Αφηρημένο

Ιστορικό

Celastrol είναι ένας φυσικός αναστολέας πρωτεασώματος που παρουσιάζει ελπιδοφόρα αντι- επιδράσεις όγκου σε ανθρώπινες κακοήθειες, ειδικά το ανδρογόνο-ανεξάρτητου καρκίνου προστάτη (AIPC) με συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ. Celastrol επάγει την απόπτωση μέσω της αναστολής του πρωτεασώματος και καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων του προστάτη. Ωστόσο, η λεπτομερής μηχανισμός δράσης παραμένει άπιαστο. Στην παρούσα μελέτη, στόχος μας είναι να ελεγχθεί η υπόθεση ότι celastrol καταστέλλει AIPC εξέλιξης μέσω της αναστολής της συστατικής δραστικότητας NF-κΒ, καθώς και τη διαμόρφωση των πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εξετάσαμε την αποτελεσματικότητα της celastrol τόσο

in vitro

και

in vivo

και αξιολογούνται το ρόλο του ΝΡ-κΒ σε celastrol μεσολάβηση AIPC παλινδρόμησης. Βρήκαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων celastrol ανέστειλε στις τρεις κυτταρικές σειρές AIPC (PC-3, DU145 και CL1), με IC

50 στην περιοχή των 1-2 μΜ. Celastrol κατέστειλε επίσης την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Celastrol επάγεται σημαντικά απόπτωση όπως αποδεικνύεται από αύξηση του πληθυσμού υπο-G1, ενεργοποίηση της κασπάσης και διάσπαση PARP. Επιπλέον, celastrol προωθείται διάσπαση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Mcl-1 και ενεργοποίησε την προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Noxa. Επιπλέον, celastrol μπλοκάρει γρήγορα κυτοσολικής υποβάθμιση ΙκΒα και την πυρηνική μετατόπιση της ΚεΙΑ. Ομοίως, celastrol ανέστειλε την έκφραση πολλαπλών γονιδίων στόχων του ΝΡ-κΒ που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και αντι-απόπτωσης. Celastrol κατέστειλε την εξέλιξη του όγκου AIPC αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό, αυξάνοντας την απόπτωση και τη μείωση της αγγειογένεσης, σε PC-3 μοντέλο ξενομοσχεύματος σε γυμνό ποντίκι. Επιπλέον, αυξημένη κυτταρική ΙκΒα και ανέστειλε την έκφραση διαφόρων γονιδίων στόχων του NF-κΒ παρατηρήθηκαν σε ιστούς όγκων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι, μέσω της στόχευσης του πρωτεασώματος, celastrol καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, εισβολή και αγγειογένεση με επαγωγή την αποπτωτική μηχανήματα και εξασθένηση συστατική δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε AIPC τόσο

in vitro

και

in vivo

. Celastrol ως ενεργό συστατικό παραδοσιακών φυτικών φαρμάκων θα μπορούσε έτσι να αναπτυχθεί ως ένα νέο θεραπευτικό μέσο για ορμόνη-ανθεκτικό καρκίνο προστάτη

Παράθεση:. Dai Υ, DeSano J, Tang W, Meng Χ, Meng Υ, Burstein Ε , et al. (2010) Φυσικό Proteasome Αναστολέας Celastrol Καταστέλλει ανδρογόνων-Ανεξάρτητη Καρκίνος του προστάτη Εξέλιξη διαμορφώνοντας αποπτωτικών πρωτεϊνών και NF-κΒ. PLoS ONE 5 (12): e14153. doi: 10.1371 /journal.pone.0014153

Συντάκτης: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Ιουλ του 2010? Αποδεκτές: 10 του Νοέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 10 του Δεκεμβρίου του 2010

Copyright: © 2010 Dai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από Υπουργείο άμυνας του καρκίνου του προστάτη Ερευνητικό Πρόγραμμα [W81XWH-06-1-0010] και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου [R01 CA121830 (S1), R21 CA128220 και R01 CA134655] για LX, καθώς και από ΝΙΗ μέσω του Πανεπιστημίου του Michigan Αντικαρκινικού Κέντρου Grant υποστήριξης [5 P30 CA46592]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το πρωτεάσωμα είναι ένα σύμπλοκο πολυκαταλυτικής πρωτεάσης υπεύθυνη για την αποδόμηση των πολλαπλών ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές εκδηλώσεις, συμπεριλαμβανομένης της επισκευής του DNA, του κυτταρικού κύκλου, την επιβίωση και απόπτωση. Για παράδειγμα, ρ27, ένας ρυθμιστής κλειδί στον G1 σε S μετάβαση του κυτταρικού κύκλου, ταχέως ουβικουιτινωμένης και αποικοδομείται από πρωτεασώματα που οδηγεί σε σύντομη ημιζωή ρ27 [1]. Επίσης, οι περισσότεροι οικογένειας Bcl-2 πρωτείνες διασπώνται από το σύστημα ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος (UPS) [2], [3], [4]. Πυρηνικού παράγοντα κΒ (ΝΡ-κΒ) είναι ένας σημαντικός παράγοντας προ-επιβίωσης που είναι περιστροφικά ρυθμίζεται από το πρωτεάσωμα, αφού είναι γνωστό ότι στην κλασική οδό NF-κΒ, ΙκΒα, ο συμπλεκτικό του ΝΡ-κΒ, αποικοδομείται από την πρωτεασώματος, επομένως απελευθερώνοντας NF-κΒ ενεργοποίησης [5].

Συναρμολόγηση απόδειξη αποκαλύπτει ότι παρατεταμένη ή συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ συμβάλλει στην κακοήθη εξέλιξη και θεραπευτική αντίσταση στους περισσότερους ανθρώπινους καρκίνους [6]. Για παράδειγμα, σε καρκίνο του προστάτη, συστατικώς δραστική ΝΡ-κΒ έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται αντιστρόφως με την κατάσταση του υποδοχέα ανδρογόνων και να συνδέεται με ανδρογόνων αντίσταση ανεξαρτησία και θεραπεία [7]. Η υπερυψωμένη ΝΡ-κΒ που επιβιώνουν μονοπατιού σηματοδότησης στην μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη (AIPC) φαίνεται να συσχετίζεται με την υψηλή δραστικότητα πρωτεασώματος, όπως αντανακλάται από μια ταχύτερη κύκλο εργασιών ΙκΒα [8], [9]. Με βάση αυτά τα στοιχεία, η στόχευση πρωτεασώματα μπορούσε να μειώσει την δραστικότητα ΝΡ-κΒ και ως εκ τούτου να είναι μια χρήσιμη στρατηγική AIPC παρέμβαση. Στην πραγματικότητα, η ρύθμιση της λειτουργίας του πρωτεασώματος με ειδικούς αναστολείς έχει ήδη αποδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. Bortezomib (Velcade? PS-341), η πρώτη που χρησιμοποιεί έναν αναστολέα πρωτεασώματος σε μία κλινική εφαρμογή, έχει επιδείξει δραστικότητα κατά του όγκου όταν χρησιμοποιείται ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με συμβατικές θεραπείες σε ορμόνες καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού [10]. Σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου, αναστολείς πρωτεασώματος επάγουν απόπτωση καρκίνου του προστάτη τόσο

in vitro

και

in vivo

[11], [12], παρέχοντας σημαντικές ενδείξεις ότι οι αναστολείς πρωτεασώματος μπορεί να εφαρμοστεί ως ένα θεραπευτικό στρατηγική για AIPC.

Celastrol είναι ένας φυσικός αναστολέας πρωτεασώματος που έχει αναφερθεί ότι εμφανίζουν αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα και την απόπτωση σε πολλά προκλινικά μοντέλα καρκίνου του [12], [13]. Μηχανιστικά, NF-κΒ έχει δειχθεί ότι είναι ένας βασικός στόχος της celastrol [14]. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι μπορεί να ενισχύσει την celastrol απόπτωση και μπλοκάρουν είτε ιδιοσυστατική ή επαγόμενη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ με άλλους θεραπευτικούς παράγοντες, όπως ο παράγοντας νέκρωσης όγκου [15], η τεμοζολομίδη [16] και gambogic οξύ [17]. Επιπλέον, celastrol προτείνεται να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύτηκε μέσω στόχευσης της αγγειογένεσης [18], [19]. Στη ρύθμιση του καρκίνου του προστάτη, celastrol μόνος πυροδοτεί την απόπτωση μέσω της αναστολής πρωτεασώματος και καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη [12]. Ωστόσο, η άμεση μηχανισμός δράσης παραμένει άπιαστο. Στην παρούσα μελέτη, στόχος μας είναι να ελεγχθεί η υπόθεση ότι celastrol καταστέλλει AIPC εξέλιξης μέσω της αναστολής της συστατικής δραστικότητας NF-κΒ, καθώς και τη διαμόρφωση των πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2. Προσδιορίσαμε την αποτελεσματικότητα του celastrol τόσο

in vitro

και

in vivo

και αξιολογούνται το ρόλο του ΝΡ-κΒ σε celastrol μεσολάβηση AIPC παλινδρόμησης.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και Cell Culture

Celastrol (98% καθαρότητα) αγοράστηκε από τη Γαία Χημικών (Gaylordsville, CT). Η σκόνη επιλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αποθηκεύονται ως κλάσματα (20 mM) στους -70 ° C. MG-132 αγοράστηκε από την Biomol (Plymouth Meeting, ΡΑ). κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης παρεσχέθη από τη Roche (Indianapolis, ΙΝ). Τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma εκτός και αν αναφέρεται διαφορετικά. Ανθρώπινα προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές PC-3, DU145 και LNCaP αγοράσθηκαν από την American Type Culture Collection. Ο καρκίνος του προστάτη κυτταρική γραμμή ανεξάρτητου από ανδρογόνα CL1, που προέρχεται από την κυτταρική σειρά LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα [20], χορηγήθηκε ευγενώς από το Δρ Arie Belldegrun (Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας, Λος Άντζελες, CA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (PC-3) ή ϋΜΕΜ (DU145, LNCaP και CL1) συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και επωάστηκαν σε 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα και υποβάλλεται σε επεξεργασία με celastrol εις τριπλούν. Μετά από 4 ημέρες επώασης, τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ μέτρησης κυττάρων με WST-8 (Dojindo, Rockville, MD) και η απορρόφηση ελέγχθηκε σε 450 nm χρωματομετρικώς. Η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) ήταν ο λόγος της απορρόφησης του επεξεργασμένου δείγματος να μη επεξεργασμένο μάρτυρα [21], [22]. Εναλλακτικά, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκα σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με celastrol εις διπλούν φρεάτια. Προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν μετρητή κυττάρων Coulter (Fullerton, CA) κάθε 24 ώρες για 4 ημέρες. Ο κυτταρικός θάνατος ελέγχθηκε με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου και για τα δύο επιπλέοντα και συνδεδεμένα κύτταρα [21], [23]. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς και αναλύθηκαν με GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA). ανασταλτικές συγκεντρώσεις πενήντα τοις εκατό (IC

50) υπολογίστηκαν με τη χρήση ανάλυσης σιγμοειδή δόσης-απόκρισης μη γραμμικής παλινδρόμησης (Prism 5.0) [21], [22], [24].

τηλέφωνα Μετανάστευση

η κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία «επούλωση πληγών» [25], [26]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων και αυξήθηκαν για 48 ώρες για να φθάσουν σε συρροή. Κενά δημιουργήθηκαν τεχνητά από το ξύσιμο του μονοστοιβάδα κυττάρων. Η μετανάστευση των κυττάρων φωτογραφήθηκε 6 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες μετά από κάθε μηδέν. Τα κύτταρα μεταναστεύουν στην απογυμνωμένη περιοχή βαθμολογήθηκαν από τέσσερα τυχαία πεδία.

τηλέφωνα εισβολή

Εισβολή ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας Transwell (8 μm πόρων) προ-φορτωμένο με Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA ). Τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς celastrol (1 μΜ) σε ένα μέσο χωρίς ορό και φορτώνεται στην κορυφή του θαλάμου (2 × 10

4 /ένθετο). Το πλήρες μέσο (10% FBS) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο για να δημιουργήσει ένα χημειοελκυστικό. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την σπορά των κυττάρων, τα ένθετα σκουπίστηκαν με βύσμα βάμβακα για την απομάκρυνση του Matrigel, και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (0.1%). Εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω πλευρά του φίλτρου βαθμολογήθηκαν από οκτώ τυχαίων πεδίων.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους 4 ° C όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ιωδιούχο προπίδιο ( ΡΙ, 50 μg /ml) και RNase Α (1 μg /ml) για 30 λεπτά. Τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACScalibur, BD Biosciences). Ο πληθυσμός υπο-G1 βαθμολογήθηκε από υποδιπλοειδή περιεχόμενο του DNA [24], [27]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση WinMDI 2,8 λογισμικού (Purdue University κυτταρομετρίας Εργαστήριο).

κασπάσης Ενεργοποίηση

Τα κύτταρα ομογενοποιούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (BioVision, Mountain View, CA), και λύματα ολόκληρων κυττάρων (40 μα) επωάστηκαν με 20 μΜ του φθορισμογόνου υποστρώματος LEHD-AFC ή DEVD-AFC σε ένα ρυθμιστικό αντίδρασης (BioVision) που περιείχε 5 mM DTT στους 37 ° C για 1 ώρα. Η πρωτεολυτική απελευθέρωση του AFC παρακολουθήθηκε σε λεχ = 405 nm και λem = 500 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού (BMG LABTECH, Cary, NC). Η δραστικότητα εκφράζεται ως «πλάσια αύξηση», και υπολογίζεται ως η αναλογία του σήματος φθορισμού σε επεξεργασμένα δείγματα με μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου.

Western Blot

Προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου από κύτταρα ή ιστούς όγκων έγιναν και πειράματα κηλίδος Western διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Αντισώματα έναντι πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) (F-2), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (C-2), ουβικιτίνης (P4D1), κασπάσης-3 (Η-277), ΙκΒα (C-15), ΚεΙΑ (F-6), τουμπουλίνη (4G1) και GAPDH (L-20) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντι-Noxa αντίσωμα αγοράσθηκε από την Calbiochem (Gibbstown, NJ). Αντι-β-ακτίνης (AC-74) αντίσωμα ελήφθη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). πυκνότητα Band ποσοτικοποιήθηκε με λογισμικό TotalLab (Durham, NC).

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

κυτταρολύματος και πυρήνων κλάσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [24], [25]. Εν συντομία, κυτοσολικό εκχύλισμα ελήφθη με ομογενοποίηση κυττάρων σε ένα υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα [10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2 και 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT) με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης], ακολουθούμενη από την προσθήκη του Igepal CA- 630 (0,5%). Τα σφαιρίδια διαχωρίστηκαν σε υπερτονικό ρυθμιστικό (20 mM HEPES, 50 mM ΚΟΙ, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, και αναστολείς πρωτεασών) για να ληφθούν πυρηνικών εκχυλισμάτων. Υποκυτταρική πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν με δοκιμασία Bradford πριν κηλίδος Western.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR)

qPCR διεξήχθη για να προσδιοριστεί η έκφραση του γονιδίου-στόχου NF-κΒ [28]. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA ελήφθη με αντίστροφη μεταγραφή με 1 μg του ολικού RNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ TaqMan Reverse Transcription (Applied Biosystems). SYBR Green χρησιμοποιήθηκε για ποσοτική PCR. Οι αλληλουχίες του γονιδίου εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα S1. Αντιδράσεις με TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems) πραγματοποιήθηκαν στο Mastercycler

realplex

2 σύστημα S (Eppendorf, Westbury, Νέα Υόρκη). επίπεδα του mRNA των γονιδίων στόχων κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH με τον τύπο: [2∧- (C

T-στόχου C

T ακτίνη)] χ 100%, όπου Ο

Τ είναι ο κύκλος ορίου [27] . έκφραση mRNA εκφράζεται ως «πλάσια αύξηση» και υπολογίστηκε διαιρώντας την κανονικοποιημένη έκφραση του γονιδίου-στόχου του δείγματος υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου.

Μελέτη ζώων

Θηλυκά αθυμικά ηυ /ηυ ποντίκια (5 εβδομάδων) εμβολιάσθηκαν υποδορίως (sc) με PC-3 κύτταρα (3 χ 10

6) και στις δύο πλευρές του κάτω μέρος της πλάτης. Όταν οι όγκοι αναπτύχθηκαν σε 100 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν και έλαβαν θεραπεία καθημερινά μέσω στοματικής σίτισης (ρ.ο.) με τον έλεγχο του οχήματος [12] ή celastrol σε δόση 1 mg /kg με 5 ημέρες την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε την τελευταία δοσολόγηση celastrol (ημέρα 18). Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σαν (μήκος Χ πλάτος

2) /2. δείγματα όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και εγκλείστηκαν με παραφίνη. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση εκτελέστηκε με Ki67, τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης βιοτίνη-dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL), και χρώση CD31 για την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης και της αγγειογένεσης, αντίστοιχα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [23], [26] . Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα εγκεκριμένα από το Πανεπιστήμιο του Michigan Οδηγίες για τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων.

Στατιστική Ανάλυση

Δύο ουρά του Student

t-test

WAS που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση τόσο

in vitro

και

in vivo

δεδομένων. Όλα ανάλυση διεξήχθη με GraphPad Prism 5.0. Ένα όριο των

P

& lt?. 0,05 ορίστηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Celastrol Αναστέλλει τον καρκίνο του προστάτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Celastrol έχει αναφερθεί να παρουσιάζουν αντικαρκινική δραστικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη [12]. Στη μελέτη μας, επιβεβαιώσαμε ότι celastrol μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και στις δύο ανδρογόνων που εξαρτώνται (LNCaP) και ανδρογόνα-ανεξάρτητο (-3 PC, DU145, CL1) κύτταρα καρκίνου του προστάτη, με ένα IC

50 κυτταροτοξικότητα μικρότερη από 2 μΜ ( Σχ. 1Α). Για κύτταρα PC-3, celastrol ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό δοσοεξαρτώμενο (Εικ. 1Β), με 65% αναστολή αύξησης στο IC

50 δόσης (~ 1 μΜ) την ημέρα 3. Στο 2 μΜ, celastrol ανέστειλε πλήρως την ανάπτυξη των κυττάρων σε οι κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι celastrol μειώνεται σταθερά πολλαπλασιασμού AIPC κυττάρου και βιωσιμότητα στις συγκεντρώσεις & lt? 2 μΜ

(Α): τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες δόσεις celastrol και κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ.. IC

50 φάνηκε όπως υπολογίζεται από Prism 5.0. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD (η = 3). (Β): τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις του celastrol (Cel). Προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν κάθε μέρα για 4 ημέρες. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD (n = 6).

Η

Celastrol Καταστέλλει τη Μετανάστευση και την εισβολή

Όπως μια υψηλότερη συγκέντρωση της celastrol ήταν κυτταροτοξικά (Εικ. 1), αξιολογήσαμε την επίδραση της celastrol για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή χρησιμοποιώντας μη τοξικές δόσεις (& lt? 1 μΜ). Celastrol ανέστειλε PC-3 κυτταρική μετανάστευση τόσο μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2Α). Με συγκεντρώσεις (0,5 μΜ) που επηρεάζεται ελάχιστα πολλαπλασιασμό, celastrol εμπόδισε την κυτταρική κινητικότητα 24 ώρες μετά τη θεραπεία (

P

& lt? 0.001, Σχήμα 2Β.). Επιπλέον, DU145 εισβολή των κυττάρων αναστάλθηκε σε 70% έως 1 μΜ celastrol (

P

& lt?. 0,001, Σχήμα 2C και D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι celastrol καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση AIPC και εισβολή σε subcytotoxic συγκεντρώσεις

(Α):. PC-3 κύτταρα μονοστοιβάδας ήταν γδαρμένο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με celastrol σε 0.5 και 1 μΜ. «Επούλωση πληγών» δοκιμάστηκε σε 6 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες μετά το μηδέν. Αρχική μεγέθυνση, × 100. (Β): ποσοτικοποίηση της κυτταρικής μετανάστευσης Α από 4 τυχαία πεδία εις διπλούν δείγματα.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD (n = 8). ***

P

& lt? 0.001. (Γ): τα κύτταρα DU145 σε επεξεργασία με ή χωρίς 1 μΜ celastrol σπάρθηκαν σε επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα transwell (2 × 10

4 /ένθετο) για 24 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν στην κάτω πλευρά του φίλτρου. Αρχική μεγέθυνση, × 200. (D): εισβάλλοντα κύτταρα στο (C) βαθμολογήθηκαν από 8 τυχαία πεδία.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD (n = 8). ***

P

& lt?. 0.001

Η

Celastrol επάγει την απόπτωση και ρυθμίζει Mcl-1

επόμενο διερευνηθεί κατά πόσον η απόπτωση εμπλέκεται σε celastrol κυτταροτοξικότητα . Celastrol μάλιστα που προκαλείται από τη συμπύκνωση της χρωματίνης και κατακερματισμό του DNA σε κύτταρα AIPC. PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 2 μΜ celastrol για 24 ώρες παρήγαγε μια 8-πλάσια αύξηση σε υπο-G

1 πληθυσμό (Σχ. 3Α). Επιπλέον, celastrol που προκαλείται G

2 /M σύλληψη (Εικ. 3Α) που ήταν συνεπείς με την προηγούμενη έκθεση [29], καταδεικνύοντας περαιτέρω δράση celastrol για τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου. Celastrol ενισχύεται επίσης δραματικά ενζυματική δραστικότητα τόσο κασπάσης-9 και κασπάσης-3 σε DU145, με το ισχυρότερο ενεργοποίησης (2,9 ± 0,4-φορές για κασπάσης-9 και 22,3 ± 3,5-φορές για κασπάση-3, αντίστοιχα,

P

& lt?. 0.001) στις 8 ώρες μετά την αγωγή (Σχήμα 3Β), δείχνοντας την ενίσχυση της αλληλουχίας κασπάσης στην ενδογενή αποπτωτική παθολογική οδό. Celastrol διάσπαση επαγόμενη ΡΑΚΡ που θα μπορούσε να αναστραφεί με τον αναστολέα zVAD παν-κασπάσης, καταδεικνύοντας την απόπτωση είναι κασπάσης-εξαρτώμενο (Σχ. 3C). Είναι ενδιαφέρον, celastrol δείχθηκε να συσσωρεύονται και ταυτοχρόνως διασπούν την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Mcl-1 σε πρώιμο (4 ώρες) αντί για ένα προχωρημένο στάδιο (24 h) σε PC-3 (Σχ. 3C). Τέτοια παρατήρηση ήταν σύμφωνη με την έκφραση του ενδοκυτταρικού ουβικιτίνη (Σχ. 3C), γεγονός που υποδηλώνει μια ταχεία και πολύπλοκη ρύθμιση των Mcl-1 με την πρωτεασώματος-αναστολέα. Σε DU145, παρατηρήθηκε ένα παρόμοιο φαινόμενο. Mcl-1 διάσπασης που παρατηρήθηκε στην πρώιμη φάση (4-8 h) (Σχ. 3D) συσχετίστηκε με ενεργοποίηση της κασπάσης (Σχ. 3Β). Επιπλέον, επαγωγή διασπάται Mcl-1 αντιστράφηκε με zVAD (Σχ. 3C), υποδεικνύοντας ότι τέτοια διάσπαση διαμεσολαβείται από κασπάσες. Αντίθετα, μικρή αλλαγή παρατηρήθηκε για Bcl-2 (Εικ. 3C), Bcl-xL ή ΧΙΑΡ (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι μεταξύ των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών, Mcl-1 φαίνεται να είναι ένας κύριος στόχος των celastrol στις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν

(Α):. τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με celastrol για 24 ώρες και του κυτταρικού κύκλου ελέγχθηκε. πληθυσμός κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου ήταν αριθμητικά απεικονίζεται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β): τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με celastrol (2 μΜ) για επιθυμητά χρονικά σημεία. Η ενζυματική δραστικότητα της κασπάσης-9 και κασπάσης-3 προσδιορίστηκε φθορομετρικά.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD (n = 3). (C): κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με celastrol με ή χωρίς 1 h προεπεξεργασία του αναστολέα παν-capsase zVAD (2 μΜ) για ανάλυση στυπώματος Western. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ο κυτταρικός θάνατος ανιχνεύθηκε με αποκλεισμό trypan blue. (D): κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με celastrol (2 μΜ) για στύπωμα Western. Ακτίνης είναι ένας έλεγχος φόρτωσης.

Η

Celastrol επάγει την απόπτωση ενεργοποιώντας Noxa

Έχει αποδειχθεί ότι Noxa, ένα ΒΗ3-μόνο προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, μπορεί να προκληθεί σημαντικά από τη βορτεζομίμπη [ ,,,0],30]. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αν Noxa μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί από celastrol. Πράγματι, celastrol επαγόμενη έκφραση Noxa που ήταν σύμφωνο με κασπάσης-3 ενεργοποίησης, διάσπαση PARP και συσσώρευση ουβικιτίνης δοσοεξαρτώμενο σε κύτταρα CL1 (Σχ. 4Α) και PC-3 κύτταρα (Σχ. 4Β). Επιπλέον, η επαγωγή Noxa συνέβη ήδη 2 ώρες μετά τη θεραπεία, πολύ πιο γρήγορα από ό, τι της κασπάσης-3 ενεργοποίησης και διάσπαση PARP σε CL1 (Εικ. 4C). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Noxa είναι έντονα και ταχέως ενεργοποιούνται από celastrol, η οποία μπορεί να είναι υπεύθυνη για την προ-αποπτωτική δράση σε κύτταρα AIPC

(Α):. Κύτταρα CL1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με celastrol για 16 ώρες. (Β): τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με celastrol (2 μΜ) για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. (C): κύτταρα CL1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με celastrol (2 μΜ) για 16 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν με κηλίδα Western, με ακτίνη ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Celastrol καταστέλλει την ιδρυτική NF-κΒ Δραστηριότητα

Είναι γνωστό ότι οι αναστολείς πρωτεασώματος, συμπεριλαμβανομένων celastrol, μπορεί να μπλοκάρει δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [15]. Στη μελέτη μας, εξετάσαμε αν ένα παρόμοιο αποτέλεσμα θα μπορούσε να επιτευχθεί σε κύτταρα AIPC. Σε κύτταρα PC-3, celastrol μπλοκάρει κυτοσολικά αποικοδόμηση ΙκΒα, καθώς και πυρηνική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ πρωτεΐνη ΚεΙΑ /p65, δείχνοντας αποτελέσματα που ξεπέρασαν MG132, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αναστολέα πρωτεασώματος που εμφανίζεται να μπλοκάρει NF-κΒ σηματοδότηση [31] ( Σχ. 5Α). Παρομοίως, εξαρτώμενο από τη δόση celastrol προκάλεσε υποκυτταρική αναδιανομή του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα DU145 (Εικ. 5Β). Επιπλέον, σαν MG132, celastrol ανέστειλε την έκφραση διαφόρων γονιδίων-στόχων του ΝΡ-κΒ που εμπλέκονται σε πολλαπλά στάδια εξέλιξης του όγκου, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού (CXCL1, c-Myc και κυκλίνη D1), πρόσφυσης (ICAM-1), τη μετανάστευση ( CXCL1), εισβολή (ΜΜΡ-9), και αντι-απόπτωση (BIRC2 /4/5, Bcl-2 και Bcl-xL) (Πίνακας. 1). Η ανασταλτική δράση του ΝΡ-κΒ με celastrol επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι μπορεί να καταστείλει celastrol AIPC εξέλιξη, εμποδίζοντας την συστατική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ

(Α):. Τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με celastrol (2 μΜ) ή MG132 (10 μΜ) για 30 λεπτά. (Β): τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με celastrol (1 και 2 μΜ) για 30 λεπτά. Τόσο για την (Α) και (Β), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για υποκυτταρική κλασμάτωση. Εκχύλισμα κυτταρολύματος (CE) ανιχνεύθηκε για ΙκΒα και πυρηνικό εκχύλισμα (ΝΕ) ανιχνεύθηκε για ΚεΙΑ. Τουμπουλίνης και PARP χρησιμοποιούνται ως δείκτης και ο έλεγχος φόρτωσης για τη σήμανση και ΝΕ, αντίστοιχα.

Η

αντικαρκινική επίδραση του Celastrol Περιλαμβάνει NF-κΒ Εξασθένηση στο PC-3 ξενομοσχεύματα

για να καθοριστεί εάν η καταστολή του ΝΡ-κΒ θα συμβάλει στην υποχώρηση του όγκου

in vivo

, αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα celastrol στην καθιερωμένη PC-3 μοντέλο ξενομόσχευμα όπως περιγράφεται προηγουμένως [26]. Θεραπεία της celastrol (1 mg /kg) για 3 εβδομάδες παρεμπόδισε την ανάπτυξη του όγκου PC-3 (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 6Α), με ελάχιστη συστηματική τοξικότητα [26]. Η ιστολογική ανάλυση έδειξε ότι celastrol μειωμένη Κί67-θετικών κυττάρων και CD31 θετικών μικροαγγείων, και αυξημένη TUNEL θετικά κύτταρα (Σχ. 6Β), υποδηλώνοντας ότι η celastrol μειώνει τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση, και επάγει την απόπτωση σε ιστούς όγκων. Επιπλέον, η συνολική ΙκΒα δείχθηκε να έχουν συσσωρευτεί μετά τη θεραπεία (Εικ. 6C). Επίσης, η έκφραση των γονιδίων ΝΡ-κΒ στόχος που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό (CXCL1), την αγγειογένεση (IL-8) και αντι-απόπτωση (BIRC2 και BIRC3) αναστάλθηκε από celastrol σε όγκους (

P

& lt? 0,01 για CXCL1 και BIRC2?

P

& lt?. 0,001 για άλλα γονίδια) (Σχήμα 6D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η εξασθένηση του ΝΡ-κΒ συσχετίζεται με PC-3 υποχώρηση του όγκου με celastrol

in vivo

Η

(Α):. Όγκος του όγκου μετρήθηκε μετά τη θεραπεία celastrol. Ο αριθμός των ποντικών σε κάθε ομάδα παρουσιάστηκε. *,

P

& lt? 0,05. (Β): τομές όγκων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντι-Κί67, TUNEL και χρώση CD31 αντι-ποντικού. Αρχική μεγέθυνση, × 400. (C): προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου (50μg) ιστών όγκου ανιχνεύθηκαν με αντι-ΙκΒα αντίσωμα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Έκφραση φορές ήταν ο λόγος της έκφρασης ΙκΒα στην ομάδα celastrol τον έλεγχο του οχήματος. (D): qPCR ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου στόχου NF-κΒ σε όγκους. Ολικό RNA από ιστούς όγκων εκχυλίζεται για αντίστροφη μεταγραφή. εκκινητές Gene αναμίχθηκαν με cDNA και SyberGreen για qPCR.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD (n = 3). **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε διαπιστώσει ότι celastrol, ένας αναστολέας φυσικό πρωτεασώματος, καταστέλλει AIPC εξέλιξη από διαμορφώνοντας δύο μονοπάτια. Πρώτον, celastrol επάγει κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση ρυθμίζοντας αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Mcl-1 και την ενεργοποίηση προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Noxa. Δεύτερον, με την πρόληψη της υποβάθμισης ΙκΒα, celastrol εξασθενεί συστατική δραστικότητα ΝΡ-κΒ και έτσι καταργεί την ανασταλτική δράση του NF-κΒ στην απόπτωση, καθώς και την προαγωγή του πολλαπλασιασμού, της αγγειογένεσης, τη μετανάστευση και εισβολή (Εικ. 7). Συνολικά, τα στοιχεία αυτά διευκρινίσει τις δυνατότητες της αποτελεσματικότητας και του μηχανισμού της celastrol στη θεραπεία AIPC μέσω στόχευση του πρωτεασώματος.

μπλοκ Celastrol πρωτεασώματος λειτουργία, με αποτέλεσμα Mcl-1 κύκλου εργασιών και επαγωγή noxa που προκαλεί απόπτωση. Ταυτόχρονα, celastrol αποτρέπει την αποδόμηση ΙκΒα, οδηγώντας σε καταστολή NF-κΒ. Συνολικά, celastrol διαταράσσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό AIPC, μετανάστευση, εισβολή και την αγγειογένεση, και επάγει την απόπτωση με σημαντικά εμποδίζοντας συστατική δραστικότητα ΝΡ-κΒ.

Η

Έχει δειχθεί ότι η λειτουργία απορυθμισμένη πρωτεασώματος συσχετίζεται με την εξέλιξη και τη θεραπεία των όγκων αντίσταση σε ανθρώπινους καρκίνους [32]. Υπερενεργοποίηση ΝΡ-κΒ συσχετίζεται με τον φαινότυπο των ανδρογόνων ανεξαρτησία και την αντίσταση σε θεραπεία AIPC [7], [33]. Σε κύτταρα PC-3, υψηλής συστατική δραστικότητα ΝΡ-κΒ είναι, τουλάχιστον εν μέρει, το αποτέλεσμα ενός υψηλού επιπέδου δραστικότητας πρωτεασώματος [34]. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι celastrol όχι μόνο αναστέλλει ισχυρώς PC-3 ανάπτυξη, τη μετανάστευση, εισβολή, και η αγγειογένεση, αλλά επάγει επίσης την απόπτωση που σχετίζεται με ΝΡ-κΒ εξασθένηση τόσο

in vitro

και

in vivo

. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι σε AIPC, καταστολή NF-κΒ μέσω στόχευσης πρωτεασώματος είναι εφαρμόσιμη σε διατάραξη της προόδου των όγκων, περιλαμβανομένων των πρωτογενών ανάπτυξη και μετάσταση. Παρά το γεγονός ότι απαιτούνται περισσότερα στοιχεία να οριοθετηθούν το ρόλο του ΝΡ-κΒ σε celastrol μεσολάβηση υποχώρηση του όγκου, η τρέχουσα μελέτη μας αποκαλύπτει ότι celastrol αναστέλλει πολλαπλούς έκφραση ΝΡ-κΒ με γνώμονα γονίδιο που εμπλέκεται στην ανάπτυξη και μετάσταση AIPC. Τα ευρήματά μας, σε συμφωνία με τους άλλους [35], [36], δείχνουν ότι η NF-κΒ είναι ένα καίριο διαμεσολαβητή της AIPC εξέλιξης, και celastrol, λειτουργεί ως ένα ενεργό φυσικό αναστολέα πρωτεασώματος, μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την εξέλιξη AIPC.

Mcl-1 είναι ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη της οικογένειας Bcl-2 που αποικοδομείται γρήγορα από το πρωτεάσωμα και, ως εκ τούτου, έχει μικρό χρόνο ημιζωής (& lt? 3 η) [37]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών προτείνουν ότι οι αναστολείς πρωτεασώματος είναι σε θέση να αντιστρέψει Mcl-1 λειτουργία μέσω διάσπασης αρχικό μόριο του από κασπάσες να δημιουργήσει μια μικρή μορφή (26~28 kDa) η οποία είναι προ-αποπτωτικά ανεξάρτητα από την άμεση σταθεροποίηση του πλήρους μήκους του Mcl-1 [38], [39]. Όπως γρήγορη εναλλαγή των Mcl-1 αναδεικνύει την γρήγορη απάντηση από τα καρκινικά κύτταρα από τη στιγμή που αντιμετωπίζουν πρωτεασώματος το άγχος, η αλλαγή του φαινοτύπου από την επιβίωση των κυττάρων σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Συνεπής με βορτεζομίμπη [38], [40], διαπιστώνουμε ότι σε AIPC, celastrol ρυθμίζει επίσης σημαντικά Mcl-1 σε πρώιμο στάδιο από παραδόξως συσσώρευση της αντι-αποπτωτική αρχική του μορφή, ενώ, επίσης, τη δημιουργία του προ-αποπτωτικών διασπασμένου μορφή. Καθώς τα κύτταρα υφίστανται απόπτωση τελικά, είναι λογικό να αξίωμα που διασπάται Mcl-1 μπορεί να είναι πιο σημαντικά στον έλεγχο της κυτταρικής συμπεριφοράς από προηγουμένως αναφερθεί [41]. Αυτό συμβαίνει επειδή Mcl-1 διάσπαση λαμβάνει χώρα μαζί με την ενεργοποίηση της κασπάσης και πριν από τη διάσπαση PARP, ενώ αυξημένη ανέπαφο Mcl-1 είναι μόνο μια παροδική συμβάν σε απάντηση πρωτεασώματος αναστολής. Επαγωγή διασπάται Mcl-1 μπορεί να μειωθεί μερικώς από τον αναστολέα κασπάσης, υποδηλώνοντας ότι μια τέτοια επαγωγή είναι κασπάσης-εξαρτώμενη. Είναι ενδιαφέρον, διασπάται επίπεδα Mcl-1 μειώνονται σε μεταγενέστερο στάδιο, το οποίο είναι σύμφωνο με άθικτο Mcl-1. Αυτό υποδηλώνει ότι ακόμα και μετά από διάσπαση από κασπάσες, το θραύσμα Mcl-1 είναι ακόμη ρυθμίζεται από πρωτεασώματα. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι στα κύτταρα AIPC, Mcl-1 αποτελεί βασικό στόχο της celastrol που παρουσιάζει μια σύνθετη απάντηση από την αναστολή του πρωτεασώματος.

Σαν Mcl-1, Noxa είναι ένα άλλο Bcl-2 οικογένειας πρωτεΐνη που είναι έντονα αυξημένη με την αναστολή πρωτεασώματος σε διαφορετικούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος [30], [42] και του πολλαπλού μυελώματος [39], [43]. Ωστόσο, σε αντίθεση Mcl-1, Noxa δεν είναι άμεσος υπόστρωμα του πρωτεασώματος [44]. Αντ ‘αυτού, το mRNA Noxa μεταγραφικά ενισχύεται από έναν αναστολέα πρωτεασώματος [44], [45]. Noxa είναι ένα BH3-μόνο προ-αποπτωτική πρωτεΐνη λειτουργίας στο μιτοχονδριακό απόπτωση [4], [22]. Κατά στρες, Noxa μπορεί να ενεργοποιηθεί σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο και να αλληλεπιδρούν με αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, καταργώντας έτσι αρνητική επίδρασή τους στην απόπτωση [46]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση Noxa παρουσιάζεται ακόμα και πριν από την ενεργοποίηση του εκκινητή κασπάσης-9, που δείχνει ότι είναι ένα πρώιμο μεσολαβητής του celastrol απόπτωση. Περιέργως, καμία από τις τρεις κυτταρικές γραμμές AIPC έχει λειτουργική ρ53 (PC-3 και CL1: p53 null? DU145: p53 μεταλλαγμένο). Έτσι, η επαγωγή Noxa από celastrol είναι ρ53-ανεξάρτητη. Πώς Noxa ρυθμίζεται θετικά σε ένα σενάριο ρ53 ανεπάρκεια είναι ασαφής. Παρ ‘όλα αυτά, όπως επαγωγή Noxa συσχετίζεται με Mcl-1 συσσώρευσης, και δεδομένου ότι το σύμπλοκο Mcl-1 /Noxa αναφέρεται να αυξηθεί κατά bortezomib [39], τα τρέχοντα δεδομένα δείχνουν ότι το δυναμικό λειτουργίας της επαγόμενης Noxa μπορεί να αλληλεπιδρά με συσσωρευμένες Mcl- 1 και εξουδετερωτικών αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα της. Μαζί, αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι τόσο Mcl-1 και Noxa εμφανίζουν ταχεία και πολύπλευρη γεγονότα του κύκλου εργασιών κατά την αναστολή του πρωτεασώματος, και το συντονισμό celastrol των δύο αυτών μελών οικογένειας Bcl-2 θα οδηγήσει σε απόπτωση μέσω της έναρξης του καταρράκτη κασπάσης σε AIPC.

Εν περιλήψει, τα δεδομένα μας περιγράφει τις ισχυρές επιδράσεις κατά του όγκου του παραδοσιακού φυσικού πρωτεασώματος αναστολέα celastrol επί ανεξάρτητου από ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη. Ο διπλός ρόλος της celastrol, διαμορφώνοντας τόσο αποπτωτικών πρωτεϊνών και NF-κΒ, δικαιολογεί την εξέταση της ως δυνητική θεραπευτική υποψήφιος για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο του προστάτη ορμόνη πυρίμαχα με μόνιμα ενεργό NF-κΒ.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Συμπληρωματικό Πίνακας S1 ..

Αστάρια για πραγματικού χρόνου PCR (ανθρώπινη)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0014153.s001

(0.01 MB PDF)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Susan Harris για βοήθεια σχετικά με το χειρόγραφο? Ο Δρ Arie Belldegrun στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας – Λος Άντζελες για την ευγενική παροχή της κυτταρικής σειράς CL1? το Πανεπιστήμιο του Michigan Comprehensive Κέντρο Καρκίνου (UMCCC) Ιστολογία πυρήνα για βοήθεια σχετικά με τη μελέτη ανοσοϊστολογία? UMCCC Μονάδα Εργαστήριο Ζώων Ιατρικής (Ulam) για βοήθεια σχετικά με τα πειράματα σε ζώα, και η UMCCC κυτταρομετρία ροής πυρήνα για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.