Αφηρημένο

Ιστορικό

Ταυτοποίηση των γονιδίων που εμπλέκονται αιτιολογικά στην ογκογένεση είναι ένας σημαντικός στόχος στην έρευνα για τον καρκίνο. Εκτιμάται 10-20% του καρκίνου που σχετίζονται με μεταλλάξεις του γονιδίου έχει ως αποτέλεσμα παρακάμπτοντας από ένα ή περισσότερα εξόνια στις κωδικοποιημένες μεταγραφές. Εδώ θα υποβάλει έκθεση σχετικά με μια στρατηγική για την οθόνη σε μια παγκόσμια μόδα για τέτοιες εκδηλώσεις εξόνιο-παρακάμπτοντας τη χρήση Συσχέτιση μοτίβο βάση (PAC). Ο αλγόριθμος PAC έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για τον εντοπισμό παραλλαγών ματίσεως διαφορικά εκφραζόμενων μεταξύ δύο προκαθορισμένων υποομάδων. Όπως γενετικές αλλαγές στον καρκίνο είναι δείγμα συγκεκριμένες, εξετάσαμε την ικανότητα των PAC για τον εντοπισμό εκφράζονται ανώμαλα εξώνια σε μεμονωμένα δείγματα.

Κύρια Ευρήματα

Ως απόδειξη της αρχής, ελέγξαμε το PAC στρατηγική σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του οποίου η πλήρης κωδικοποιητική αλληλουχία του οκτώ γονίδια του καρκίνου είχαν διαλογή για μεταλλάξεις. PAC ανιχνεύονται όλα τα επτά εξώνια παρακάμπτοντας μεταλλάξεις μεταξύ των κυτταρικών σειρών 12 καρκίνου. PAC εντοπίζονται επίσης μεταλλάξεις εξόνιο-παρακάμπτοντας σε κλινικά δείγματα καρκίνου, αν και η ανίχνευση ήταν σε κίνδυνο λόγω της ετερογενούς (άγριου τύπου) η έκφραση μεταγραφή. PAC μείωσε τον αριθμό των υποψηφίων γονιδίων /εξόνια για επακόλουθη ανάλυση μεταλλάξεων κατά δύο έως τρεις τάξεις μεγέθους και είχε σημαντική πραγματική θετικό ρυθμό. Είναι σημαντικό ότι, από 112 τυχαία επιλεγμένων εξώνια ακραία, ανάλυση της αλληλουχίας εντόπισαν δύο νέα εξόνιο παρακάμπτοντας τα γεγονότα, δύο νέες αλλαγές βάσης και 21 έχουν αναφερθεί στο παρελθόν αλλαγές βάσης (SNPs).

Συμπεράσματα

Η ικανότητα του PAC να εμπλουτίσουν για μεταλλαγμένα αντίγραφα και για τον εντοπισμό γνωστών και νέων γενετικών αλλαγών επιβεβαιώνει την καταλληλότητά του ως μια στρατηγική για τον εντοπισμό γονιδίων υποψήφιος καρκίνο

Παράθεση:. Schutte Μ, Elstrodt F, Bralten LBC, Nagel ΔΕΥ του Συμβουλίου, Duijm Ε, Hollestelle Α, et al. (2008) Το εξόνιο Συστοιχίες Έκφραση ως εργαλείο για την ταυτοποίηση γονιδίων Νέα Καρκίνου. PLoS ONE 3 (8): e3007. doi: 10.1371 /journal.pone.0003007

Επιμέλεια: Χριστόφορος Arendt, Sanofi-Aventis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 του Ιουνίου του 2008? Αποδεκτές: 31 Ιούλη του 2008? Δημοσιεύθηκε: 20 του Αυγ, 2008

Copyright: © 2008 Schutte et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Susan G. Komen Breast Cancer (BCTR0601309), της ολλανδικής Cancer Society Koningin Wilhelmina Fonds, DDHK 2002-2687 και το Erasmus MC Mrace 2005.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχει.

Εισαγωγή

Καρκίνος οδηγείται από μεταλλάξεις σε γονίδια που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την επιβίωση τους και την ακεραιότητά τους. Οθόνες με στόχο τον προσδιορισμό τέτοιων γονιδίων του καρκίνου συχνά χρησιμοποιούν χρωμοσωμική θέση ή /και λειτουργικές ιδιότητες για την επιλογή των υποψηφίων γονιδίων για μετέπειτα ανάλυση μετάλλαξης [1] – [4]. Αν και πολλές θέσεις υποψήφιο γονίδιο του καρκίνου έχουν αναγνωριστεί, η ανάλυση μετάλλαξης εντάσεως εργασίας και εμποδίζει σοβαρά την εύρεση το αντίστοιχο γονίδιο του καρκίνου. Άλλες στρατηγικές αναζήτησης γονιδίου έχουν επικεντρωθεί στην παρεκκλίνουσα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης για τον εντοπισμό των υποψηφίων. Για παράδειγμα, μεταλλάξεις γονιδίων που οδηγούν σε πρόωρη κωδικόνια τερματισμού ταυτοποιήθηκαν με διαλογή για γονίδια που εκφράζονται ειδικά ακόλουθη χημική αναστολή που προκαλείται ανοησίες αποσύνθεση RNA [5]. Περαιτέρω, τα γονίδια σύντηξης στον καρκίνο του προστάτη ταυτοποιήθηκαν με διαλογή για ακραίες τιμές σε μια μεγάλη ομάδα των προφίλ γονιδιακής έκφρασης [6].

Ανθρώπινο μεταλλάξεις γονιδίων του καρκίνου συχνά έχουν ως αποτέλεσμα την παράλειψη ενός ή περισσοτέρων εξονίων από τα κωδικοποιημένα μεταγραφές [7] – [9]. Το εξόνιο-παρακάμπτοντας μεταλλάξεις μπορεί να προκληθεί από υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων εντός των θέσεων ματίσματος συναίνεση ή με εξαλείψεις που εκτείνονται σε ολόκληρο το εξόνια. Επιπλέον, οι μεταλλάξεις εξόνιο-παρακάμπτοντας μπορεί να προκληθεί από σχετικά μικρό ενδογονικοί ενθέσεις, διαγραφές ή διπλασιασμούς. Ακόμα κι αν το εξώνιο-παρακάμπτοντας μεταλλάξεις αντιπροσωπεύουν περίπου 10-20% του συνόλου των μεταλλάξεων του γονιδίου σχετίζονται με τον καρκίνο [4], [9] – [12], δεν υψηλής απόδοσης μέθοδος έχει στη διάθεσή της οθόνης για τέτοιες μεταλλάξεις. Εδώ, περιγράφουμε βάση Συσχέτιση Pattern (PAC) ως μια προσέγγιση για τον εντοπισμό γονιδίων υποψήφιος του καρκίνου με εξέταση για τα γεγονότα εξόνιο-παρακάμπτοντας σε μια παγκόσμια μόδα. Λεπτομερής ανάλυση μετάλλαξης στη συνέχεια περιορίζεται μόνο στις PAC-προσδιορίζονται εξώνια ακραία. Ως απόδειξη της αρχής, θα καταδεικνύουν την αποτελεσματικότητα της στρατηγικής PAC επί προηγουμένως ταυτοποιηθεί εξονίου-παρακάμπτοντας μεταλλάξεις σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και σε κλινικά δείγματα όγκων του εγκεφάλου. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι ο PAC μπορεί να προσδιορίσει νέες εξόνιο παρακάμπτοντας τα γεγονότα με υποκείμενες γενετικές αλλαγές σε γνωστά γονίδια του καρκίνου και σε τυχαία επιλεγμένα PAC-προσδιορίζονται εξώνια ακραία τιμή.

Αποτελέσματα

εντοπισμό ακραίων τιμών εξόνιο από Pattern βάση Συσχέτιση (PAC)

σε αυτή τη μελέτη έχουμε αναπτύξει μια νέα προσέγγιση για τον έλεγχο εκδηλώσεις εξόνιο-παρακάμπτοντας σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου. Επειδή οι μεταλλάξεις σε καρκίνο συχνά είναι πολύ ετερογενείς σε σχέση με ενδογονικοί θέση τους, οι μεμονωμένοι όγκοι συχνά εκφράζουν μοναδικά είδη RNA. Η διαλογή για μεταλλάξεις που οδηγούν σε παρακάμπτοντας ένα ή περισσότερα εξόνια στο κωδικοποιημένο μεταγραφής επομένως απαιτεί διαλογή για τα μοναδικά, το εξόνιο-παραλειφθεί, μεταγραφές μέσα σε ένα συγκεκριμένο δείγμα κοόρτη. Εν συντομία, τα προφίλ έκφρασης εξόνιο επιπέδου παράγονται χρησιμοποιώντας Affymetrix Human Εξόνιο Πίνακες, οι οποίες καθορίζουν το επίπεδο έκφρασης όλων σχεδόν των εξωνίων υπάρχουν στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Ο αλγόριθμος μοτίβο βασίζεται Συσχέτιση (PAC) στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της προβλεπόμενης επίπεδο έκφρασης του κάθε εξόνιο (ή σετ καθετήρα). Στη συνέχεια, τον εντοπισμό εξώνια ακραία αφαιρώντας το προβλεπόμενο επίπεδο έκφρασης εξώνια από τις μετρούμενες επίπεδο έκφρασης τους, με τιμές που ισούται με μηδέν όταν το μετρούμενο επίπεδο έκφρασης ενός εξόνιο ήταν παρόμοια με προβλεπόμενο επίπεδο έκφρασης του (διατυπώθηκε λεπτομερώς στο Methods). Ο αλγόριθμος PAC έχει χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό διαφορικό μάτισμα μεταξύ προκαθορισμένες ομάδες [13]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δοκιμαστεί τον αλγόριθμο PAC για την ικανότητά του να εντοπίσει παρεκκλίνοντα εκφράζονται εξώνια σε μεμονωμένα δείγματα από μία καλά καθορισμένη ομάδα από κυτταρικές σειρές ή όγκους. PAC ομαλοποιεί αποτελεσματικά την μεταβλητότητα των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων και, σε ένα μόνο δείγμα, ομαλοποιεί τη μεταβλητότητα στην ένταση του σήματος μεταξύ των σετ ανιχνευτή του ίδιου μεταγραφής (Εικ. 1).

(Α) κανονικοποιημένα δεδομένα έκφραση του όλα τα εξώνια μέσα στο

PTEN

γονίδιο. Κάθε σετ καθετήρα εξόνιο αντιπροσωπεύεται από μια τελεία στο στερεό γραμμή? πολλαπλά σετ ανιχνευτής μπορεί να στρέφεται κατά την ίδια εξωνίου. (Β) PAC ομαλοποιεί τη μεταβλητότητα των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων και, σε ένα μόνο δείγμα, η μεταβλητότητα στην ένταση του σήματος μεταξύ των σετ ανιχνευτή του ίδιου μεταγραφής. Ως εκ τούτου, υπολογισμός PAC επιτρέπει την ταχεία ανίχνευση παρακάμπτοντας του

PTEN

εξόνιο 4 καρκινικών κυττάρων του μαστού σειρά MDA-MB-468 οφείλεται σε ένα

PTEN

c.253 + 1G Από την επιλογή μας από ακραία εξώνια, εντοπίσαμε περίπου 20% (21/112) SNPs, ~ 2% (2/112) μεταβολές νέα βάση και περίπου 2% (2/112) εξόνιο παρακάμπτοντας τα γεγονότα. Όταν συμπεριλαμβανομένων όλων των αντικαταστάσεων νουκλεοτιδίων, το ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων στα πειράματα αυτά είναι -76%. Κατ ‘επέκταση, την ενίσχυση και αλληλούχιση 1.763 αντιδράσεις σε ένα μόνο δείγμα (όλες οι ακραίες τιμές σε τιμές PAC & lt? -4,0) Μπορεί να αναμένεται να αποδώσει όσο 34 νέες αλλαγές βάσεων και 34 παράκαμψη εξωνίου γεγονότα. Ως εκ τούτου, η προσέγγισή μας μπορεί να χαρακτηριστεί ως μια εξαιρετικά αποτελεσματική μέθοδο διαλογής για υποψήφια γονίδια του καρκίνου, ειδικά όταν συγκρίνεται με τυχαία επιλογή των εξονίων. Πρόσθετες μελέτες θα πρέπει στη συνέχεια να γίνει για να προσδιοριστεί αν εντοπιστεί αλλαγές είναι αιτιώδης για το σχηματισμό του όγκου και /ή την πρόοδο, για παράδειγμα με διαλογή για πρόσθετες μεταλλάξεις (π.χ. απαλείψεις, μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος) σε άλλα δείγματα του όγκου ή με λειτουργική ανάλυση των προσδιορισμένων μεταλλάξεων.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα

Η συλλογή μας από 41 δημοσίως διαθέσιμων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού είχαν υποβληθεί σε μεταλλάξεων οθόνες των κατασταλτικών γονιδίων επτά όγκων:

BRCA1

(Breast Cancer Gene Ευαισθησία 1? ΟΜΙΜ 113705),

Cdh1

(E-cadherin? ΟΜΙΜ 192090),

MAP2K4

(ΜΑΡ κινάσης 4, γνωστός και ως

ΜΚΚ4

? ΟΜΙΜ 601335),

PTEN

(φωσφατάση και tensin ομόλογο? ΟΜΙΜ 601728),

p16

(CDK4-αναστολέα, γνωστός και ως

ΙΝΚ4 &

,

CDKN2A

? ΟΜΙΜ 600160),

p53

(Tumor πρωτεΐνη p53? ΟΜΙΜ 191170) και

RB1 ​​

(ρετινοβλάστωμα Ευαισθησία Gene 1? ΟΜΙΜ 180200) [14] – [18] (Nagel

et al.

υποβληθεί για δημοσίευση). Μεταλλακτική ανάλυση εμπλέκονται αλληλούχιση ολόκληρη την περιοχή κωδικοποίησης αυτών των γονιδίων σε γονιδιωματικό DNA, καθώς και ανάλυση της κωδικοποιημένης μεταγραφής. Οι καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού δώδεκα χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη ήταν: CAMA-1, EVSA-T, HCC1937, MDA-MB-134VI, MDA-MB-157, MDA-MB-435S, MDA-MB-436, MDA-MB- 453, MDA-MB-468, MPE600, OCUB-F και SK-BR-5. Κλινικά δείγματα γλοιοβλάστωμα καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο αμέσως μετά την χειρουργική εκτομή από ασθενείς στο Πανεπιστήμιο Erasmus Medical Center, όπως περιγράφεται αλλού [13]. Παθολογική επανεξέταση έδειξε τουλάχιστον 70% των πυρήνων του όγκου για κάθε δείγμα. ανάλυση μετάλλαξη του

EGFR

ογκογονίδιο (Growth υποδοχέα παράγοντα επιδερμικής? ΟΜΙΜ 131550) στις γλοιοβλαστώματα διεξήχθη με συμβατικό RT-PCR και μετέπειτα αλληλούχιση του μετεγγραφής από δείγματα με

EGFR

ενισχύσεις.