Αφηρημένο

Η pentaspan μεμβράνη γλυκοπρωτεΐνη CD133 (επίσης γνωστή ως προμινίνη-1) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως δείκτης για την τόσο καρκίνο και φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων. Ωστόσο, η λειτουργία του CD133 δεν έχει διευκρινιστεί. Εδώ περιγράφουμε μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του βλαστικών εγκατεστημένος σαφές καρκίνωμα της ωοθήκης (CCC) και δείχνουν ότι CD133 αλληλεπιδρά με πλακοσφαιρίνης (επίσης γνωστή ως γ-κατενίνη), μια πρωτεΐνη των δεσμοσωμάτων συνδετήρα. Έχουμε αποδείξει ότι η περαιτέρω knockdown του CD133 με παρεμβολή RNA (RNAi) έχει σαν αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα κάτω της δεσμογλεΐνης-2, ένα δεσμοσωμάτων cadherin, και καταργεί την προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και ογκογονικότητα της CCC βλαστικών κυττάρων. Είμαστε εικάζουν ότι CD133 μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο στόχο για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Koyama-Nasu R, Takahashi R, Yanagida S, Nasu-Nishimura Υ, Oyama Μ, Kozuka-Hata H, et al. (2013) Ο Καρκίνος Βλαστικών Κυττάρων Marker CD133 αλληλεπιδρά με πλακοσφαιρίνη και Controls δεσμογλεΐνης-2 επίπεδα πρωτεΐνης. PLoS ONE 8 (1): e53710. doi: 10.1371 /journal.pone.0053710

Επιμέλεια: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Σεπ 2012? Αποδεκτές: 3 Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Koyama-Nasu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Ερευνητικό Πρόγραμμα Καινοτόμων Βιολογίας Κυττάρου από Innovative Technology (Ολοκληρωμένα Συστήματα Ανάλυσης Κυτταρικής Ογκογόνες Σηματοδοσίας Δίκτυα), επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα για τα καινοτόμα Περιοχές (Ολοκληρωμένες Έρευνας για τον Καρκίνο μικροπεριβάλλον Network) και για την Επιστημονική Έρευνα (C), Ίδρυμα Takeda Επιστήμη και εν μέρει από παγκόσμιο Πρόγραμμα του Συμβουλίου της Ευρώπης (Ολοκληρωμένες Life Science βασίζεται στη μελέτη της Biosignaling μηχανισμών), MEXT, Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα πιστεύεται ότι έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται και αυτο-ανανέωση και να είναι υπεύθυνος για την ογκογένεση, τη μετάσταση και η επανάληψη [1], [2]. Η παρουσία των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου έχει αποδειχθεί σε μία ποικιλία όγκων [1]. Ειδικότερα, γλοιοβλάστωμα βλαστικά κύτταρα έχουν μελετηθεί εκτεταμένα καθώς μπορούν να διατηρηθούν σε μέσα άνευ ορού που ευνοούν την ανάπτυξη των νευρικών βλαστικών [3] κύτταρα. Ωστόσο, εξακολουθεί να είναι δύσκολο να διατηρηθεί και να επεκταθεί καρκινικά βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από άλλους ιστούς

in vitro

. Στην παρούσα μελέτη, πετύχαμε την ίδρυση ενός καρκίνου βλαστικών κυττάρων γραμμή από σαφείς καρκίνωμα της ωοθήκης (CCC), η οποία έχει τη χειρότερη πρόγνωση μεταξύ των επιθηλιακών ωοθηκικών καρκίνων [4] και δείχνουν ότι CD133 αλληλεπιδρά με πλακοσφαιρίνης, ελέγχει δεσμογλεΐνης-2 πρωτεΐνη επίπεδα και απαιτείται για την προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και καρκινογένεση από τη CCC βλαστικών κυττάρων.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

καλλιεργηθούν βλαστικά κύτταρα CCC απομονωθεί από έναν ασθενή με διάγνωση CCC υπό συνθήκες χωρίς ορό. Παρόμοια με γλοιοβλάστωμα βλαστικών κυττάρων [5], CCC βλαστικά κύτταρα αναπτύχθηκαν εκθετικά για λαμινίνη επικαλυμμένα πιάτα υπό συνθήκες χωρίς ορό (Εικ. 1Α και S1 Α). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για άλλους καρκίνους [3], [6], [7], CCC βλαστικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε διαφοροποίηση όταν καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει ορό (CCC διαφοροποιημένων κυττάρων): αυτοί εμφάνισαν μια ελαφρά μορφολογική αλλαγή (Εικόνα 1Α.), Και το τα επίπεδα έκφρασης δεικτών των βλαστικών κυττάρων, όπως

CD133

[8],

SOX2

[9] και

Lgr5

[10], ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ. 1Β) . Όταν βλαστοκύτταρα CCC εγχύθηκαν υποδορίως σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, όλα τα ποντίκια ανέπτυξαν όγκους που ήταν ιστοπαθολογικά παρόμοια με την αρχική τους όγκου (Σχ. 1C και S1B). Αντιθέτως, κανένας από τους ποντικούς που έχουν μεταμοσχευθεί CCC διαφοροποιημένα κύτταρα ανέπτυξαν όγκους, παρά την ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται εκθετικά

in vitro

(Σχ. 1C και S1 Α).

(Α) στέλεχος CCC και διαφοροποιημένη κύτταρα (diff) σε καλλιέργεια. Οι φωτογραφίες αντίθεσης φάσης εμφανίζεται. (Β) Τα επίπεδα mRNA των υποδεικνυόμενων γονιδίων εκτιμήθηκαν με ποσοτική RT-PCR και εμφανίζονται ως φορές μεταβολής επί των επιπέδων mRNA σε CCC βλαστικά κύτταρα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.d. (

n

= 3). (Γ) CCC βλαστικά ή διαφοροποιημένα κύτταρα υποδορίως μεταμοσχεύθηκαν σε ποντίκια NOG (

n

= 3). Επτά μήνες μετά τη μεταμόσχευση, τα ποντίκια (άνω) και όγκων (κατώτερο) φωτογραφήθηκαν. (D) εκλούεται από ανοσοκαθαρισμένου CD133 από το κλάσμα μεμβράνης των βλαστικών κυττάρων CCC αναλύθηκαν με SDS-PAGE και κατέστησαν ορατά με βαφή αργύρου. πρωτεΐνες (Ε) δεσμοσωμάτων προσδιορίζονται με φασματομετρία μάζας. Οι αριθμοί των μοναδικών πεπτιδίων προσδιορίζονται απεικονίζεται. (F) Τα δείγματα παρασκευάσθηκαν όπως περιγράφεται στο (D) και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες. (G) Συν-εντοπισμός του CD133 (κόκκινο) με τις πρωτεΐνες των δεσμοσωμάτων (πράσινο). βλαστοκύτταρα CCC ανοσοχρωματίστηκαν με αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες. TO-PRO-3 ιωδίδιο χρησιμοποιήθηκε για χρώση πυρηνικό DNA (μπλε). Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 20 μm.

Η

Η έκφραση του CD133 περιορίζεται αυστηρά σε ένα σπάνιο πληθυσμό των σωματικών και καρκινικά βλαστικά κύτταρα [8]. Συνεπώς, είναι δύσκολο να ληφθούν επαρκείς αριθμοί κυττάρων για να εκτελέσει βιοχημική ανάλυση του συμπλόκου πρωτεΐνης CD133 που περιέχει. Εκμεταλλευόμενοι την ικανότητα της CCC βλαστικών κυττάρων να αυξάνονται με γεωμετρική πρόοδο και να διατηρούν υψηλά επίπεδα έκφρασης του CD133

in vitro

, στόχος μας ήταν να immunopurify της ενδογενούς συγκρότημα CD133. CD133 ανοσοκατακρημνίσθηκε από το κλάσμα μεμβράνης με αντι-CD133 αντισώματος και μετά την επιβεβαίωση με SDS-PAGE και χρώση αργύρου, τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (Σχ. 1D). Μεταξύ των συν-καθαρισμένες πρωτεΐνες εντοπίστηκαν (Πίνακας S1), εστιάσαμε την προσοχή μας στις πλακοσφαιρίνης και δεσμοπλακίνη (Εικ. 1 Ε), δεδομένου ότι είναι συστατικά της δεσμόσωμα, η οποία μεσολαβεί προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου [11]. Δεσμοσώματα είναι συνδετική συμπλέγματα που αποτελούνται από μέλη της οικογένειας cadherin πρωτεϊνών κυτταρικής προσκόλλησης και σύνδεση πρωτεϊνών που αποδίδουν τις πρωτεΐνες προσκόλλησης κυτταρικής επιφάνειας σε ενδοκυτταρική κερατίνη νημάτια κυτταροσκελετικών. Πλακοσφαιρίνης και λειτουργία δεσμοπλακίνη ως τα κύρια δεσμοσωματικής σύνδεση πρωτεϊνών.

Εμείς επιβεβαίωσε την ικανότητα του CD133 να αλληλεπιδρούν με πλακοσφαιρίνη από

in vivo

δοκιμασίες pull-down. Όταν ένα προϊόν λύσεως από βλαστικά κύτταρα CCC υποβλήθηκε σε ανοσοκαθίζηση με αντι-CD133 αντίσωμα, που ακολουθείται από ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-πλακοσφαιρίνης, πλακοσφαιρίνης βρέθηκε να έχει συν-ανοσοκαταβυθίζεται με CD133 (Εικ. 1 F). Πλακοσφαιρίνη δεν ανιχνεύθηκε όταν IgG ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαθίζηση. Ωστόσο, οι προσδιορισμοί

in vitro

pull-down μας απέτυχε να ανιχνεύσει συν-καταβύθιση του πλακοσφαιρίνης με θραύσματα που περιέχουν μεμονωμένα κυτταροπλασματικές περιοχές του CD133 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό μπορεί να συμβαίνει επειδή η τοπολογία μεμβράνη CD133 είναι σημαντική για τη σύνδεσή της με πλακοσφαιρίνη. Εναλλακτικά, CD133 δεν μπορεί να συνδέεται άμεσα με πλακοσφαιρίνη. Τα αποτελέσματα με δεσμοπλακίνη ήταν ασαφή, όπως συν-καθιζάνει είτε με το αντίσωμα αντι-CD133 ή τον έλεγχο της IgG υπό πειραματικές συνθήκες μας.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των βλαστικών κυττάρων CCC αποκάλυψε ότι CD133 και πλακοσφαιρίνη συν-εντοπίζεται εντός των περιοχών του κυττάρου β-κυττάρων επαφής (Εικ. 1G). χρώση CD133 δεν ανιχνεύθηκε όταν τα κύτταρα έχουν μολυνθεί με ένα φακοϊό εκφράζουν ένα shRNA στόχευση CD133 (Εικ. 2C), υποδεικνύοντας την ειδικότητα της αντι-CD133 αντίσωμα. Δεσμοπλακίνη βρέθηκε σε μερική συν-εντοπίζονται με CD133 (Εικ. 1G).

(Α) βλαστικά κύτταρα CCC μολύνθηκαν με φακοϊό έκφραση shRNA CD133 στόχευση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μηχανική καταπόνηση με σιφώνιο σε PBS που περιέχει 1 mM ΟαΟ

2 και 0.5 mM MgCl

2. Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται (επάνω). Το ραβδόγραμμα αντιπροσωπεύει το λόγο του αριθμού των κυττάρων /αριθμό cluster (κατώτερο). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.d. (

n

= 3).

p = 0,011

με σύγκριση με τον έλεγχο shRNA από t test. (Β) βλαστοκύτταρα CCC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α). Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες. (Γ) βλαστοκύτταρα CCC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α). Τα κύτταρα ανοσοχρώστηκαν με αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες (κόκκινο). TO-PRO-3 ιωδίδιο χρησιμοποιήθηκε για χρώση πυρηνικό DNA (μπλε). Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 20 μm. (D) βλαστοκύτταρα CCC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α). Τα κύτταρα υποδορίως μεταμοσχευθεί σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς (

n

= 3). Έντεκα μήνες μετά τη μεταμόσχευση, φωτογραφήθηκαν ποντίκια (άνω) και όγκους (μεσαία). Το ραβδόγραμμα αντιπροσωπεύει το βάρος του όγκου (κάτω). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.d. (

n

= 3).

p = 0,007

με σύγκριση με τον έλεγχο shRNA από t test.

Η

Πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση της δεσμογλεΐνης-2 και desmocollin-2, δύο δεσμοσωματικής καντερίνες που εκφράζονται σε βλαστικά κύτταρα CCC . Βρήκαμε ότι αυτές οι πρωτεΐνες επίσης συν-εντοπισμένη με CD133 (Εικ. 1 G). Ειδικότερα, CD133 και δεσμογλεΐνης-2 είχε πολύ παρόμοια σχέδια κατανομής. Ωστόσο, ούτε δεσμογλείνης-2 ούτε desmocollin-2 θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε CD133 ανοσοκαθιζήματα, υποδεικνύοντας ότι δεν συνδέονται φυσικώς (Εικ. 1 F). Αντίθετα, ανοσοϊζήματα πλακοσφαιρίνης βρέθηκαν να περιέχουν CD133 καθώς καντερίνες δεσμοσωμάτων (Εικ. 1 F). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι CD133 αλληλεπιδρά με πλακοσφαιρίνης, αλλά όχι με το σύμπλοκο πρωτεΐνης δεσμοσωμάτων περιέχει δεσμογλείνης-2 και desmocollin-2.

Μελετήσαμε επόμενο τον ρόλο της CD133 στη ρύθμιση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Παρατηρήσαμε ότι τα βλαστικά κύτταρα CCC δεν θα μπορούσε εύκολα να διασκορπίζονται με σιφώνιο. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα έχουν μολυνθεί με ένα φακοϊό εκφράζουν ένα shRNA στόχευσης CD133, τα κύτταρα θα μπορούσαν να διασπείρονται με πιπέτα (Εικ. 2Α). Επιπλέον, κρέμονται προσδιορισμούς συσσωμάτωσης σταγόνα κυττάρων έδειξαν ότι κύτταρα νοκ ντάουν CD133 δεν αθροίζει σφιχτά και θα μπορούσαν να διασπείρονται με πιπέτα (Εικ. S2). Έτσι, CD133 μπορεί να είναι σημαντική για την προσκόλληση της CCC βλαστικών κυττάρων. Για να διαλευκανθεί ο μοριακός μηχανισμός βασίζεται η παρούσα μείωση στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών δεσμοσωμικών. Ανοσοκηλίδωση και RT-PCR αναλύσεις αποκάλυψαν ότι knockdown του CD133 είχε ως αποτέλεσμα μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης δεσμογλείνης-2, αλλά όχι

δεσμογλείνης-2

mRNA (Σχ. 2Β και S3A), ένα αποτέλεσμα που επιβεβαιώνεται από ανοσοϊστοχημεία (Εικ. 2C).

Νοκ ντάουν του CD133 χρησιμοποιώντας μια ξεχωριστή shRNA οδήγησε επίσης σε ρύθμιση προς τα κάτω της δεσμογλεΐνης-2 (Εικ. S3b). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με την ανθρώπινη εντερική επιθηλιακή κυτταρική σειρά Caco-2, η οποία εκφράζει επίσης υψηλά επίπεδα CD133 [12] (Σχ. S3C). Επιπλέον, knockdown του CD133 οδήγησε σε ελαφρώς διαχέεται εντοπισμό του πλακοσφαιρίνη (Εικ. 2C). Επιπλέον, βρήκαμε ότι knockdown του πλακοσφαιρίνης οδήγησε σε μείωση των επιπέδων της δεσμογλείνης-2 πρωτεΐνης (Εικ. S3D, E). Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, οι δοκιμασίες κυτταρικής συσσωμάτωσης που κρέμεται σταγόνα αποκάλυψε ότι knockdown της δεσμογλείνης-2 είχε σαν αποτέλεσμα μία μείωση στην προσκόλληση των κυττάρων CCC (Εικ. S2). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CD133 απαιτείται για τη σταθερότητα και την ορθή εντοπισμό των πρωτεϊνών δεσμοσωμικών.

CD133 χρησιμοποιείται ευρέως για την απομόνωση μιας ποικιλίας καρκινικών βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων CCC της ωοθήκης [8], [13]. Ωστόσο, η λειτουργική συμβολή της στην ογκογένεση υπήρξε ασαφής. Η προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου είναι ένα εγγενές χαρακτηριστικό του συμπαγείς όγκους, και αρκετές αναφορές έχουν προτείνει ότι δεσμογλείνης-2 είναι απαραίτητη για την ογκογονικότητα αρκετών επιθηλιακών όγκων [14]. Έτσι, εξετάσαμε τον πιθανό ρόλο της CD133 στη ογκογονικότητας της CCC βλαστικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα shRNA-κωδικοποιεί λεντοϊού σε σταθερά νοκ ντάουν έκφραση CD133. Soft-άγαρ προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας έδειξε ότι knockdown του CD133 είχε ως αποτέλεσμα μείωση στην ικανότητα σχηματισμού αποικίας των CCC βλαστικά κύτταρα (Εικ. S4). Επιπλέον, knockdown της δεσμογλείνης-2 μείωσε επίσης το σχηματισμό αποικιών. Όταν οι CD133-knockdown κύτταρα εγχύθηκαν υποδόρια σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, μεγάλωσε σε σημαντικά μειωμένο ποσοστό σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2D). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι CD133 απαιτείται για την καρκινογένεση από τη CCC βλαστικών κυττάρων.

Σε αυτήν την έκθεση, αποδείξαμε ότι CD133 αλληλεπιδρά με πλακοσφαιρίνη και ελέγχει την προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου σε CCC βλαστικά κύτταρα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η εξόντωση CD133 σε βλαστικά κύτταρα CCC προκάλεσε μείωση στα επίπεδα της δεσμογλείνης-2. Ο μηχανισμός με τον οποίο το συγκρότημα CD133-πλακοσφαιρίνης σταθεροποιεί δεσμογλεΐνης-2 μένει να διερευνηθεί. Σε αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα, CD133 είναι γνωστό να εμπλουτιστεί στις θέσεις επαφής με οστεοβλάστες [15]. Έτσι, CD133 μπορεί να λειτουργήσει τόσο σε καρκίνο και φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων ως ρυθμιστής των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου. Δείξαμε επίσης ότι CD133 είναι σημαντική για την καρκινογένεση από τη CCC βλαστικών κυττάρων. Το εύρημα αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν ότι δεσμογλεΐνης-2 εμπλέκεται στην ογκογένεση [14]. Συνεπώς, είναι ενδιαφέρον να υποθέσουμε ότι CD133 ή /και δεσμογλείνης-2 μπορεί να είναι θεραπευτικοί στόχοι για επιθηλιακό καρκίνο βλαστικά κύτταρα CD133-θετική.

Υλικά και Μέθοδοι

Tumor Δείγμα and Cell Cultures

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας για Ιατροβιολογικών Ερευνών της επιτροπής αναθεώρησης Jikei θεσμικών, Jikei Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου, Τόκιο, Ιαπωνία. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. δείγμα όγκου που ταξινομούνται ως σαφής καρκίνωμα της ωοθήκης ελήφθη από έναν ασθενή που υποβάλλεται χειρουργική θεραπεία στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Jikei. Οι όγκοι πλύθηκαν, και μηχανικά και ενζυμικά διάσταση σε μεμονωμένα κύτταρα. Τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε λαμινίνη (Sigma) -επικαλυμμένα πιάτο σε DMEM /F-12 (Life Technologies) που περιέχει συμπλήρωμα Β27 (Life Technologies), EGF και FGF2 (20 ng /ml το καθένα? Wako Pure Chemical Industries). Για

in vitro

διαφοροποίησης, καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F-12 (Life Technologies) που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. κύτταρα 293FT και Caco-2 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Nissui) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου.

υποδόρια ξενομοσχεύματα

Μία εβδομάδα μετά την λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό, 1 × 10

5 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε 6 εβδομάδων ποντικούς NOG (Κεντρικό Ινστιτούτο Πειραματικής Animals) (

n

= 3). Οι όγκοι αναλύθηκαν ιστολογικά μετά χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (ΗΕ). Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων, Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Τόκιο, Ιαπωνία. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα των ζώων έγιναν σύμφωνα με την πολιτική της Επιτροπής Δεοντολογίας Ζώων, Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Τόκιο, Ιαπωνία.

Ποσοτική RT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας NucleoSpin RNA Clean -up kit (Takara) και αντίστροφη-μεταγραφή προς το cDNA χρησιμοποιώντας PrimeScript RT Master Mix (Takara). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση LightCycler480 SYBR Green Ι Μάστερ και ένα μέσο LightCycler480 (Roche). Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με την τιμή που ανιχνεύεται για

αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH)

. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται σε πραγματικό χρόνο PCR ήταν ως ακολούθως:

GAPDH

εμπρός (5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘),

GAPDH

αντίστροφη (5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′)?

CD133

προς τα εμπρός (5′-AGTGGCATCGTGCAAACCTG-3 ‘),

CD133

αντίστροφη (5′-CTCCGAATCCATTCGACGATAGTA-3′)?

SOX2

προς τα εμπρός (5′-TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA-3 ‘),

SOX2

αντίστροφη (5′-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC-3′)?

Lgr5

προς τα εμπρός (5′-GATTTCCTGCTTGACTTTGAGG-3 ‘),

Lgr5

αντίστροφη (5′-GCAGGTGTTCACAGGGTTTG-3′)?

πλακοσφαιρίνης

προς τα εμπρός (5′-GATCTTCCGGCTCAACACC-3 ‘),

πλακοσφαιρίνης

αντίστροφη (5′-GATGTTCTCCACCGACGAGT-3′)?

δεσμογλεΐνης-2

προς τα εμπρός (5′-GGAAATTTTCAAGCTTTTGATGA-3 ‘),

δεσμογλεΐνης-2

αντίστροφη (5′-CCACAGAGATCCAATTATCTCTATCTT-3′).

Αντισώματα

Ποντίκια μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) προς CD133 (AC133) ελήφθη από τη Miltenyi Biotec. Mouse mAb προς desmocollin-2/3 (7G6), δεσμογλείνης-2 (6d8) και α-τουμπουλίνης ήταν από την Santa Cruz Biotechnology. Ποντίκι mAb να πλακοσφαιρίνη ήταν από BD Biosciences. Ποντίκι mAb να GAPDH ήταν από την Millipore. Mouse mAb προς δεσμοπλακίνη (2Q400) ήταν από Abcam και χρησιμοποιήθηκε για ανοσοϊστοχημεία. Κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα (pAb) για να δεσμοπλακίνη ήταν από Abcam και χρησιμοποιήθηκε για ανοσοκηλίδωση.

Ανοσοκαταβύθιση και ανοσοκηλίδωση

Το κλάσμα μεμβράνης των κυττάρων λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [50 mM HEPES-NaOH ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ40, 1 mM διθειοθρεϊτόλη και αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche)] (Σχ. 1D). Εναλλακτικά, το κλάσμα μεμβράνης λύονται σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 1% διγιτονίνη αντί ΝΡ40 (Εικ. 1 F). Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν με αντι-CD133, αντι-πλακοσφαιρίνης ή IgG1 ελέγχου ακινητοποιημένο σε Ενεργοποιημένη CH-Sepharose 4Β (GE Healthcare) για 4 ώρες στους 4 ° C. Μετά από πέντε πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με 100 mM Γλυκίνη-ΗΟΙ και υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη. Μετά αφαλατώθηκε με ZipTip (C18? Millipore), το δείγμα υποβλήθηκε σε χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας υγρού. Για ανοσοστύπωση, οι πρωτείνες εκλούονται κλασματώθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Immobilon-P, Millipore). Η μεμβράνη υποβλήθηκε σε ανάλυση ανοσοκηλίδος χρησιμοποιώντας αλκαλική φωσφατάση-συζευγμένη αντι-ποντικού ή κουνελιού IgG (Promega) ως δευτερεύοντα αντισώματα. Οπτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το χρωματομετρικό σύστημα υπόστρωμα ΝΒΤ /ΒΟΙΡ (Promega).

φασματομετρίας μάζας Ανάλυση και Πρωτεΐνης Ταυτοποίηση

Κυνηγετικό πρωτεομική αναλύσεις διεξήχθησαν από ένα γραμμικό ιόντων παγίδα-Orbitrap φασματόμετρο μάζας (LTQ- Orbitrap Βέλος, Thermo Fisher Scientific) σε συνδυασμό με το σύστημα λεπτής ροής LC (Ντίνα-2Α, ΚΥΑ Technologies) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. προσδιορισμός πρωτεΐνης διεξήχθη από την αναζήτηση MS και MS /MS δεδομένα κατά την REFSEQ (National Center for Biotechnology Information) της βάσης δεδομένων ανθρώπινη πρωτεΐνη (32.968 πρωτεϊνικές ακολουθίες από 12, Σεπτεμβρίου του 2011) με τη χρήση μασκότ ver. 03/02/02 (Matrix Science). οξείδωση Μεθειονίνη, πρωτεΐνης Ν-τελική ακετυλίωση και πυρο-glutamination για Ν-τερματική γλουταμίνη ορίστηκαν ως μεταβλητή τροποποιήσεις. Ένα μέγιστο δύο αναπάντητες διασπάσεις επετράπη στην αναζήτηση της βάσης δεδομένων μας και η ανοχή για τη μαζική απόκλιση ορίστηκε σε 3 μέρη ανά εκατομμύριο (ppm) για το πεπτίδιο μάζες και 0,8 Da για το MS /MS κορυφές, αντίστοιχα. ταυτοποίηση πρωτεϊνών βασίστηκε στο κριτήριο της ύπαρξης τουλάχιστον ενός δεδομένων MS /MS με μασκότ σκορ που υπερέβαινε τα κατώτατα όρια (

σ

& lt? 0,01).

παρεμβολή RNA

Οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων shRNA είχαν ως εξής: CD133 # 1 (5′-GGAUACACCCUACUUACUAAA-3 ‘), CD133 # 2 (5′-GCACUCUAUACCAAAGCGUCA-3′), δεσμογλείνης-2 # 1 (5’-GUUAGCGAGAGCAUGGAUAGA-3 ‘), δεσμογλεΐνης -2 # 2 (5’-GCAUUAUCAGUAAUAAUUUGU-3 ‘), πλακοσφαιρίνης (5′-GAGCAUGAUUCCCAUCAAUGA-3’).

Lentivirus Παραγωγή

φορέα λεντοϊού (CS-RFA-CG) εκφράζει μια shRNA οδηγείται από τον υποκινητή Η1 επιμολύνθηκε με τους φορείς συσκευασίας pCAG-HIV-GP και pCMV-VSV-G-RSV-Rev εντός 293FT κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Όλα τα πλασμίδια ευγενώς από τον H. Miyoshi (RIKEN Bioresource Κέντρο, Ιαπωνία). Viral υπερκείμενο καθαρίστηκε με υπερφυγοκέντρηση στις 25.000 rpm για 90 λεπτά (SW28 ρότορα, Beckman). αποδοτικότητα μόλυνση παρακολουθήθηκε με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) έκφραση, όπως κατευθύνεται από τον προαγωγέα CMV.

Ανοσοϊστοχημεία

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες επικαλυμμένες με λαμινίνη και σταθεροποιήθηκαν με παγωμένη μεθανόλη . Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα ακολουθούμενη από επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με Alexa 488 ή 594 (Life Technologies). Για CD133 οπτικοποίηση, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-CD133 αντίσωμα συζευγμένο με R-φυκοερυθρίνη. TO-PRO-3 ιωδίδιο (Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση πυρηνικό DNA. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με LSM 510 META μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Carl Zeiss).

Διαχωρισμού Κυττάρου Δοκιμασία

5 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκες λαμινίνη με λεπτό υμένιο. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν από τις πλάκες καλλιέργειας με ένα ξέστρο κυττάρων και διαβιβάζεται 10 φορές μέσω 200 μΙ ρύγχος της πιπέτας σε PBS που περιέχει 1 mM ΟαΟ

2 και 0.5 mM MgCl

2. Οι εικόνες συλλήφθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Η έκταση της κυτταρικής διάσπασης εκπροσωπήθηκε από την αναλογία του αριθμού των κυττάρων αριθμού /cluster.

Κρεμαστά Drop τηλέφωνα Aggregation Δοκιμασία

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS και επανααιωρήθηκαν σε 5 × 10

5 κύτταρα ανά χιλιοστόλιτρο στο μέσο. 7,5 × 10

3 κύτταρα ανασταλεί κρέμονται σταγόνες από το καπάκι του δίσκου καλλιέργειας και αφήνεται να αθροίζει τη διάρκεια της νύχτας. Για κονιοποίηση, τα κύτταρα πέρασαν 10 φορές μέσω 200 μΙ ρύγχος πιπέτας. Οι εικόνες συλλήφθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Το μέγεθος των σωματιδίων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ 1.46r.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Χαρακτηρισμός των βλαστικών κυττάρων CCC. κινητική (Α) Πολλαπλασιασμός της CCC βλαστικών κυττάρων. CCC βλαστικών και διαφοροποιημένων κυττάρων (διαφ) καλλιεργήθηκαν για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Το γράφημα ράβδων αναπαριστά την ημέρα (

x

-άξονα) και την κυτταρική σειρά (

y

-άξονα). (Β) Η ιστοπαθολογική ανάλυση των ξενομοσχευμάτων όγκου. HE σήμανσης ενός CCC βλαστικών κυττάρων ξένου μοσχεύματος και ασθενή με όγκο παρουσιάζεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

CD133 και δεσμογλεΐνης-2 που απαιτούνται για την προσκόλληση της CCC βλαστικών κυττάρων. βλαστικά κύτταρα CCC μολύνθηκαν με φακοϊό έκφραση shRNA στόχευση CD133 ή δεσμογλεΐνης-2. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε κρέμονται καλλιέργειες πτώσης και αφέθηκαν να συσσωματωθούν όλη την νύχτα. Πριν (-) και μετά κύτταρα (Λειοτρίβηση) υποβλήθηκαν σε μηχανική καταπόνηση με σιφώνιο, οι εικόνες συλλήφθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (άνω). Το γράφημα μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο μέγεθος σωματιδίου σε σχέση με κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο shRNA (κατώτερο). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.d. (

n

= 3). NS, μη σημαντικό? *,

σ

& lt? 0,05 με δοκιμή t

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

CD133 και της πλακοσφαιρίνης ελέγχουν τα επίπεδα έκφρασης της δεσμογλείνης-2. (Α) βλαστικά κύτταρα CCC μολύνθηκαν με φακοϊό έκφραση shRNA CD133 στόχευση. Τα επίπεδα mRNA των υποδεικνυόμενων γονιδίων εκτιμήθηκαν με ποσοτική RT-PCR και εμφανίζονται ως φορές μεταβολής επί των επιπέδων mRNA σε κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο shRNA. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.d. (

n

= 3). (Β) βλαστικά κύτταρα CCC μολύνθηκαν με φακοϊό έκφραση shRNA CD133 στόχευση (CD133 shRNA # 2). Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες. κύτταρα (C) Caco-2 μολύνθηκαν με φακοϊό ένα εκφράζει μια CD133 shRNA στόχευσης. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες. (D) βλαστικά κύτταρα CCC μολύνθηκαν με φακοϊό έκφραση πλακοσφαιρίνη στόχευση shRNA. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες. (Ε) βλαστοκύτταρα CCC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (D). Τα επίπεδα mRNA των υποδεικνυόμενων γονιδίων εκτιμήθηκαν με ποσοτική RT-PCR και εμφανίζονται ως φορές μεταβολής επί των επιπέδων mRNA σε κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο shRNA. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.d. (

n

= 3)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

CD133 και demoglein-2 που απαιτούνται για την αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη της CCC βλαστικών κυττάρων. βλαστικά κύτταρα CCC μολύνθηκαν με φακοϊό έκφραση shRNA στόχευση CD133 ή δεσμογλεΐνης-2. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μαλακό άγαρ και καλλιεργήθηκαν για 2 εβδομάδες. Το γράφημα ράβδος αντιπροσωπεύει τον αριθμό των αποικιών σε σχέση με κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο shRNA. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.d. (

n

= 4). *,

σ

& lt? 0.05 με σύγκριση με τον έλεγχο shRNA με δοκιμή t

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s004

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Πλήρης κατάλογος των πεπτιδίων που προσδιορίζονται στην ανάλυση φασματομετρίας μάζας.

doi: 10.1371 /journal.pone.0053710.s005

(XLSX)