Αφηρημένο

βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα (MAC) αντιπροσωπεύει μια ξεχωριστή ιστοπαθολογική οντότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC), η οποία συνδέεται με τη νόσο την εξέλιξη και την κακή πρόγνωση. Εδώ, βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-205 και miR-373 ήταν ειδικά ρυθμισμένη προς τα πάνω μόνο σε ασθενείς με βλεννώδες καρκίνους του παχέος εντέρου, αλλά όχι σε CRC που στερούνται βλεννώδες συστατικά. Να διερευνήσει τις επιπτώσεις του miR-205 και miR-373 στην εντερική επιθηλιακών κυττάρων (IEC) βιολογία από gain- και πειράματα απώλειας λειτουργίας σε μια προσέγγιση απόδειξη της έννοιας, που επιλέξαμε προηγουμένως συσταθεί

in-vitro

ανθρώπινα μοντέλα διαφοροποιημένων, μη επεμβατική Caco-2-based (εκφράζουν TLR4 άγριου τύπου? ονομάζεται Caco-2 [WT]) έναντι αδιαφοροποίητη, επεμβατική (εκφράζουν μεταλλαγμένες D299G TLR4? ονομάζεται Caco-2 [D299G]) IEC. Εντεροκύτταρο-όπως Caco-2 [WT] έδειξαν χαμηλά επίπεδα του miR-205 και miR-373 έκφρασης, ενώ και οι δύο miRNAs ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε ορθοκολικό καρκίνωμα που μοιάζει με Caco-2 [D299G], που μοιάζει έτσι το πρότυπο έκφρασης των miRNAs ζευγών κανονική έναντι δείγματα όγκων από ασθενείς MAC. Χρησιμοποιώντας σταθερή επιμόλυνση, δημιουργήσαμε miR-205- ή miR-373 που εκφράζουν και miR-205- ή miR-373-αναστέλλοντας υποκλώνους αυτών των γραμμών IEC. Βρήκαμε ότι η εισαγωγή του miR-205 σε Caco-2 [WT] οδήγησε σε επέκταση του κυττάρου-σαν λαγηνοειδή κύτταρα που εκκρίνουν βλέννα, η οποία σχετίζεται με την επαγωγή της KLF4, MUC2 και έκφραση TGFβ1. Η ενεργοποίηση του miR-205 σε Caco-2 [WT] που προκαλείται χημειοαντίσταση, ενώ η αναστολή των miR-205 σε Caco-2 [D299G] προωθείται χημειοευαισθησίας. Caco-2 [WT] υπερεκφράζουν miR-373 έδειξε μιτωτική ανωμαλίες και υποβλήθηκε σε μορφολογικές αλλαγές (απώλεια των επιθηλιακών πολικότητας, κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση, και συνδετική διατάραξη) που συνδέονται με επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης και εξέλιξης σε καρκίνωμα του κόλου που σχετίζεται με φλεγμονή, η οποία συσχετίζεται με την επαγωγή του φωσφορυλιωμένη STAT3 και έκφραση Ν-cadherin. Λειτουργικά, εισαγωγή του miR-373 σε Caco-2 [WT] μεσολάβηση απώλεια προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και αυξημένο πολλαπλασιασμό και εισβολή. Αντίστροφα, η αναστολή του miR-373 επιτρέπεται μεσεγχυματικών IEC να επανακτήσει επιθηλιακά ιδιότητες, οι οποίες συσχετίζονται με την απουσία των νεοπλασματικών εξέλιξης. Χρησιμοποιώντας ξενομοσχευμάτων σε ποντίκια απέδειξαν miR-373-μεσολάβηση επιτάχυνση της ανάπτυξης κακοήθων εντερικών όγκων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι το miR-205 και miR-373 μπορούν να συμβάλλουν διαφορικά στην επιθετική φαινότυπο της MAC στο CRC

Παράθεση:. Eyking Α, Reis Η, Frank M, Gerken G, Schmid KW , Cario Ε (2016) MiR-205 και MiR-373 συνδέονται με την επιθετική του Ανθρώπου βλεννώδες του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 11 (6): e0156871. doi: 10.1371 /journal.pone.0156871

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα Mitchell Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 12 του Απρίλη του 2016? Αποδεκτές: 20η Μαΐου του 2016? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουν 2016

Copyright: © 2016 Eyking et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant CA226 /4-3 στο ΕΚ) και εντός των τειχών της χρηματοδότησης (Interne Forschungsförderung Έσσεν στην ΕΚ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές καρκίνους και μία από τις κύριες αιτίες του καρκίνου σχετίζονται με το θάνατο παγκοσμίως [1]. Εντός της ετερογενούς φάσμα CRC, βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα (MAC) αντιπροσωπεύει μια ξεχωριστή ιστολογική υποτύπου η οποία χαρακτηρίζεται από άφθονη παραγωγή εξωκυτταρικών βλεννίνης (& gt? 50% του όγκου του όγκου) [2]. Τυπικά, του παχέος λαγηνοειδών κυττάρων που προέρχονται από βλεννίνη MUC2 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε MAC [3]. Υπερέκκριση βλέννας έχει συνδεθεί με αλλοιώσεις στο έντερο μικροχλωρίδα και επαγωγή φλεγμονωδών αποκρίσεων που μπορούν να προωθήσουν την ανάπτυξη του όγκου [4]. Ενώ τα ποσοστά επιπολασμού ποικίλουν από 4% έως 11% όλων των περιπτώσεων CRC, ανάλογα με τη γεωγραφική θέση [5], MAC είναι πολύ πιο συχνά διαγιγνώσκεται σε ασθενείς με CRC στην ελκώδη κολίτιδα (UC) [6]. Πιστεύεται ότι η χρόνια φλεγμονή σε UC μπορεί να διευκολύνει παρεκκλίνουσα διαφοροποίηση βλεννίνης σε CRC παθογένεση [7], αλλά τα μονοπάτια σηματοδότησης δεν είναι ακόμη κατανοητός.

Κλινικά, MAC έχει συσχετιστεί με πιο προχωρημένα στάδια του όγκου κατά τη διάγνωση, την κακή θεραπευτικές αποκρίσεις και μειωμένη επιβίωση σε πολλές σειρές [8-11]. Παρά τις πρόσφατες προόδους στην εξατομικευμένη στρατηγικές θεραπείας και διαχείριση των ασθενών με MAC, πρόγνωση του μεταστατικού ρύθμιση φαίνεται να είναι ακόμη χειρότερη από εκείνη των ασθενών με άλλους υπότυπους του CRC [12]. Καλλιέργεια στοιχεία δείχνουν ότι MAC μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα γενετικά και φαινοτυπικά διαφορετική οντότητα νόσου από άλλους τύπους κολονικού αδενοκαρκινώματος (AC) [13-15], αλλά οι ειδικοί μοριακοί μηχανισμοί που δύναται να οδηγεί την εξέλιξη του όγκου και των μεταστατικών μετασχηματισμός σε βλεννώδες καρκινογένεση είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μια εξαιρετικά διατηρημένη κατηγορία των 19-25 νουκλεοτιδίων μήκους μονόκλωνο μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της παθογένειας του καρκίνου [16]. Αλλοίωση των διαφορετικών προφίλ miRNA έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με την πρόοδο του καρκίνου του παχέος εντέρου με ρύθμιση έκφρασης γονιδίου μεταφραστικά ή /και μεταγραφικά σε πολύπλοκα δίκτυα σηματοδότηση [17,18]. Ωστόσο, miRNA υπογραφές έκφραση μπορεί να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ CRC πληθυσμών [19], πιθανώς αντανακλώντας φαινοτυπική μεταβλητότητα λόγω των διαφορετικών κατανομών ιστολογικών υποτύπου σε ετερογενή ομάδες CRC [20]. Είναι μέχρι στιγμής ασαφές κατά πόσον οι μεμονωμένοι miRNAs μπορεί να προκαλέσει τη βιολογική συμπεριφορά της MAC. Πρόσφατα, ανεξάρτητες εκθέσεις έχουν μεταβλητά αναφερθεί miR-205 και miR-373 να συνδέεται με CRC [21-23], αλλά μεμονωμένες περιπτώσεις δεν είχαν ταξινομηθεί σε ιστολογική υποτύπους.

miR-205 αλληλεπιδρά με τα μέλη του miR -200 οικογένεια (miR-200Α /-200b) [24] και αντιπροσωπεύει μια επιθηλιακή-ειδική miRNA [25], που συμμετέχουν ουσιαστικά στην κανονική κυτταρικές λειτουργίες, όπως αναγέννηση και βλαστικών κυττάρων επέκταση [26]. miR-373 ανήκει στην οικογένεια miR-520 /-373, το οποίο αποτελείται από τρεις διαφορετικές ομάδες miRNA (miR-302 /-367, miR-371 /-372 /-373, και miR-520) [27]. miR-373, που προσδιορίζονται πρώτα ως ένα εμβρυϊκό βλαστικό κύτταρο-ειδικό miRNA [28], μπορεί να ρυθμίζει άμεσα την δραστηριότητα του μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης [29]. Τόσο miR-205 και miR-373 φαίνεται να ασκούν πλειοτροπικές επιδράσεις στην ογκογένεση, ανάλογα με το κύτταρο ή ιστό προέλευσης. Στοχεύουν πολλαπλών γονιδίων ή πρωτεϊνών, άμεσα ή έμμεσα [27,30] και έτσι μπορεί να δράσει είτε ως ογκογονίδια, διευκολύνοντας την έναρξη του όγκου ή ως καταστολείς των όγκων αναστέλλοντας την εισβολή. Σηματοδότηση μέσω του miR-205 και miR-373 μπορεί να ευνοήσει επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε ορισμένους φορείς του όγκου [24,31-33]. Ωστόσο, οι πιθανοί ρόλοι του miR-205 και miR-373 στο CRC παθογένεια παραμένει μέχρι στιγμής άγνωστη.

Εδώ, δείχνουμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-205 και miR-373 απορυθμίζεται συγκεκριμένα μόνο στο βλεννώδες CRC. Λειτουργικά, miR-205 κατευθύνει το εντερικών επιθηλιακών κυττάρων απόφαση μοίρα προς μια παράγουν βλεννίνη λαγηνοειδών κυττάρων που μοιάζουν γράμμωσης και miR-373 οδηγεί φλεγμονή που σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου με μείωση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και την αύξηση της εισβολής. Έτσι, παρέχουμε την πρώτη απόδειξη ότι διακριτές επιδράσεις σηματοδότησης των miR-205 και miR-373 μπορούν να συμβάλλουν διαφορικά στο μοναδικό φαινότυπο της MAC στο CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Μια λεπτομερής κατάλογος όλων των αντισωμάτων παρέχεται στο S1 πίνακα. Η μεθοτρεξάτη (ΜΤΧ) ελήφθη από την Pfizer και Matrigel

® από την Corning.

Ανθρώπινο παχύ έντερο δείγματα καρκίνου

Πραγματοποιήσαμε μια αναδρομική, ενιαίο κέντρο μελέτης κοόρτης μεταξύ των ασθενών με διάγνωση CRC , χρησιμοποιώντας υλικό φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) αρχειοθετούνται από Ιούλιος 2003 – Νοέμβριος 2013 στο Ινστιτούτο Παθολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Essen, Γερμανία. Η μελέτη αυτή συμμορφώθηκαν με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας ( «Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen»? # 13-5602-BO? Ανώνυμη ανάλυση της ιστορικής συλλογής). Ο Πίνακας 1 δείχνει τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των 51 ασθενών. συμπεριλήφθηκαν ζεύγη Μόνο συμφωνημένα παρακείμενες μη-νεοπλασματικές, φυσιολογικό ιστό (R

0) και μπλοκ του όγκου για κάθε περίπτωση. Όλα όγκου και αντιστοιχισμένο όγκο χωρίς ιστοί παθολογικά αναθεωρούνται, ταξινομούνται ως ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (AC) και υποδιαιρείται σε 1. συμβατικά (ορίζεται ως: & gt? 50% αδένα-σχηματισμό, καμία παραγωγή βλεννίνης), 2. βλεννώδες (& gt? 50% εξωκυτταρικό βλεννίνη), ή 3. η χρόνια UC που σχετίζεται (οποιαδήποτε ιστολογική παραλλαγή). Ο υπότυπος συχνότερα παρατηρείται σε UC που σχετίζεται CRC ήταν MAC (& gt? 50% εξωκυτταρικό βλεννίνη) ή AC με βλεννώδες συστατικό (& lt? 50% της βλάβης που αποτελείται από βλεννίνη) (

n

= 10), ενώ η υπόλοιπο ήταν σφραγίδα κυττάρων (

n

= 1) ή αδένα που σχηματίζουν AC (

n

= 2). Καμία από τις συμβατικές όγκων βαθμολογήθηκε ως πτωχά διαφοροποιημένη, σε σύγκριση με σχεδόν τα δύο τρίτα του βλεννώδους (60%?

ρ

& lt? 0,0001? Fisher exact test) ή περισσότερο από το ένα τρίτο του UC που σχετίζεται (38%?

σ

& lt? 0,01? Fisher exact test) όγκους. Όλα τα δείγματα (όγκου έναντι R

0) από ασθενείς με UC αποδεικνύεται ήπια έως μέτρια φλεγμονή.

Η

Οι κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο εντερικό επιθηλιακό κύτταρο (IEC) γραμμή Caco-2 αντιπροσωπεύει ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο για τη μελέτη μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση και τον καρκίνο βήματα προόδου [34]. Παραγωγή και φαινότυποι των ανθρώπινων γραμμών IEC προέρχονται από Caco-2 (που λαμβάνεται από ATCC # ΗΤΒ cat-37? Παρτίδα 1537739) σταθερά επιμολυσμένα με TLR4-WT ή κατασκευάσματα έκφρασης TLR4-D299G έχουν πρόσφατα περιγραφεί λεπτομερώς [35]. Caco-2-TLR4-WT έκθεμα τυπικό μορφολογικές και λειτουργικές ιδιότητες του φυσιολογικού, ώριμου εντεροκυττάρων, και ονομάστηκαν Caco-2

WT. Το πρότυπο ανάπτυξης της Caco-2

WT είναι μη επεμβατική και IEC αρχίσει να πολώσει προς συρροή, συγκρίσιμη με τη γονική Caco-2. Σε αντίθεση, Caco-2-TLR4-D299G υιοθετήσει μια επιθετική φαινότυπο του παχέος καρκινικών κυττάρων [35], και ονομάστηκαν Caco-2

D299G. Η επιτάχυνση της ανάπτυξης των Caco-2

D299G είναι ιδιαίτερα επεμβατική και IEC παραμένουν σε μια αδιαφοροποίητη κατάσταση, παρά τη συρροή. Οι περιγραφόμενες φαινότυποι είχαν προηγουμένως αναπαράγεται σε 3 κλώνους από Caco-2

WT και 3 κλώνοι του Caco-2

D299G [35].

Πρόσθετες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ασθενείς με ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα του ανθρώπου αγοράστηκαν από την ATCC: LS 174Τ (cat # CL-188? παρτίδα 3752718), ΗΤ-29 (cat # ΗΤΒ-38? παρτίδα 1467609), HCT-116 (cat # CCL-247? παρτίδα 60286831) και SW480 (cat # CCL- 228? [36]), το οποίο όλα τα μεταβλητά εκφράζουν MUC2 [37-39]. Caco-2, ΗΤ-29 και HCT 116 αναπτύχθηκαν σε υψηλής γλυκόζης (4,5 g /L) ϋΜΕΜ (Life), SW480 σε Leibovitz του L-15 (Life) και LS 174Τ σε ΕΜΕΜ (ATCC). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Life ή ΡΑΑ) και 10% FBS (Thermo? Παρτίδα RYF35911), εκτός Caco-2, η οποία έλαβε το 20% FBS. Όλες οι κυτταρικές σειρές συνήθως αρνητικές για μυκόπλασμα (MycoAlert

™? Lonza).

πλασμίδιο κατασκευάζει και σταθερή επιμόλυνση

Οι κλώνοι του eGFP-tagged miExpress

™ πρόδρομος miRNAs του miR -205 (cat # HmiR0026-MR04) και miR-373 (cat # HmiR0347-MR04) και τα αντίστοιχα πρόδρομα miRNA κωδικοποιημένο κλώνο ελέγχου (mIR-c) για το διάνυσμα pEZX-MR04 (cat # CmiR0001-MR04), καθώς και οι κλώνοι του mCherry σημασμένο με επισύναψη miArrest

™ αναστολείς miRNA του miR-205 (α-miR-205? cat # HmiR-AN1314-AM02), miR-373 (α-miR-373? cat # HmiR-AN0461-AM02) και τα αντίστοιχα miRNA αναστολέα κωδικοποιημένο κλώνο ελέγχου (α miR-c-) για το διάνυσμα pEZX-AM02 (cat # CmiR-AN0001-AM02) ελήφθησαν από GeneCopoeia (Rockville, USA). Πλασμίδια (EndoFree Maxi, Qiagen) των miRNAs διαμολύνθηκαν σταθερά σε εντερικά κύτταρα-όπως οι αναστολείς Caco-2

WT και miRNA σε καρκίνωμα που μοιάζει με Caco-2

D299G, αντίστοιχα. Η επιμόλυνση διεξήχθη σε επικαλυμμένη πλάκα 12 φρεατίων Poly-D-Lysine χρησιμοποιώντας 1 μg πλασμιδίου /φρεάτιο (Λιποφεκταμίνη LTX, Thermo Fisher). Σταθερό υποκλώνοι επελέγησαν με 1 μg /ml βλαστισιδίνη και 1-3μg /ml πουρομυκίνη (InvivoGen). 14-34 υποκλώνοι ανά πλασμίδιο επεκτάθηκαν και εξετάστηκαν για έκφραση eGFP /mCherry με μικροσκοπία φθορισμού. Μεταξύ των 2-7 υπόλοιπους υποψήφιους ανά πλασμίδιο, ατομική υποκλώνοι επελέγησαν με βάση τις βέλτιστες επίπεδα έκφρασης του ώριμου miR-205 και miR-373, χρησιμοποιώντας ανάλυση qPCR.

Πριν από τα πειράματα, τα κύτταρα (0,7 έως 3 x 10

5/2 ml) καλλιεργήθηκαν για 8 ημέρες, εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά. Προσαρμοσμένα μέσα από Caco-2

D299G συμπυκνώνεται χρησιμοποιώντας Amicon (3kDa) Φυγόκεντρες Μονάδες-4 Ultra φίλτρου (Millipore) και επωάζονται με Caco-2

WT για 18h.

CD-1

nu /nu

μοντέλο ξενομοσχεύματος

Γυναίκα CD-1

nu /nu

ποντίκια (Charles River) στεγάστηκαν κάτω από αυστηρές ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου στο Μηχανισμό Κεντρικής ζώων, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Essen, Γερμανία. Πρωτόκολλα συμμορφωθεί με τη γερμανική νομοθεσία για τη χρήση των ζώντων ζώων και τη μελέτη εγκρίθηκε από την Βόρεια Ρηνανία-Βεστφαλία Οργανισμού μέλος για τη Φύση, το Περιβάλλον και την Προστασία των Καταναλωτών. Ξενομεταμόσχευση πειράματα πραγματοποιήθηκαν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Σύμφωνα με ισοφλουράνιο που προκαλείται από την αναισθησία, CD-1

nu /nu

ποντίκια (

n

= 4), ηλικίας περίπου 7 εβδομάδων ενέθηκαν

s

.

γ

. σε λαγόνες με εναιωρήματα του 1 χ 10

6 μονά κύτταρα σε 200 μΐ υψηλού συγκέντρωση Matrigel

® /PBS (1: 1). Τα ποντίκια ενέθηκαν

i

.

σ

. (0,5 mg σε 500 μΙ) κάθε 5

ης ημέρας με πολυκλωνικό αντι-ασιαλο GM1 αντισώματος για την εξάλειψη δραστηριότητα των φυσικών φονικών κυττάρων. Οι όγκοι μετρήθηκαν με ψηφιακά παχύμετρα και ο όγκος του όγκου (

V

) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο:

V

= 0,4 x

μια

x

β

2 [

μια

: μήκος?

β

: πλάτος]. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση. Οι όγκοι αποκόπηκαν μετά από 11 ή 23 ημέρες από θανατώνονται τα ποντίκια, διχοτομημένοι, μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη, και διατομών (5 μm) βάφτηκαν. Όλα έγιναν προσπάθειες για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας των ζώων και να μειωθεί ο αριθμός των ζώων που χρησιμοποιούνται.

RNA /εξαγωγή των miRNAs και σε πραγματικό χρόνο qPCR ανάλυση της έκφρασης

Τα κυτταρικά δείγματα καταψύχονται σε trizole (RNA) ή Qiazol ( miRNA) στους -80 ° C. Ολικό RNA από κύτταρα εκχυλίστηκε (RiboPure Kit, Thermo Fisher Scientific) και καθαρίστηκε (RNeasy Kit, Qiagen). miRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το miRNeasy Kit (Qiagen). δείγματα ιστού FFPE κόπηκαν σε τμήματα των 10 μm πάχους μετά macrodissection (για τον εμπλουτισμό του περιεχομένου περιοχή ενδιαφέροντος, όπως απαιτείται). miRNA εκχυλίζεται από ένα έως έξι διαδοχικές τομές από το ίδιο μπλοκ παραφίνης χρησιμοποιώντας το miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) με το διάλυμα αποπαραφινώσεως (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. miRNA (1 μg) μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας την miScript II RT Kit (Qiagen). ανάλυση σε πραγματικό χρόνο qPCR διεξήχθη με τη χρήση του ένα βήμα κιτ QuantiFast SYBR Green RT-PCR (Qiagen) για το «Mastercycler ep realplex

2″ σύστημα ενίσχυσης σε πραγματικό χρόνο (Eppendorf). QuantiTect Primer Δοκιμασίες (Qiagen) χρησιμοποιήθηκαν ως τα ζεύγη εκκινητών γονιδίου. τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας miScript Primer Δοκιμασίες (Qiagen) με την miScript SYBR Green ΡΟΚ Kit (Qiagen) για το «Mastercycler ep realplex

2″ του συστήματος σε πραγματικό χρόνο. αριθμό αντιγράφων των επιμέρους μεταγραφές αφορούσαν GAPDH (mRNA) ή RNU6 (miRNA) ως ενδογενής ελέγχους (χ /100.000 αντίτυπα) και κανονικοποιημένη όπως υποδεικνύεται.

ανάλυση Πρωτεΐνη με ανοσοαποτύπωση

πρωτεΐνες απομονώθηκαν από καλλιεργημένα κύτταρα σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% Triton-X (Thermo Fisher Scientific), συμπληρωμένο με PhosSTOP φωσφατάσης /πλήρης Mini αναστολέα πρωτεάσης δισκία μίγμα και 1 mM PMSF ( Roche)). Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [36]. Για να επιβεβαιωθεί ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης, πηκτώματα χρωματίστηκαν με SimplyBlue (Thermo Fisher Scientific) και κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντι-GAPDH. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες τουλάχιστον 2 ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται.

ELISA

Συγκεντρώσεις CHI3L1 και TFPI σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη χιτινάση-3-σαν 1 και Αναστολέας Οδού Ιστικού Παράγοντα Quantikine κιτ ELISA (R & amp? D Systems), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Παθολογικής Ανατομικής, ανοσοφθορισμό, ανοσοϊστοχημεία και μετάδοση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (TEM)

η ιστοπαθολογική ανάλυση

η ιστοπαθολογική ανάλυση.. διεξήχθη από την H & amp? E λεκέ και περιοδικού οξέος Schiff (PAS) αντίδραση ακόλουθα τυποποιημένα πρωτόκολλα

ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Poly-D-Λυσίνη διαφάνειες 8-καλά θάλαμο… Ανάλογα με πρωτογενή αντισώματα (S2 πίνακας), τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεϋδη (Electron Microscopy Sciences) ή ακετόνη (100%). Τα κύτταρα αποκλείστηκαν για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με πρωτογενές ή σημασμένα φθορίζοντα αντισώματα σε υγροποιημένο θάλαμο ο /η στους 4 ° C. AlexaFluor

® 647-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας-αντι-κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα, εάν είναι απαραίτητο. Πειράματα ελέγχου πραγματοποιήθηκαν με ισοτυπικό έλεγχο IgG (Santa Cruz). Μετά την τοποθέτηση με Vectashield Τοποθέτηση Μεσαίο με ή χωρίς DAPI (Vector Laboratories), χρώση ανοσοφθορισμού αξιολογήθηκε με τη χρήση οπτικής τομής με ομοεστιακό (Axiovert 100M με LSM 510) ή δομικές φωτισμού (Axio Observer.Z1 με ApoTome) μικροσκόπια (Zeiss). Η επιλογή πολυκάναλη και διαδοχική σάρωση για κάθε κανάλι χρησιμοποιήθηκαν για την εξάλειψη κάθε cross-talk από τα χρωμοφόρα.

ανοσοϊστοχημεία.

Ξενομοσχεύματος FFPE-τομές βάφτηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Cell Signaling) .

TEM.

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 8 ημέρες σε ένθετα (0.4 μm μέγεθος πόρων), που καθορίζεται με παγωμένο 2% γλουταραλδεϋδη και περαιτέρω επεξεργασία από τη διευκόλυνση TEM πυρήνα, Heinrich-Heine Πανεπιστήμιο, Ντίσελντορφ, Γερμανία. Εν συντομία, τα κύτταρα μετά καθορίζεται osmiumtetroxid σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα Millonig`s, σε αντίθεση με ουρανυλίου, αφυδατώθηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης και ενσωματώνονται σε Spurr. Κόπηκαν τομές σε υπερμικροτόμου και μικρο-γράφημα με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Hitachi-H600) σε 75kv (5000X μεγέθυνση).

Ανάλυση της κυτταρικής προσκόλλησης, εισβολή, διάδοση και τον χημειοαντίσταση

τηλέφωνα πρόσφυση.

μειωμένη μεσοκυττάρια κολλητικότητα μπορεί να επιτρέψει την εισβολή καρκίνου και μετάσταση από διαχωρισμού κυττάρων από τις φωλιές καρκίνο. Διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία σχηματίζουν σφιχτά κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-υποστρώματος ενώσεις, είναι θρυψίνη-ανθεκτικά, ενώ μεσεγχυματικά κύτταρα, τα οποία στερούνται αυτών των μηχανισμών προσκόλλησης, είναι ευαίσθητη στη θρυψίνη [40]. Για να ελέγξετε αν το miR-205 και miR-373 μπορεί να μειώσει την πρόσφυση, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία διαφορικό τρυψινοποίηση. Για την αξιολόγηση της προσκόλλησης κυττάρου με διαφορική θρυψινοποίηση, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί πολυ-ϋ-λυσίνη πλακίδια 8 φρεατίων θάλαμο για 3 ημέρες, πλύθηκαν μία φορά και κατόπιν επωάστηκαν με 0,05% θρυψίνη /0,02% EDTA (PAN-Biotech) για 2 λεπτά. Η ενζυματική αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη ολόκληρο μέσο καλλιέργειας. Υπόλοιπα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και χρωματίστηκαν με διάλυμα hemalum Mayer του (Merck).

Invasion.

Μόλις τα καρκινικά κύτταρα είναι σε θέση να διαχωρίσουν από τον πρωτογενή όγκο, μπορούν να εισβάλουν ο περιβάλλοντες ιστούς. Για κυττάρου όγκου εισβολή [35], τα κύτταρα (1,3 χ 10

5/2 ml) καλλιεργήθηκαν επί BD Biocoat Matrigel

®-προεπικαλυμμένα transwells 6-φρεατίων για 25 ημέρες. Τα κύτταρα εισβάλλουν στην μεμβράνη ήταν μεθανόλη-μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.26% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma).

Πολλαπλασιασμός και χημειοαντίσταση.

Κλινικά, αντοχή φαρμάκου των όγκων μπορεί να επιτρέψει την εξέλιξη της νόσου. Εξετάσαμε βασικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ευαισθησία στην ρουτίνα χημειοθεραπεία (ΜΤΧ) από κινητό Ο τίτλος 96

® Δοκιμασία AQ

ueous One Λύση (MTS-based) κυτταρικού πολλαπλασιασμού από Promega.

Ανάλυση εικόνας

Για την ιστοπαθολογική εξέταση, ανοσοϊστοχημεία, κυτταρολογική εξέταση (κυτταρική προσκόλληση και προσδιορισμούς εισβολής), υψηλής ανάλυσης εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Aperio ScanScope (Aperio Technologies) και εμφανίσθηκε με τη χρήση του λογισμικού πεδίο εικόνας (έκδοση 11.2.0.780, ImageScope). Για μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, απέκτησε εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας LSM 510 v3.2 ή ZEN Μπλε 2012 (Carl Zeiss) λογισμικού. Σε όλα τα πειράματα, τουλάχιστον 4 ξεχωριστές θέσεις λήψης εικόνας επελέγησαν τυχαία για κάθε δείγμα. Μορφολογικά αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά μόνο εάν τουλάχιστον το 70% των σαρωμένων τμήματα ανά τομέα παρουσίασαν το παρατηρούμενο αποτέλεσμα.

Η στατιστική ανάλυση

Η ακριβής δοκιμασία Fisher χρησιμοποιήθηκε για τους πίνακες έκτακτης ανάγκης για να συγκρίνετε αναλογίες των ασθενών. Η δοκιμή που υπογράφηκε-rank Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της έκφρασης miRNA μεταξύ ζεύγη των ανθρώπινων όγκων και των φυσιολογικών ιστών εντός της ίδιας υποομάδας καρκίνου. Το ζευγαρωμένο t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει έκφραση miRNA μεταξύ διαφορετικών υποομάδων του καρκίνου και σε όλα τα άλλα πειράματα, εάν δεν υποδεικνύεται διαφορετικά. Όλες οι δοκιμασίες ήταν αμφίδρομες (GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 5.04) και ένα

σ

αξία των & lt? 0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM.

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα έκφρασης του miR-205 και miR-373 αυξήθηκαν σε βλεννίνη παραγωγή ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου

ερευνήσαμε την ρόλος του miR-205 και miR-373 στην παθοφυσιολογία διαφόρων ιστολογικών υπότυπων του ορθοκολικού καρκίνου με αξιολόγηση έκφρασης τους, μαζί με εκείνη των άλλων miRNAs, σε δείγματα των συμβατικών, βλεννώδες και UC-αντίστοιχοι ανθρώπινοι κολονικού αδενοκαρκινώματος. Εξετάστηκαν Μόνο συμφωνημένα ιστούς όγκων με γειτονικά μη-νεοπλασματικές, κανονική χειρουργικά όρια (R

0) του κάθε ασθενή. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-205 και miR-373 ήταν ειδικά αυξήθηκαν σε δύο υποομάδες αδενοκαρκινώματος παχέως εντέρου που συνδέονται με την παραγωγή της βλεννίνης (βλεννώδες και χρόνιες UC που σχετίζονται με καρκίνους του παχέος) σε σχέση με παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου (Σχήμα 1Α και 1Β). Αξίζει να σημειωθεί, η έκφραση της miR-205 ήταν ελαφρώς υψηλότερη σε UC που σχετίζεται με τον καρκίνο σε σύγκριση με (μη-UC) βλεννώδες καρκίνου. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη miR-205 και η έκφραση του miR-373 αναγνωρίστηκαν σε ζεύγη κολονικό ιστό του όγκου και αντίστοιχο φυσιολογικό βλεννογόνο από ασθενείς με συμβατικά αδενοκαρκινώματος κόλου (μη βλεννώδες). Αμφότερα τα miRNAs ήταν εξίσου εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε όλη την άνευ όγκου του κόλου ιστών μεταξύ των τριών υποομάδων ασθενών. Σε αντίθεση, miR-1, miR-10a και miR-133α ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε ανθρώπινους ιστούς όγκου CRC, ανεξάρτητα από το ιστολογικών υποτύπου (S1A, S2A και S3A Σχήματα).

Τα επίπεδα έκφρασης του (Α) ΜΙΚ 205 και (Β) miR-373 ρυθμίζονται προς τα άνω σημαντικά σε ανθρώπινο βλεννώδες (

n

= 20) και χρόνια UC (

n

= 13) περιοχές του όγκου σε σύγκριση με το CRC συμφωνημένα R

0 περιθώρια, όπως προσδιορίζεται με qPCR. Αντίθετα, οι σημαντικές διαφορές στη miR-205 και miR-373 έκφραση παρατηρήθηκε μεταξύ ζεύγη συμβατικών CRC (

n

= 18) του ιστού του όγκου και της αντίστοιχης κανονικής βλεννογόνου. (Γ) Ενώ εντεροκύτταρο-όπως Caco-2

WT παρουσιάζουν χαμηλά επίπεδα των miR-205 και miR-373 έκφρασης, και οι δύο miRNAs απορυθμίζεται σημαντικά σε παχέος εντέρου Caco-2

κύτταρα D299G καρκίνωμα-όπως, όπως εκτιμάται από qPCR . (Δ) Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης του miR-205 /miR-373 πρόδρομες ουσίες ή αναστολείς επιβεβαιώνεται από qPCR σε πρόσφατα δημιουργήθηκε (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) Caco-2

WT /miR-205, Caco-2

WT /miR -373, Caco-2

D299G /α-miR-205 και Caco-2

D299G /α-miR-373 κλώνους (n = 3 ανά κλώνο). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε σχέση με την έκφραση RNU6 miRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM (NS: μη σημαντική, *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001, ****

ρ

& lt? 0,0001? Α, Β: Wilcoxon υπογραφεί-rank test για συγκρίσεις μεταξύ ομάδων συμφωνημένα (R

0 εναντίον του όγκου), αλλιώς μη ζευγαρωμένο t-test? C, D:. unpaired t-test)

Η

Κλινικά, βλεννώδες καρκίνοι του παχέος εντέρου εμφανίζεται μια πιο προοδευτική διανομή στάδιο του όγκου κατά την αρχική διάγνωση σε σύγκριση με τα συμβατικά ή UC σχετιζόμενη CRC (Πίνακας 1). Προηγμένη νόσος με μετάσταση μακρινό όργανο κατά τη στιγμή της διάγνωσης παρατηρήθηκε συχνότερα σε ασθενείς με CRC το βλεννώδες υπότυπο από ότι σε ασθενείς με συμβατικά ή χρόνια όγκων UC. Ωστόσο, δεν είχαμε εντοπίσει τυχόν συσχετίσεις μεταξύ miR-205 και τα επίπεδα έκφρασης του miR-373 και τα στάδια του καρκίνου (συμπεριλαμβανομένου του ιστολογικού βαθμού) σε κάθε υπότυπο.

Η έκφραση του miR-205 και miR-373 απορυθμίζεται σε καρκίνωμα του παχέος εντέρου κύτταρα

in-vitro

Η

στη συνέχεια, με στόχο να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του miR-205 και miR-373 στην κυτταρική βιολογία και τη λειτουργία υπό κανονικές συνθήκες και νεοπλασματικών εντερικό επιθήλιο

in-vitro

. Έχουμε δημιουργήσει στο παρελθόν δύο

in-vitro

μοντέλα του πολωμένου, εντεροκυττάρου-όπως (Caco-2

WT) και αδιαφοροποίητο, του παχέος εντέρου καρκίνωμα-όπως (Caco-2

D299G) κύτταρα του ανθρώπου [35 ], όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Χρησιμοποιώντας πραγματικό χρόνο qPCR, βρήκαμε (σχήμα 1Γ) ότι Caco-2

WT έδειξαν χαμηλά επίπεδα του miR-205 και miR-373 έκφρασης, ενώ και οι δύο miRNAs ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε Caco-2

D299G. Επιπλέον, miR-1, miR-10a και miR-133a ήταν αισθητά μειωμένη σε Caco-2

D299G σε σύγκριση με Caco-2

WT (S1B, S2B και S3b σχήματα). Θα προβληθεί επίσης και άλλες γραμμές CRC, αλλά απέτυχαν να αποκαλύψουν πρότυπα έκφρασης των miRNAs παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν σε ανθρώπινο ιστό του παχέως εντέρου (S4 σχήμα). Αποφασίσαμε να προχωρήσουμε με τη χρήση αυτών των sublines IEC (Caco-2

WT και Caco-2

D299G), επειδή ιδανικά καθρεφτίζονται τα αποτελέσματα της έκφρασης των miRNAs μας σε συνδυασμό κανονικής και βλεννώδες παχέος δείγματα αδενοκαρκινώματος από ασθενείς.

Χρήση σταθερή επιμόλυνση με πρόδρομες ουσίες miRNA ή αναστολείς, δημιουργήσαμε (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) miR-205 που εκφράζουν και miR-373 που εκφράζουν Caco-2

WT κλώνους (Caco-2

WT /miR-205? Caco-2

WT /miR-373), καθώς και miR-205-ανασταλτική και miR-373-αναστολής Caco-2

κλώνοι D299G (Caco-2

D299G /α-miR-205? Caco -2

D299G /α-miR-373). Ως αρνητικοί μάρτυρες, ομελέτα κλώνοι φορέα που εκφράζουν χρησιμοποιήθηκαν (Caco-2

WT /miR-c? Caco-2

D299G /α-miR-γ). Η υπερεκφράζεται προ-miR-205 και προ-miR-373 με επιτυχία σε επεξεργασία για να αυξάνουν την έκφραση του ώριμου miR-205 και miR-373 σε Caco-2

WT, αντίστοιχα, όπως επιβεβαιώθηκε με ανάλυση qPCR (Σχήμα 1D). Η υπερέκφραση των αναστολέων miR-205- και miR-373- οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του ώριμου miR-205 και miR-373 σε Caco-2

D299G.

miR-205 επάγει αυξημένη παραγωγή βλεννίνης, ενώ miR-373 προκαλεί αποδιαφοροποίηση

Όπως φαίνεται στο Σχ 2Α-2D, του κλώνου ελέγχου Caco-2

WT /miR-c επέδειξε μια μορφή στήλης μονοστοιβάδα κανονικών, πολωμένο IEC με τακτικές βλεννίνη παραγωγή, ενώ ο έλεγχος κλώνος Caco-2

D299G /α-miR-γ έδειξαν πεπλατυσμένο μονοστιβάδα νεοπλασματικών, αδιαφοροποίητα κύτταρα με λιγότερο βλεννίνη παραγωγής. Σταθερό υπερέκφραση του miR-205 σε Caco-2

WT επαγόμενη σχηματισμό εκκριτικά κύτταρα που περιέχουν μεγάλα κυστίδια με ασθενώς περιεχόμενα Lucent καταλαμβάνει σχεδόν το σύνολο της κυτόπλασμα (Σχήμα 2Α). Παραγωγή βλεννίνης ανιχνεύθηκε με PAS (Σχήμα 2Β) και ΤΕΜ έδειξε τεράστια κυστίδια στο κορυφαίο κυτταρόπλασμα με λιγότερο πυκνά σε ηλεκτρόνια υλικό (Σχήμα 2C), υποδηλώνουν βλεννώδες ουσιών. Ανάλυση ανοσοφθορισμού επιβεβαίωσε αυξημένη παραγωγή MUC2 σε Caco-2

WT /miR-205 (Σχήμα 2D). Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του miR-373 σε Caco-2

WT που προκαλείται από τα χαρακτηριστικά της χαμηλής διαφοροποίησης, ετερογενή κύτταρα αυξάνονται σε επίπεδα φύλλα, που έμοιαζε με νεοπλασματική Caco-2

D299G /α-miR-γ (Σχήμα 2Α-2D ). Καταστολή του miR-373 αντιστρέφεται μερικά από τα νεοπλασματικά χαρακτηριστικά των Caco-2

D299G. Σταθερό αναστολή των miR-373 σε Caco-2

D299G οδήγησε στην οργάνωση του πολωμένου επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία έμοιαζαν με διαφοροποιημένα Caco-2

WT /miR-c (Σχ 2Α-2D).

( μ.Χ.) Caco-2

WT υπερεκφράζουν το miR-205 ή miR-373 οθόνη σημαντικές μορφολογικές μεταβολές σε σύγκριση με τον έλεγχο των Caco-2

WT /miR-c. Σε αντίθεση, η καταστολή της miR-373 αντιστρέφει μερικά από τα χαρακτηριστικά νεοπλασματικών κυττάρων Caco-2

D299G. Εκπρόσωπος εικόνες (

n

≥ 2 δείγματα /κλώνος) δείχνει (Α) H & amp? E χρώση (bar, 200 μm), (Β) ΠΑΣ (bar, 200 μm), (C) TEM (bar, 5 μm) και (D) χρώση ανοσοφθορισμού με αντι-MUC2 (AlexaFluor

® 647? κίτρινο) και DAPI (μπλε), η οποία αξιολογείται με οπτική μικροσκοπία κοπής (bar, 50μm), παρουσιάζονται. Μαύρο αστέρι δείχνει κύστη (C)? λευκά βέλη δείχνουν βλέννα (Β) ή MUC2 (D) -θετικό δομές.

Η

miR-205 και miR-373 διαταράξει την εντερική ακεραιότητα του επιθηλιακού φραγμού

Για να κατανοήσουμε περισσότερο τις μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από miR-205 και miR-373, εκτελέσαμε μια σειρά πειραμάτων χρώση ανοσοφθορισμού για την εκτίμηση των επιπτώσεων σχετικά με τη διαρθρωτική οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης (Σχήμα 3Α), διανομή εμπόδιο που σχετίζεται με σφιχτό κομβική ΖΩ-1 (Σχήμα 3Β) και φωσφο- η β-κατενίνη (Εικ 3C) και το σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου (Εικόνα 3D). Η υπερέκφραση του miR-205 σε Caco-2

WT μεσολάβηση διαταραχή του κυτταροσκελετού ακτίνης που βασίζεται και μείωσε την έκφραση της ΖΟ-1 στην κυτταρική μεμβράνη, αλλά δεν μετέβαλε μιτωτικά σχήματα. Η υπερέκφραση του miR-373 σε Caco-2

WT προκάλεσε αναστάτωση και ακανόνιστη αναδιανομή των νημάτων ακτίνης, σφιχτό κομβική ZO-1 και φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα, υπονοώντας κίνδυνο εντερική λειτουργία του επιθηλιακού φραγμού και φράχτη. Επιπλέον, διευρυμένη πυρήνες Caco-2

WT /miR-373 αποκάλυψε ακαθάριστο διαταραχές της μιτωτικής ατράκτου, συγκρίσιμη με Caco-2

D299G /α-miR-c. Σε αντίθεση, η αναστολή της miR-373 Σ Caco-2

D299G προωθείται επιθηλιακών σφίξιμο με ακραία πόλωση των νημάτων της ακτίνης και την εκ νέου εγκατάσταση του ΖΟ-1 και της ακεραιότητας που συνδέονται φράγμα φωσφο-β-CATENIN-, μειώνοντας έτσι τον φαινότυπο μεσεγχυματικών των κακώς διαφοροποιημένα Caco-2

D299G. Αξίζει να σημειωθεί ότι, Caco-2

D299G /α-miR-373 έδειξε φυσιολογική μιτωτική μεταφάσεων, συγκρίσιμη με Caco-2

WT /miR-c. Ωστόσο, η αναστολή του miR-205 σε Caco-2

D299G δεν άλλαξε την ινοβλαστών-όπως εμφάνιση με κυτταροσκελετού ακτίνης αποδιοργάνωση, κυτταροπλασματική αναδιανομή του ΖΩ-1 και παρεκκλίνουσα μιτωτική στοιχεία.

Η έκφραση του miR-205 και miR-373 διαφορικά (Α) μεταβάλλει την αρχιτεκτονική του κυτταροσκελετού ακτίνης, επιρροές (Β) ΖΟ-1 και (C) φωσφο-β-κατενίνης -associated ακεραιότητα του φραγμού, και (Δ) προκαλεί σχηματισμό πολυπύρηνων με πολυπολικό ατράκτους. Εκπρόσωπος εικόνες (

n

≥ 2 δείγματα /κλώνος) της χρώσης ανοσοφθορισμού με (Α) phalloidin (AlexaFluor

® 647?

λευκό

? Κίτρινη γραμμή, 20.29μm [3-διαστάσεων απόσταση ], λευκή γραμμή, 100 μm), (Β) αντι-ΖΩ-1 (AlexaFluor

® 647?

λευκό

? bar, 50 μm) και DAPI (

μπλε

), (C ) φωσφο-β-κατενίνης (AlexaFluor

® 647?

πράσινο

? bar, 50 μm) και DAPI (

κόκκινο

) και (Δ) αντι-φωσφο-Η3 (PacificBlue <