Αφηρημένο

γαστρικός καρκίνος είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Η ταυτοποίηση νέων βιοδεικτών του καρκίνου είναι αναγκαίο να μειωθούν τα ποσοστά θνησιμότητας μέσα από την ανάπτυξη νέων δοκιμασιών διαλογής και της έγκαιρης διάγνωσης, καθώς και νέες θεραπείες στόχο. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια πρωτεομική ανάλυση των noncardia γαστρικού νεοπλασιών των ατόμων από τη Βόρεια Βραζιλία. Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων και φασματομετρία μάζας. Για την ταυτοποίηση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών, που χρησιμοποιούνται στατιστικές δοκιμές με bootstrapping αναδειγματοληψία για τον έλεγχο του σφάλματος τύπου Ι σε αναλύσεις πολλαπλών συγκρίσεων. Εντοπίσαμε 111 πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην γαστρική καρκινογένεση. Η υπολογιστική ανάλυση αποκάλυψε αρκετές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στις διαδικασίες παραγωγής ενέργειας και να ενισχυθεί το αποτέλεσμα Warburg στο γαστρικό καρκίνο. ΕΝΟ1 και έκφραση HSPB1 περαιτέρω αξιολόγηση. ΕΝΟ1 επιλέχθηκε λόγω του ρόλου της στην αερόβια γλυκόλυση που μπορεί να συμβάλλουν στο φαινόμενο Warburg. Παρόλο που παρατηρήθηκε δύο επάνω ρυθμισμένη κηλίδες του ΕΝΟ1 στην πρωτεομική ανάλυση, η μέση έκφραση του ΕΝΟ1 μειώθηκε σε γαστρικών όγκων με κηλίδα western. Ωστόσο, η μέση ΕΝΟ1 έκφραση φαίνεται να αυξάνεται σε πιο επεμβατικές όγκους. Αυτή η έλλειψη συσχετισμού μεταξύ πρωτεομικής και αναλύσεις στυπωμάτων western μπορεί να οφείλεται στην παρουσία άλλων κηλίδων ΕΝΟ1 που παρουσιάζουν μια ελαφρώς μειωμένη έκφραση, αλλά με σημαντικές επιπτώσεις στην έκφραση μέση πρωτεΐνης. Σε νεοπλασίες, HSPB1 επάγεται από κυτταρικό στρες να προστατεύουν τα κύτταρα από την απόπτωση. Στην παρούσα μελέτη, HSPB1 παρουσίασε μια υπερυψωμένη πρωτεΐνη και η έκφραση mRNA σε ένα υποσύνολο των γαστρικών δειγμάτων καρκίνου. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης HSPB1 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Εδώ, έχουμε προσδιορίσει διάφορους πιθανούς βιοδείκτες του καρκίνου του στομάχου σε άτομα από τη Βόρεια Βραζιλία. Αυτές οι βιοδείκτες μπορεί να είναι χρήσιμη για την εκτίμηση της πρόγνωσης και της διαστρωμάτωσης για θεραπεία, αν επικυρωθεί σε μεγαλύτερα σύνολα κλινική μελέτη

Παράθεση:. Leal MF, Chung J, Calcagno DQ, Assumpção PP, Demachki S, da Silva IDCG, et al. (2012) Διαφορικές πρωτεομική ανάλυση των Noncardia Καρκίνου Γαστρική από άτομα της Βόρειας Βραζιλίας. PLoS ONE 7 (7): e42255. doi: 10.1371 /journal.pone.0042255

Επιμέλεια: Jörg Δ Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 9 Φεβρουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 3 Ιουλ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 του Ιούλη του 2012

Copyright: © Leal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό (CNPq? Δρ Chammas, ο Δρ Σμιθ και ο Δρ Burbano) και Fundação de Amparo à Pesquisa κάνει Estado de São Paulo (FAPESP? Δρ Leal, ο Δρ Chung και ο Δρ Calcagno ) ως επιχορηγήσεις και τα βραβεία υποτροφία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Η συνολική σχετική ποσοστό επιβίωσης 5-ετών είναι λιγότερο από το 20% [2]. Στη Βόρεια Βραζιλία, GC είναι η δεύτερη πιο συχνή νεοπλασία στους άνδρες και η τρίτη στις γυναίκες [3]. Στην παράγραφο μέλος, Βόρεια Βραζιλία, το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι περίπου 9-10% [4].

Οι δύο κύριες περιοχές του όγκου των GC είναι καρδιακή (εγγύς) και noncardia (άπω). Η GC καρδιακή επηρεάζει πέντε φορές περισσότεροι άνδρες από τις γυναίκες [5]. Επιπλέον, τα ποσοστά εμφάνισης της Καρδίας GC είναι σχετικά υψηλές στις επαγγελματικές κατηγορίες [6]. Αντίθετα, η noncardia GC έχει μία αναλογία αρσενικών προς θηλυκά περίπου 2:01 και η συχνότητα αυξάνεται προοδευτικά με την ηλικία, με αιχμή εμφάνισης μεταξύ 50 και 70 ετών [7]. Οι παράγοντες κινδύνου για noncardia GC περιλαμβάνουν

Helicobacter pylori

λοίμωξη, χαμηλή κοινωνικοοικονομική κατάσταση, το κάπνισμα, η κατανάλωση αλμυρών και καπνιστά τρόφιμα, και χαμηλή κατανάλωση φρούτων και λαχανικών [8]. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, η συχνότητα εμφάνισης της noncardia GC έχει μειωθεί σημαντικά στις αναπτυγμένες περιοχές του κόσμου. Ωστόσο, αυτός ο υπότυπος εξακολουθεί να αποτελεί την πλειοψηφία των περιπτώσεων GC σε όλο τον κόσμο και παραμένει κοινή σε πολλές γεωγραφικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένης της Κίνας, της Ιαπωνίας, της Ανατολικής Ευρώπης και της Κεντρικής /Νότια Αμερική [8]. Η κατανόηση της βιολογίας GC και ο προσδιορισμός των βιοδεικτών του καρκίνου είναι απαραίτητα για τη μείωση των ποσοστών θνησιμότητας μέσα από προβολές του καρκίνου σε πληθυσμούς υψηλού κινδύνου, για να αυξηθεί η έγκαιρη διάγνωση, και για την ανάπτυξη νέων θεραπειών στόχο.

GC, όπως άλλες νεοπλασίες , πιστεύεται ότι προκύπτει από έναν συνδυασμό περιβαλλοντικών παραγόντων και τη συσσώρευση των γενικευμένων και των ειδικών γενετικών και επιγενετικών αλλαγών, οι οποίες επηρεάζουν ογκογονίδια, ογκοκατασταλτικά γονίδια, και τον έλεγχο γενωμική αστάθεια. Αρκετές γονίδια /πρωτεΐνες έχουν προταθεί ως βιοδείκτες GC. Στην πολυσταδιακή γαστρική καρκινογένεση, μετατροπές των ογκογονιδίων myc, KRAS2, CTNNB1, erbB2, FGFR2, CCNE1 και HGFR, καθώς και των καταστολείς όγκων ΤΡ53, APC, RB, DCC, RUNX3 και Cdh1 έχουν μέχρι σήμερα αναφερθεί (βλέπε σχόλια [9], [10]). Παρά το γεγονός ότι η απελευθέρωση αυτών των γονιδίων /πρωτεϊνών έχει εντατικά μελετηθεί σε GC, μια πιο ολοκληρωμένη προφίλ είναι απαραίτητο να κατανοήσουμε τη διαδικασία της καρκινογένεσης.

Η τελευταία δεκαετία στον τομέα των βιοεπιστημών ήταν βαθιά επηρεασμένος από την ανάπτυξη της «Γονιδιωματική» τεχνολογίες (γονιδιωματική, transcriptomics, πρωτεομική και η μεταβολισμική) που έχουν σκοπό να απεικονίσει μια σφαιρική άποψη των βιολογικών συστημάτων και την κατανόηση της ζωής των κυττάρων [11]. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες είναι τελικά υπεύθυνη για την κακοήθη φαινότυπο, πρωτεομική ανάλυση μπορεί να αντικατοπτρίζει τη λειτουργική κατάσταση των καρκινικών κυττάρων, και ως εκ τούτου έχουν διακριτά πλεονεκτήματα σε σχέση με τη γονιδιωματική και μελέτες transcriptomics [12]. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες είναι σήμερα τα κύρια μόρια-στόχους των αντικαρκινικών φαρμάκων [13].

Μερικές πρωτεομική με βάση μελέτες που έγιναν στο παρελθόν πραγματοποιήθηκε σε ανθρώπινα πρωτογενή γαστρικών όγκων (βλ επανεξέταση [14]). Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες αναλύθηκε όγκους ατόμων από ασιατικό πληθυσμό και, ως εκ τούτου, μπορεί να μην αντικατοπτρίζουν τις ξεχωριστές βιολογικές και κλινικές συμπεριφορών μεταξύ διεργασιών GC. GC χαρακτηρίζεται από την παγκόσμια διακυμάνσεις στην συχνότητα, αιτιολογία, φυσική πορεία, και τη διαχείριση [15]. Παρά το γεγονός ότι, περίπου το 90% των όγκων του στομάχου είναι αδενοκαρκινώματα [7], διάφοροι παράγοντες οδηγούν σε βιολογικά και κλινικά υποσύνολα GC: προγενέστερες ογκογόνα συνθήκες, όπως

Helicobacter pylori

γαστρίτιδα και άλλες χρόνιες παθολογίες γαστρικού? θέση του πρωτογενούς όγκου (καρδιακή και noncardia περιοχής)? υπότυποι του αδενοκαρκινώματος (διάχυτη, εντερική, ή να αναμιχθεί [16])? εθνικότητα του προσβεβλημένου πληθυσμού (διαφορετικά επίπεδα ευαισθησίας και επιθετικότητας των όγκων)? και ένα προγνωστικό βιοδείκτη (ΕΚΒΒ2) [15]. Έτσι, ο όρος «γαστρικό καρκίνο» χρησιμοποιείται για να περιγράψει διάφορες νεοπλασίες που επηρεάζουν την περιοχή του στομάχου.

Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε την έκφραση του προφίλ noncardia GC και του δείκτη μη νεοπλασματικά γαστρικό ιστό του ατόμου από Northern Βραζιλία (όλα με

H. pylori

μόλυνση), και εντόπισε μία πρωτεΐνη υπογραφή που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των δύο ομάδων με μία δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση μέθοδο (2-DE). Για τη διαλογή των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την εξέλιξη της γαστρικής καρκινογένεσης, μπορούμε επίσης συγκριτικά μη νεοπλαστικά γαστρικών ιστών με δείγματα GC των ατόμων με και χωρίς μεταστάσεις λεμφαδένα. Για την επιλογή των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε μια στατιστική δοκιμή Parametrics με bootstrapping αναδειγματοληψία. Έχουμε αναλάβει μια ολοκληρωμένη υπολογιστική ανάλυση των ιστών πρωτεομικών δεδομένων για να ανακαλύψετε τις οδούς και τα δίκτυα που εμπλέκονται στην γαστρική ογκογένεση και την εξέλιξη. Οι πιθανές συσχετίσεις μεταξύ ενολάση 1 (ΕΝΟ1) και θερμικού σοκ 27 kDa πρωτεΐνη 1 (HSPB1) γονιδίου και την έκφραση της πρωτεΐνης, και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά αξιολογήθηκαν επίσης σε άτομα από τη Βόρεια Βραζιλία. Αυτές οι δύο πρωτεΐνες έχουν αναφερθεί συχνά ως απελευθερωμένη μόρια σε προηγούμενες GC πρωτεομική μελέτες σε άλλους πληθυσμούς. Ωστόσο, δεν αξιολογήθηκαν ποτέ σε μια βραζιλιάνικη πληθυσμό.

Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Για την ανάλυση πρωτεϊνών προφίλ, δείγματα noncardia GC και τα αντίστοιχα μη-νεοπλασματικές γαστρικού ιστού (μακρινή τοποθεσία του πρωτογενούς όγκου? ομάδα ελέγχου) συλλέχθηκαν από 15 ασθενείς. Πρόσθετες ζευγαρωμένα δείγματα συμπεριλήφθηκαν για western blot και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (RT-qPCR) αναλύσεις. Αποσυντίθενται δείγματα ιστών καταψύχθηκαν ακαριαία σε υγρό άζωτο μετά από χειρουργική εκτομή και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Όλα τα γαστρικά δείγματα λήφθηκαν χειρουργικά από João de Barros Barreto Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (HUJBB) Στην παράγραφο μέλος, Βόρεια Βραζιλία. Στην παράγραφο μέλος, ο ανθρώπινος πληθυσμός αποτελείται από εθνοτήτων διασταυρώσεις μεταξύ τρεις κύριες ομάδες προέλευσης: Ευρωπαϊκή (εκπροσωπείται κυρίως από τους Πορτογάλους), Αφρικανοί και Ινδιάνοι [17]. Όλοι οι ασθενείς είχαν αρνητικό ιστορικό της έκθεσης είτε σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση και δεν υπήρχε άλλος συν-εμφάνισης των διαγνωσμένων καρκίνων. Γραπτή συγκατάθεση με την έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας της HUJBB λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη συλλογή του δείγματος.

Όλα τα δείγματα κατατάσσονται ανάλογα με Lauren [16] και οι όγκοι οργανώθηκαν με τη χρήση τυποποιημένων κριτηρίων από ΤΝΜ σταδιοποίηση [18] . Η παρουσία του

H. pylori

, ένα κλάσης Ι καρκινογόνο, σε γαστρικό δείγματα ανιχνεύθηκε με PCR δοκιμασία για το γονίδιο ουρεάσης [19] και για τον παράγοντα λοιμικότητας κενοτοπιοποιητικής κυτοτοξίνη του (CagA) [20] χρησιμοποιώντας το DNA καθαρίζεται ταυτόχρονα με τις πρωτεΐνες και το mRNA. Σε κάθε πείραμα PCR, συμπεριλήφθηκαν θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες.

Για να μειωθεί το δείγμα ετερογένεια, η ανάλυση 2-DE περιλαμβάνονται μόνο noncardia GC και του γαστρικού δείγματα παρουσιάζουν

H. pylori

λοίμωξη CagA +, η οποία φαίνεται να είναι συχνή στον πληθυσμό μας (αδημοσίευτα δεδομένα). Ο Πίνακας 1 δείχνει τις κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση προφίλ πρωτεϊνών.

Η

Protein, mRNA και DNA καθαρισμό

Η συνολική πρωτεΐνη, mRNA, και ϋΝΑ ταυτόχρονα απομονώθηκαν από δείγματα γαστρικού ιστού χρησιμοποιώντας ο AllPrep DNA /RNA /Protein Kit (Qiagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το σφαιρίδιο πρωτεΐνη διαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης (Sigma) και 0,5% από κάθε Cocktail φωσφατάσης Αναστολέας 1 και 2 (Sigma-Aldrich, USA ). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο του Bradford (Sigma-Aldrich, USA). συγκέντρωση του RNA και η ποιότητα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Kisker, Germany) και πηκτές 1% αγαρόζης. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

2-DE πρωτεομική προφίλ

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 2-DE [21]. Τα δείγματα πρωτεΐνης (300 μg) φορτώθηκαν σε IPG λωρίδες (pH 3-10 L, 18 cm, GE Healthcare, ΗΠΑ). Οι λωρίδες επανυδατώθηκαν για 12 ώρες στους 50 V. Η ισοηλεκτρική εστίαση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 200 V 2 ώρες, 300 V 30 min, 500 V 30 λεπτά, 1.000 V 1 ώρα, 8000 V 1.5 ώρα και 80000 Vh. Οι εστιασμένες λωρίδες μειώθηκαν με 50 mM DTT και αλκυλιώθηκαν με 100 mM ιωδοακεταμίδιο σε ρυθμιστικό που περιέχει 6 Μ ουρία, 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8.8), 30% γλυκερόλη, 2% SDS, και ίχνος κυανού βρωμοφαινόλης. Για τη δευτεροβάθμια ηλεκτροφόρηση, οι επεξεργασμένες λωρίδες φορτώθηκαν στην κορυφή του 12,5% SDS-PAGE (200 mm) μαζί με τις φωσφοπρωτεΐνη Μοριακό Βάρος Πρότυπα PeppermintStick ™ (Invitrogen, USA). Σε όλα τα πειράματα, GC και αντιστοιχισμένο δείγματα ελέγχου πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα. Όλα τα πηκτώματα 2-DE διεξήχθησαν εις διπλούν.

Οι πρωτεΐνες στα πηκτώματα 2-DE οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SYPRO® Ruby Gel Stain (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εικόνες τζελ βάφονται με SYPRO® Ruby σαρώθηκαν με διέγερσης 582 nm και ένα φίλτρο εκπομπής 610 nm ζωνοπερατού 30 σε ένα σύστημα απεικόνισης Typhoon Trio (GE Healthcare, ΗΠΑ). Για spot εκτομή και μετέπειτα ανάλυση φασματομετρία μάζας, οι πηκτές απεικονίστηκαν με Coomassie Brilliant χρώση Μπλε G250.

Η ανάλυση εικόνας και σημείο αναγνώρισης

εικόνες Gel αναλύθηκαν με την έκδοση PDQuest Προηγμένο λογισμικό 8.0 (Bio -Rad, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αυτόματη ανίχνευση σημείο σε κάθε γέλη επαληθεύεται με οπτικό έλεγχο. Μερικά σημεία χρησιμοποιήθηκαν ως ορόσημα για την ευθυγράμμιση των εικόνων. Οι εντάσεις σημείο ομαλοποιήθηκαν να εξισώσει τις συνολικές πυκνότητες της κάθε εικόνας τζελ χρησιμοποιώντας το Τοπικό Μοντέλο Παλινδρόμησης. Κανονικοποιημένες ποσότητες spot πρωτεΐνη στα των πρωτεϊνών συγκρίθηκαν μεταξύ των πειραματικών ομάδων

Έχουμε δημιουργήσει δύο σειρές αναλύσεων για τον εντοπισμό διαφορικά εκφρασμένων σημεία:. (1) τη σύγκριση της πρωτεϊνικής έκφρασης μεταξύ όγκου και συμφωνημένα ελέγχου χρησιμοποιώντας paired t-test? (2) σύγκριση της έκφρασης πρωτεΐνης μεταξύ δειγμάτων ελέγχου, GC χωρίς μετάσταση λεμφαδένων, και GC με μετάσταση λεμφαδένων χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης για ανεξάρτητα δείγματα (μονόδρομη ΑΝΟνΑ). Επιπλέον, οι συγκρίσεις post-hoc πραγματοποιήθηκαν με τεστ Tukey για κανονικά κατανεμημένες μεταβλητές και με παιχνίδια-Howell για διανομές όπου δεν θα μπορούσε να θεωρηθεί ίση διακυμάνσεις. Οι αναλύσεις παραμετρικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με bootstrapping, μια μέθοδο αναδειγματοληψία. Η μέθοδος bootstrapping [22] παρέχει μια κρίσιμη τιμή p ρυθμίζεται, ελέγχοντας ένα σφάλμα τύπου Ι (ψευδώς θετικά), μείωση πάνω-fit προκατάληψη και την επικύρωση των εκτιμήσεων ακρίβεια. Η τεχνική bootstrapping μπορεί να παρέχει μια πιο ακριβή και λιγότερο συντηρητική ποσοστό σφάλματος familywise (FWER) από πρότυπες μεθόδους (π.χ., ρύθμιση Bonferroni του) για multicomparison αναλύσεις [23]. Πραγματοποιήσαμε όλες οι αναλύσεις για την αναγνώριση διαφορετικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών βασίζεται σε 1000 δείγματα bootstrap. Σε όλες τις αναλύσεις, το διάστημα εμπιστοσύνης (CI) ήταν 95% και σ τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών με φασματομετρία μάζας, θα φιλτράρονται σημαντικά σημεία που παρουσιάζουν φορές αλλαγή κάτω από 1,5 φορές σε η πυκνότητα μεταξύ των δύο πειραματικών ομάδων. Αυτές οι κηλίδες παρατηρήθηκαν σε λιγότερο από 30% των δειγμάτων σε μία ομάδα [24].

Η φασματομετρία μάζας ανάλυση

Οι κηλίδες που μας ενδιαφέρουν με το χέρι αποκόπηκαν για μετέπειτα ανάλυση φασματομετρίας μάζας [25]. Επιπλέον, κενό τεμάχια γέλης από μία περιοχή spot-free, και κηλίδες αναφοράς (γνωστές πρωτεΐνες δείκτη από το 2-DE) αποκόπηκαν, χρησίμευσαν ως μάρτυρες για την πέψη με θρυψίνη, και έτρεξαν παράλληλα με την πρωτεΐνη σημεία ενδιαφέροντος. Μετά τον αποχρωματισμό και την πλύση, τα σωματίδια γέλης υποβλήθηκαν σε πέψη σε πήκτωμα με 20 ng /μΙ τρυψίνης χρυσού (φασματομετρία μάζας Grade, Promega Corporation, USA) σε 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Υποστεί πέψη πεπτίδια ανακτήθηκαν, τοποθετήθηκαν σε φυγόκεντρο Speed-vac μέχρι ξηρού, και ανασυστάθηκαν σε 15 μΙ 0.1% μυρμηκικό οξύ σε νερό. Το μίγμα πεπτιδίων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας C18 υγρή χρωματογραφία υπερ-απόδοσης (UPLC, NanoAcquity, Waters, USA) συζευγμένο με ESI-τετράπολο TOF φασματόμετρο μάζας (ESI-QTOF Ultima, Waters /Micromass, USA). Η κλίση ήταν 0-80% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ επί 20 ή 10 λεπτά. Όλα τα MS /MS φάσματα αναζήτηση στη βάση δεδομένων IPIhuman 379 χρησιμοποιώντας τη μηχανή αναζήτησης ΜΑΣΚΩΤ (Matrix Science), την αποδοχή ενός έχασε τρυπτικά διάσπαση και carbamidomethyl (C) ως πάγια τροποποίηση και την οξείδωση (Μ) ως μεταβλητή τροποποιήσεις. ανοχή πεπτίδιο ήταν ± 0,1 Da και MS /MS ανοχή ήταν ± 0,1 Da. Υψηλότερη ταυτοποίηση εμπιστοσύνη είχαν στατιστικά σημαντικές βαθμολογίες αναζήτησης και ταυτοποιήσεις πρωτεΐνης βασίζεται σε ένα ελάχιστο 2 πεπτιδίου επιτυχίες.

Βιοπληροφορική ανάλυση

Οι προσδιορίζονται πρωτεΐνες (μόνο από τα σημεία όπου εντοπίστηκε μία πρωτεΐνη) ήταν κατατάσσονται σε ομάδες ανάλογα με υποκυτταρική διαμερισματοποίηση, βιολογική διαδικασία, και μοριακή λειτουργία με βάση τις πληροφορίες σχολιασμένο στην οντολογία γονιδίων (GO) βάσεις δεδομένων Consortium (https://www.geneontology.org/). Αυτή η ανάλυση ταξινόμηση έγινε με τη χρήση του εργαλείου DAVID λειτουργική σχολιασμού (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [26]. Η χρωμοσωμική θέση του εντοπίστηκαν πρωτεϊνών πρόσβαση χρησιμοποιώντας το εργαλείο Biomart εξόρυξης δεδομένων απευθείας από τη βάση δεδομένων Ensembl (https://www.ensembl.org/biomart/martview).

Το σύστημα PANTHER (www.pantherdb.org/) , το λογισμικό MetaCore (GeneGo Inc.), και η εφευρετικότητα Pathways Ανάλυση 9.0 (IPA, Ingenuity Systems Inc.) χρησιμοποιήθηκαν για την πορεία, το δίκτυο και λειτουργικές αναλύσεις των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών. Όλα αναφερθεί μονοπάτια και βιολογικές διεργασίες που παρατίθενται σύμφωνα με την βαθμολογία εμπλουτισμό GO τους παρέχονται από τα πακέτα λογισμικού όπως -Log (p-τιμές) και με False Discovery Rate (FDR) 0,05%.

Η μη επιβλεπόμενη ανάλυση ομαδοποίησης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συσχέτισης του Pearson των κανονικοποιημένων (z-score) τιμές όλων των σημαντικών διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών (μοναδικό αναγνωριστικό από spot) των 30 δειγμάτων στο σύνολο ανάλυση. χάρτες θερμότητας παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο δημιουργίας Heatmap (https://ashleylab.stanford.edu/tools_scripts.html) για να κανονίσει τα προφίλ πρωτεϊνικής έκφρασης και τα δείγματα με βάση την ομοιότητά τους. Κάθε χρωματισμένο κύτταρο στο δισδιάστατο χάρτη αντιπροσωπεύει την αξία έκφραση πρωτεΐνης του δείγματος. Οι ολοένα και πιο θετικές τιμές που υποδεικνύονται από τα κόκκινα της αύξησης της έντασης, και όλο και περισσότερο αρνητικές τιμές από χόρτα της αυξανόμενης έντασης. Δενδρογράμματα στο πάνω μέρος του χάρτη θερμότητας δείχνουν την ομαδοποίηση των δειγμάτων και από την πλευρά της ομαδοποίησης με έκφραση πρωτεΐνης.

έκφραση ΕΝΟ1 και HSPB1

Η πρωτεΐνη και mRNA που χρησιμοποιείται για την ΕΝΟ1 και HSPB1 έκφραση αναλύσεις καθαρίστηκαν ταυτόχρονα με το δείγμα πρωτεΐνης που χρησιμοποιείται για πήγματα 2-DE.

για ανάλυση western blot, μειωμένη πρωτεΐνη (20 μg για ΕΝΟ1 και 30 μg για HSBP1) εκάστου δείγματος διαχωρίστηκαν σε 12,5% SDS ομοιογενών -PAGE γέλης και ηλεκτρο-αποτυπώθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Hybond-P, η GE Healthcare, ΗΠΑ). Η μεμβράνη PVDF μπλοκαρίστηκε με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο που περιέχει 0.1% Tween 20, 5% χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά γάλα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντίστοιχη πρωτοταγή αντισώματα σε αντι-ΕΝΟ1 (SC-100812, 1:3000, Santa Cruz Biotechnology, USA ), αντι-HSBP1 (SC-13132, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), και αντι-ACTB (Ac-74, 1:3000, Sigma-Aldrich, USA). Μετά από εκτεταμένη πλύση, ένα δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western αντιδραστήριο λουμινόλη και οι εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό σύστημα εικόνας ImageQuant 350 (GE Healthcare, Σουηδία). ACTB χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας αναφοράς φόρτωσης.

Για ανάλυση RT-qPCR, το συμπληρωματικό DNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Πολωνία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλα σε πραγματικό χρόνο προσδιορισμοί RT-qPCR διεξήχθησαν εις τριπλούν τόσο για γονίδιο στόχος (

ΕΝΟ1

: Hs00361415_m1?

HSPB1

: Hs03044127_g1, Applied Biosystems, USA) και των εσωτερικών ελέγχων (

ACTB

: Hs03023943_g1?

GAPDH

: Hs99999905_m1, Applied Biosystems, USA) χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και ανιχνευτές TaqMan. Σχετική ποσοτικοποίηση (RQ) της έκφρασης του γονιδίου υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Pfaffl [27]. Ένα δείγμα ελέγχου ορίστηκε ως βαθμονόμησης της κάθε συνδεδεμένο όγκου.

Η στατιστική ανάλυση των ΕΝΟ1 και HSBP1 δεδομένων έκφρασης

Είμαστε αξιολόγησε για πρώτη φορά την κανονική κατανομή όλων των δεδομένων με τη χρήση του τεστ κανονικότητας Shapiro-Wilk να καθορίσει τη μετέπειτα χρήση των κατάλληλων δοκιμών για στατιστική σύγκριση.

ΕΝΟ1

επίπεδα mRNA και δεδομένα έκφρασης HSPB1 δεν ήταν κανονικά κατανεμημένες και μεταμορφώθηκαν (z-score) για ανάλυση. Paired t-test εκτελέστηκε για να συγκριθεί η μέση τιμή των ΕΝΟ1 και πρωτεΐνης HSPB1 έκφραση μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και GC. Οι συσχετίσεις μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρων και τη μέση τιμή της έκφρασης ΕΝΟ1 και HSPB1 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας T-test για ανεξάρτητα δείγματα. Chi-square test (χ

2) χρησιμοποιήθηκε επίσης για την αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ των δεδομένων έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες. Η συσχέτιση μεταξύ του ΕΝΟ1 και HSPB1 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης (Western Blot και 2-DE αναλύσεις) αναλύθηκε με δοκιμασία Spearman. Σε όλες τις αναλύσεις, η CI ήταν 95% και σ τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

πρωτεομική ανάλυση του γαστρικού ιστού

Αναλύσαμε την proteome της 15 noncardia δείγματα GC – 6 χωρίς λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες και 9 με λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες – και 15 συμφωνημένα ιστούς ελέγχου (Πίνακας 1). Χρησιμοποιώντας 2-DE με ρΐ εύρος 3,0 έως 10 και περιοχή μοριακού μεταξύ 10 kDa και 120 kDa, περίπου 1000 κηλίδες σαφώς ανιχνεύθηκαν με γέλη και στην συνέχεια αναλύθηκαν για διαφορική έκφραση της πρωτεΐνης. Το Σχήμα 1 δείχνει αντιπροσωπευτικές εικόνες gel με τις κηλίδες και την ταυτότητα τους σε πρωτεΐνες. Μερικές πρωτεΐνες που ανακλάται από πολλαπλές κηλίδες πιθανότατα οφείλεται σε μετα-μεταφραστική τροποποίηση οδηγεί σε μετατοπίσεις στο πήκτωμα 2-DE. Οι λεπτομέρειες των πρωτεϊνών ταυτοποιήσεις, θεωρητική τιμή ρΙ, το μοριακό βάρος, το σκορ πρωτεΐνη, την κάλυψη ακολουθία, αριθμός ταιριάζουν πεπτίδια, καθώς και την μέση σχετική μεταβολή και p-τιμές εμφανίζονται σε συμπληρωματικούς πίνακες S1 και S2. Οι πίνακες αυτοί δείχνουν επίσης ποιες πρωτεΐνες είχαν προηγουμένως παρατηρηθεί σε μελέτες πρωτεομικής GC.

πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε εύρος ρΐ 3-10, που ακολουθείται από 12.5% ​​SDS-PAGE και χρωματίστηκαν με SYPRO® Ruby. Οι ταυτοποιημένες πρωτεΐνες που έδειξαν έκφραση μεταβάλλεται σημαντικά σε γαστρική καρκινογένεση επισημαίνονται με τα αντίστοιχα αναγνωριστικά πρωτεΐνη.

Η

Αν και μερικοί πρωτεομική με βάση μελέτες που έγιναν προηγουμένως πραγματοποιήθηκε σε ανθρώπινα πρωτογενή γαστρικών όγκων, εξ όσων γνωρίζουμε, μόνο τρεις μελέτες επικεντρωθεί στην noncardia GC [28], [29], [30]. Οι περισσότεροι GC πρωτεομική μελέτες που εντοπίστηκαν διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών βασίζεται μόνο σε μια πτυχή της αλλαγής μεταξύ δύο προϋποθέσεις [24], [28], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Άλλες προηγούμενες GC πρωτεομική μελέτες που έχουν διεξαχθεί στατιστικές αναλύσεις για τη σύγκριση της έκφρασης της πρωτεΐνης μεταξύ των ομάδων [29], [36], [37], [38], [39], αλλά χωρίς τον έλεγχο του Ι (ψευδώς θετικά) το σφάλμα τύπου. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι συγκρίναμε την πρωτεΐνη χαρακτηριστικών των όγκων και μη νεοπλασματικών δειγμάτων χρησιμοποιώντας παραμετρικά τεστ με κάνουν εκκίνηση για διαφορικά εκφραζόμενο ταυτοποίηση πρωτεϊνών. Οι μέθοδοι αναδειγματοληψία, που χρησιμοποιούνται συνήθως σε μελέτες μικροσυστοιχιών [40], έχουν χρησιμοποιηθεί για να γίνουν προσαρμογές p-value για τις πολλαπλές διαδικασίες δοκιμών που ελέγχουν την FWER και να λάβει υπόψη τη δομή της εξάρτησης μεταξύ των στατιστικών δοκιμών [41]. Ο στόχος είναι να δημιουργηθούν πολλά σύνολα δειγμάτων bootstrap με επαναδειγματοληψία με τις αντικαταστάσεις από τα αρχικά δεδομένα [22].

Η σύγκριση των δειγμάτων όγκου και ελέγχου από τα ζεύγη T-test και τη χρήση των bootstrapping αποκάλυψε 133 σημεία που ήταν σημαντικά μεταβληθεί με πάνω από 1,5 φορές αλλαγή. Μετά από μια αναζήτηση της βάσης δεδομένων μασκότ χρησιμοποιώντας τα αποκτηθέντα δεδομένα MS, εντοπίστηκαν 97% των κηλίδων. Μεταξύ αυτών των κηλίδων, 18% εντοπίστηκαν με περισσότερες από μία πρωτεΐνη. Οι αναλύσεις των κηλίδων με ένα μοναδικό ταυτοποιημένες πρωτεΐνες έδειξε ότι 33 σημεία 26 πρωτεΐνες επάνω ρυθμισμένη και 72 από 56 πρωτεΐνες ρυθμισμένα προς τα κάτω σε δείγματα GC σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικό ιστό.

Η σύγκριση του όγκου και δείγματα ελέγχου με μονόδρομη ANOVA αποκάλυψε 143 διαφορικά ρυθμιζόμενη κηλίδες και ταυτοποιήθηκαν 98% από αυτά. Παρατηρήσαμε ότι το 94 σημεία ήταν κοινή σε ζεύγη T-test και αναλύσεις ANOVA. Όσον αφορά τα σημεία με ένα μοναδικό προσδιορισμένο πρωτεΐνη, παρατηρήσαμε ότι 54 πρωτεΐνες ρυθμίζεται προς τα κάτω και 9 έγιναν πάνω ρυθμισμένα σε όγκο χωρίς λεμφαδένα μετάσταση συγκριτικά με έλεγχο δείγματα. Παρατηρήσαμε επίσης ότι το 68 πρωτεΐνες ρυθμίζεται προς τα κάτω και 15 πάνω ρυθμισμένα σε όγκους με μετάσταση λεμφαδένα σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου. Διαπιστώσαμε 38 πρωτεΐνες που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ μη νεοπλασματικών δείγματα και οι όγκοι ανεξάρτητα από την κατάσταση των λεμφαδένων.

Δεκατέσσερις πρωτεΐνες παρουσιάζονται σημαντικές μεταβολές μεταξύ των όγκων με και χωρίς λεμφαδένα μετάσταση (σχήμα S1). Η έκφραση της NNMT αυξήθηκε συνεχώς ενώ ATP5H και UQCRFS1 έδειξε μια συνεχή μείωση από μη-νεοπλασία σε ογκογένεση με μετάσταση στους λεμφαδένες. NNMT προηγουμένως αναφερθεί με αυξημένη έκφραση σε GC σε σύγκριση με μη νεοπλασματικά δείγματα [24], [42]. Η μειωμένη έκφραση του ATP5H και UQCRFS1 μπορεί να οφείλεται σε χαμηλότερη εξάρτηση της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης για την παραγωγή ενέργειας, λόγω του φαινομένου Warburg σε προχωρημένο στάδιο (βλέπε βιοπληροφορική αποτελέσματα παρακάτω).

Λειτουργική ταξινόμηση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε GC

Η ανάλυση βιοδείκτης GeneGo αποκάλυψε ότι οι περισσότεροι από τους ταυτοποιημένες πρωτεΐνες προβλεπόμενες δείκτες για γαστρεντερικές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένου του GC (Σχήμα 2Α, αντιπροσωπευτικό του όγκου έναντι μη όγκου σύγκριση). Αυτό υποστηρίζει τα τρέχοντα δεδομένα και δηλώνει ότι τα ευρήματα θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω για τον εντοπισμό ή την επικύρωση κλινικά σημαντική στόχοι για τη διάγνωση ή /και την πρόγνωση του GC.

Α) Εμπλουτισμός της νόσου GeneGo χρησιμοποιώντας τα διαφορικά ρυθμίζονται πρωτεϊνών μεταξύ νεοπλασματικών και συμφωνημένα μη νεοπλασματικά δείγματα? Β) Κυτταρική διαμερίσματα, Γ) Οι βιολογικές διαδικασίες, D) Μοριακή λειτουργίες και τη θέση Ε) Η χρωμοσωμική όλων των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών.

Η

Οι προσδιορίζονται πρωτεΐνες ομαδοποιούνται σε διάφορες κατηγορίες με βάση λειτουργική διαθέσιμες πληροφορίες. Οι περισσότερες από τις ταυτοποιημένες πρωτεΐνες ήταν ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες οργανιδίων και ήταν μέρος των οργανιδίων δεσμευμένη σε μεμβράνη, ειδικά τα μιτοχόνδρια (Σχήμα 2Β). Αυτές οι πρωτεΐνες εμπλέκονται κυρίως στην κυτταρική μεταβολικές διαδικασίες και μείωση της οξείδωσης (Σχήμα 2C). Η σύγκριση των όγκων με μεταστάσεις στους λεμφαδένες και τα δείγματα ελέγχου αποκάλυψε τη μεταφορά και τη δημιουργία της θέσης ως εμπλουτισμένο βιολογικές διαδικασίες. Αυτό δεν παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση των όγκων χωρίς μεταστάσεις λεμφαδένα και τα δείγματα ελέγχου. Η δραστηριότητα οξειδοαναγωγάσης που ακολουθείται από δραστικότητα δέσμευσης συνένζυμο ήταν οι κύριοι μοριακές λειτουργίες των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην γαστρική καρκινογένεση (Σχήμα 2D).

σχετικά με την χρωμοσωμική θέση, οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια που βρίσκονται στο χρωμόσωμα 1 (11 %), χρωμόσωμα 19 (8%), και το χρωμόσωμα 11 (7%) (Σχήμα 2Ε). Συγκρότημα καρυότυποι των γαστρικών όγκων περιλαμβάνουν κατά προτίμηση αυτά τα χρωμοσώματα, καθώς και χρωμοσώματα 3, 6, 7, 8, 13 και 17 (βλέπε ανασκόπηση [9]). Κέρδος και την απώλεια των περιοχών του χρωμοσώματος 1, 19 και 11 είχαν αναφερθεί προηγουμένως από την έρευνα μας ομάδα σε δείγματα GC [43], [44]. Έτσι, αυτά τα χρωμοσώματα μπορεί να περιέχει αρκετές θέσεις με δόση-ευαίσθητα γονίδια.

Δίκτυα ανάλυση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε GC

Έχουμε αναλάβει μια ολοκληρωμένη υπολογιστική ανάλυση των ιστών πρωτεομικών δεδομένων για να ανακαλύψετε τις οδούς και τα δίκτυα που εμπλέκονται στην ογκογένεση γαστρικό και εξέλιξης. Ο Πίνακας 2 δείχνει τις κύριες κανονικές οδούς με τη χρήση της βάσης δεδομένων Ingenuity Pathway Ανάλυση (IPA). Οι κυριότερες κανονικών μονοπατιών στη διαδικασία γαστρική καρκινογένεση συμμετείχαν στις πορείες μεταβολισμό της ενέργειας, συμπεριλαμβανομένων μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, πυροσταφυλικό μεταβολισμό, οξειδωτική φωσφορυλίωση, κιτρικό κύκλο και γλυκόλυση /γλυκονεογένεση. Η παρούσα μελέτη έδειξε ένας μεγάλος αριθμός διαφορικών εκφράζονται μεταβολικών πρωτεΐνες που δεν έχουν αναφερθεί προηγουμένως στο noncardia γαστρική καρκινογένεση (Πίνακας S1 και S2).

Η

πρωτεομική ανάλυση μας αποκάλυψε ότι αρκετά ένζυμα του κιτρικού κύκλου ( Krebs κύκλος) και της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε κύτταρα GC. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν πιθανές αλλαγές στη λειτουργία του μιτοχονδρίου και μια στροφή στην παραγωγή ενέργειας υπό τις παρούσες κύτταρα GC, υποδηλώνοντας την επίδραση Warburg [45]. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα όγκου επαναπρογραμματίσει μεταβολικών οδών τους για την παραγωγή ενέργειας και, κατά συνέπεια, να στηρίξουν την ταχεία κυτταρική διαίρεση υπό στρεσογόνες μεταβολικές συνθήκες που είναι χαρακτηριστικές της ανώμαλης μικροπεριβάλλον του όγκου [46]. Ακόμη και κάτω από τις κανονικές συγκεντρώσεις οξυγόνου, τα καρκινικά κύτταρα μετατοπιστεί από ΑΤΡ γενιά μέσα οξειδωτική φωσφορυλίωση σε ΑΤΡ γενεά μέσω γλυκόλυση, μετατρέποντας τα περισσότερα εισερχόμενα γλυκόζης σε γαλακτικό [45]. Έχει προταθεί ότι υψηλά ενεργό γλυκόλυση παρέχει ένα βιοσυνθετικό πλεονέκτημα για τα κύτταρα του όγκου. Η γλυκόλυση παρέχει αρκετή μεταβολικά ενδιάμεσα αποφεύγοντας την οξείδωση της γλυκόζης, η οποία είναι απαραίτητη για τη σύνθεση των μακρομορίων, όπως τα λιπίδια, πρωτεΐνες, και νουκλεϊκά οξέα, κατά την κυτταρική διαίρεση [47], [48], [49].

Η γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) και αφυδρογονάσης πυροσταφυλικού (ΡΟΗ) σύμπλοκα ελέγχουν το μεταβολισμό του πυροσταφυλικού οξέων, μετατρέποντας είτε γαλακτικό οξέα ή ακετυλο-CoA στη συνέχεια εισέρχονται στην κιτρικό κύκλο. Η προς τα κάτω ρύθμιση των υπομονάδων των συμπλοκών LDH και PDH προτείνει μια μείωση της ροής πυροσταφυλικού στο κιτρικό κύκλο και μείωση του ποσοστού της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και την κατανάλωση οξυγόνου, ενισχύοντας την γλυκολυτικά φαινότυπο. Άλλες κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες, όπως LipF και GOT1, υπογραμμίζουν την ενεργοποίηση άλλων μεταβολικών οδών με την απομείωση του κιτρικού κύκλου και οξειδωτική φωσφορυλίωση. Διάφορες μεταβολικές αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν σε noncardia GC επίσης περιγράφεται από τον Cai

et al.

[36] σε μια καρδιακή GC πρωτεομική μελέτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι μεταβολικές αλλαγές δεν αφορούν ειδικά σε έναν υπότυπο GC με βάση την τοποθεσία του όγκου.

με το σύστημα PANTHER, η πιο σημαντικά εμπλουτισμένη οδός είναι η οδός p53 παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων όγκου και ελέγχου. Επιπρόσθετα με τη λειτουργία της στην απόκριση βλάβης DNA και απόπτωση, ρ53 είναι επίσης ένας ρυθμιστής του μεταβολισμού των κυττάρων [50]. p53 προωθεί οξειδωτική φωσφορυλίωση [51] και αναστέλλει επίσης την γλυκολυτική οδό με up-ρύθμιση της έκφρασης του ΤΡ53 επαγόμενης γλυκόλυση και το ρυθμιστή απόπτωση (Tigar) [52]. Ως εκ τούτου, η απώλεια της ρ53 συμβάλλει στην απόκτηση του γλυκολυτικού φαινότυπο. Η απώλεια του

TP53

τόπος είναι ένα συχνό εύρημα σε GC των ατόμων από τη Βόρεια Βραζιλία [53]. Επιπλέον, το 20% του GC αναλύονται με 2-DE παρουσιάζονται ρ53 ανοσοαντιδραστικότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ανοσοαντιδραστικότητα ρ53 εξαρτάται συνήθως από συσσώρευση των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών στο κύτταρο, που οδηγεί σε μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής [54].

Τα κορυφαία δίκτυα των μοριακών αλληλεπιδράσεων και των λειτουργιών ταυτοποιήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΙΡΑ (Σχήμα S2 ? Πίνακας 3? υποδικτύου από την ανάλυση MetaCoreTM δεν φαίνεται). Δείξαμε πολλά διαφορετικά νομοθετικά πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική συναρμολόγηση και την οργάνωση, και σε φλεγμονώδεις διαδικασίες. Το κυτταρικό συναρμολόγηση και οργάνωση ήταν η κυρίως εμπλουτισμένο δίκτυο που παρατηρείται κατά τη σύγκριση μεταξύ των ελέγχων και των όγκων με μετάσταση στους λεμφαδένες.