Αφηρημένο

Το oseltamivir phosphate είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αναστολέα σιαλιδάση αντι-γρίπης. Σιαλυλίωση διέπεται από σιαλυλοτρανσφερασών και σιαλιδασών, έντονα εμπλέκεται στην ογκογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού. Σε αυτή τη μελέτη αξιολόγησε τη βιολογική συμπεριφορά του σκύλου μαστικού κυττάρων όγκου κατά την κατεργασία με φωσφορικό oseltamivir (ένας αναστολέας σιαλιδάσης)

in vitro

και

in vivo

. Μας

in vitro

αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορική οσελταμιβίρη εξασθενίζει δραστηριότητα σιαλιδάσης που οδηγεί σε αυξημένη σιαλικυλίωσης στην CMA07 και CMT-U27 καρκινικά κύτταρα του μαστού σκύλου. Παραδόξως, φωσφορικό oseltamivir διεγείρονται, CMT-U27 μετανάστευση των κυττάρων και την ικανότητα εισβολής

in vitro

, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. CMT-U27 όγκων ξενομοσχεύματος του oseltamivir φωσφορικού αγωγή γυμνά ποντίκια έδειξαν αυξημένη σιαλυλίωση, δηλαδή α2,6 τερματικό δομές και ΣΕΛ (x) έκφρασης. Αξιοσημείωτα, μια τάση προς την αυξημένη μεταστάσεις πνεύμονα παρατηρήθηκε σε ποντικούς που oseltamivir γυμνούς φωσφορικό αγωγή. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας αποκάλυψε ότι η οσελταμιβίρη εξασθενίζει κυνικός μαστικού δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων σιαλιδάσης, αλλάζοντας το σχέδιο σιαλυλίωσης του σκύλου όγκων του μαστού, και οδηγεί, κατά περίεργο τρόπο, να

in vitro

και

in vivo

αυξημένη μαστικούς επιθετικότητα του όγκου

Παράθεση:. de Oliveira JT, Σάντος aL, Gomes C, Barros R, Ribeiro C, Mendes Ν, et al. (2015) Αντι-γρίπης νευραμινιδάσης Αναστολέας Oseltamivir Φωσφορικών Προκαλεί Canine Μαστικών Cancer Cell Επιθετικότητα. PLoS ONE 10 (4): e0121590. doi: 10.1371 /journal.pone.0121590

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: David Wai Chan, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 12 του Σεπτέμβρη 2014? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 7 του Απρίλη, 2015

Copyright: © 2015 de Oliveira et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και της υποστήριξη αρχείων Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από τον πορτογαλικό οργανισμό «Fundação para a εα Επιστημών Tecnologia, Programa Operacional Επιστημών e Inovação 2010 (POCI 2010) κάνει Quadro comunitario de Apoio III «και του έργου δεν χορηγούν. PTDC /CVT /117610/2010. RB (SFRH /BPD /68276/2010) και CG (SFRH /BPD /96510/2013) αναγνωρίζουν την πορτογαλική Ίδρυμα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία. Ινστιτούτο Μοριακής Παθολογίας και Ανοσολογίας είναι Αναπληρωτής Εργαστήριο του Υπουργείου Υπουργείο Επιστημών, Τεχνολογίας και Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης της Πορτογαλίας και υποστηρίζεται εν μέρει από την πορτογαλική Ίδρυμα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος παραμένει μια μεγάλη κοινωνική και οικονομική επιβάρυνση στο δυτικό κόσμο. Πράγματι, παρ ‘όλες τις προσπάθειες για τη μείωση αυτών των θλίψη, ο αριθμός των ασθενών έχει αυξηθεί εκθετικά τα τελευταία χρόνια. Ο καρκίνος του μαστού, ειδικότερα, είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες και η πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται, κυρίως λόγω της ανάπτυξης των απομακρυσμένων μεταστάσεων [1].

Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στη δημιουργία των αποικιών καρκίνου σε απομακρυσμένα όργανα απέχει πολύ από το να γίνει κατανοητό, όπως είναι και οι πραγματικοί λόγοι που οδηγούν στο θάνατο μετάσταση σχετίζονται. Έτσι, τον εντοπισμό και τη διερεύνηση σήμερα κλινικά χρησιμοποιούμενα φάρμακα που ενδέχεται να έχουν αντίκτυπο στην εξέλιξη των όγκων είναι υποχρεωτική [2]. Για παράδειγμα, παρεμβαίνοντας με πολλές οδούς κυττάρου που είναι κοινά ή παρόμοια μεταξύ παθογόνων και ξενιστών, φάρμακα όπως ραπαμυκίνη και νικλοζαμίδιο (που χρησιμοποιήθηκαν αρχικά ως αντιμυκητιακή και antihelmintic φάρμακα αντίστοιχα) έχουν κατέληξε να είναι πολλά υποσχόμενη αντικαρκινικούς παράγοντες [3, 4] .

το oseltamivir phosphate είναι ένα φάρμακο κατά της γρίπης που έχει γίνει ευρέως χρησιμοποιείται ως προφυλακτική θεραπεία από την εποχή των Η1Ν1 πανδημίες [5]. Χορηγείται ως προφάρμακο φωσφορική oseltamivir, η οποία μετατρέπεται από ένζυμα εστεράσης καρβοξυλίου στο ενεργό καρβοξυλικό άλας oseltamivir. Το oseltamivir phosphate είναι ένα ανάλογο του σιαλικού οξέως το οποίο αλληλεπιδρά με και μπλοκ των δραστικών θέσεων της σιαλιδάσης ενζύμων του ιού της γρίπης, συνδέεται με τα ένζυμα του ιού, μπλοκάροντας την ικανότητά τους να διασπούν κατάλοιπα σιαλικού οξέος στην επιφάνεια του μολυσμένου κυττάρου που έχει σαν αποτέλεσμα μια ανικανότητα να απελευθερώσει ιοσωμάτια απογόνους [6].

Μερικές προτάσεις έχουν προηγουμένως σημειωθεί όσον αφορά δυνητικά σχετικές φαρμακολογικές επιδράσεις αυτής και άλλων αναστολέων της ιικής σιαλιδασών χρησιμοποιούνται στις κλινικές, στα ανθρώπινα ενδογενή σιαλιδασών [7]. Ενώ χαμηλές συγκεντρώσεις nanomolar του oseltamivir carboxylate είναι επαρκείς για να εμποδίσουν δραστηριότητας της ιογενούς σιαλιδασών, αυτό το φάρμακο κατέδειξε σχεδόν καμία αισθητή αναστολή της ανθρώπινης σιαλιδασών [7, 8]. Παρ ‘όλα αυτά, αντικρουόμενα αποτελέσματα ελήφθησαν όταν φωσφορικού oseltamivir ελέγχθηκε σε καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας τόσο

in vitro

και

in vivo μοντέλα

[9, 10]. Πράγματι, ορισμένες παρατηρήσεις επισημάνει μια πιθανή ανασταλτική επίδραση της φωσφορικής oseltamivir στην ενδογενή σιαλιδάσες των αρουραίων και ποντικών [11-14]. Πιο πρόσφατα, προτάθηκε ότι το φωσφορικό oseltamivir είχε τη δυνατότητα να αντιστρέψει την επιθηλιακά να μεσεγχυματικά (EMT) μεταβατική διαδικασία και να αυξήσει την ευαισθησία του φαρμάκου στη χημειοθεραπεία ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [10].

σιαλυλιωμένες γλυκάνες είναι επιδημιολογικά σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του μαστού [15]. Τα σιαλικά οξέα είναι όξινες μονοσακχαρίτες συνήθως βρίσκονται στην τελική θέση των αλυσίδων υδατάνθρακα που υπάρχουν σε γλυκοπρωτεΐνες και γλυκολιπίδια [16]. Μέσω πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις με σελεκτίνες και siglecs μεταξύ άλλων μορίων, σιαλικά οξέα είναι φυσιολογικά παρούσες σε διαφορετικούς τύπους αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου. Τα σιαλικά οξέα αυξάνουν τη δύναμη της πυκνότητας φορτίου σε ολόκληρη την αλυσίδα γλυκάνης, λόγω της παρουσίας του ημίσεως τους καρβοξυλικού οξέως, συσχετίζοντας σε μεταβολές στις ιδιότητες προσκόλλησης γλυκάνες »[17]. Τα σιαλικά οξέα μεταφέρονται από ένα υπόστρωμα δότη σε έναν γλυκάνη δομή παρόν σε μία δεδομένη γλυκοσύζευγμα από σιαλυλοτρανσφερασών [18, 19]. Από την άλλη πλευρά, η απομάκρυνσή τους από γλυκάνη αλυσίδες καταλύεται από σιαλιδασών. Η δράση των ενζύμων αυτών πιστεύεται ότι επηρεάζουν την διαμόρφωση των γλυκοπρωτεϊνών, και επομένως να συμβάλει στην αύξηση είτε της αναγνώρισης ή της συγκάλυψης των βιολογικά σχετικές θέσεις στα μόρια και τα κύτταρα [20].

Η αύξηση της ομάδας αίματος σιαλυλιωμένη Lewis τύπου αντιγόνα όπως Sialyl Lewis Χ (SLE (x)) και μικρά κόλουρου γλυκάνες όπως Sialyl Tn (LHR) είναι από τα πιο κοινά γλυκάνης μεταβολές στα καρκινικά κύτταρα [21-24]. Αρκετές λειτουργικές δοκιμασίες στις οποίες σιαλυλιωμένη γλυκάνες φαίνεται να παίζει ένα ρόλο στην αυξημένη μετανάστευση και εισβολή τόσο

in vitro

και

in vivo

βρίσκονται στη βιβλιογραφία [19, 24]. Από την άλλη πλευρά, η παραποίηση των σιαλυλίωσης

in vitro

έχει επίσης δειχθεί t μερικές φορές μειώνουν την επεμβατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων [25]. Ως αποτέλεσμα, η ρύθμιση της σιαλυλιωμένη γλυκανών έχει υποστηριχθεί ως πιθανός στόχος για νεο-επικουρική θεραπεία στον καρκίνο [26]. Ωστόσο, λόγω του ευρέως φάσματος και της πολυπλοκότητας των σιαλυλοτρανσφεράσες και όλων των άλλων γλυκοζυλοτρανσφεράσες που εμπλέκονται στη διαδικασία σιαλυλίωση, υπάρχουν καλά αναγνωρισμένο δυσκολίες με στροφή σιαλικών οξέων σε κλινικά σχετικές θεραπευτικοί στόχοι [27, 28]. Ωστόσο, ακόμη και αν υπάρχουν περισσότερα από 20 γνωστά διαφορετικά σιαλυλοτρανσφεράσες, υπάρχουν μόνο τέσσερα ταυτοποιηθεί και χαρακτηριστεί σιαλιδασών των θηλαστικών [20]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα τέσσερα γνωστά σιαλιδασών των θηλαστικών είναι ομόλογες με εκείνες των ιών που περιέχουν, σε ορισμένες περιπτώσεις, τα κατάλοιπα πανομοιότυπα με εκείνα που βρέθηκαν στο εσωτερικό της δραστικής ενζυματική θέση [29].

Υπάρχει επομένως μία επιτακτική ανάγκη να μελετηθεί νεοπλασματικών πλαίσιο στο η οποία φωσφορικό oseltamivir θα μπορούσε να αναστέλλουν ανταγωνιστικά σιαλιδάσες θηλαστικών [30]. Διαφορετικά αποτελέσματα είναι πιθανό να προκύψουν και μπορεί να εξαρτάται από το στόχο της παρούσας αναστολής και της συστοιχίας των επηρεαστεί γλυκοσυζευγμάτων [20]. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε τις επιδράσεις της σιαλιδάσης αναστολής ως ρυθμιστής των μηχανισμών σιαλυλίωσης σχετίζονται εισβολής στην μαστικών όγκων των κυττάρων χρησιμοποιώντας τόσο

in vitro

και

in vivo

προσεγγίσεις.

Υλικό και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

για να εκτιμηθούν οι πιθανές διαφορές της επεξεργασίας φωσφορικών oseltamivir σε καλοήθεις και κακοήθεις κυτταρικές σειρές, δύο μαστικών κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: ένα αδένωμα που προέρχονται από κυτταρική σειρά (CMA07 εδραιωμένη στο εργαστήριο μας από μια αυθόρμητα συμβαίνουν κυνικός συγκρότημα αδένωμα αποκοπεί από 6 χρόνια-old θηλυκό σκυλί για θεραπευτικούς σκοπούς με τους ιδιοκτήτες συναινείτε [31]) και ένα καρκίνωμα που προέρχονται από κυτταρική σειρά (CMT-U27 – ιδιαίτερα μεταστατική κυτταρική γραμμή καρκινώματος του σκύλου, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον καθηγητή Eva Héllmen, από τη Σουηδία [32]). Οι δύο κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 επωαστή (Thermo Scientific) και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 με Glutamax και 25 mM Hepes (Gibco Life Technologies), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco Life Technologies) και 1% πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη (P /S) (Gibco Life Technologies).

σιαλιδάσης δραστηριότητα δοκιμασία

Υψηλότερα τα επίπεδα σιαλυλίωσης αναμένονται σε κακοήθη κύτταρα, σε σύγκριση με καλοήθης ομολόγους. Αυτό είναι πιο πιθανό να εξαρτάται από την δραστηριότητα και τα δύο sialyltranferases και σιαλιδάση [17]. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της φωσφορικής oseltamivir για τη δραστηριότητα των σιαλιδασών, ένα

in vitro

δοκιμασίας χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο σιαλικό οξύ (4-μεθυλο-ουμπελλιφερυλο-Nacetylneuraminic οξύ-4-Muñana), διεξήχθη χρησιμοποιώντας CMA07 και CMT- U27 σκύλου μαστικού καρκινικά κύτταρα. Σιαλιδάσης δραστικότητα προσδιορίστηκε με την απόκτηση του μεταβολική μετατροπή του αναλόγου σιαλικό οξύ, 4-Muñana, στην φθορίζουσα ένωση μεθυλ-ουμπελλιφερόνη (μπλε χρώμα), κατά την αγωγή με διαφορετικές δόσεις του φωσφορικού oseltamivir. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 12 mm κυκλική γυαλί μέχρι συρροή και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες με μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις φωσφορικών oseltamivir (0.305 μΜ, 3.05 μΜ, 30.5 μΜ και 305 φωσφορικό μΜ oseltamivir διαλυμένο σε PBS), και το όχημα του φαρμάκου (PBS ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από 24 ώρες κατεργασίας, το καθένα 12 mm κυκλική γυαλί τοποθετήθηκε σε αντικειμενοφόρο πλάκα και επωάζονται σε 2 μΜ 4-Muñana (2 ‘- (4-μεθυλο) -α-DN-ακετυλονευραμινικό οξύ) (Sigma, Saint Louis, USA) διάλυμα . Τα πλακίδια αμέσως παρατηρήθηκαν με επι-φθορισμού μικροσκοπία κάτω από υπεριώδες φως (διέγερση μήκος κύματος στα 360 nm, και μήκος κύματος εκπομπής στα 440 nm), όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [33]. Διαφάνειες αναλύθηκαν και οι εικόνες ελήφθησαν με ένα φακό Carl Zeiss μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss Μικροσκοπίας).

μορφολογία των κυττάρων ανάλυση

CMA07 και CMT-U27 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1×10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων, εις τριπλούν. Τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις φωσφορικού oseltamivir μελετήθηκαν: 0.305 μΜ, 3.05 μΜ και 30,5 μΜ, και PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ανάλυση της κυτταρικής συρροής και της μορφολογίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο αντίθεσης σε μια περίοδο 7 ημερών. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν τις ημέρες 0 και 7 υπό μεγέθυνση 200χ

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

δοκιμασία

CMA07 και CMT-U27 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 24-φρεατίων εις τριπλούν για κάθε κατάσταση:. 0.305 μΜ, 3.05 μΜ, 30.5 μΜ και 305 μΜ φωσφορικού oseltamivir και PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα κύτταρα μετρήθηκαν κάθε μέρα για 7 ημέρες σε θάλαμο Α Neubauer σε μία αραίωση 1: 2 των κυττάρων σε 0,4% trypan blue και η κυτταρική αρίθμηση έγινε χρησιμοποιώντας τον παράγοντα αναγωγής όγκου για 1 mm3, η οποία είναι 1×10

4. Αυτή η δοκιμασία επαναλήφθηκε 3 φορές και καμπύλες αύξησης εντοπίστηκαν.

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία

Η ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε σε κυτταρικές σειρές CMA07 και CMT-U27 χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ CellTiter 96 Υδατικό αντιδραστήριο One Solution (Promega Corporation), και διεξάγεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν (Orange Scientific), σε πυκνότητα 5χ10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων, φωσφορικό oseltamivir προστέθηκε σε 0.305 μΜ, 3.05 μΜ, 30.5 μΜ και 305 μΜ τελικές συγκεντρώσεις και PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ο κυτταρικός μεταβολισμός μετρήθηκε με προσθήκη αντιδραστηρίου τετραζολίου MTS και η απορρόφηση καταγράφηκε στα 490 nm. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 και 48 ώρες. Μια πρόσθετη μέτρηση ελέγχου έγινε σε χρονικό σημείο 0h, σε έναν πολιτισμό καλά χωρίς κύτταρα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν δύο φορές.

δοκιμασία TUNEL κυτταρικές σειρές

CMA07 και CMT-U27 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις φωσφορικού oseltamivir (0.305 μΜ, 3.05 μΜ, 30.5 μΜ και 305 μΜ, και PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος). Μετά από 24 ώρες κατεργασίας, το μέσο καλλιέργειας και tripsinized κύτταρα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στις 2000 rpm. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και μονιμοποιήθηκαν σε ψυχρή μεθανόλη για 20 λεπτά. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα ressuspended σε 1 κ.εκ. PBS για διαδικασία cytospin. Εν συντομία, 100 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος φυγοκεντρήθηκαν σε φυγόκεντρο cytospin3 χρησιμοποιώντας polilysine επικαλυμμένα διαφάνειες. Τα πλακίδια στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για

in situ ανίχνευση

κυτταρικό θάνατο χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ (

Σε situ

κιτ ανίχνευσης θανάτου κυττάρου, φλουορεσκεΐνης από τη Roche) με βάση το DNA επισήμανση θραύσεων διπλής έλικος (τεχνολογία TUNEL) , σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πλακίδια παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα μήκος κύματος 488nm διέγερσης και το ποσοστό των νεκρών κυττάρων υπολογίστηκε με καταγραφή θετικά κύτταρα TUNEL σε σχέση με το συνολικό κύτταρα χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Αυτή η δοκιμασία πραγματοποιήθηκε δύο φορές.

επούλωση πληγών

Η δοκιμασία επούλωση της πληγής πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν καλοήθη (CMA07) και ένα πολύ μεταστατικός (ΟΜΤ-U27) σκύλου μαστικού κυτταρική γραμμή όγκου σε ένα time-lapse μικροσκόπιο. Εν συντομία, 20×10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε μια πλάκα καλλιέργειας 24 φρεατίων και μετά την επίτευξη υψηλών συρροή ένα τεχνητό «πληγή» έγινε με ένα ρύγχος πιπέτας. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με τις διαφορετικές συγκεντρώσεις φωσφορικών oseltamivir: 0.305 μΜ, 3.05 μΜ και 30,5 μΜ φωσφορικού oseltamivir και PBS ως μάρτυρα. Πληγή απόκτηση εικόνας έγινε με διαστήματα 5 λεπτών για 48 ώρες, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Axio Vision Release 4.8.2. και μετατρέπεται σε βίντεο. Η επεξεργασία των κυττάρων με 305 μΜ φωσφορικού oseltamivir δεν εκτελέστηκε λόγω της προηγουμένως δειχθεί κυτταροτοξικότητα της. Αυτή η δοκιμασία πραγματοποιήθηκε δύο φορές.

εισβολής σε Matrigel Δοκιμασία

Μια δοκιμασία Matrigel εισβολή πραγματοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επεμβατική ικανότητα των κυττάρων CMT-U27, ένα καλό μοντέλο για τη μελέτη των κυττάρων εισβολή [34]. Τα ένθετα Matrigel επανα-ενυδατωμένο με RPMI 1640 για 1 ώρα στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένο 5% CO2 επωαστή (Thermo Scientific). Οι συνθήκες μέσων ήταν οι ίδιες στην κορυφή και τα κάτω φρεάτια (RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% των FBS και 1% πενικιλίνη και streptimicin).

Μετά ένθετο επανυδάτωση, 1×10

5 κύτταρα σπάρθηκαν επί Matrigel επικαλυμμένα θαλάμων υπό την παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων φωσφορικών oseltamivir (0.305 μΜ, 3.05 μΜ, 30.5 μΜ φωσφορικό oseltamivir) και PBS ως έλεγχο, και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για περαιτέρω 6 ώρες (προηγουμένως βελτιστοποιημένη χρονικό σημείο για δοκιμασίες εισβολή τη χρήση αυτής της κυτταρικής γραμμής ). Το φάρμακο χρησιμοποιήθηκε στην κορυφή φρεάτια. Μετά την επώαση, το περιεχόμενο του κάθε ενθέματος απομακρύνθηκε και πλύθηκε δύο φορές με PBS για την απομάκρυνση μη εισβάλλοντα κύτταρα. Διηθητική κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή μεθανόλη για 20 λεπτά, τα ένθετα μεταφέρθηκαν σε πλακίδια (βιομηχανικής ποιότητας) και τοποθετείται με Vectashield μέσο με DAPI (Vector Laboratories) στερέωσης. Εισβάλλοντα κύτταρα καταγράφηκαν με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων που υπάρχουν στο ένθετο. Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν 3 φορές.

φθορισμού κυτταροχημεία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και το μέσο καλλιέργειας συμπληρώθηκε με 0.305 μΜ, 3.05 μΜ και 30,5 μΜ φωσφορικού oseltamivir και PBS ως έλεγχο, για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή μεθανόλη για 20 λεπτά. Μετά την σταθεροποίηση, τα κύτταρα επανα-ενυδατωμένο με PBS και αποκλείστηκαν με 10% BSA για 20 λεπτά. Φυτικών λεκτινών ΣΕΛ (Βιοτινυλιωμένη Elderberry φλοιό λεκτίνη, B-1305, Vector Laboratories), MAL Ι (Βιοτινυλιωμένη Maackia amurensis λεκτίνη Ι, Β-1315, Vector Laboratories), και MAL II (Βιοτινυλιωμένη Maackia amurensis λεκτίνη ΙΙ, Β-1265, Vector Laboratories ) αραιώθηκαν 1: 300 σε 5% BSA σε PBS και επωάστηκαν σε πλακίδια επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επωάστηκαν 1 ώρα με στρεπταβιδίνη-ΡΙΤΟ. Μετά από δύο πλύσεις με PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν για 10 λεπτά με ϋΑΡΙ (Sigma-Aldrich) σε PBS και τα πλακίδια τοποθετούνται σε Vectashield μέσο (Vector Laboratories) για ανάλυση φθορισμού στερέωσης. Τα πλακίδια αναλύθηκαν και οι εικόνες ελήφθησαν σε ένα Carl Zeiss μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss Microscopy).

Western Blot ανάλυση

Κύτταρα από CMA07 και κυτταρικές γραμμές CMT-U27 αναπτύχθηκαν προς συρροή σε 6 φρεατίων -plates και διαφορετικές συγκεντρώσεις φωσφορικών oseltamivir προστέθηκαν στο μέσο (0,305 μΜ, 3,05 μΜ και 30,5 μΜ φωσφορικού oseltamivir). Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA λύσης (50 mM Tris HCl, ρΗ 8? 150 mM NaCl? 1% ΝΡ-40? 0,5% desoxicolate νάτριο? 0,1% SDS ) που περιέχει πλήρες κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche), 1 mM PMSF (φαινυλμεθυλ σουλφονυλο φθορίδιο), και 1 mM Na

3νο

4 (ορθοβαναδικό νάτριο). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο biocinchoninic οξέος από την Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce /Thermo Scientific), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Τα συνολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν σε 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε ένα μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences /GE Healthcare Life Sciences) και επωάζονται με διαφορετικές biotinylatedlectins: MAL Ι (Β-1315, Vector Laboratories), MAL II (Β-1265, Vector Laboratories) και το ΣΕΛ (Β-1305, Vector Laboratories) αραιωμένο 1 : 500 σε 5% BSA (Sigma-Aldrich) σε PBS με 0,05% Tween-20 (Sigma-Aldrich, USA). Μετά την πλύση με PBS 0,05% Tween-20, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αβιδίνη-βιοτίνης-υπεροξειδάσης κιτ (κιτ Vectastain ABC Προτύπου, Vector Laboratories) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Για SLE (x) και ανάλυση STn, οι μεμβράνες επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού, KM93 (Millipore) αραιωμένο 1: 500 και TKH2 (προσφέρονται απαλά από τον Dr H. Clausen από τη Δανία), που ακολουθείται από επώαση με ένα συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα. Η ανάλυση έγινε με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο και ταινιών ECL κηλίδωση Western ανίχνευση (και τα δύο από την GE Healthcare). κηλίδα Western για ακτίνη αραιωμένο 1: 4000 (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης

ηλεκτροφόρηση γέλης

2D

Οι διαφορές στα επιμέρους πρωτεΐνες είναι δύσκολο να απεικονίσει τη χρήση τυποποιημένων ανάλυση Western Blot.. Προσπαθώντας να ξεπεραστεί αυτό, έχουμε πραγματοποιήσει μια ανάλυση 2D τζελ ποια καλύτερη εισάγει διακρίσεις πρωτεΐνη μορφές σακχάρων σε εκχυλίσματα πρωτεϊνών. Τα δείγματα πρωτεΐνης από CMA07 και κυττάρων CMT-U27 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 3,05 μΜ oseltamivor και PBS κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου κατακρημνίστηκαν (ProteoExtract, Calbiochem) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα επανενυδάτωσης (7Μ ουρία, 2Μ Θειουρία, 4% (ν /ν) CHAPS ν και 0,0002 % κυανό βρωμοφαινόλης) με 0,2% του αμφολυτικού και ποσοτικά (2D Quant Kit από την GE Healthcare). Παθητική επανυδάτωση των λωρίδων διεξήχθη όλη τη νύχτα με 200 μα ολικών πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας IPG λωρίδες ρΗ 3-10 NL (ReadyStrip? 0,5 ​​x3 X70 mm, Bio-Rad, Hercules) σε θερμοκρασία δωματίου. Η ισοηλεκτρική εστίαση εκτελέστηκε σε Protean IEF κυττάρου (Bio-Rad) με αρχική τάση 250 V για 15 λεπτά, και στη συνέχεια με την εφαρμογή μιας βαθμίδας τάση μέχρι 4000V με περιορισμό ρεύμα 50 μΑ ανά λωρίδα και θερμοκρασία ρυθμίζεται στους 20 ° C. Η πρώτη διάσταση ολοκληρώθηκε σε 14-20 KVH.

Μετά την ισοηλεκτρική εστίαση πρωτεΐνες μειώθηκαν και αλκυλιώνεται με επώαση με 2% DL-διθειοθρεϊτόλη (DTT) που ακολουθείται από 2,5% ιωδοακεταμίδιο σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης (6Μ Ουρία, 2% SDS, 0,002% βρωμοφαινόλη μπλε, 75 mM Tris ρΗ 8,8, 29,3% γλυκερόλη) για 10 λεπτά κάθε υπό ήπια ανάδευση. Οι λωρίδες στη συνέχεια συσκευάζονται σε ένα χαμηλό πηκτωματοποιήσεως 1% (1% αγαρόζη σε ρέον ρυθμιστικό 25 mM Tris, 192 mM γλυκίνη, και 0.1% (w /v) SDS, ρΗ 8,3? Bio-Rad) πάνω από 10% πηκτή ακρυλαμιδίου (ακρυλαμιδίου /δισακρυλαμίδιο 37,5: 1, 2,6% από την Bio-Rad). Δεύτερον ηλεκτροφόρηση διάσταση πραγματοποιήθηκε σε ένα Mini-Protean σύστημα τετρα κυττάρου (Bio-Rad) χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό 1xTris /γλυκίνης /SDS σε σταθερή τάση της ανάλυσης Western blot 125 V. χρησιμοποιώντας SNA λεκτίνη εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στο προηγούμενο τμήμα.

Μελέτες σε ζώα

τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις ευρωπαϊκές κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων, η οδηγία 2010/63 /UE και του Εθνικού κανονισμό που δημοσιεύθηκε το 2013 (Decreto-Lei n. ° 113/2013 de 7 de Agosto). Ν: ΝΙΗ (S) II-ηυ /ηυ γυμνά ποντίκια, στεγάστηκαν, breeded και διατηρείται στο Ipatimup Animal Σώμα, σε ένα περιβάλλον χωρίς παθογόνα υπό ελεγχόμενες συνθήκες φωτός και υγρασίας. καθορίστηκαν οι ακόλουθες τελικά σημεία ευθανασίας: τυχόν ενδείξεις αγωνία, ταλαιπωρία ή πόνος, απώλεια σωματικού βάρους μεγαλύτερη από 20-25% της μάζας του σώματος, η ανορεξία και η κατάσταση ετοιμοθάνατου, που σχετίζονται ή όχι με την πειραματική διαδικασία

Πειραματική. ομάδες ποντικών και φαρμακευτική θεραπεία

Θηλυκά ΝΙΗ (S) II-ηυ /ηυ γυμνά ποντίκια, ηλικίας 4-6 εβδομάδων, ορθοτοπικά εμβολιάσθηκαν με 1 χ 106 βιώσιμα CMT-U27 καρκίνου του σκύλου κύτταρα του μαστού στο μαστικό λιπώδες στρώμα χρησιμοποιώντας μια βελόνα 25 gauge. Ένα σύνολο 8 ποντικών εμβολιάστηκαν. Όταν οζίδια φτάσει σε ένα όγκο περίπου 500mm3, τα ποντίκια (η = 8) τυχαιοποιήθηκαν και διαιρέθηκαν σε ομάδα ελέγχου (n = 4) και ομάδα αγωγής (η = 4) .Τα ζώα έλαβαν ενδοπεριτοναϊκώς (ΙΡ) είτε Dailly 100 μL PBS ( ομάδα ελέγχου) ή 100 mg /Kg φωσφορικού Oseltamivir (Tamiflu Roche) που αγοράστηκε από το φαρμακείο, αραιωμένο σε PBS (ομάδα θεραπείας) μέχρι το χρόνο του θανάτου. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας παχύμετρα και ο όγκος του όγκου (mm3) υπολογίστηκε με πλάτος x μήκος x ύψος. Για να παρατηρήσουμε metastization, πρωτογενών όγκων όλων των ποντικών αφαιρέθηκαν χειρουργικά, όταν επετεύχθη μέσος όγκος ~ 1000-1500mm3. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ΙΡ χορήγηση 100 μι ενός μίγματος που περιέχει 50 mg /kg Κεταμίνη (Imalgene 1000) και 1 mg /kg υδροχλωρικής μεδετομιδίνης (Medetor) και του όγκου αποκόπηκε. Χρησιμοποιήσαμε 2,5 mg /kg ατιπαμεζόλης (Revertor) ανά ποντίκια για να ανταγωνίζεται τη δράση της αναισθησίας. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με από του στόματος διάλυμα 10 mg /kg του tramadol chloridrate (Tramal) κάθε 8 ώρες για 24-48 ώρες για την πρόληψη του πόνου. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν μετά από χειρουργική εκτομή των πρωτοπαθών όγκων για την εισβολή ή /και σήματα metastization.

Όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία σύμφωνα με τις καθιερωμένες τελικά σημεία ευθανασίας και νεκροψία. Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη, υποβάλλονται σε επεξεργασία και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Τρία τμήματα μικρόμετρο κόπηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξιλίνη Ribeiro, C .; και Gartner, ΣΤ).

Η στατιστική ανάλυση

Όπου ενδείκνυται, τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση. Διεξήχθη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA (ανάλυση διακύμανσης) δοκιμής. Για MTS, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και την ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασίες πολλαπλών συγκρίσεων χρησιμοποιήθηκαν μέθοδος Dunnett. Student t test διεξήχθη για να αξιολογηθεί η επούλωσης τραύματος αποτελέσματα του προσδιορισμού. Πολλαπλές συγκρίσεις δοκιμή του Tukey χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί δοκιμασία εισβολή κυττάρων Matrigel και πολλαπλών συγκρίσεων δοκιμή Bonferroni χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση δοκιμασία TUNEL. GraphPad Prism 5.02 έκδοση χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση αυτών των στατιστικών αναλύσεων.

Imunohistochemical εικόνες του Ki-67 και κασπάσης-3 έκφρασης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα online εργαλεία ανάλυσης ImmunoRatio, σύμφωνα με τη μεγέθυνση υψηλής ισχύος σε κάθε περιοχή [35] . περιπτώσεις όγκων χωρίστηκαν σε 3 κατηγορίες ανάλογα με το σκορ Κί67: λιγότερο από 10% Κί67 θετικά κύτταρα (χαμηλή), 10 έως 50% Κί67-θετικά κύτταρα (μέτρια) και πάνω από 50% Κί67-θετικά κύτταρα (υψηλή). Για την αξιολόγηση της κασπάσης 3 και ΣΕΛ

x έκφρασης, οι όγκοι ομαδοποιήθηκαν ανάλογα με το ποσοστό των ανοσοαντιδραστικών κυττάρων σε όλη την αλλοίωση, σε 3 κατηγορίες: 0% (αρνητική)? λιγότερο από 5% (σπάνια κύτταρα) ή 6-10% (χαμηλή). Αναφορικά με SNA και ΜΑΑ έκφραση Ι, μια ημι-ποσοτική ανάλυση στην οποία τα δείγματα βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με το ποσοστό των θετικών κυττάρων. Οι όγκοι ομαδοποιήθηκαν σε: λιγότερο από 25% (χαμηλή)? 25 έως 50% (μέτρια) και πάνω από 50% (υψηλή). Στη συνέχεια, οι υποθέσεις ένωση ελέγχθηκαν, χρησιμοποιώντας Chi-square test για διακριτές μεταβλητές. λογισμικό SPSS (έκδοση 22.0) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση.

Αποτελέσματα

Επίδραση της πρόσληψης φωσφορικών oseltamivir από CMA07 και CMT-U27 κυττάρων στην ενδογενή δράση σιαλιδάσης

in vitro

Oseltamivir αγωγή με φωσφορικό δραστηριότητα εξασθενημένη σιαλιδάσης (υδρόλυση νευραμινικό οξύ), όπως φαίνεται από μια μείωση του φθορισμού μεθυλ-ουμπελλιφερόνη σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1). Επιπλέον, μια μείωση της σιαλιδάσης δραστηριότητας ήταν όλο και περισσότερο εμφανής σε υψηλότερες συγκεντρώσεις φωσφορικού oseltamivir.

CMA07 και CMT-U27 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις φωσφορικού oseltamivir (0.305 μΜ, 3.05 μΜ, 30.5 μΜ και 305 μΜ) ή PBS ως έλεγχο, και επωάστηκαν με ένα διάλυμα 2 μΜ 4-Muñana. Διαφάνειες αμέσως παρατηρήθηκαν στο πλαίσιο ενός επι-φθορισμού μικροσκόπιο με υπεριώδες φως. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν μειωμένη δράση σιαλιδάσης όπως εκτιμάται από την φθορίζουσα μεθυλ-ουμπελλιφερόνη, η οποία προκύπτει από μεταβολική μετατροπή του 4-Muñana.

Η

Επίδραση της θεραπείας με φωσφορικό oseltamivir σε CMA07 και κυττάρων CMT-U27 μορφολογία, βιωσιμότητα και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο

για να αξιολογηθεί το αποτέλεσμα διαφορετικών δόσεων του φωσφορικού oseltamivir στη μορφολογία των κυττάρων, βιωσιμότητα και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, το

in vitro δοκιμασίες

παρακάτω εκτελέστηκαν.

Ελαφρά μεταβολές στην κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκαν σε CMA07 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με oseltamivir φωσφορικό. Δεν υπάρχουν σημαντικά μεταβολές στη μορφολογία των κυττάρων CMT-U27 παρατηρήθηκαν (S1 Σχήμα).

Η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στο ρυθμό αύξησης τόσο CMA07 (

σ

= 0,6209) και CMT-U27 (

σ

= 0,9929) κυτταρικές σειρές, μετά από επεξεργασία με φωσφορικό oseltamivir (Σχήμα 2Α). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδραση της θεραπείας oseltamivir για CMA07 και η κυτταρική βιωσιμότητα CMT-U27, η MTS χρωματομετρική δοκιμασία, η οποία καθορίζει την κυτταρική μεταβολική δραστηριότητα, διεξήχθη, για 48 ώρες. Η μεταβολική δραστηριότητα των CMA07 και κυτταρικές σειρές CMT-U27 μειώθηκε σημαντικά με 305 θεραπεία φωσφορικό μΜ oseltamivir (

σ

= 0,005 και p & lt? 0,0001 αντίστοιχα) χρησιμοποιώντας One Way ANOVA όρχεις (ανάλυση διακύμανσης). Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικές μεταβολές παρατηρήθηκαν με 0.305 μΜ (p = 0,9781), 3,05 μΜ (

σ

= 0,7436) και 30,5 μΜ (

σ

= 0,9623) από θεραπείες φωσφορικού oseltamivir όταν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2Β). Τέλος, για να εκτιμηθεί η επίδραση του φωσφορικού oseltamivir για CMA07 και CMT-U27 προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, και δεδομένου ότι η μεταβολική δραστηριότητα 305 μΜ θεραπεία φωσφορική οσελταμιβίρη κυτταρική δυσλειτουργία, ένα προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο μέτρηση έγινε με τη δοκιμασία TUNEL. Είκοσι τέσσερις ώρες κατεργασία με φωσφορικό oseltamivir, ειδικά στα 305 μΜ, αυξήθηκε σημαντικά CMA07 (

σ

= 0,0010) και CMT-U27 (

ρ = 0,0002

) κατακερματισμό του DNA, γεγονός που υποδηλώνει την προώθηση του προγραμματισμένου κυτταρικού θάνατος, σε σύγκριση με χαμηλότερες συγκεντρώσεις oseltamivir, ή με PBS (Σχήμα 2C άνω και κάτω πλαίσια).

η ανάπτυξη των κυττάρων αξιολογείται με Trypan blue (Α) ή με τη δοκιμασία MTS (Β) και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (Γ ) αξιολογήθηκαν σε CMA07 και κυττάρων CMT-U27 μετά από αγωγή με φωσφορικό oseltamivir (0.305 μΜ, 3.05 μΜ, 30.5 μΜ και 305 μΜ) ή PBS ως μάρτυρα. (Α) Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων φωσφορικών oseltamivir, και κυτταρική ανάπτυξη παρακολουθήθηκε επί 7 ημέρες με μέτρηση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων καθημερινά. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στους ρυθμούς ανάπτυξης των κατεργασμένων κυττάρων ελέγχθηκαν σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα, εκτός από μια μειωμένη ανάπτυξη σε κύτταρα CMA μετά από 4 ημέρες θεραπείας με φωσφορικό oseltamivir 305 μΜ. (Β) Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων φωσφορικών oseltamivir, και μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων παρακολουθήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία MTS, με τρόπο χρονικής πορείας για 48 ώρες. CMA07 και CMT-U27 κύτταρα κατεργασμένα με 305 μΜ φωσφορικού oseltamivir έδειξαν μια σημαντική μείωση στην μεταβολική τους δραστηριότητα (***

ρ

& lt? 0.001), αλλά δεν έγινε καμία αλλαγή επαληθεύονται με τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις. (Γ) CMA07 και CMT-U27 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του oseltamivir για 24 ώρες. Κύτταρα κατεργασμένα με 305 μΜ φωσφορικού oseltamivir έδειξε επίσης μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (***

ρ

& lt? 0.001) μετά 24 ώρες θεραπείας με φωσφορικό oseltamivir αλλά καμία αλλαγή δεν επαληθεύονται με τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις (γραφήματα