-CAD και ZEB1 αποκάλυψε ότι είχε λάβει χώρα σε καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν OVOL1 ή ZEB1-shRNA, όπως υποδεικνύεται από τις θετικές E-CAD και μείωσε ZEB1 έκφραση σε αντίθεση με τα κύτταρα ελέγχου μεσεγχυματικά (Σχήμα 3G).

Ovol επαγόμενη ΜΕΤ μειώνει την μεταστατικό δυναμικό των μεσεγχυματικών κυττάρων καρκίνου

Για να διερευνηθεί περαιτέρω το μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων Ovol εκφράζουν, χρησιμοποιήσαμε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού καρκίνου του προστάτη [20]. Στην ανάλυσή βιοφωταύγεια, είδαμε ένα παρόμοιο συνολικό φορτίο του όγκου (ROIs) σε όλες τις ομάδες (Εικόνα 4Α). Είκοσι οκτώ ημέρες μετά τον εμβολιασμό, ο αριθμός των ποντικών με μεταστάσεις ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα που εγχύθηκε με κύτταρα Ovol εκφράζουν (Σχήμα 4Β και 4C). Εμείς εκτομή πρωτοπαθείς όγκους 42 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, καταγράφονται τα βάρη τους, και αναλύθηκαν τομές όγκων με IHC. Ορθοτοπική βάρη του όγκου του προστάτη ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ποντίκια που εμβολιάστηκαν με PC3-EMT14-OVOL2, ενώ τα ποντίκια που ενέθηκαν με PC3 κύτταρα ελέγχου-EMT14 έδειξε τα χαμηλότερα βάρη (Εικόνα 4D). Η παρατηρούμενη μείωση του μεταστατικού δυναμικού κύτταρα Ovol εκφράζουν στο μοντέλο μας συσχετίζεται με μια προηγούμενη έκθεση που δείχνει ότι τα ποντίκια με μεγαλύτερες ορθοτοπική όγκους του προστάτη είχαν μειωμένο μεταστατικό φορτίο [20]

(Α) Tumor βάρος:. Έκφραση λουσιφεράσης απεικονίζεται ως περιοχές ενδιαφέροντος (ROI-φωτόνια /s) σε ποντίκια με ορθοτοπική ενέσεις

(Β) Μετάσταση:. (αριστερά) το ποσοστό των ορθοτοπικώς εμβολιάζονται ποντίκια με πολλαπλά σήματα λουσιφεράσης σε 21 και 28 ημέρες (Δεξιά ). απεικονίζει το συνολικό αριθμό των μεταστάσεων ανά ομάδα διαιρεμένος με τον αριθμό των ποντικών (n) ανά ομάδα στις 28 ημέρες

(C) Imaging:. Αντιπροσωπευτικές εικόνες λουσιφεράσης έκφραση σε ποντικούς 28 ημέρες μετά τη λήψη ορθοτοπική ενέσεις. . Οι μεταστάσεις για κάθε ομάδα σε κόκκινο κύκλο είτε τα κοιλιακά ή ραχιαία εικόνες και με εξαίρεση εκείνα υποψία ότι αντιστοιχούν στην ίδια όγκου

(D) Tumor Βάρος: Τα μέσα βάρη των ορθοτοπική (προστάτη) όγκους εκτομή στους 42 ημέρα (n = 4)

(Ε) IHC:. E-cad, και ZEB1 χρώση μεταστατικών όγκων σε ποντικούς που έλαβαν ενέσεις ορθοτοπική από κάθε ομάδα εμβολιάστηκαν με κύτταρα που εκφράζουν Ovol ή ελέγχου PC3-EMT14. Σημειώστε την υψηλότερη E-CAD και χαμηλότερη έκφραση ZEB1 σε Ovol εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 100 μm. Η IHC παρουσιάζει μια αντιπροσωπευτική χρώση του ενός από τα τρία τμήματα με παρόμοια αποτελέσματα

Τα διαγράμματα δείχνουν την μέση τιμή +/- SEM.? p-τιμές υπολογίστηκαν και παρουσιάζονται ως ** p & lt? 0.01. Δείτε επίσης το Σχήμα S4.

Η

IHC χρώση των όγκων αποκάλυψε ότι οι όγκοι PC3-EMT14 (ορθοτοπική και μεταστάσεις) είναι κυρίως μεσεγχυματικά και είναι ως επί το πλείστον αρνητικά για την έκφραση E-CAD και θετικά για ZEB1 (Σχήμα 4Ε και Εικόνα S4A). Αυτά τα μεσεγχυματικά κύτταρα μπορούν να πολλαπλασιαστούν και να σχηματίσουν τη μετάσταση. Αυτό καταδείχθηκε περαιτέρω με Κί67 θετική χρώση των αρνητικών κυττάρων E-CAD στο μεταστατικό τομές όγκων ποντικών PC3-EMT14 (Σχήμα S4B). Αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα παροδικής ΚΟΑ που ακολουθείται από EMT, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα δεν χρειάζεται να υποβληθούν σε ΚΟΑ να αποικίσουν τον όγκο. Σε αντίθεση, τα κύτταρα που εκφράζουν Ovol-σχηματίζονται ορθοτοπική όγκων και μεταστάσεων με ισχυρές επιθηλιακά φαινότυπο, που χαρακτηρίζεται από υψηλή έκφραση της Ε-CAD και μείωσε ZEB1? γεγονός που υποδηλώνει έντονα ότι η Ovol-ΤΡ προκαλέσει και να σταθεροποιήσει ΚΟΑ σε αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 4Ε και Εικόνα S4A).

Ovol TFs ενορχηστρώσει μια μεταγραφική και μάτισμα-κανονιστικό πρόγραμμα που προκαλεί ΚΟΑ σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

επόμενο κοίταξε για συνεπή αποτελέσματα χρησιμοποιώντας συστοιχίες ιστών cDNA από τα τμήματα ανθρώπινων όγκων καρκίνου του προστάτη (n = 40), αξιολογώντας την έκφραση της E-cad, OVOL1 και OVOL2. Για να αποδειχθεί η συσχέτιση μεταξύ της E-CAD και Ovol έκφρασης που ομαλοποιήθηκε κάθε δείγμα αξίας με τη μέση τιμή για όλα τα δείγματα όγκων. Παρατηρήσαμε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ E-CAD και OVOL1 (r = 0,66) και OVOL2 (r = 0,7) σε όλες τις δοκιμασμένες ιστούς όγκων του προστάτη (Σχήμα 5Α)

(Α) qPCR:. CDNA από ανθρώπινα πρωτογενή καρκίνο του προστάτη ιστούς (n = 40? ΟηΟεηε) αναλύθηκε για την έκφραση της Ε-cad, OVOL1 και OVOL2. Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και εμφανίζονται σε σχέση με το μέσο όρο όλων των δειγμάτων καρκίνου για κάθε γονίδιο, όπως:.

log ((Αξία της Gene (Χ) για ένα δείγμα) /(Αξία της Gene (Χ ) για μέση Καρκίνου)). Οι τιμές του δείγματος φαίνεται στα διαγράμματα στιγμών και η συσχέτιση των OVOL1 ή OVOL2 έκφρασης με E-CAD υπολογίστηκε (R). Το γράφημα απεικονίζει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από δύο παρόμοια αποτελέσματα με

(Β) διάγραμμα Venn:. Απεικονίζει τα RNA-seq αποτελέσματα των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων κοινά στην Ovol κύτταρα που εκφράζουν και PC3-Epi, σε σχέση με PC3- EMT14. Η τομή των Α και Β αντιπροσωπεύει ένα κοινό επιθηλιακά μεταγραφικό υπογραφή του 277 γονιδίων. Τα δεδομένα RNA-seq αναλύθηκε από τουλάχιστον δύο βιολογικούς επαναλήψεις για κάθε κυτταρική σειρά

(C) Dot οικόπεδο:. Έκφραση συσχέτιση αναλύσεις των 277 γονιδίων που ταυτοποιούνται στην επιθηλιακή υπογραφή από τον πίνακα (Β). Συσχέτιση απεικονίζεται μεταξύ των PC3-Epi, PC3-EMT14-OVOL1 ή PC3-EMT14-OVOL2

(D) διάγραμμα Venn:. Συγκρίνει τα αποτελέσματα από τον πίνακα (Β) με τα γονίδια που σχετίζονται με την έκφραση της OVOLs σε 917 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Από τα 129 γονίδια που συσχετίζονται (R & gt? 0,5) με την έκφραση OVOLs στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του 917, οι 67 γονίδια που επάγονται από την έκφραση τόσο της OVOL1 και OVOL2 σε PC3-EMT14 (C τομής D)

(Ε) χάρτης θερμότητας: ConceptGen ανάλυση των 67 γονιδίων-υπογραφή από τον πίνακα (Δ) αποκάλυψε μια λίστα των 18 σχολιασμένη γονιδίων με τις λειτουργίες που σχετίζονται με την επιθηλιακά κατάσταση των κυττάρων

(F) Πίνακας:. 45 γονίδια συσχετίζεται αρνητικά με OVOL2 έκφρασης (r & lt? -0,5) απέναντι 917 καρκινικές κυτταρικές γραμμές. Μεταξύ αυτών των 45 γονιδίων, τα 10 εμφανίζονται επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω από την έκφραση OVOL2 σε PC3-EMT14. §§2.086.13/4.812.91/2.31+NM_016351ADAM221.000.400.4+NM_014324AMACR5.292.350.45+NR_036556ANKRD540.9900+NM_001010986ATP11C4.321.500.35+NM_174957ATP2A30.2600+NR_024597C11orf7300.46INF+NM_001001389CD440.395.1313.20+NM_001185177CES300.31INF+NM_203356CTAGE50.550.130.24+NM_001085460CTNND112.895.420.42+NM_133375DIS3L1.5000+NM_004432ELAVL21.450.370.26+NM_001135023ELMOD3*0.352.497.06+NM_001135022ELMOD3*3.761.850.49+NM_203343EPB4100.97INF+NM_001184939EPB41L5*1.493.662.47+NM_020909EPB41L5*1.740.620.36+NM_017848FAM120C1.860.920.5+NM_001015045FAM13A3.331.560.47+NM_001134456FAM55C5.552.650.48+NM_000802FOLR10.060.325.44+NM_001018100GCOM11.144.523.96+NM_001193322IKBKE0.9000+NM_016291IP6K26.1000+NM_177535_1MAGED4B9.113.070.34+NM_145687MAP4K422.7410.810.48+NM_001042453MST400.31INF+NM_022764MTHFSD1.670.750.45+NM_203318MYO18A2.385.782.43+NM_001098623OBSCN0.220.673+NM_001128629PAK63.016.252.07+NM_001166109PALLD1.846.803.69+NM_001146105PARP95.5311.412.06+NM_001184917PCYT21.103.142.85+NM_153321PMP2213.015.040.39+NM_182948PRKACB3.740.900.24+NM_001164758PRKAR1B*1.404.293.06+NM_001164759PRKAR1B*5.132.190.42+NM_002840PTPRF1.696.523.85+NM_144489RGS35.161.430.28+NM_138484SGOL100.41INF+NM_001135054SIGIRR15.506.130.4+NM_020428SLC44A2*5.8922.833.88+NM_001145056SLC44A2*28.715.320.19+NM_001104590SLFN111.800.600.33+NM_001184749SLITRK40.280.090.32+NM_001128210SPRED24.300.370.09+NM_001198531TCF7L22.050.740.36+NM_001167912VEPH14.4100+NM_014667VGLL42.556.172.41+NM_139119YY1AP12.084.912.36+NM_001145448ZNF2000.500.150.3+Table 0,01? 0.001.