Αφηρημένο

Η υπερέκφραση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της κεφαλής και του τραχήλου και απονέμει αυξημένη αντοχή και κατώτερα ποσοστά επιβίωσης. Παρά τις στοχευμένες παράγοντες εναντίον EGFR, όπως cetuximab (C225), σχεδόν το ήμισυ των ασθενών που έλαβαν θεραπεία αποτύχει αυτή τη θεραπεία, η οποία απαιτεί νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) αναστολείς (PARPi) έχουν κερδίσει τα τελευταία προσοχή λόγω της μοναδικής επιλεκτικότητα τους σε σκοτώνει τους όγκους με ελαττωματική επιδιόρθωση του DNA. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αποδείξει ότι C225 ενισχύει την κυτταροτοξικότητα με την PARPi ABT-888 στο UM-SCC1, UM-SCC6, και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα FaDu. Ο μηχανισμός της αυξημένης ευαισθησίας σε C225 και C225 PARPi εμπλέκει διαμεσολαβούμενη μείωση του μη ομόλογου άκρου συναρμογής (NHEJ) – και ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) μεσολάβηση DNA διπλό σπάσιμο κλώνου (DSB) επισκευή, η επακόλουθη επιμονή της βλάβης του DNA, και ενεργοποίηση της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι. Με τη δημιουργία μια ανεπάρκεια επιδιόρθωσης DSB, C225 μπορεί να καταστήσει το κεφάλι και το λαιμό του όγκου κύτταρα ευαίσθητα στην αναστολή PARP. Ο συνδυασμός του C225 και το PARPi ABT-888 μπορεί έτσι να είναι μια καινοτόμος θεραπευτική στρατηγική σε δυνητικά βελτίωση των αποτελεσμάτων σε ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Επιπλέον, αυτή η στρατηγική μπορεί επίσης να είναι εφικτή για άλλους όγκους που υπερεκφράζουν EGFR, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων και καρκίνων του εγκεφάλου

Παράθεση:. Nowsheen S, Bonner JA, LoBuglio AF, Trummell Η, Whitley AC, Dobelbower MC, et al. (2011) Το cetuximab Augments κυτταροτοξικότητα με Poly (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης Αναστολή σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. PLoS ONE 6 (8): e24148. doi: 10.1371 /journal.pone.0024148

Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 7 Μαρτίου 2011? Αποδεκτές: 5 Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 30, Αυγούστου του 2011

Copyright: © 2011 Nowsheen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το κράτος της Αλαμπάμα Επενδύσεων πισίνα δράσης (IMPACT) Βραβείο από το Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ της Ιατρικής Σχολής, του Κέντρου για την Κλινική και Μεταγραφική Science (CCTS) και το Συμβούλιο του Κέντρου Συμβουλίου (COCD) Μεταγραφική έρευνα Τειχών Pilot Grant πρόγραμμα (αριθμός επιχορήγηση 5UL1 RR025777-04) από το Εθνικό Κέντρο NIH Έρευνας Πόρων και αναπτυξιακή στήριξη από την Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου και του Τμήματος Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας στο Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ της Ιατρικής Σχολής (έως ΕΣΥ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση από τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, και η απόκριση βλάβης του DNA [1] – [5]. Ειδικότερα, η υπερέκφραση και ενίσχυση του EGFR είναι παρούσα στο 80-100% των πλακωδών κυττάρων καρκινωμάτων της κεφαλής και του τραχήλου και προμηνύει κακή πρόγνωση, κατώτερα επιβίωση, ραδιοαντοχή, και αποτυχίες θεραπείας [3], [6]. Έτσι, EGFR έχει γίνει σε μεγάλο βαθμό στόχο ως καρκίνος θεραπευτική στρατηγική, και αυτό έχει βελτιώσει τα ποσοστά ανταπόκρισης, τοποπεριοχική ελέγχου, και τη συνολική επιβίωση, σε συνδυασμό με ακτινοβολία στο κεφάλι και το λαιμό ασθενών με καρκίνο [2], [7]. Ωστόσο, σχεδόν οι μισοί από τους ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και λαιμού που έλαβαν θεραπεία με τη στρατηγική αυτή θα εξακολουθεί να υποκύψει σε αυτή την ασθένεια. Έτσι, οι νέες στρατηγικές που απαιτούνται για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων.

Οι παράγοντες που στοχεύουν καρκίνους που έχουν έλλειψη ομόλογο ανασυνδυασμό (HR) μεσολάβηση DNA διάλειμμα διπλή έλικα (ΟΕΔ) επισκευής, όπως πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP ) αναστολείς (PARPi), έχουν κερδίσει πρόσφατη προσοχή λόγω της εξαιρετικά επιλεκτική θανάτωση τους BRCA-συνδέονται, επιδιόρθωσης DNA ελαττωματικού όγκους ενώ διατηρείται ελάχιστη τοξικότητα σε κανονικούς ιστούς [8] – [10]. Επιπλέον, PARPi έχει αναφερθεί ότι ενισχύει την κυτταροτοξικότητα σε σποραδικά καρκινώματα όταν συνδυάζεται με άλλες παράγοντες βλάβης του DNA, όπως με πλατίνα και κυκλοφωσφαμίδη στον καρκίνο του μαστού και με τεμοζολομίδη σε γλοιοβλάστωμα [11]. Έτσι, πολλή προσπάθεια έχει αναληφθεί για την επέκταση της χρησιμότητας των PARPi πέρα ​​από τη σφαίρα των όγκων BRCA-που σχετίζονται με το συνδυασμό με παράγοντες που μεταβάλλουν τα μονοπάτια βλάβης /επιδιόρθωσης του DNA.

Εμείς και άλλοι έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η στόχευση του EGFR μονοπάτι επάγει μια ανεπάρκεια επιδιόρθωσης DSB [4], [12] – [15]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, υποθέσαμε ότι cetuximab (C225), ένας ισχυρός αναστολέας του EGFR, θα μπορούσε να αυξήσει την ευαισθησία του όγκου σε PARPi. Σε αυτή τη μελέτη, και σε συμφωνία με την υπόθεσή μας, έχουμε αποδείξει ότι C225 αυξάνει κυτταροτοξικότητα με την PARPi ABT-888 στο UM-SCC1, UM-SCC6, και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα FaDu με την ενίσχυση της ενδογενούς αποπτωτικό μονοπάτι. Περαιτέρω ανατομή του μηχανισμού του κυτταρικού θανάτου που επάγεται αποκαλύπτει ότι C225 μειώνει μη ομόλογες άκρο σύνδεσης (NHEJ) – και HR-διαμεσολαβούμενη επιδιόρθωσης DNA DSB, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την επιμονή της βλάβης του DNA παρακάτω PARPi. Με τη δημιουργία μια ανεπάρκεια επιδιόρθωσης DSB, C225 μπορεί να καταστήσει το κεφάλι και το λαιμό του όγκου κύτταρα ευαίσθητα στην αναστολή PARP. Έτσι, ο συνδυασμός της C225 και το PARPi ABT-888 μπορεί να είναι μια καινοτόμος θεραπευτική στρατηγική σε δυνητικά βελτίωση των αποτελεσμάτων σε ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Επιπλέον, η στρατηγική αυτή μπορεί επίσης να είναι εφικτή σε άλλους όγκους EGFR-απορυθμίζεται, όπως ο εγκέφαλος και των πνευμόνων.

Αποτελέσματα

Το cetuximab ενισχύει την κυτταροτοξικότητα με PARPi

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι C225, το αντι-EGFR μονοκλωνικό αντίσωμα, αναστέλλει αποτελεσματικά δραστικότητα υποδοχέα αναστέλλοντας τη θέση δέσμευσης συνδέτη [16]. Η επίδραση της C225 στη βιωσιμότητα των κυττάρων και ανάπτυξη έχει επίσης μελετηθεί καλά [17]. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο EGFR μπορεί να προσδώσει αυξημένη αντίσταση σε βλάβη του DNA με την ενίσχυση της κυτταρικής ικανότητας επισκευής DSB. Αντιστρόφως, η αναστολή του EGFR μπορεί να εμποδίσει την αποκατάσταση DSB. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, υποθέσαμε ότι C225 μπορεί να ενισχύσει την κυτταροτοξικότητα με τη PARPi ΑΒΤ-888 σε UM-SCC1, UM-SCC6 και κύτταρα FaDu, οι οποίες είναι καλά χαρακτηρισμένες, EGFR που υπερεκφράζουν, εκπρόσωπος καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της κεφαλής και του τραχήλου [17 ] – [20]

Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, καρκίνο κεφαλής και λαιμού βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από C225 και ΑΒΤ-888 ερευνήθηκε με τη χρήση της δοκιμασίας ΑΤΡϋίβ.. Οι δόσεις των C225 και ΑΒΤ-888 επιλέγεται έχουν προηγουμένως αναφερθεί ότι είναι εντός φυσιολογικών εύρος [2], [7], [9], [21]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, διαφορική ευαισθησία σε C225 και ΑΒΤ-888 παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν (μείωση 50 έως 75% σε κυτταρική βιωσιμότητα με τη συνδυαστική θεραπεία), γεγονός που υποδηλώνει ότι C225 αυξάνει πράγματι τον κυτταρικό θάνατο με ΑΒΤ-888. Παραδόξως, τα κύτταρα UM-SCC1 ήταν επίσης επιρρεπή σε PARPi μόνο (μείωση περίπου 75% της βιωσιμότητας των κυττάρων με 10 μΜ ΑΒΤ-888).

(Α) Συνδυασμός C225 και ΑΒΤ-888 μειώνει την βιωσιμότητα του UM-SCC1 , UM-SCC6, και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα FaDu. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο ή 2.5 μg /mL C225 για 16 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε όχημα ή 10 μΜ ΑΒΤ-888. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά ΑΒΤ-888, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με το σύστημα ΑΤΡϋίβ (Perkin Elmer). Ορατή είναι τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα της κυτταρικής βιωσιμότητας μετά από διάφορες θεραπείες, όπως μετράται με σχετικά επίπεδα ΑΤΡ (μέση τιμή +/- SEM, * ρ & lt? 0,01, ** ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος). (Β-D) Συνδυασμός C225 και ΑΒΤ-888 μειώνει την ικανότητα σχηματισμού αποικίας του (Β) UM-SCC1, (Γ) UM-SCC6 και κύτταρα (D) της κεφαλής FaDu και του τραχήλου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο ή 2.5 μg /mL C225 για 16 ώρες. Μετά την περίοδο θεραπείας, τα κύτταρα σπάρθηκαν για προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας και υποβάλλονται σε διάφορες δόσεις ΑΒΤ-888. Εμφανίζεται είναι το κλάσμα μέση επιβίωση (+/- SEM) από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μετά τη θεραπεία (** p & lt? 0.001).

Η

Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα ευρήματα, μπορούμε επίσης να πραγματοποιηθεί σχηματισμού αποικιών δοκιμασίες υπό την παρουσία C225 σε συνδυασμό με διάφορες δόσεις (1-20 μΜ) του ΑΒΤ-888. Σε συμφωνία με τα δεδομένα βιωσιμότητας κυττάρων, η προσθήκη του C225 να ΑΒΤ-888 μείωσε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού UM-SCC1, UM-SCC6, και τα κύτταρα FaDu με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 1Β-D) αποικίας. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα UM-SCC1 ήταν και πάλι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην ABT-888 μόνο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή του EGFR με C225 μπορεί να καταστήσει τα κύτταρα πιο ευαίσθητα στην PARPi ABT-888.

Ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα με cetuximab και ΑΒΤ-888 περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της ενδογενούς οδού της απόπτωσης

Για να διαλεύκανση του μηχανισμού με τον οποίο C225 και ΑΒΤ-888 επάγουν κυτταρική κυτταροτοξικότητα, εξετάσαμε πρώτη ενεργοποίηση της κυτταρικής απόπτωσης, αφού PARPi κυτταροτοξικότητα έχει δειχθεί ότι περιλαμβάνει το αποπτωτικό μονοπάτι [8]. Εκτιμήσαμε την κυτταρική θετικότητα αννεξίνη V, μια πρώιμη ένδειξη της επαγωγής απόπτωσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και 2Β, η ενεργοποίηση της απόπτωσης ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα δύο κύτταρα UM-SCC6 και FaDu με C225 και ΑΒΤ-888 σε σύγκριση με τον κάθε παράγοντα ξεχωριστά. Η ενεργοποίηση των αποπτωτικών οδών οδηγεί τελικά σε διάσπαση της κασπάσης 3, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί τον καταρράκτη του πρωτεόλυση αναπόσπαστο κυτταρικών πρωτεϊνών και οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Για να επιβεβαιωθεί ότι C225 και ΑΒΤ-888 επάγουν απόπτωση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα, αξιολογήσαμε τα επίπεδα της ολικής και διασπασμένη κασπάση 3. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, αυξημένη διασπασμένη κασπάση 3 με ταυτόχρονη μείωση του συνολικού αριθμού ή μη διασπασμένης κασπάσης 3 παρατηρείται σε κύτταρα FaDu εξής 2.5 μg /mL C225 και 10 μΜ ΑΒΤ-888. Σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις, C225 μόνος επαγόμενη απόπτωση στα επεξεργασμένα κύτταρα [17], [22]. Μία παρόμοια αύξηση της κασπάσης 3 διάσπαση παρατηρήθηκε μετά C225 και ΑΒΤ-888 σε UM-SCC6 (Σχ. 2D).

(Α-Β)% των αποπτωτικών κυττάρων ακόλουθο συνδυασμό cetuximab (C225) και ΑΒΤ-888 θεραπεία στο (Α) FaDu και (Β) UM-SCC6 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο ή 5 μg /mL C225 για 16 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 10 μΜ ΑΒΤ-888 για 24 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν και επεξεργασία για αννεξίνης V ως δείκτη για την απόπτωση. Ορατή είναι η% αννεξίνης V θετικών κυττάρων (μέση τιμή +/- SEM, * ρ & lt? 0,01, ** ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος). Αξίζει να σημειωθεί, συνδυασμός C225 + PARPi ήταν στατιστικά διαφορετικό από είτε μόνο του παράγοντα (* ρ & lt? 0,01) (C-D) C225 και ΑΒΤ-888 αυξημένη απόπτωση σε (C) FaDu και (D) UM-SCC6 κύτταρα όπως αποδεικνύεται από διάσπαση της κασπάσης 3. (Ε-Ρ) C225 και ΑΒΤ-888 ενεργοποιήσει την ενδογενή οδό αποπτωτικό σε (Ε) FaDu και UM-SCC6 κύτταρα (F), όπως αποδεικνύεται από διάσπαση της κασπάσης 9. τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε είτε όχημα ή 2,5 μg /mL C225 για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ΑΒΤ-888. 6 και 24 ώρες μετά την περίοδο θεραπείας, κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και τα επίπεδα της ολικής και διασπασμένη κασπάση 3 (24 ώρες) και 9 (6 ώρες) ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Παρατηρήθηκε επίσης μια δραματική ταυτόχρονη μείωση του συνολικού κασπάσης. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Παρίσταται ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα Western τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Υπάρχουν δύο κύρια κυτταρικά αποπτωτικές διεργασίες, που αποτελείται από τους ενδογενών και εξωγενών οδών [23]. Η εξωγενής οδός ενεργοποιείται από προ-αποπτωτικών συνδέτη διαμεσολαβούμενη διέγερση των κυτταρικών υποδοχέων θανάτου και, με τη σειρά του, η διάσπαση της κασπάσης 8. Σε αντίθεση, η ενδογενής οδός ενεργοποιείται από τα σήματα στρες από το εσωτερικό του κυττάρου, η οποία τελικά οδηγεί σε διάσπαση της κασπάσης 9.

Υποθέσαμε ότι PARPi επαγόμενη απόπτωση οφείλεται σε ενδοκυτταρικά σήματα στρες από βλάβη του DNA που οδηγούν στην ενεργοποίηση της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι. Συνεπής με αυτή την υπόθεση, C225 και ΑΒΤ-888 προκάλεσε διάσπαση της κασπάσης 9 σε FaDu (Σχ. 2Ε) και UM-SCC6 (Σχ. 2F). Αυτά ενεργοποίηση υποστήριξης δεδομένων της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι μετά από C225 και θεραπεία ΑΒΤ-888.

Το cetuximab αναστέλλει ομόλογο ανασυνδυασμό και μη-ομόλογο τέλος-που ενώνει την επισκευή

Το παραπάνω δεδομένα υποστηρίζει ότι C225 ενισχύει την κυτταροτοξικότητα με ΑΒΤ-888 και ενεργοποιεί την ενδογενή οδό της απόπτωσης. Επειδή θνησιμότητα με PARPi έχει αναφερθεί ότι εξαρτάται από ελαττωματικά οδούς επιδιόρθωσης DSB [8], [10], και επειδή EGFR έχει προηγουμένως δειχθεί ότι μεταβάλλει τις οδούς βλάβη /απόκριση DNA, έχουμε την επόμενη υπόθεση ότι η ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα με C225 και ΑΒΤ -888 οφειλόταν σε C225 αλλοίωση της επισκευής DSB [13].

υπάρχουν 2 μεγάλα μονοπάτια επιδιόρθωσης DSB, HR-και ΝΗΕΙ μεσολάβηση επισκευής [24]. HR είναι μια υψηλή πιστότητα μηχανισμός της επισκευής και είναι η προτιμώμενη οδός όταν ένα ομόλογο είναι παρόν σε G2 και S φάση. Οι πολλαπλές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των BRCA1, BRCA2 και Rad51, που εμπλέκονται σε αυτήν την περίπλοκη διαδικασία. Σε αντίθεση, NHEJ θεωρείται επιρρεπές σύστημα σφάλμα, επειδή έχει να είναι δομικά διαφορετικές για να φιλοξενήσει πολλά διαφορετικά υποστρώματα. Εμφανίζεται κατά προτίμηση όταν ένα ομόλογο είναι απούσα, εκτός από G2 και S φάση. NHEJ εξαρτάται από το DNA εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (ϋΝΑ-ΡΚ) καταλυτική υπομονάδα, ο Κυ70 /80 ετεροδιμερές, και το σύμπλοκο IV XRCC4-λιγάσης.

Για να ελεγχθεί αν ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα από C225 και C225 PARPi εμπλέκει διαμεσολαβούμενη αναστολή της επιδιόρθωσης DSB, αξιολογήσαμε την επίδραση της C225 επί HR-και NHEJ μεσολάβηση επισκευή DSB που προκαλείται μετά από γ-ακτινοβολία (IR), ένα ισχυρός ενεργοποιητής της επιδιόρθωσης του DNA DSB. Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις του C225 στο HR-μεσολάβηση επισκευής, αναλύσαμε την κινητική της IR που προκαλείται Rad51 εστίες, καθιερωμένη δείκτες της επισκευής ΥΕ, σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά από 4 Gy IR. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, IR αύξησε το ποσοστό των κυττάρων με Rad51 εστίες, και κορυφώθηκε σε 4-8 ώρες μετά IR. Σύμφωνα με την υπόθεσή μας, C225 εξασθενημένο HR κατά περισσότερο από 50% σε ακτινοβολημένα UM-SCC1 (Εικ. 3Α), UM-SCC6 (Σχ. 3Β), και FaDu κύτταρα (Εικ. 3C) καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι C225 επάγει έλλειμμα ΥΕ και την κυτταρική ευπάθεια σε PARPi εξής C225 ήταν σύμφωνο με την αναστολή PARP στόχευση κυττάρων τα οποία είναι ανεπαρκή σε HR-μεσολάβηση επισκευή.

C225 εξασθενεί IR επαγόμενη Rad51 εστίες, καλά χαρακτηρισμένη σημειωτές ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) μεσολάβηση επιδιόρθωσης του DNA DSB στο (Α) UM-SCC1, (Β) UM-SCC6 και κύτταρα (C) FaDu. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, 2.5 μg /mL C225, ή 5,0 μg /mL C225 για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε κοροϊδεύει ή 4 Gy ακτινοβολία (IR). Στους χρόνους που υποδεικνύονται παρακάτω IR, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού για Rad51 εστιών. Ορατή είναι τα δεδομένα αντιπροσωπευτικά των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων η% των κυττάρων (μέση τιμή +/- SEM) με & gt? 10 εστίες (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με όχημα σε κάθε αντίστοιχο χρονικό σημείο). Το ένθετο στο (Α) είναι μια αντιπροσωπευτική εικόνα των κυττάρων UM-SCC1 εμφανίζουν Rad51 εστίες μετά από IR.

Η

PARP ανέστειλε κύτταρα έχουν επίσης αναφερθεί ότι είναι ευαίσθητα σε αναστολείς της ΟΝΑ-ΡΚ, ένα κρίσιμο παίκτης σε NHEJ [25]. Αυτό υποδηλώνει ότι ΝΗΕΙ μπορεί να είναι μια εναλλακτική οδό επιδιόρθωσης DSB εκτός HR για να προσδίδουν ανθεκτικότητα σε PARPi. Επιπλέον, EGFR έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά και μετατοπίζουν με DNA-ΡΚ στον πυρήνα για την ενεργοποίηση των διεργασιών επιδιόρθωσης NHEJ [13], [26], [27]. Είναι έτσι πιθανό ότι C225-μεσολαβητική κυτταρική ευαισθησία στην PARPi οφείλεται επίσης C225 αλλοίωση του μονοπατιού NHEJ.

Για να αναλύσει τις επιπτώσεις της C225 στο ΝΗΕΙ, αξιολογήσαμε την κινητική της φωσφοφρεονίνη 2609 (Thr2609) DNA-ΡΚ εστίες, καθιερωμένη δείκτες για IR επαγόμενη NHEJ μεσολάβηση επισκευή [28], [29], σε διάφορα χρονικά σημεία μετά 4 Gy IR. Όπως ήταν αναμενόμενο, IR αύξησε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων με φωσφο-Thr2609-DNA-PK-εστιών στα δύο 30 λεπτά και 1 ώρα μετά IR σε UM-SCC1 (Σχ. 4Α), UM-SCC6 (Εικ. 4Β), και FaDu (Εικ. 4C). Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη του C225 εξασθενημένων σημαντικά αυτή την απόκριση κατά περισσότερο από 30% σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν.

C225 εξασθενεί την ακτινοβολία (IR) επαγόμενη DNA-ΡΚ Thr2609 εστίες, καθιερωμένη δείκτες μη ομόλογου άκρου ενώνει (NHEJ) μεσολάβηση επιδιόρθωσης του DNA DSB στο (Α) UM-SCC1, (Β) UM-SCC6, και τα κύτταρα (C) το κεφάλι FaDu και του τραχήλου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, 2.5 μg /mL C225, ή 5,0 μg /mL C225 για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε κοροϊδεύει ή 4 Gy IR. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά μετά από IR, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού για ΟΝΑ-ΡΚ Thr2609 εστιών. Ορατή είναι τα δεδομένα αντιπροσωπευτικά των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων η% των κυττάρων (μέση τιμή +/- SEM) με & gt? 10 εστίες (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με κύτταρα που δεν εκτέθηκαν σε C225). (D) C225 μειώνει τα επίπεδα φωσφο-Thr2609 ΟΝΑ-ΡΚ σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα UM-SCC6. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή 2,5 μg /mL C225 για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε κοροϊδεύει ή 4 Gy IR. Μία ώρα μετά από IR, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση στυπώματος Western για τα επίπεδα φωσφο-Thr2609 DNA Pk. Ολικό DNA Pk αναλύθηκε επίσης και τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

EGFR έχει επίσης δειχθεί να φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν το DNA-ΡΚ [13], [26], [27]. Για να καθοριστεί εάν η αναστολή της NHEJ με C225 οφείλεται σε μειωμένη φωσφορυλίωση της ΟΝΑ-ΡΚ, εξετάσαμε έπειτα επίπεδα φωσφο-ΟΝΑ-ΡΚ εξής C225. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4D, C225 μειωμένη φωσφορυλίωση ϋΝΑ-ΡΚ χωρίς να μεταβάλλει το συνολικό DNA-ΡΚ σε UM-SCC1, UM-SCC6 και κύτταρα FaDu, η οποία είναι συνεπής με C225-διαμεσολαβούμενη αναστολή της NHEJ μεσολάβηση επισκευή.

Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι C225 προκαλεί μια ανεπάρκεια επιδιόρθωσης DSB από τις 2 μεγάλες οδούς επιδιόρθωσης DSB, ΝΗΕΙ και ΥΕ, καθώς και ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα από C225 με PARPi οφείλεται στην αναστολή των δύο μεγάλων οδών επιδιόρθωσης DSB.

αναστολή του EGFR αυξάνει DNA βλάβη

C225 προκαλεί ανεπάρκεια επιδιόρθωσης DSB στο κεφάλι και το λαιμό καρκινικά κύτταρα (Εικ. 3 και 4). Υποθέσαμε ότι C225-κατεργασμένων κυττάρων θα πρέπει να παρουσιάζει αυξημένη δείκτες του DNA DSBs. Για την εκτίμηση του DNA DSBs, εξετάσαμε την επίδραση της C225 επί γ-H2AX εστίες, οι οποίες είναι καλά τεκμηριωμένες δείκτες DNA DSBs [30], σε UM-SCC1, UM-SCC6, και κυτταρικές σειρές FaDu. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, όλες οι κυτταρικές γραμμές εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη βλάβη DNA μετά C225 όπως αποδεικνύεται από αυξημένο ποσοστό των κυττάρων με γ-H2AX εστίες με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτό επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot, η οποία αποκάλυψε αυξημένη γ-H2AX επίπεδα μετά από διάφορες δόσεις του C225 στο UM-SCC1, UM-SCC6, και τα κύτταρα FaDu (Σχ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή του EGFR με C225 αυξάνει βλάβες στο DNA DSB σε επεξεργασμένα κύτταρα, το οποίο είναι συνεπές με C225-επαγόμενη αναστολή της επιδιόρθωσης DSB.

(Α) C225 αυξάνει τον αριθμό των κυττάρων με DSBs όπως αποδεικνύεται από γ -H2AX εστίες, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη για ϋδΒδ. Ορατή είναι τα δεδομένα αντιπροσωπευτικά των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων η% των κυττάρων (μέση τιμή +/- SEM) με & gt? 10 εστίες (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος). (Β) C225 αυξάνει γ-Η2ΑΧ επίπεδα πρωτεΐνης σε επεξεργασμένα κύτταρα. UM-SCC1, UM-SCC6, και FaDu κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα, 2.5 μg /mL C225, ή 5,0 μg /mL C225 για 16 ώρες. Μετά την περίοδο θεραπείας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για (Α) χρώση ανοσοφθορισμού για γ-H2AX εστίες ή (Β) Ανάλυση στυπώματος western για τα επίπεδα γ-Η2ΑΧ. Παρουσιάζεται είναι ο εκπρόσωπος κηλίδας Western από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συνδυασμός cetuximab και ΑΒΤ-888 παράγει επίμονη βλάβη του DNA

PARPi αναστέλλει την οδό επιδιόρθωσης βάση εκτομή υπεύθυνη για την επίλυση του DNA ενιαίου διαλείμματα σκέλος (SSB,). SSB, που εξακολουθούν να υπάρχουν σε διαιρούμενα κύτταρα που τελικά μετατρέπονται σε DSBs και να επισκευαστεί από HR-μεσολάβηση επισκευής. Δεδομένου ότι C225 μειώνει την ικανότητα επιδιόρθωσης DSB και ότι C225 ενισχύει την κυτταροτοξικότητα με ABT-888, υποθέσαμε ότι ο συνδυασμός C225 και ΑΒΤ-888 θα οδηγήσει σε περαιτέρω επίμονη βλάβη του DNA DSB. Για την αξιολόγηση αυτή, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση χρονικής πορείας της γ-H2AX εστίες με όχημα, C225 και μόνο, ΑΒΤ-888 μόνο, ή συνδυασμός C225 και ΑΒΤ-888. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, C225 και μόνο όπως αναμενόταν επάγεται 2-3 φορές την% των κυττάρων με σημαντικές βλάβες του DNA UM-SCC1 (Σχ. 6Α), UM-SCC6 (Εικ. 6Β), και FaDu (Εικ. 6C) καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο συνδυασμός του C225 και ΑΒΤ-888 οδήγησε σε σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων με επίμονη βλάβη του DNA σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν (Εικ. 6). Επιπλέον, τα κύτταρα UM-SCC1 (Σχ. 6Α), που επέδειξε εξαιρετική ευαισθησία σε ΑΒΤ-888 μόνη της, είχε επίσης επίμονη βλάβη του DNA μόνο με ΑΒΤ-888. Αντίθετα, σε UM-SCC6 (Εικ. 6Β) και FaDu (Εικ. 6C) κύτταρα, ΑΒΤ-888 μόνος δεν οδηγούν σε σημαντική αύξηση των κυττάρων με προφανή βλάβη του DNA DSB. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η κυτταροτοξικότητα από C225 και PARPi μπορεί να οφείλεται στην ανικανότητα των κατεργασμένων κυττάρων για την επίλυση του DNA DSBs, το κρισιμότερο βλάβη στα κύτταρα.

(Α-Ο) βλάβης του DNA 2, 24 και 48 ώρες ακόλουθο όχημα, C225, PARPi, ή και τα δύο C225 + PARPi αξιολογήθηκε με γ-Η2ΑΧ εστίες στο (Α) UM-SCC1, (Β) UM-SCC6, και (C) κύτταρα FaDu. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή διάφορες δόσεις C225 για 16 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε όχημα ή διάφορες δόσεις ΑΒΤ-888. Στους χρόνους που υποδεικνύονται μετά την αναστολή PARP, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού για γ-Η2ΑΧ εστιών. Ορατή είναι τα δεδομένα αντιπροσωπευτικά των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων η% των κυττάρων (μέση τιμή +/- SEM) με & gt? 10 εστίες (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος σε κάθε αντίστοιχο χρονικό σημείο).

Επιπτώσεις του cetuximab και ΑΒΤ-888 για βλάβες στο DNA και επιδιόρθωση δεν οφείλεται σε αναδιανομή

μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA του κυτταρικού κύκλου, ιδίως HR, μπορεί να εξαρτάται από τον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον, EGFR εμπλέκεται στις οδούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού, και η αναστολή του EGFR έχει δειχθεί ότι επάγει την αναδιανομή του κυτταρικού κύκλου [4], [31], [32]. Είναι πιθανό ότι η αναστολή της HR με C225 μπορεί να είναι μια έμμεση επίδραση της αυξημένης κυτταρικής συσσώρευσης στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. έτσι Ερευνήσαμε την κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με όχημα ή C225 για να αποκλείσει ανεπιθύμητες κυτταρικού κύκλου ως δυνητικό παράγοντας σύγχυσης με την οποία C225 μεταβάλλει επιδιόρθωσης του DNA DSB. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7, υπάρχει μια απουσία οποιασδήποτε ανακατανομής του κυτταρικού κύκλου μετά από αγωγή στο UM-SCC1 (Εικ. 7Α) ή UM-SCC6 (Εικ. 7Β) να λογοδοτήσουν για C225 μεσολάβηση μείωση της επισκευής DSB στα χρονικά σημεία στα οποία επισκευής HR ήταν μετρήθηκαν.

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου του (Α) UM-SCC1 ή (Β) UM-SCC6 κυττάρων μετά από θεραπεία με όχημα ή C225. (Γ) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου των κυττάρων UM-SCC1 εξής οχήματος, C225, ΑΒΤ-888, ή συνδυασμός C225 και ΑΒΤ-888. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή διάφορες δόσεις C225 για 16 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε όχημα ή 5 μΜ ΑΒΤ-888. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την αναστολή PARP, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση κύκλου κυττάρου με κυτταρομετρία ροής. Ορατή είναι η αντιπροσωπευτική κατανομή κυτταρικού κύκλου (μέση τιμή +/- SEM) τουλάχιστον 2 ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

ΑΒΤ-888 έχει επίσης αναφερθεί ότι προκαλούν γήρανση όταν συνδυάζονται με ακτινοβολία στον καρκίνο του μαστού κύτταρα [33]. Επιπλέον, άλλες PARPi μπορεί να επάγει G2 /M συσσώρευση κυττάρων [34]. Έτσι, για να αξιολογηθούν οι αλλαγές του κυτταρικού κύκλου ως ένα άλλο πιθανός μηχανισμός ενισχυμένης κυτταροτοξικότητας, διανομή του κυτταρικού κύκλου ακόλουθο συνδυασμό C225 και ΑΒΤ-888 διεξήχθη σε κύτταρα UM-SCC1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, δεν παρατηρήθηκε καμία ανακατανομή του κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι C225 που προκαλείται εξασθένηση των μονοπατιών επιδιόρθωσης DSB και την επακόλουθη αυξημένη κυτταροτοξικότητα με ABT-888 δεν οφείλονταν στις επιπτώσεις του κυτταρικού κύκλου.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αποδείξει ότι C225 , ένας αναστολέας του EGFR, αυξάνει την κυτταρική ευαισθησία στην PARPi ΑΒΤ-888 σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Ο μηχανισμός της ενισχυμένης κυτταροτοξικότητας εμπλέκονται C225 μεσολάβηση εξασθένησης των δύο κύριες οδούς επιδιόρθωσης του DNA DSB, NHEJ και HR, η οποία οδηγεί στη διατήρηση της βλάβης του DNA παρακάτω PARPi και την επακόλουθη ενεργοποίηση της ενδογενούς οδού της απόπτωσης. Έτσι, ο συνδυασμός της C225 και το PARPi ABT-888 μπορεί να είναι μια καινοτόμος θεραπευτική στρατηγική σε δυνητικά βελτίωση των αποτελεσμάτων σε ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Αυτός ο συνδυασμός του C225 και ΑΒΤ-888 μπορεί να είναι ιδιαίτερα συναρπαστικό για αγωγές που περιλαμβάνουν άλλους παράγοντες βλάβης DNA όπως ακτινοβολία.

Ο EGFR έχει εμπλακεί σε έναν αριθμό κυτταρικών διαδικασιών, περιλαμβανομένων του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επιβίωση, αγγειογένεση, και την αντιμετώπιση της βλάβης του DNA και την επισκευή. Συγκεκριμένα, σε σχέση με την απόκριση βλάβης DNA, EGFR έχει δειχθεί ότι μετατοπίζονται στον πυρήνα και να αλληλεπιδρούν με το DNA-ΡΚ να ενεργοποιήσετε NHEJ [13], [26], [27]. Η ενεργοποιημένη EGFR μπορεί επίσης να αυξήσει τα επίπεδα έκφρασης εστίες και Rad51 να ρυθμίζουν HR [35]. Αυτές οι ενέργειες από EGFR έχουν αποδοθεί στην αντίσταση του EGFR ενισχύεται /μεταλλαγμένο όγκους σε παράγοντες βλάβης του DNA και να παρέχουν αιτιολόγηση για στοχευμένη αναστολή του EGFR.

Σε υποστήριξη ενός ρόλου του EGFR στα μονοπάτια βλάβες στο DNA και επισκευής, C225 , η οποία αναστέλλει EGFR, εξασθενεί τα δύο κύρια μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA DSB, HR και NHEJ, μεταβάλλοντας Rad51 και DNA-ΡΚ εστίες επίπεδα, αντίστοιχα. C225 ανέστειλε επίσης την φωσφορυλίωση ϋΝΑ-ΡΚ. Όπως PARPi έχει δειχθεί να στοχεύσει HR-ελλειμματικά κύτταρα, οι δράσεις του C225 επί HR μεσολάβηση επισκευή παρέχουν λογική για τους οποίους η νέος συνδυασμός του C225 και PARPi ενισχύει την κυτταροτοξικότητα σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα [8], [9]. Επιπροσθέτως, έχουν ανέστειλαν κύτταρα PARP έχουν δειχθεί να είναι ευαισθητοποιημένα σε αναστολείς της οδού NHEJ, γεγονός που υποδηλώνει ότι NHEJ μπορεί επίσης να είναι ένα εφεδρικό μονοπάτι του άλυτα SSB, [25]. Αυτό μπορεί επίσης να εξηγήσει την δραματική κυτταροτοξικότητα που παρατηρείται σε C225 και PARPi επεξεργασμένα κύτταρα. Επιπλέον, όπως C225 επάγει τόσο μια ανεπάρκεια NHEJ και επισκευή ΥΕ, ο συνδυασμός του C225 με PARPi οδηγεί σε ένα υψηλό ποσοστό των κατεργασμένων κυττάρων με επίμονη DSBs. Λαμβάνοντας υπόψη αυτές τις παρατηρήσεις, τα κύτταρα εκτίθενται σε C225 και PARPi θα πρέπει να είναι εξαιρετικά ευαίσθητα σε άλλα παράγοντες βλάβης του DNA, όπως η ακτινοβολία. Αυτός είναι ένας τομέας της ενεργού έρευνας στο εργαστήριο μας.

C225 και PARPi επίσης αυξημένη απόπτωση, η οποία είναι συνεπής με τις προηγούμενες εκθέσεις του PARPi-μεσολάβηση κυτταροτοξικότητας [8]. Βρήκαμε ότι αυτή η απόπτωση ήταν ένα αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του ενδογενούς οδού. Αξίζει να σημειωθεί ότι το μέγεθος της ρύθμισης της απόπτωσης δεν φθάσουν τα επίπεδα κυτταροτοξικότητας μετρήθηκε με προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας. Πολλαπλές οδούς, εκτός από την απόπτωση θα μπορούσαν να επηρεάσουν τις ικανότητες σχηματισμού αποικίας των κυττάρων, όπως αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, μιτωτική καταστροφή, και αυτοφαγία. Η διαφορά αυτή μπορεί επίσης να εξηγηθεί από την ιδέα ότι σε αντίθεση με την ανάλυση των εστιών ή ανοσοστύπωση, η οποία αποδεικνύει την επίδραση σε ένα στιγμιότυπο στο χρόνο, η δοκιμασία σχηματισμού αποικίας αντανακλά πολλαπλών μηχανισμών κυτταρικού θανάτου σε μια περίοδο 3 εβδομάδων. Δεδομένου ότι οι πολλαπλές οδούς σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ρύθμιση και τον προσδιορισμό της μοίρας του κυτταρικού θανάτου ή επιβίωσης, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η αναστολή του EGFR μπορεί να είναι ένα μέρος του δικτύου επισκευή βλάβης περίπλοκη κυτταρική σηματοδότηση /DNA, και μπορεί να συμβάλει μόνο εν μέρει στη συνολική του επιδεκτικότητα των κυττάρων στη βλάβη του DNA. Είναι, ως εκ τούτου, είναι πιθανό η PARPi και η αναστολή του EGFR θα μπορούσε να ρυθμίζουν πολλαπλές κυτταροτοξική οδούς. Για παράδειγμα, ΑΒΤ-888 σε συνδυασμό με ακτινοβολία έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα [36]. Έτσι, άλλοι μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένων των αυτοφαγία, δεν μπορεί να αποκλειστεί.

Δεδομένου ότι PARP είναι ένα ένζυμο το SSB επιδιόρθωση του DNA, η αγωγή με το PARPi ΑΒΤ-888 αναμένεται να αναστέλλουν αποκατάσταση SSB και έτσι να αυξήσουν τα βασικά επίπεδα της τα SSB. Η προσθήκη του C225 οδηγεί σε περαιτέρω βλάβη του DNA. Η αυξημένη βλάβη του DNA που παρατηρήθηκε σε μεγαλύτερα χρονικά σημεία μπορεί να οφείλεται σε επίμονη DSBs ή το αποτέλεσμα των πρόσθετων DNA περικοπές ως συνέπεια της μετατροπής Οι SSB να DSBs διάρκεια απόπειρα επιδιόρθωσης του DNA ή κατέρρευσαν πιρούνια αντιγραφής. Αυτό υποστηρίζεται από την αυξημένη% των κυττάρων με γ-H2AX εστίες σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία. Εναλλακτικά, η ενεργοποίηση των διαδικασιών κυτταρικού θανάτου, όπως απόπτωση θα μπορούσε επίσης να προκαλέσει δείκτες της βλάβης του DNA.

Είναι ενδιαφέρον, οι καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα UM-SCC1 επιδεικνύουν ευαισθησία σε PARPi μόνο. Αυτά τα κύτταρα δεν είναι εγγενώς DSB επισκευή ανεπάρκεια, όπως αξιολογείται με IR-επαγόμενη Rad51 και DNA-ΡΚ εστιών. Ωστόσο, PARPi μόνη της προκαλεί επίμονη εστίες γ-H2AX, που υποδηλώνουν την παρουσία της επίμονης ϋδΒδ. Είναι ενδιαφέρον να υποθέσουμε ότι οι άλλες μοριακές καθοριστικούς παράγοντες της PARPi ευαισθησία ανεξάρτητα από εγγενή ελαττώματα επιδιόρθωσης του DNA πρέπει να υπάρχει. Μία από τις πολλές δυνατότητες που είναι η πρόσφατα αναφέρθηκε αύξηση της πληρότητας από καταπιεστικά συγκροτήματα E2F4 /ρ130 των BRCA1 και RAD51 υποστηρικτές παρουσία PARPi, αυξάνοντας έτσι την κυτταρική ευαισθησία στην οξειδωτική βλάβη από την καταστολή των οδών επισκευής αντιγράφων ασφαλείας DSB [37].

Κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια, η σχέση μεταξύ του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου έχει στερεοποιηθεί [38], [39]. Είναι ενδιαφέρον, συνδέεται HPV κεφάλι και το λαιμό καρκίνοι εμφανίζουν καλύτερη πρόγνωση και φαίνεται να ανταποκρίνονται καλύτερα στις chemoradiation [40]. Λαμβάνεται ως δεδομένο ότι αυτό οφείλεται στον HPV ογκοπρωτεΐνες και τις μεταβολές της βλάβης του DNA /μονοπάτια απόκριση [41], [42]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση Ε7 έχει δειχθεί να διαταράξει E2F4 και ρ130 κατασταλτική δραστηριότητα και εμπόδισε PARPi μεσολάβηση μειορύθμιση του BRCA1 και Rad51 [37]. Ωστόσο, η αλληλεπίδραση μεταξύ όλων των HPV-ογκογονίδια και την ανταπόκριση βλάβη του DNA μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικό βαθμό ευπάθειας σε βλάβη του DNA. Έτσι, θα ήταν ενδιαφέρον να αξιολογηθεί η ευαισθησία του HPV που σχετίζονται με όγκους στο PARPi.

Η μελέτη μας δείχνει ότι η αναστολή του EGFR με C225 ενισχύει την κυτταροτοξικότητα με τη PARPi ΑΒΤ-888 σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα μέσω C225- μεσολαβεί διακοπή του HR-και ΝΗΕΙ μεσολάβηση μονοπάτια επιδιόρθωσης DSB. Τα αποτελέσματα αυτά δικαιολογούν μελλοντικές μελέτες να συγκρίνουν την αποτελεσματικότητα έναντι των παραδοσιακών χημειοθεραπεία. Το πιο σημαντικό, καθώς η διατήρηση της ποιότητας ζωής έχει γίνει ένας χώρος έμφαση στην ογκολογία, η χρήση στοχευμένων παραγόντων όπως C225 και ΑΒΤ-888 μπορεί περαιτέρω να βελτιώσει τη θεραπευτική αναλογία. Τέλος, αυτή η στρατηγική μπορεί επίσης να είναι εφικτή σε άλλους όγκους με παρεκκλίνουσα σηματοδότηση EGFR, όπως οι καρκίνοι του εγκεφάλου και του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο κεφάλι και λαιμού πλακωδών κυττάρων καρκινώματος γραμμές UM-SCC1 και UM-SCC6 ελήφθησαν ευγενική προσφορά του Δρ Thomas E Carey (Πανεπιστήμιο του Michigan, Ann Arbor, MI). Αυτά διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (GIBCO, Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Atlanta Biologicals) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Το ανθρώπινο κεφάλι και το λαιμό πλακώδους καρκινώματος γραμμή FaDu (ΗΤΒ-43) λήφθηκε από την ATCC (Manassas, VA) και διατηρήθηκε σε RPMI-1640 (GIBCO, Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% FBS. Ο αναστολέας PARP ABT-888 (Enzo Life Sciences) και cetuximab (C225, Bristol Myers Squibb) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας.

τηλέφωνα Βιωσιμότητας

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση της ΑΤΡ-lite 1 δοκιμασία βήμα φωταύγειας (Perkin Elmer) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.